CN111690572B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用和制剂 - Google Patents
一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用和制剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用和制剂,其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M2020218。该菌株能有效抑制病原菌F.tricinctum孢子的萌发,所述的贝莱斯芽孢杆菌、发酵液和/或代谢产物在防治黄芪根腐病和促进生长中具有显著效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物菌剂技术领域,尤其涉及的是一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治黄芪根腐病和促进生长中的应用和制剂。
背景技术
黄芪是我国传统大宗药材之一,随着市场需求量的增加,黄芪栽培过程中的轮作周期变短,加上全球气候变暖,使得黄芪发生根腐病的频率大幅度增加,严重的影响了 黄芪的产量和品质(高芬等,2018;邢占民等,2015)。因此,如何经济、高效的防治 黄芪根腐病的发生引起了许多学者的关注。农药防治黄芪根腐病会破坏土壤生态平衡、 易造成二次污染及造成药材农药残留等。由于很多微生物对宿主植物具有促生或抑病的 特性,且不易对动植物、人类和生态环境造成有害影响,因此人们将其视为控制土传病 害的理想方法。
生物防治指利用对病原菌有拮抗作用的微生物来控制植物体内病原菌的一种防治 策略,因其绿色环保、经济节约、防治效果较好等特点而成为国内外的研究焦点(Reddaet al.,2018;Karimi et al.,2016)。据报道,假单胞菌属、链霉菌属、芽孢杆菌属、肠杆菌属、泛菌属、伯克氏菌属等属的细菌在病原体抑制中起到了重要作用。拮抗菌主要通过 以下5种方式降低植物病害的发生:(1)与病原菌竞争生态位或营养物质;(2)分泌可 溶解病原真菌菌丝的次生代谢产物;(3)产生抗菌蛋白等抗菌物质;(4)诱导植物产生 的***性抗性;(5)刺激植物产生激素类物质。因而筛选出环境适应性强、防病性能优 异的拮抗微生物并研究它们对黄芪根腐病的防控作用,对减少化学农药使用、提高黄芪 产量和质量方面具有重大意义。
发明内容
本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌CCNWDCBXLAMB-359,能够明显抑制Fusariumtricinctum孢子萌发和菌丝生长;由该菌制备的固体生防微生物菌剂,能够大幅度的降 低黄芪根腐病的发生。
本发明的技术方案如下:
一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),其在中国典型培养物保藏中心的保藏 编号为CCTCC No:M2020218。
所述的贝莱斯芽孢杆菌的发酵液和/或代谢产物。
所述的贝莱斯芽孢杆菌、发酵液和/或代谢产物在在防治黄芪根腐病和促进生长中的 应用。
所述的黄芪根腐病的病原菌为Fusarium tricinctum。
所述的贝莱斯芽孢杆菌、发酵液和/或代谢产物在促进黄芪生长中的应用。
包含所述的贝莱斯芽孢杆菌、发酵液和/或代谢产物的制剂。
本发明具有以下有益效果:
(1)本发明中所用菌株CCNWDCBXLAMB-359是从发生根腐病黄芪根际分离得 到,经过了黄芪的选择作用,能在稳定的在黄芪根部定殖。
(2)本发明中所用的菌株CCNWDCBXLAMB-359能有效抑制病原菌F.tricinctum 孢子的萌发。
(3)本发明的CCNWDCBXLAMB-359微生物菌剂可直接撒施于土壤,使用方便。
(4)本发明的CCNWDCBXLAMB-359微生物菌剂能有效防止F.tricinctum入侵 黄芪根部。
(5)本发明的CCNWDCBXLAMB-359微生物菌剂能减少化学农药的使用。
附图说明
图1为菌株CCNWDCBXLAMB-359平板对峙试验;
图2为拮抗菌对病原菌孢子萌发的抑制;a:无菌水处理对照b:拮抗菌处理c:不同处理下病原菌孢子萌发率;
图3为菌株CCNWDCBXLAMB-359的***发育树;
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明进行详细说明。
(1)土壤样品采集:
2018年8月从甘肃省宕昌县黄芪种植基地地采集根样品,落掉黄芪根上松动的土,并 将完整的植株放置于无菌自封袋,将所有样本用冰袋冻存送回实验室。采样地点年平均降雨量为530mm,海拔2300m。
(2)黄芪内生菌分离:
用无菌剪刀将黄芪的根剪成适当长度的小段,用软刷清洗根表面的泥土,无菌水彻 底冲洗,用吸水纸吸干根表水分。用75%乙醇将根浸泡2min,无菌水冲洗干净残留的 乙醇,接着在1%次氯酸钠中浸泡1min,用大量无菌水去除表面残留的消毒剂。将经 消毒得到的黄芪根放入无菌研钵中充分研磨(可加入少量无菌水便于研磨),制得根匀浆 液。用移液枪吸取1mL根匀浆液,将其转移到含9mL无菌水的离心管中,充分混匀 后即得到了稀释度为10-1的根悬液,按这种方法依次将黄芪根匀浆液梯度稀释至10-7。于 超净工作台中用的移液枪分别吸取稀释度为10-5、10-6、10-7的根悬液各100μL于TSA固 体培养基上,用无菌刮铲将根悬液均匀地涂开,将平板倒置放入28℃培养箱中培养3天。 选择平板上形态、颜色、大小有差异的单菌落,用无菌竹签挑取该单菌落划线于新的TSA 平板上进行纯化,重复此步骤,直到分离出纯菌株CCNWDCBXLAMB-359。
(3)拮抗菌的筛选:
取上述分离的黄芪内生菌株CCNWDCBXLAMB-359,分别接种到TSB液体培养基中 活化。同时取根腐病病原真菌Fusarium tricinctum平板,用直径5mm的打孔器取菌饼接 种在新的PDA平板中央,过菌饼的圆心在平板背面画一条直线,在该直线上取距圆心 2.5cm的两个对称点,在这两处点接同种黄芪内生菌,以接无菌水的作为空白对照,将 所有平板倒置,放回28℃恒温培养箱培养。7天后观察每个位置接种的黄芪内生菌与病 原真菌间是否有抑菌圈的出现,用直尺分别测量点接了内生菌和对照组中的病原菌菌落 半径。最后依据牛世全等人(2016)提供的方法计算拮抗菌抑菌率:
PDA平板上,通过平板对峙实验发现菌株CCNWDCBXLAMB-359对病原真菌的具有 较强的抑制作用,其对Fusarium tricinctum菌丝生长的抑制率可达36.84%。
表1菌株CCNWDCBXLAMB-359抑菌率
拮抗菌株编号 | 病原菌直径/mm | 抑菌率(%) |
J1 | 30 | 36.84 |
CK | 47.5 | 0 |
(4)菌株CCNWDCBXLAMB-359对病原菌孢子萌发的抑制:
将菌株CCNWDCBXLAMB-359在TSB液体培养基中进行活化,取1ml活化好的菌液 到装有50ml TSB的三角瓶中,28℃振荡培养至对数期,用无菌水调节菌悬液浓度为108 CFU/ml。将等体积的CCNWDCBXLAMB-359菌悬液和病原菌孢子悬液(浓度106个/ml) 混合均匀,放置于25黑暗条件下10小时,显微镜下观察孢子发芽情况,计算 CCNWDCBXLAMB-359对病原菌孢子发芽的抑制率。
真菌孢子萌发试验结果表明,菌株Bacillus velezensis CCNWDCBXLAMB-359能明显抑制Fusarium tricinctum孢子的萌发,CCNWDCBXLAMB-359处理后的孢子萌发率 为21.3%,比对照降低了77.3%,对孢子萌发的抑制率可达78.4%,并且在菌株CCNWDCBXLAMB-359处理下,萌发的病原菌孢子芽管较短。
(5)植物抑病试验
取菌株CCNWDCBXLAMB-359,将其接种到TSB液体培养基内,培养至菌液浑浊 后,离心沉淀菌体。沉淀经无菌水洗涤后,用无菌水溶解并调节浓度OD600=0.8,同时 用无菌水设置一个空白对照。分别用无菌注射器将CCNWDCBXLAMB-359菌液及无菌 水接种至灭过菌的黄芪基质袋中,每袋接种10mL,每个处理十个重复。将基质袋封口 后置于温室内适应一周。一周后将出芽的黄芪种子种入基质袋中,每袋种植10颗,封 口后放入温室中继续培育。黄芪长出第一片真叶后,拔除大小不一的苗子,每袋仅留长 势一致的5株黄芪,将上述CCNWDCBXLAMB-359菌液与无菌水分别补加到对应的基 质袋中进行第二次接种,每袋同样加10mL,继续封口培育。五天后向所有处理中等量 添加病原菌孢子悬液(浓度105CFU/mL,剂量10mL),自接病原菌起,每日观察黄芪的 生长状况,记录各个处理下黄芪的发病情况。
CCNWDCBXLAMB-359起到了延迟发病的作用,接种Fusarium tricinctum后的第5天,对照组开始出现发病症状,而接种CCNWDCBXLAMB-359的处理组未表现出发病 症状。CCNWDCBXLAMB-359能明显降低黄芪根腐病的发病率,在第19天收样时,接 种CCNWDCBXLAMB-359使根腐病发病率降低了34.32%。同时 CCNWDCBXLAMB-359使发生根腐病的黄芪致死率降低了59.06%。
表2菌株CCNWDCBXLAMB-359对黄芪发病率和致死率的影响
(6)植物促生试验
将筛选出具有防病效果的菌株CCNWDCBXLAMB-359孵育在已灭菌的基质中,以 不接菌的作为对照组CK,种植黄芪种子。在第18天收样后,对每个处理的幼苗进行生 理特征变化测定,测量各组黄芪植株的根长、株高、干重和叶绿素含量。由表3可知, 与对照组相比,加入了拮抗菌CCNWDCBXLAMB-359的根长、株高、鲜重、干重和叶 绿素含量分别增加了32.47%、11.98%、8.02%、5.38%和14.00%。
表3接菌处理对土壤养分的影响
(7)菌株CCNWDCBXLAMB-359鉴定
形态特征:菌株CCNWDCBXLAMB-359在TY培养基上的单菌落呈现乳白色,表 面粗糙,不透明,边缘不规则产生芽孢。对其进行革兰氏染色后,在油镜下观察其生长 形态,CCNWDCBXLAMB-359革兰氏染色呈阳性,形状短杆状。在TY培养基上28℃ 培养24小时,其菌体大小约为(3.46±0.71)×(0.84±0.10)μm。
生理生化特征:参照细菌鉴定手册对菌株CCNWDCBXLAMB-359的VP反应、碳 源利用、吲哚试验等生理生化特性进行测定,其结果显示该菌株能以甘露糖和可溶性淀 粉作为碳源生长,吲哚试验呈阳性,VP反应和甲基红试验呈阴性,能产生淀粉酶。
16S rDNA测序:采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株CCNWDCBXLAMB-359的 基因组DNA,用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R (5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16S rDNA,经电泳检测后送公司测序,序列在NCBI 数据库中进行比对,菌株CCNWDCBXLAMB-359在分类上归属于贝莱斯芽孢杆菌,与 Bacillus velezensis CR-502相似度为99.85%,菌株CCNWDCBXLAMB-359的***发育 树如图3所示。
CCNWDCBXLAMB-359菌株的16S rDNA序列
TAGTGCTACAATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCT AATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTA GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAT GAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGG CACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG TAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTG ATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAA GAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG CGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGA TTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCT TAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCA AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAA GAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAG AGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAA CGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGA CAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACAC GTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCT GTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGG ATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAG TTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTAGGAGCCAGCCGCCGATAGA
将贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)CCNWDCBXLAMB-359于2020年6月18日保 藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),保藏编号为CCTCC No:M2020218。保藏 地址为中国.武汉.武汉大学。
应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用和制剂
<130> 111
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
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<211> 1435
<212> DNA
<213> CCNWDCBXLAMB-359菌株的16S rDNA序列()
<400> 3
tagtgctaca atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg 60
acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg 120
gctaataccg gatggttgtc tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac 180
cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg 240
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 300
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 360
gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg 420
ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 480
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg 540
ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt 600
ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 660
gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 720
gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 780
gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca 840
ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 900
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 960
tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 1020
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 1080
gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1140
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1200
aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct 1260
cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg gaatcgctag taatcgcgga 1320
tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag 1380
agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa cctttaggag ccagccgccg ataga 1435
Claims (6)
1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis),其在中国典型培养物保藏中心的保藏编号为CCTCC No:M2020218。
2.一种如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的发酵液。
3.一种如权利要求1的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述发酵液在防治黄芪根腐病和促进生长中的应用。
4.如权利要求3所述的应用,黄芪根腐病的病原菌为Fusarium tricinctum。
5.一种如权利要求1的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述发酵液在促进黄芪生长中的应用。
6.一种包含权利要求1的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述发酵液的制剂。
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- 2020-07-15 CN CN202010682524.9A patent/CN111690572B/zh active Active
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