CN109082396B

CN109082396B - 一种dsf群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用

Info

Publication number: CN109082396B
Application number: CN201810997336.8A
Authority: CN
Inventors: 陈少华; 叶田; 林子秋; 范兴辉; 李绮婷; 罗青青; 张炼辉
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2018-08-29
Filing date: 2018-08-29
Publication date: 2020-08-07
Anticipated expiration: 2038-08-29
Also published as: CN109082396A

Abstract

本发明公开了一种DSF群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用。本发明研究发现贪铜菌（Cupriavidussp.）可以以DSF为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，并对较高浓度的DSF具有显著的降解效果；同时本发明还提供了一株高效降解DSF的贪铜菌菌株HN‑2，该菌株于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60432。贪铜菌HN‑2对植物病原菌中群体感应信号分子具有显著的降解活性，且环境友好，在依赖DSF及/或DSF信号分子类似物介导的致病的植物病原菌的防治中有巨大的应用潜力，同时本发明可以减少抗生素滥用问题和农药残留污染问题，减轻环境压力，为生物防治植物病害提供了新思路，具有巨大的应用价值及广阔的应用前景。

Description

一种DSF群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用

技术领域

本发明属于生物防治技术领域。更具体地，涉及一种DSF群体感应信号分子淬灭菌及其在植物病害防治中的应用。

背景技术

DSF（Diffusible Signal Factor）信号分子源自于革兰氏阴性病原菌，是一种不饱和脂肪酸类物质。DSF信号分子参与调控微生物的细胞生长、生物膜的形成和致病因子的产生等重要的生物功能。研究发现，DSF信号分子介导的群体感应***不仅广泛存在于黄单胞菌属（Xanthomonas）细菌中，而且在嗜麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）、苛养木杆菌（Xylellafastidiosa）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、伯克氏菌（Burkholderia）及许多海洋细菌中也有发现。此外，多种DSF信号类似物已被鉴定并报道，如顺-2-十二碳烯酸、（2Z，3Z）-11-甲基-2,5-二烯-12-烷酸、顺-11-甲基-2-十二碳烯酸、顺-2-葵烯酸、12-甲基-十四烷酸等，构成了DSF群体感应信号分子家族。

农作物病害往往会导致农作物大面积减产，病害严重时对于农产品的运输、贮藏以及加工更会带来巨大的损失。目前，在实际生产中防治农作物病害的常采用化学药物。然而使用大量的化学药物会导致环境污染、细菌耐药性增加等问题。除此之外，农产品上残留的化学药物也会危害到人体的健康。而群体感应信号降解作为一种生物防治新策略，为解决微生物的耐药性问题提供了新的思路。利用这一策略进行病害生物防治时，生防菌不会直接作用于致病菌，不会使致病菌产生抗药性，符合高效安全的要求。

因此，筛选能高效降解DSF群体感应信号分子的微生物并探究其对植物病害的生物防治效果，对丰富微生物资源，解决抗生素滥用问题以及防治DSF及/或DSF信号分子类似物介导致病的致病菌具有非常重要的现实意义。目前国内外均已经开展了野油菜黄单胞菌DSF家族群体感应信号分子淬灭机制的研究，但是关于DSF及/或DSF信号分子类似物降解微生物的研究仍鲜有报道，DSF降解菌则更为少见。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有植物病害生防技术的缺陷和不足，尤其是针对依赖DSF致病的致病菌的防治，提供一种新的高效的群体感应信号DSF分子淬灭菌，即贪铜菌。本发明研究发现，贪铜菌对群体感应信号分子DSF具有显著且快速的降解作用，且具有较好的抗生素耐药性，具有防治依赖DSF和/或DSF信号分子类似物介导的致病菌的巨大潜力，为解决农药或抗生素滥用及细菌耐药性增加问题提供新思路。

本发明的目的是提供一株可降解DSF信号分子的贪铜菌（Cupriavidussp.）菌株HN-2。

本发明另一目的是提供贪铜菌在降解群体感应信号分子DSF及其类似物和防治DSF介导致病的植物病害方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供一株可降解DSF信号分子的贪铜菌（Cupriavidussp.）菌株HN-2，该菌株于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60432，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

该菌株采集自广东省广州市华南农业大学试验田水稻根围土壤中。经人工筛选分离纯化获得，通过对该菌株的形态学特征、生理生化特性及16S rRNA***发育分析，将该菌株鉴定为贪铜菌（Cupriavidussp.）。

菌株HN-2为革兰氏阴性菌，菌落呈米黄色，圆形，扁平，表面光滑不透明，边缘整齐。

菌株HN-2在扫描电镜下呈杆状，有时近球形，成对或呈不同长度的链状。

该菌株的培养条件为，将其接种于培养基中，最适温度为30 ℃，最适pH为7.2，接种量为1～3 %，摇床转速为200 rpm。

所述菌株HN-2对利福平的抗性达到400 μg/mL或以上，对氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的抗性小于10 μg/mL。

经研究发现，该贪铜菌菌株HN-2对群体感应信号分子DSF具有显著且快速的降解作用，能够耐受浓度高达5 mM的DSF，并能够在24 h内将初始浓度为2 mM的群体感应DSF信号分子降解完全，在防治DSF介导的病原菌危害发明有巨大的应用潜力。

因此，贪铜菌在降解群体感应信号分子DSF和/或DSF信号类似物中的应用，或在制备降解DSF和/或DSF信号类似物中产品中的应用，均应在本发明的保护范围之内。

优选地，所述DSF信号类似物为包括顺-2-十二碳烯酸、（2Z，3Z）-11-甲基-2,5-二烯-12-烷酸、顺-11-甲基-2-十二碳烯酸、顺-2-葵烯酸、12-甲基-十四烷酸在内的DSF家族群体感应信号分子。

贪铜菌在防治DSF介导致病的植物病害中的应用，或在制备依赖DSF致病的致病菌的防治制剂方面的应用，也均应在本发明的保护范围之内。

优选地，上述任一项所述应用中，所述贪铜菌为贪铜菌菌株HN-2。

本发明还提供了一种防治依赖DSF致病的致病菌病害的方法，用贪铜菌的菌悬液对植物进行处理。

优选地，所述依赖DSF致病的致病菌包括但不局限于野油菜黄单胞菌野油菜致病变种（Xanthomonas campestris pv. campestris, Xcc）XC1所引起的植物黑腐病，还包括其他DSF及/或DSF信号类似物介导致病的病害。

优选地，所述贪铜菌的菌悬液为菌株HN-2的菌悬液。

另外，一种含有菌株HN-2和/或其菌悬液的可降解群体感应信号分子DSF的降解剂，以及一种含有菌株HN-2/或其菌悬液的依赖DSF致病的致病菌的生防制剂，及其相关应用，也都应在本发明保护范围内。

优选地，所述降解剂和生防制剂是由菌株HN-2经过发酵所得的菌悬液制备而成。

优选地，所述菌悬液的制备方法为：将菌株HN-2分别接种于LB固体培养基平板，30℃过夜培养，挑取单菌落，按照接种量1~3 %接种至LB液体培养基培养过夜，初始pH为7.2，摇床转速为200 rpm，将菌株HN-2菌液于4000 g离心10 min，弃上清，再用无菌水冲洗并重悬，得到菌悬液。

更优选地，在制备贪铜菌的菌悬液时所用的最适培养基为MM培养基，其配方包括4.5 g/L KH₂PO₄、2.0 g/L (NH₄)₂SO₄、0.005 g/L FeSO₄、10.5 g/L K₂HPO₄、0.2 g/L MgSO₄·7 H₂O、0.01 g/L CaCl₂、0.002 g/L MnCl₂。

另外，优选地，在上述应用中，控制体系的pH为7.0～7.5，温度为28～32℃，效果更佳。

更优选地，控制体系的pH为7.2，温度为30℃。

优选地，控制DSF在体系中的浓度≤5 mM。

本发明具有以下有益效果：

本发明研究发现，贪铜菌（Cupriavidussp.）对群体感应信号分子DSF有显著且快速的降解作用，具有防治依赖DSF致病的病原菌巨大潜力，对解决农药或抗生素滥用及耐药性问题具有现实意义。

本发明筛选得到了一株贪铜菌菌株HN-2，具有DSF高降解活性，在以DSF作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，贪铜菌HN-2能够耐受浓度高达5 mM的DSF，并在24 h内可以将2 mM的DSF降解完全。本发明的贪铜菌HN-2与黄单胞菌XC1共同接种相较于单独接种XC1时对白萝卜肉质根引发的黑腐病病害程度明显减轻，从而达到对白萝卜黑腐病防治的效果。

另外，该菌株分离自水稻根围土壤，对环境友好，且适应性较好。因此，本发明提供的贪铜菌HN-2具有对植物病原菌中群体感应信号分子较高的降解活性，且环境友好，在依赖DSF及/或DSF信号分子类似物介导的致病的植物病原菌的防治中有巨大的应用潜力，同时本发明可以减少抗生素滥用问题和农药残留污染问题，减轻环境压力，为生物防治植物病害提供了新思路。

附图说明

图1为本发明的菌株HN-2在营养琼脂培养基上的菌落形态图。

图2为本发明的菌株HN-2的扫描电镜图。

图3为本发明的菌株HN-2的***进化树分析图。

图4为本发明的菌株HN-2在不同抗生素中的生长情况图。

图5为本发明的菌株HN-2以DSF为唯一碳源时的生长曲线和降解曲线图。

图6为本发明的菌株HN-2单独接种及与野油菜黄单胞菌共同接种于白萝卜肉质根切片48 h后白萝卜肉质根切片的发病情况。

图7为本发明的菌株HN-2单独接种及与野油菜黄单胞菌共同接种于马铃薯切片48h后马铃薯切片的发病情况。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1 菌株HN-2的分离鉴定

1、菌株的分离、筛选

（1）土壤采集自广东省广州市华南农业大学实验田水稻根围的土壤，土壤呈黄褐色。

（2）菌株的分离纯化

配制MM培养基，分装至250 mL三角瓶中，每个瓶中分装50 mL的MM培养基，高压灭菌锅灭菌，待其冷却后在超净工作台内加入DSF母液，使培养基中DSF的最终浓度为50 μm/L，同时在培养基中加入土样5 g。在摇床中30 ℃，200 rpm条件下培养7天后，按10%的接种量转接到第二批DSF浓度为100 μm/L的MM培养基中。相同条件培养7天后，再按10%的接种量转接到DSF浓度为200 μm/L的MM培养基中，继续培养7天。以此类推，不断增加培养基中DSF的浓度。

之后采用稀释、平板涂布划线的方法进行菌株的分离纯化。取1 mL终MM培养基发酵液用无菌水将其稀释为浓度梯度为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8的发酵液，然后分别吸取100 μL各个浓度梯度的发酵液均匀涂布于LB固体平板上，30℃培养箱内培养。接着挑取平板中呈不同菌落形态的单菌落，在LB固体平板上反复划线培养纯化，直至分离出单菌落。将单菌落接种至LB液体培养基培养得到菌液，培养条件为30℃，200 rpm。将菌液与甘油以一定比例混合后，放入-80℃保存。

MM培养基配方为：KH₂PO₄，4.5 g/L；(NH₄)₂SO₄，2.0 g/L；FeSO₄，0.005 g/L；K₂HPO₄，10.5 g/L；MgSO₄·7 H₂O，0.2 g/L；CaCl₂，0.01 g/L；MnCl₂，0.002 g/L。

（3）菌株的筛选

利用以5 mM的DSF作为唯一碳源的MM基础培养基对从土样中分离得到的菌株进行筛选。将分离纯化后的菌株进行活化后，挑取单菌落接种至DSF浓度为5 mM的50 mL MM基础培养基中，在30 ℃、200 rpm的条件下培养48 h，进行DSF的提取并利用HPLC测定DSF残余量，降解率（%）=（1-A₁/A₀）×100%，A₁为菌株处理后DSF残留浓度，A₀为对照处理后的DSF残留浓度。

DSF的提取方法：每个样品取5 mL至15 mL离心管中，4000 g离心5 min，取上清液转移到50 mL分液漏斗中，向分液漏斗中加入5 mL乙酸乙酯，摇匀，剧烈震荡3 min，静置，分层，弃去下层溶液至15 mL离心管中，上层液经漏斗过滤到50 mL圆底烧瓶中，漏斗铺上滤纸并装有5 g无水硫酸钠。下层溶液按上述方法再萃取1次。滤液并入圆底烧瓶，50℃恒温浓缩蒸干，用色谱甲醇分3次洗涤圆底烧瓶，定容至2 mL，经0.45 μM有机滤膜过滤至进样瓶，使用HPLC法测定其残余量。HPLC测定DSF残余量条件：C₁₈反向色谱柱，流速为1 mL/min，柱温为35℃，流动相为甲醇：水=80：20（ν：ν），检测波长为210 nm，进样量20 μL。

筛选得到一株DSF降解率最高的菌株，命名为HN-2。

2、菌株的鉴定

（1）菌株HN-2的菌落形态特征

菌株HN-2菌落呈米黄色，圆形，扁平，表面光滑不透明，边缘整齐（图1）。在扫描电镜下菌体呈杆状，有时近球形，成对或呈不同长度的链状（图2）。

（2）菌株HN-2的16S rRNA鉴定

对菌株HN-2的16S rRNA基因进行克隆、测序，然后在GenBank中进行Blast比对。结果显示，与其序列相似性达到99%的均为贪铜菌（Cupriavidussp.），其***进化树如图3所示。

因此，菌株HN-2经形态学特征鉴定及16S rRNA分子鉴定为贪铜菌（Cupriavidussp.），并于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为：GDMCC NO：60432，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2 贪铜菌HN-2的抗生素敏感性分析

为了能够更好地研究实施例1获得的菌株HN-2的生防潜力，我们对该菌株抗生素敏感性进行了研究。

结果如图4所示，该菌株对利福平（RIF）的抗性达到400 μg/mL或以上，对氯霉素（CM）、四环素（TC）、庆大霉素（GEN）、氨苄青霉素（AMP）和卡那霉素（KAN）的抗性小于10 μg/mL。

结果显示，菌株HN-2对利福平表现出较高的耐药性，而对对氯霉素、四环素、庆大霉素、氨苄青霉素和卡那霉素的抗性较低，这一结果利于后续研究中选取合适的抗生素作为参考。

实施例3 贪铜菌HN-2生长和DSF降解关系曲线的测定

1、挑取菌株HN-2单菌落接种于LB培养基中预培养至对数期，所得菌液在4000 rpm的条件下离心5 min后，弃去上清液，菌体用0.9%的无菌生理盐水冲洗并重悬，作为种子悬液，再以1～3%的接种量接种至50 mL MM基础培养基中，并添加DSF母液，使其最终浓度为2mM，在30℃，200 rpm条件下培养，定时取样。采集不同时间点的样品，进行分光光度计测定OD₆₀₀值表示菌株HN-2的生长情况，HPLC测定DSF的残留量表示菌株HN-2对DSF的降解情况。

2、以DSF为唯一碳源时菌株HN-2的生长与DSF降解关系图如图5所示。如图所示，DSF的降解与菌株生长呈正相关，在DSF的存在下，菌株生长没有滞留期，在6～12h迅速进入生长对数期，此时DSF降解最快，菌株培养至24 h，DSF降解完全。对照中24 h内DSF的自然降解率不到20%。

结果表明，贪铜菌HN-2对DSF有显著且快速的降解作用，在防治DSF介导的致病菌危害方面有巨大的应用潜力。

实施例4 贪铜菌HN-2对白萝卜黑腐病的生防效果研究

1、本实施例以黄单胞菌XC1为例，研究贪铜菌HN-2对依赖DSF致病的致病菌对白萝卜黑腐病的生防效果。

将菌株HN-2与依赖DSF致病的致病菌黄单胞菌XC1，分别接种于LB固体培养基平板，30℃过夜培养。分别挑取单菌落，接种至LB液体培养基培养过夜，将菌株HN-2菌液与XC1菌液于4000 g离心10 min，弃上清，再用无菌水冲洗并重悬，得到菌悬液。

将菌株HN-2菌悬液与菌株XC1菌悬液混匀得到混合菌液。混合菌液、XC1、HN-2菌液均OD₆₀₀= 0.2，分别设置HN-2+无菌水、HN-2+XC1、无菌水、XC1+无菌水四组实验。将白萝卜肉质根用蒸馏水清洗干净，待外表干燥后进行切片。肉质根横切获取厚约0.2～0.3 cm的圆片，分别放入培养皿（内置已用无菌水浸润的棉花）中。每个实验组取菌液100 μL，滴在白萝卜肉质根切片上，用涂布棒将其涂抹涂匀。然后将已进行接种的白萝卜肉质根切片放入28℃恒温箱内培养。定期观察并记录发病情况。

2、菌株HN-2对白萝卜黑腐病的生防效果如图6所示。结果表明，菌株HN-2与野油菜黄单胞菌XC1共同接种较单独接种XC1时对白萝卜肉质根切片引起的黑腐病病害程度明显减轻。由实验结果可知，菌株HN-2对野油菜黄单胞菌XC1引起的白萝卜黑腐病具有非常明显的生防效果。

实施例5 贪铜菌HN-2对马铃薯黑腐病的生防效果研究

1、本实施例以黄单胞菌XC1为例，研究贪铜菌HN-2对依赖DSF致病的致病菌对马铃薯黑腐病的生防效果。

将菌株HN-2与依赖DSF致病的致病菌黄单胞菌XC1分别划线于LB固体培养基平板，30℃过夜培养。分别挑取单菌落，接种至LB液体培养基培养过夜，将菌株HN-2菌液与XC1菌液于4000 g离心10 min，弃上清，再用无菌水冲洗并重悬，得到菌悬液。

菌株HN-2的悬浮液与菌株XC1的悬浮液混合均匀得到混合菌液。所得菌液最终浓度均为OD₆₀₀=2。将常用于防治黑腐病的化学农药农用链霉素做为阳性对照，实验时将72%农用链霉素可溶性粉剂用无菌水溶解稀释3000倍使用。分别设置无菌水、HN-2+无菌水、HN-2+XC1、XC1+无菌水、XC-1+农用链霉素五组实验。将马铃薯块茎用蒸馏水清洗干净后进行切片处理。马铃薯块茎横切获取厚约0.2～0.3 cm的马铃薯块茎切片，用蒸馏水轻轻搓洗三遍，以去除块茎中含有的淀粉，整齐放入垫有滤纸的白瓷盘中，待表面干燥后进行下一步实验。用移液枪取100 μL菌悬液，滴在每个薄片上，用涂布棒将其涂抹涂匀。随后将放有马铃薯的白瓷盘放入28℃恒温箱中培养。定期段进行观察并记录下发病情况。

2、菌株HN-2对马铃薯黑腐病的生防效果如图7所示。如图所示，无菌水和HN-2+无菌水实验组中，马铃薯均未发病，说明无菌水和菌株HN-2对马铃薯无致病性。XC1+无菌水实验组的马铃薯腐烂，严重处为青黑色，但无恶臭味，仅有一股干菜味，与软腐病区分；XC-1+农用链霉素实验组马铃薯不发病，HN-2+XC1实验组马铃薯仅为轻微发病。结果表明，生防菌HN-2对黑腐病具有明显的防治效果且与农用链霉素防治效果相近。

综上结果表明，贪铜菌HN-2能利用DSF作为唯一碳源、氮源和能源进行生长繁殖，并能够耐受浓度高达5 mM的DSF，并在24 h内可以将2 mM的DSF降解完全，对高浓度的DSF具有稳定且高效的降解活性。将贪铜菌HN-2与野油菜黄单胞菌XC1共同接种于白萝卜或马铃薯时，较单独接种XC1时对白萝卜或马铃薯引起的黑腐病病害程度明显减轻，说明该菌株可应用于依赖DSF及/或DSF信号分子类似物致病的致病菌生物防治中，可以减少化学农药的使用，减轻环境压力，具有广阔的应用前景和发展潜力。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株可降解DSF群体感应信号分子的贪铜菌(Cupriavidus sp.)菌株HN-2，其特征在于，该菌株于2018年8月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO：60432。

2.权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2在降解群体感应信号分子DSF中的应用。

3.权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2在制备降解DSF的产品中的应用。

4.权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2在防治DSF介导致病的植物病害中的应用。

5.权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2在制备依赖DSF致病的致病菌的防治剂方面的应用。

6.一种防治依赖DSF致病的致病菌病害的方法，其特征在于，用权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2和/或权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2的菌悬液处理植物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，制备权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2的菌悬液的培养基为MM培养基，其配方包括4.5g/L KH₂PO₄、2.0g/L(NH₄)₂SO₄、0.005g/LFeSO₄、10.5g/L K₂HPO₄、0.2g/L MgSO₄·7H₂O、0.01g/L CaCl₂和0.002g/L MnCl₂。

8.一种可降解群体感应信号分子DSF的降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2和/或其菌悬液。

9.一种依赖于DSF致病的致病菌的生防菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的贪铜菌菌株HN-2和/或其菌悬液。