CN101880699B - 一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用微生物菌即淡紫拟青霉菌Paecilomyces lilacinus为发酵菌，以虾壳粉为原料，通过微生物发酵生产甲壳低聚糖的工艺。该工艺包括利用微生物菌即淡紫拟青霉菌Paecilomyces lilacinus的耗氧深层发酵，降解虾、蟹壳，并在发酵中后期通过再流加工艺，使发酵产物的含量得到一定程度的富集，发酵液经离心除菌，得到的上清液即为一定浓度的甲壳低聚糖产品，再经浓缩，即可进一步产生高浓度甲壳低聚糖。所得到的甲壳低聚糖可用于医药、农业、食品领域，整个生产工艺简便高效，具有广泛的工业化发展前景，为虾、蟹壳找到了一条绿色的应用途径。

Description

一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法

技术领域：

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法。

背景技术：

当前国内对甲壳素的利用，主要以壳聚糖为主，而甲壳低聚糖作为一种功能性低聚糖，在医药、食品等领域具有广泛的应用前景，其市场价格比壳聚糖高10倍左右。甲壳低聚糖在国内已有生产，大多是采用酸碱水解法，也有采用酶解法，但都是采用复合酶法，其成本昂贵、规模较小。国外也只有日本等少数几个国家有规模生产。近年对甲壳低聚糖的功能、性质研究的深入，其应用在国内外受到广泛的关注，市场前景广阔。

甲壳低聚糖生产的原料，来源于海产品加工厂的虾、蟹壳等废料。我国海域面积极其辽阔，海产品生产量很大，这些资源很好很充足，但却迄今仍未有效地被开发和利用，因而对环境造成潜在的威胁。所以合理开发利用这一资源，不仅具有经济学意义，还有很重要的生态学意义。

传统的制备甲壳低聚糖的方法是脱乙酰基化学法，由于生产过程耗费能源多、所需设备复杂、采用大量的酸碱用量，同时也污染环境。因此，人们开始寻找生物方法脱乙酰基，现在大都采用酶解法，由于至今没有单一、高效、专一性的酶，需要采用复合的酶解，成本较昂贵，而且在酶解过程没有科学、规范化、合适的酶反应***，离大规模工业化生产尚有一定距离。

发明内容：

针对传统的制备方法是脱乙酰基化学法，其生产过程耗费能源多、所需设备复杂、采用大量的酸碱用量，同时也污染环境等问题，以及现在采用的生物酶解法，该生产法缺乏廉价、高效、专一性酶和合理的反应***，使生产缺乏产业化能力的现状。本发明提供一种用微生物菌发酵生产甲壳低聚糖的方法，该方法利用一种用微生物菌即淡紫拟青霉菌Paecilomyces lilacinus耗氧深层发酵降解虾、蟹壳，并在发酵中后期通过再流加工艺，生产出较高浓度甲壳低聚糖，有效避免了传统甲壳低聚糖生产过程采用大量的酸碱用量，有效地提高了能源的利用率，同时又能实现廉价、低成本工业化生产甲壳低聚糖。

本发明的目的是这样实现的：

一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其以新鲜的虾壳或蟹壳为原料，经原料的制备、发酵原液配制、发酵原液灭菌、接种发酵、流加补料、离心去菌体、真空浓缩、喷雾干燥、产品精制，获得产品甲壳低聚糖。

将新鲜的虾壳或蟹壳晒干，粉碎成120目的干粉，然后以重量比2.5％的虾、蟹壳干粉与水混合均匀，再加入0.02％蛋白胨，制成发酵原液。把配制好的发酵原液泵入发酵罐，密闭罐体，加入蒸汽进行灭菌，使料温升至121℃，保温30分钟，然后逐渐冷却至28℃；往灭菌好的发酵液中接种入种子罐培养好的发酵菌，搅拌通风发酵，刚接种后通风量为1：0.05v/v.min，在发酵的过程，再根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量，并逐步提高发酵温度，在发酵过程定期测定还原糖含量，和甲壳低聚糖的生成量。其中本发明筛选的微生物菌即淡紫拟青霉菌，能分泌一定量的胞外甲壳素酶，在人为的发酵调控条件下，使其具有持续降解甲壳素的能力，使甲壳素被降解形成一定分子量(3000～4000)和浓度的甲壳低聚糖。在发酵过程中虾、蟹壳(甲壳素)一方面为该菌繁殖提供C/N营养，另一方面转化为发酵代谢产物(甲壳低聚糖)。在发酵的生产过程中，我们再通过人为控制发酵生产工艺和流加工艺的办法，流加补料为10％虾、蟹壳粉混合悬浮液，置于流加罐中，通入蒸汽升温至121℃，保温30分钟灭菌，冷却后备用，在发酵的中后期时，分三次逐步流加入发酵罐；使发酵产物的含量得到一定程度的富集。发酵结束时测含甲壳低聚糖含量，直接泵入离心机，在离心机5000rpm中，离心30分钟，获得上清液，把上清液泵入储罐中备用；发酵液经离心除菌，得到的上清液即为一定浓度的甲壳低聚糖产品。其次再经浓缩罐浓缩，把上清液泵入双效蒸发浓缩罐中，进行真空浓缩，浓缩至浓缩液甲壳低聚糖含量在10～15％时，泵入储罐备用，可使甲壳低聚糖的浓度进一步提高，最后再通过低温喷雾干燥的方法，将甲壳低聚糖浓缩液，采用喷雾干燥机，通过调节进料口温度为150℃，出料口温度70～75℃，进行喷雾干燥，制得甲壳低聚糖干燥粉产品，甲壳低聚糖收率可达96％以上，水溶性好。喷雾干燥的粉末中，还含有一定量的无机盐成分，因此甲壳低聚糖3000～4000分子量的含量纯度为93.6％。该产品作为农用、畜牧食用，纯度已完全可行，如需进一步提高含量产品精制，可通过2倍的食用乙醇进行纯化，即可获得99％含量甲壳低聚糖产品，完全水溶。

本发明具有本项目综合运用微生物发酵法技术生产甲壳低聚糖，有效避免了传统甲壳低聚糖生产过程采用大量的酸碱用量，有效地提高了能源的利用率，以及避免用酶法较高昂生产成本。可以较廉价地获取纯度较高的甲壳低聚糖产品，该产品可应用于医药、农业、食品等领域，技术达到国际先进水平。

附图说明：

图1为本发明一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法工艺流程图。

具体实施方式：

实施例1：

往灭菌好的发酵液中接种入种子罐培养好的发酵菌，搅拌通风发酵，刚接种后通风量为1：0.05v/v.min，在发酵的过程，再根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量，当二氧化碳含量每立方气体体积每增加5克当量时，通风量就增加0.05v/min，并逐步提高发酵温度，分四次提高温度，初温为28℃，10小时第一次提温为29℃，16小时左右第二次提温30℃，20小时左右第三次提温31℃，28至30小时左右第四次提温33.5℃。

实施例2：

菌种的制备：从冰箱中取出淡紫拟青霉菌种的保藏斜面，转接到生产斜面上，一般一根保藏斜面转接5根生产斜面，进行菌种活化，再把转接好的生产斜面放入28℃的培养箱中培养3天；当长满斜面后即可接种入一级三角瓶中28℃培养3天，三角瓶中的培养基为2.5％虾、蟹壳粉水悬浮液和0.02％蛋白胨制成培养基；经镜检如菌丝健壮即可接入二级三角瓶中28℃培养2天，二级三角瓶培养基与一级相同；经镜检如菌丝健壮即可接入种子罐中28℃培养36小时，接种量为5％V/V。

实施例3：

为进一步提高甲壳低聚糖的含量，可用喷雾干燥完的粉末甲壳低聚糖固体体积1.5倍量的食用乙醇进行溶解，使可溶于乙醇的无机盐和其他可溶性杂质溶于乙醇中因为甲壳低聚糖不容乙醇，搅拌20min，板框过滤，得到干物质，低温抽真空干燥，就可得到99％含量甲壳低聚糖。

实施例4：

菌种从多种土壤中分离获得多种淡紫拟青霉菌株，用平板分析甲壳降解能力好的菌株，此菌株为来源南靖亚热带原始森林土壤，分离获得的淡紫拟青霉菌株，再通过钴-60和紫外线交替诱变，获取能直接降解虾、蟹壳粉末，形成甲壳低聚糖(3000～4000分子量)产品的新淡紫拟青霉菌株，通过多次的接种三角瓶虾、蟹壳粉发酵和接种种子罐发酵，采用流量计、二氧化碳检测仪、温度计、酸度计、液相色谱仪等仪器的测定，得到一组发酵参数，根据发酵工程原理，确定出合适的发酵温度和发酵通风量。发酵条件即：初始温度28℃、一次提温至29℃、二次提温至30℃、三次提温至31℃、四次提温至33℃；发酵周期为60小时；发酵通风量为：初始风量1：0.05、二次风量1：0.1、三次风量1：0.15、四次风量1：0.2、五次风量1：0.25。最终获得一定含量的产品，基本满足工业化生产所需要的浓度，生产成本较低，产品纯度较高，水溶性好。

Claims (3)

1.一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征是以新鲜的虾壳或蟹壳为原料，经原料的制备、发酵原液配制、发酵原液灭菌、接种发酵、流加补料、离心去菌体、真空浓缩、喷雾干燥、产品精制，获得产品甲壳低聚糖；

(1)原料的制备：新鲜的虾壳或蟹壳晒干，粉碎成120目的干粉备用；

(2)发酵原液配制：以重量比2.5％的虾、蟹壳粉与水混合均匀，再加入0.02％蛋白胨，制成发酵原液，其中虾壳粉的量为1.5％，蟹壳粉的量为1％；

(3)发酵原液灭菌：把配制好的发酵原液泵入发酵罐，密闭罐体，加入蒸汽进行灭菌，使料温升至121℃，保温30分钟，然后逐渐冷却至28℃；

(4)接种发酵：往灭菌好的发酵原液中接种入5％种子罐培养好的发酵菌，所述的发酵菌为淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)；搅拌通风发酵，刚接种后通风量为1∶0.05v/v.min，在发酵的过程，再根据二氧化碳的产生量，逐步增加通风量，并逐步提高发酵温度，当二氧化碳含量每立方气体体积增加5克当量时，通风量就增加0.05V/min；分四次提高温度，初温为28℃，10小时第一次提温为29℃，16小时第二次提温为30℃，20小时第三次提温为31℃，28至30小时第四次提温33.5℃，在发酵过程定期测定还原糖含量，和甲壳低聚糖的生成量；

(5)流加补料：流加料为10％虾、蟹壳粉混合悬浮液，置于流加罐中，通入蒸汽升温至121℃，保温30分钟灭菌，冷却后备用，在发酵的中后期时，分三次逐步流加入发酵罐；

(6)离心去菌体：发酵结束时需测含甲壳低聚糖含量，直接泵入离心机，在5000rpm条件下，离心30分钟，获得上清液，把上清液泵入储罐中备用，抽样检测含甲壳低聚糖量；

(7)真空浓缩：把上清液泵入双效蒸发浓缩罐中，进行真空浓缩，浓缩至浓缩液甲壳低聚糖含量在10～15％时，泵入储罐备用；

(8)喷雾干燥：将甲壳低聚糖浓缩液，采用喷雾干燥机，通过调节进料口温度为150℃，出料口温度70～75℃，进行喷雾干燥，制得甲壳低聚糖干燥粉产品，甲壳低聚糖收率可达96％以上，水溶性好；

(9)产品精制：喷雾干燥的粉末用固体体积1.5倍量的食用乙醇进行溶解，搅拌20min，板框过滤，得到干物质，低温抽真空干燥，得到99％含量甲壳低聚糖。

2.如权利要求1所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征是所述10％虾、蟹壳粉混合悬浮液为6％的虾壳粉和4％的蟹壳粉与水混合成悬浮液。

3.如权利要求1所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征是种入种子罐培养好的发酵菌为培养成熟的淡紫拟青霉菌，菌种的制备为：斜面保藏菌种-活化生产斜面-一级三角瓶扩培-二级三角瓶扩培-种子培养为成熟菌种，接种量为5％发酵液量。