CN104046570A - 一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法 - Google Patents
一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法 Download PDFInfo
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法，包括步骤：(1)将由薏苡仁10-40重量份、黄芪10-40重量份、枸杞10-40重量份和白术10-40重量份组成的中药材经水溶液提取，得到中药复合水提液；(2)将步骤(1)制备的中药复合水提液、白术内酯及吐温80加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；(3)将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中，经液体发酵，得到发酵液，然后分离得到发酵产物。本发明通过添加特定种类的中药复合水提液、白术内酯及吐温80可显著提高蝉拟青霉的生物量和多糖产量，同时多糖的活性也有明显的增大。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法。
背景技术
食药用菌蝉拟青霉(Paecilomyces cicadae(Mique1)Samson)又名雌蝉花，与冬虫夏草、蛹虫草同为虫草属，是我国的一种名贵传统中药材蝉花(Cordyceps sobolifera)的无性型菌株。蝉拟青霉的活性成分和功效与冬虫夏草相似，含有核苷类物质、多球壳菌素、麦角固醇、虫草酸、多糖、多种必需氨基酸、甘露醇及生物碱等次生代谢产物(贺亮,马素云,程俊文,等.药用真菌蝉拟青霉生物活性物质的研究进展[J].食品与生物技术学报,2012,31(1):8-15.)。现代药理学研究表明，蝉拟青霉具有诸多医疗保健功能，如免疫调节、抗肿瘤和改善肾功能(Weng S C,Chou C J,Lin L C,et al.Immunomodulatory functions of extracts from the Chinese medicinal fungusCordyceps cicadae[J].Journal of ethnopharmacology,2002,83(1):79-85；陈安徽,樊美珍,邵颖,等.蝉拟青霉代谢产物抑制单胺氧化酶和抗肿瘤活性研究[J].食品科学,2009,30(11):216-218；Chyau C C,Chen C C,Chen J C,et al.Mycelia glycoproteins from Cordycepssoboliferaamelioratecyclosporine-induced renal tubule dysfunction in rats[J].Journal ofethnopharmacology,2014.)，还有滋补强壮、抗氧化、抗病毒等(陈秀芳,金丽琴,吕建新,等.蝉拟青霉对大鼠营养状况的影响[J].温州医学院学报,2005,35(1):13-15；朱燕,程东庆.蝉花多糖抗氧化活性的测定[J].中华总医药学刊,2009,27(7):1552-1554；卓佳,杨介钻,金丽琴,等.蝉拟青霉多糖体外对乙型肝炎病毒复制的抑制作用[J].中国病理生理杂志,2010,26(2):327-332.)，因此，蝉拟青霉可以作为冬虫夏草的代用品，具有很好的研究和应用的前景，将来蝉拟青霉制剂可能在功能食品开发和医疗保健事业上作出重要贡献，造福于人类。
食药用菌可以分泌庞杂的酶系对中药中的纤维素、淀粉、蛋白质、脂类等丰富的营养成分加以利用，促进真菌生长和产物合成，从而得到丰富的代谢产物。中药发酵技术研究发现，真菌在代谢过程中还有可能对中药中的萜类、黄酮类、生物碱、皂甙类等某些活性物质进行生物转化，形成新的成分或是活性更高的物质，明显增强发酵产物的生物活性和药理功能。中药成分与蝉拟青霉的生长代谢过程存在着相互关联，中药成分有可能参与蝉拟青霉的代谢途径，影响其胞外多糖积累和生物合成的相关酶，如葡糖磷酸异构酶(PGI)是糖酵解途径中的重要酶，α-葡糖磷酸变位酶(α-PGM)是与胞外多糖(EPS)合成相关的重要酶。文献报道中药天麻中的天麻素或其复合成分对灰树花多糖合成代谢途径中PGI具有显著的抑制作用，抑制了糖酵解途径，从而有利于葡萄糖-6-磷酸向多糖合成途径的行进(贺宗毅,吴天祥,徐晓宝.中药天麻成分对灰树花胞外多糖合成及相关关键酶的影响[J].食品科学,2013,34(11):199-202.)。代谢产物活性的改变可能是培养基中添加中药后，刺激或抑制了蝉拟青霉活性物质的代谢量，或是蝉拟青霉在生长代谢过程中对某些中药成分进行了生物转化，产生了新的次生代谢产物，从而改变代谢产物的活性。
研究发现一些油脂类物质和表面活性剂在食药用菌液体发酵生产中除了作为消泡剂外，还能对真菌的生长代谢产生影响，人们便开始尝试用它们作为诱导因子来促进食药用菌特定活性成分的合成(Hsieh C,Wang HL,Chen C C,et al.Effect of plant oil and surfactant on the production ofmycelial biomass and polysaccharides in submerged culture ofGrifolafrondosa[J].Biochemical Engineering Journal,2008,38(2):198-205；毕澎洋,杨海龙,闵伟红.薏苡仁油和薏苡仁酯促进灵芝深层发酵的研究[J].食品工业科技,2011,32(12):226-228.)。油脂物质能促进真菌生长代谢与油或脂肪酸改变真菌细胞膜结构和通透性或直接影响代谢途径中某些重要的酶活性有关。研究发现0.2％的薏苡仁脂有助于灵芝菌丝生长和胞内多糖及胞外多糖的合成，而且灵芝多糖生物合成途径中的一些重要酶的活性也受到薏苡仁脂的影响(Zhou H,Bi P,Wu X,et al.Improvedpolysaccharide production in submerged culture of Ganodermalucidumn bythe addition of coixenolide[J].Applied Biochemistry and Biotechnology,2014,172:1497-1505.)。表面活性剂吐温80影响食药用菌新陈代谢的机制可能与菌丝体细胞膜的完整结构和跨膜运输活性有关(Zhang B B,Cheung P CK.A mechanistic study of the enhancing effect of Tween80on the mycelialgrowth and exopolysaccharide production by Pleurotus tuber-regium[J].Bioresource technology,2011,102(17):8323-8326.)。表面活性剂的分子结构具有两亲性，而真菌细胞膜结构也由一层两亲性的磷脂组成，因而表面活性剂可能局部嵌合到细胞膜中，从而加快了细胞从培养基中摄取营养的速率(Chen H B,Huang H C,Chen C I,et al.The use of additives as thestimulator on mycelial biomass and exopolysaccharide productions insubmerged culture of Grifolaumbellate[J].Bioprocess and biosystemsengineering,2010,33(3):401-406.)。研究表明，表面活性剂如吐温80能有效促进食药用菌中活性代谢产物的合成，在牛樟芝液体发酵的第72h添加0.1％(w/v)的吐温80，Antrodin C的产量明显高于对照，由52.37±1.02mg/L提高到103.76±0.92mg/L，在吐温80和大豆油的耦合发酵体系中，AntrodinC的最大产量是对照的3.6倍(Zhang H,Xia Y,Wang Y L,et al.Coupling useof surfactant and in situ extractant for enhanced production of Antrodin C bysubmerged fermentation of Antrodiacamphorata[J].Biochemical EngineeringJournal,2013,79:194-199.)。
中国专利ZL200510068284.9中公开了一种添加苦瓜的鸡腿蘑液体发酵工艺及发酵产品和应用的方法，其工艺方法是通过在鸡腿蘑液体发酵培养基中添加适量的中药苦瓜，在发酵过程中鸡腿蘑对苦瓜成分进行生物转化，提高了发酵液的活性。中国专利ZL 200510137457.8中公开了一种冬虫夏草的培养方法及其专用培养基，其中公开了添加大豆油进行冬虫夏草液体发酵培养的方法，该法对发酵生产冬虫夏草菌丝体具有生长速度快、周期短、产率高、工艺简单、成本低等优点。通过向培养基中添加适量中药成分或油脂类物质，显著促进食药用真菌的生长或提高活性代谢产物的产量的研究，国内外都已经多次报道，但在蝉拟青霉液体发酵上的应用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种提高蝉拟青霉液体深层发酵产物产量及产物活性的方法。
本发明发现，向发酵培养基中添加特定种类的中药复合提取物、油脂和表面活性剂，进行蝉拟青霉的液体发酵培养，有助于提高蝉拟青霉生物量和次生代谢产物的含量，同时促进代谢产物活性提高。
一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法，包括步骤：
(1)将由薏苡仁10-40重量份、黄芪10-40重量份、枸杞10-40重量份和白术10-40重量份组成的中药材经水溶液提取，得到中药复合水提液；
(2)将步骤(1)制备的中药复合水提液、白术内酯及吐温80加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；
(3)将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中，经液体发酵，得到发酵液，然后分离得到发酵产物。
本发明，进行蝉拟青霉液体发酵时，不能直接将中药材加入发酵基础培养基中，需要先将中药材制备为中药复合水提液，再将中药复合水提液加入到发酵基础培养基中制成含中药提取物的培养基，这样有助于提高蝉拟青霉生物量和次生代谢产物的含量，同时促进代谢产物活性提高。
步骤(1)中，所述的中药复合水提液的制备可采用本领域常规的水提法，优选采用以下方法：按所述量称取中药材，粉碎(优选过60目-100目的粉末)，加2倍-10倍水浸泡0.5h-1h，然后加热煎熬，保持温和的沸腾状态20min-60min，过滤收集提取液；重复提取1次-4次，合并滤液，得到中药复合水提液。
步骤(2)中，所述的白术内酯可采用市售产品，也可以采用现有的方法制备；如可采用杨林等人在《白术中白术内酯I的超临界CO2萃取工艺研究》一文中记载的白术内酯制备方法进行制备(杨林，何丹.白术中白术内酯I的超临界CO2萃取工艺研究.中草药，2006，37(9)：1331-1333)；具体可采用以下制备方法：将白术药材粉碎(优选粉碎至60目-100目的粉末)，以质量百分浓度为10％-20％的乙醇水溶液为携带剂，萃取压力25MPa，解析压力5MPa，萃取温度40℃-45℃，解析温度30℃-35℃的条件下萃取4h-4.5h，制得白术内酯。
所述的蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有以生药材量计为1g-2g的中药复合水提液、0.2g-0.6g的白术内酯及0.1g-0.3g的吐温80。
所述的发酵基础培养基可采用本领域液体发酵常用的发酵基础培养基，优选的发酵基础培养基为:葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.4g/100ml、蛋白胨0.3g/100ml、KH2PO40.1g/100ml和MgSO40.05g/100ml。
步骤(3)中，所述的蝉拟青霉菌种可采用任意一种蝉拟青霉菌种，可采用市售产品。例如蝉拟青霉菌株Paecilomyces cicadae(Miq.)SamsonCGMCC No.3453，该菌株已于2009年11月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)注册保藏。
所述的蝉拟青霉菌种的接入方法为本领域的常规方法，包括：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，接入灭菌后的液体种子培养基中培养，得到培养好的种子液，然后将培养好的种子液接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中。进一步优选：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2-8mm2接入灭菌后的液体种子培养基中至100ml-200ml，20℃-30℃(最优选25℃)，100r/min-150r/min(最优选120r/min)下摇床培养3天-5天，得到培养好的种子液，然后将培养好的种子液接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中。
所述的PDA斜面培养基和液体种子培养基均采用本领域种子培养常用的培养基，可采用市售产品。进一步优选，所述的PDA斜面培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g-20g，用水定容至1000毫升。进一步优选，所述的液体种子培养基：葡萄糖20g，酵母粉5g，KH2PO4 1g和MgSO4 0.5g，用水定容至1000毫升。
所述的蝉拟青霉菌种的菌种接种量优选为5％-15％。液体发酵条件优选：在温度20℃-30℃，转速60r/min-150r/min条件下，摇床培养5天-7天。
所述的菌种接种量指接入的菌种体积或接入的培养好的种子液体积与蝉拟青霉发酵培养基体积之比的百分数。
所述的分离采用本领域常规的分离方法，例如可选用过滤、醇沉过滤、离心等分离方法中的一种或多种。
本发明中，所述的中药材符合《中华人民共和国药典》的要求。
薏苡仁，本品为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.ma-yuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁。秋季果实成熟时采割植株，晒干，打下果实，再晒干，除去外壳、黄褐色种皮及杂质，收集种仁。性状：本品呈宽卵形或长椭圆形，长4-8mm，宽3-6mm。表面乳白色，光滑，偶有残存的黄褐色种皮。一端钝圆，另端较宽而微凹，有1淡棕色点状种脐。背面圆凸，腹面有1条较宽而深的纵沟。质坚实，断面白色，粉性。气微，味微甜。
黄芪，本品为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongho-licus(Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根及根头，晒干。性状：本品呈圆柱形，有的有分枝，上端较粗，长30-90cm，直径1-3.5cm。表面淡棕黄色或淡棕褐色，有不整齐的纵皱纹或纵沟。质硬而韧，不易折断，断面纤维性强，并显粉性，皮部黄白色，木部淡黄色，有放射状纹理及裂隙，老根中心偶有枯朽状，黑褐色或呈空洞。气微，味微甜，嚼之微有豆腥味。
枸杞，即枸杞子，本品为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实。夏、秋二季果实呈红色时采收，热风烘干，除去果梗。或晾至皮皱后，晒干，除去果梗。性状：本品呈类纺锤形或椭圆形，长6-20mm，直径3-10mm。表面红色或暗红色，顶端有小凸起状的花柱痕，基部有白色的果梗痕。果皮柔韧，皱缩；果肉肉质，柔润。种子20-50粒，类肾形，扁而翘，长1.5-1.9mm，宽1-1.7mm，表面浅黄色或棕黄色。气微，味甜。
白术，本品为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎。冬季下部叶枯黄、上部叶变脆时采挖，除去泥沙，烘干或晒干，再除去须根。性状：本品为不规则的肥厚团块，长3-13cm，直径1.5-7cm。表面灰黄色或灰棕色，有瘤状突起及断续的纵皱和沟纹，并有须根痕，顶端有残留茎基和芽痕。质坚硬不易折断，断面不平坦，黄白色至淡棕色，有棕黄色的点状油室散在；烘干者断面角质样，色较深或有裂隙。气清香，味甘、微辛，嚼之略带黏性。
本发明的有益效果：
本发明通过添加特定种类的中药复合水提液、白术内酯及吐温80可显著提高蝉拟青霉的生物量和多糖产量，同时多糖的活性也有明显的增大。其中与常规培养方法相比，采用本发明方法发酵培养的蝉拟青霉生物量提高了37.80％-134.39％，胞外多糖产量提高了15.86％-37.89％，胞内多糖提高了39.74％-134.04％，胞外多糖活性提高3.60％-33.5％，胞内多糖活性提高15.2％-61.67％。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
所用的PDA斜面培养基：马铃薯200g、葡萄糖20g和琼脂15g，用水定容至1000毫升，自然pH，在121℃下灭菌20min。
所用的白术内酯，购自成都瑞芬思生物科技有限公司；蝉拟青霉菌种，购自金寨嘉德中药材有限公司。
实施例1
1.发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为150mL，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(2)中药复合水提液制备
称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁10份，黄芪40份，枸杞20份和白术30份。加10倍水浸泡0.5h，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.2g白术内酯、0.3g吐温80以及50mL20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，60r/min摇床中培养5d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
(1)菌丝生物量的测定
发酵液中菌丝体经8层纱布过滤得到，菌丝体用蒸馏水冲洗3次，然后置60℃烘箱中烘干至恒重，得到菌体干粉，称重。
菌丝生物量＝菌体干粉重量÷发酵液体积。
(2)胞外多糖含量的测定
取发酵液过滤菌丝体后的上清液加入4倍体积无水乙醇，隔夜醇沉，3000r/min，20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀加水定容至50mL，用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即胞外多糖含量。
胞外多糖含量＝胞外多糖重量÷发酵液体积。
(3)胞内多糖含量的测定
称取适量菌体干粉，置于烧杯中，按料液比1:10(重量比)加入蒸馏水，90℃浸提3h，提取两次，减压过滤收集滤液，60℃下减压浓缩，浓缩液加入4倍体积无水乙醇，隔夜醇沉，3000r/min，20min离心后，沉淀即为粗多糖。将沉淀加水定容至50mL，用苯酚-硫酸法测定发酵液中多糖含量，重复测定3次求平均值，即胞内多糖含量。
胞外多糖含量＝胞外多糖重量÷发酵液体积。
(4)胞外及胞内多糖对DPPH自由基清除能力的测定
称取7.9mg DPPH溶解于质量百分浓度为80％的乙醇水溶液中，并定容于100mL容量瓶，得到0.2mM(mmol/L)的DPPH乙醇溶液，现配现用。取2mL5mg/mL的待测样品(胞外多糖水溶液或胞内多糖水溶液)于试管中，加入2mL0.2mM DPPH乙醇溶液，混合均匀，室温避光反应30min，在517nm波长处测定吸光值，按照下列公式计算待测样品对DPPH自由基的清除率。
清除率(％)＝(1-A1/A0)×100％
式中，A0为2mL 0.2mM的DPPH乙醇溶液加2mL蒸馏水的吸光值；A1为2mL 0.2mM的DPPH乙醇溶液加2mL待测样品的吸光值。
检测结果见表1、表2。
实施例2
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为150mL，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(2)中药复合水提液制备
称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁20份，黄芪30份，枸杞30份和白术20份。加10倍水浸泡0.5h，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.4g白术内酯、0.2g吐温80以及50mL20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，60r/min摇床中培养5d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
实施例3
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为150mL，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(2)中药复合水提液制备
称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁30份，黄芪10份，枸杞40份和白术20份。加10倍水浸泡0.5h，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.6g白术内酯、0.1g吐温80以及50mL20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，60r/min摇床中培养5d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
实施例4
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为150mL，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(2)中药复合水提液制备
称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁40份，黄芪30份，枸杞10份和白术20份。加10倍水浸泡0.5h，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.3g白术内酯、0.2g吐温80以及50mL20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，60r/min摇床中培养5d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
实施例5
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为150mL，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(2)中药复合水提液制备
称取1g复合中药材(已粉碎，过60目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁20份，黄芪20份，枸杞30份和白术30份。加10倍水浸泡0.5h，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸60min，过滤收集提取液。重复提取2次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.5g白术内酯、0.2g吐温80以及50mL20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，60r/min摇床中培养5d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
实施例6
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取8mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为100mL，20℃，100r/min下摇床培养5d，得到培养好的种子液。
(2)中药复合水提液制备
称取2g复合中药材(已粉碎，过100目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁30份，黄芪30份，枸杞30份和白术10份。加2倍水浸泡1h，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸20min，过滤收集提取液。重复提取4次，滤液合并后置于100mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.5g白术内酯、0.2g吐温80以及100mL 20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至150mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以5％的接种量接入液体发酵培养基中，在20℃，150r/min摇床中培养7d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
实施例7
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取6mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为200mL，30℃，150r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(3)中药复合水提液制备
称取1g复合中药材(已粉碎，过100目)，由以下中草药组成：按重量份数计算，薏苡仁20份，黄芪30份，枸杞10份和白术40份。加5倍水浸泡50min，用电炉煎熬，调整适当的加热温度，保持温和的沸腾状态，煮沸45min，过滤收集提取液。重复提取1次，滤液合并后置于50mL容量瓶中，加水定容得以生药材量计浓度为20mg/mL的中药复合水提液。
(4)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，0.5g白术内酯、0.2g吐温80以及50mL20mg/mL的中药复合水提液，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以15％的接种量接入液体发酵培养基中，在30℃，100r/min摇床中培养6d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
对照例
1发酵培养
(1)摇瓶种子培养
1L液体种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L和MgSO4 0.5g/L，余量为水，pH自然，在121℃下灭菌20min。
培养方法：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2(即黄豆大小)接入灭菌后液体种子培养基中，500mL锥形瓶的装瓶量为150mL，25℃，120r/min下摇床培养3d，得到培养好的种子液。
(3)摇瓶发酵培养
液体发酵培养基:2g葡萄糖，0.4g酵母粉，0.3g蛋白胨，0.1g KH2PO4，0.05g MgSO4，加水充分溶解并定容至100mL，pH自然，装入500mL三角瓶，121℃灭菌20min。
培养方法：将培养好的种子液以10％的接种量接入液体发酵培养基中，在25℃，60r/min摇床中培养5d，得到发酵液。每个试验设3个平行。
2测定
菌丝生物量的测定、胞外多糖含量的测定及胞内多糖含量的测定同实施例1。检测结果见表1、表2。
表1 蝉拟青霉液体发酵代谢产物产量及产物活性检测结果
表 2
表2中的数值是各实施例中蝉拟青霉液体发酵代谢产物产量及产物活性相对对照例中对应的蝉拟青霉液体发酵代谢产物产量及产物活性所提高的百分比。
表1和表2的数据显示，本发明通过添加特定种类的中药复合水提液、白术内酯及吐温80可显著提高蝉拟青霉的生物量和多糖产量，同时多糖的活性也有明显的增大。与常规培养方法相比，采用本发明方法发酵培养的蝉拟青霉生物量提高了37.80％-134.39％，胞外多糖产量提高了15.86％-37.89％，胞内多糖提高了39.74％-134.04％，胞外多糖活性提高3.60％-33.5％，胞内多糖活性提高15.2％-61.67％。
在本发明制备方法限定的范围内各参数的变化并不影响蝉拟青霉液体发酵代谢产物产量及产物活性的提高，因此本发明制备方法中任意参数的组合均可实现蝉拟青霉液体发酵代谢产物产量及产物活性的提高。在此不再赘述。
Claims (8)
1.一种提高蝉拟青霉液体发酵产物产量及产物活性的方法，其特征在于，包括步骤：
(1)将由薏苡仁10-40重量份、黄芪10-40重量份、枸杞10-40重量份和白术10-40重量份组成的中药材经水溶液提取，得到中药复合水提液；
(2)将步骤(1)制备的中药复合水提液、白术内酯及吐温80加入发酵基础培养基中，得到蝉拟青霉发酵培养基；
(3)将蝉拟青霉菌种接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中，经液体发酵，得到发酵液，然后分离得到发酵产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的中药复合水提液的制备方法包括：按所述量称取中药材，粉碎，加2倍-10倍水浸泡0.5h-1h，然后加热煎熬，保持温和的沸腾状态20min-60min，过滤收集提取液；重复提取1次-4次，合并滤液，得到中药复合水提液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蝉拟青霉发酵培养基每100ml中含有以生药材量计为1g-2g的中药复合水提液、0.2g-0.6g的白术内酯及0.1g-0.3g的吐温80。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的发酵基础培养基:葡萄糖2g/100ml、酵母粉0.4g/100ml、蛋白胨0.3g/100ml、KH2PO40.1g/100ml和MgSO40.05g/100ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蝉拟青霉菌种的接入方法包括：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，接入灭菌后的液体种子培养基中培养，得到培养好的种子液，然后将培养好的种子液接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的蝉拟青霉菌种的接入方法包括：将在PDA斜面培养基中活化后的蝉拟青霉菌种，取5mm2-8mm2接入灭菌后的液体种子培养基中至100ml-200ml，20℃-30℃，100r/min-150r/min下摇床培养3天-5天，得到培养好的种子液，然后将培养好的种子液接入步骤(2)制得的蝉拟青霉发酵培养基中。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蝉拟青霉菌种的菌种接种量为5％-15％。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的液体发酵条件：在温度20℃-30℃，转速60r/min-150r/min条件下，摇床培养5天-7天。
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Effective date of registration: 20150625 Address after: 201199 Shanghai Xin Road No. 396 Building No. 3 310 Applicant after: Shanghai Baisuigu Health Management Consulting Co.,Ltd. Address before: 310023 Xihu District, Zhejiang Province, and the left road, No. 399, Applicant before: Zhejiang Academy of Forestry |
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