CN102876613A - 一种以dsf为底物的降解菌的筛选方法 - Google Patents

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胡白石
田艳丽
赵玉强
刘凤权
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Nanjing Agricultural University
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Nanjing Agricultural University
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Abstract

本发明涉及筛选降解可扩散性信号分子(DSF)为底物的降解菌的筛选方法，属于生物技术领域。本筛选方法是根据BIOLOG细菌鉴定***原理自行设计的，以DSF(diffusible signalfactor)作为待测碳源，若细菌能够利用该碳源就能发生氧化还原反应，有电子转移，通过四唑紫由无色变为紫色，进而筛选能够降解DSF的阳性菌株。图为利用本方法对不同生境细菌的降解DSF的筛选结果。

Description

一种以DSF为底物的降解菌的筛选方法
(一)技术领域
本发明涉及筛选降解可扩散性信号分子(DSF)为底物的降解菌的筛选方法，属于生物技术领域。
(二)背景技术
黄单胞菌(Xanthomonas spp.)是分布最广泛的与植物相关的细菌性病原物之一。研究表明，这个属的成员可以侵染124种单子叶植物和268种双子叶植物(Leyns et al.，1984)。其中最具有经济意义的几个种，如野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)是绝对优势种，它至少有141个致病变种，能侵染许多植物，包括重要的农作物，如甘蓝、花椰菜、椰菜、番茄、胡椒、棉花、大豆和胡桃等(Hayward，1993)；稻黄单胞(Xanthomonas oryzae)包含2个致病变种，侵染水稻引起严重损失；地毯草黄单胞柑橘致病变种是危害柑橘最为严重的病原细菌。针对植物细菌病害，目前生产上尚无十分有效的控制措施。种子处理虽然能有效地阻止病害通过种子传播，但对老病区而言，控病效果并不理想；目前仍没有十分有效地化学药剂；因此，一旦细菌病害大面积发生和流行。短时间内难以拿出有效的防控措施。
日益增加的证据表明：细菌不是一个孤立的有机体，而是利用一些小的化学信号分子进行积极的信息交流。群体感应(Quorum Sensing，QS)就是细胞间信息交流机制之一，细菌通过QS机制来监测其分泌到环境中的信号分子的积累情况，从而做出应答，计算它的群体数量(Whitehead et al.，2001；Fuqua and Greenberg，2002)。与其他细菌相似，黄单胞也进化出了再群体水平上进行遗传调节的QS***。早期的转座子诱变分析揭示了一个野油菜黄单胞菌的基因簇，并定义为rpfABCDEFG，该基因簇调节致病因子，包括EPS和胞外酶的产生(Tanget al.，1991)。此后，将rpfF突变株靠近野生型菌株联合培养，发现rpfF突变体蛋白酶的产生量恢复到野生型水平，这个结果表明，野油菜黄单胞野生型菌株能够产生一种可扩散的信号因子(Diffusible singal factor，DSF)(Barber et al.，1997)。目前已经确定DSF是一种短链脂肪酸，其结构为顺式-11-甲基-2-十二碳烯酸(Wang et al.，2004)。DSF代表了细菌中一个新的QS信号分子家族。近年来，已经从多种黄单胞菌包括木质部小菌属中检测到DSF活性，并明确其对致病性的显著调控作用(Newman et al.，2004)。
近期的研究表明，黄单胞产生的QS信号分子DSF能够被多种细菌降解，这些细菌包括Bacillus，Paenibacillus，Microbacterium，Staphylococcus和Pseudomonas等属。基于细菌QS***的特殊功能，科学家研究的焦点集中在抑制细菌群体感应***上。通过抑制QS信号分子的产生、降解QS信号分子，阻断QS***的级联反应等多种途径来减弱细菌的致病性。
主要参考文献
Barber C.E.，Tang J.L.，Feng J.X.，et al.1997.a novel regulatory system required for pathogenicity ofXanthomonas campestris is mediated by a small diffusible signal molecule.Mol Microbiol24：556-566.
Fuqua C&Greenberg EP(2002)Listening in on bacteria：acylhomoserine lactone signaling.Nat RevMol Biol3：685-695
Leyns et al.1984.The host range of the genus Xanthomonas.Bot Rev50：308-355Newman et al.2008.virulence of planthogenic bacteria attenuated by degration of fatty acidcell-to-cell signaling factors.Mol Plant Microbe Interact 21：326-334.
(三)发明内容
技术问题
本发明的目的是发明一种利用四唑紫为指示标记的能够快速、灵敏、准确的以DSF为底物的降解菌的筛选方法。
技术方案
“碳源---四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法的建立
本筛选方法是根据BIOLOG细菌鉴定***原理自行设计的。四唑紫(tetrazolium violet)是一种氧化还原指示剂，能够竞争氧化还原反应中的电子，获得电子后，四唑紫由无色变为紫色，获得的电子越多，紫色越深。本研究以DSF(diffusible signal factor)作为待测碳源，若细菌能够利用该碳源就能发生氧化还原反应，有电子转移，通过四唑紫由无色变为紫色，进而筛选能够降解DSF的阳性菌株。
试验材料
四唑紫(tetrazolium violet)购自SIGMA公司(69H1223)，DSF标准品购自Cayman公司(10008123)，96孔细胞培养板购自BOYANG公司，菌株G来自Karyn L. Newman，已报道能够降解DSF。
试验方法
接种液的配制
1)将菌株G于NA培养基上28℃培养24h后，取无菌棉签在接种液(0.4％NaCl水溶液)中蘸湿。
2)将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体，注意不要带出培养基。
3)在接种液管液面上沿内壁转动棉签，使菌体附着在内壁上，同时将菌体均匀打散。
4)倾斜接种液管，用棉签将菌体分散于接种液中。
5)调整OD600＝0.6。
筛选液的配制
DSF(diffusible signal factor)是一种短链脂肪酸，在水中的溶解度为0.5mg/mL(25℃)，因此，将DSF依次配制成浓度为0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/mL的水溶液，分别取100μL加入96孔细胞培养板内，并以无菌水作为阴性对照。每孔加入50μL的四唑紫(0.1mg/mL，H2O)以及150μL的接种液，置于28℃培养12-16h后观察颜色变化。
(四)说明书附图
图1.“碳源---四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法的灵敏度检测结果。
图2.“碳源---四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法的特异性检测结果。
1-10：已报道的不能够降解DSF的菌株，11：G菌，12：无菌水。
图3.利用“碳源---四唑紫-96孔细胞培养板”筛选方法对实际样品的检测结果。
1-94：分离的待测菌株；95：G菌，96：无菌水。
(五)具体实施方式
对不同生境细菌的筛选
取样地点
1)从发生水稻白叶枯病的稻田取土样及发病的水稻植株；
2)从加油站油料污染的土壤取土样；
3)从池塘水取水样；
4)从阴沟附近取土样；
5)从饭店抽油烟机外排管正对的油污地面取土样。
6)将待测菌株于NA培养基上28℃培养24h后，取无菌棉签在接种液(0.4％NaCl水溶液)中蘸湿。
7)将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体，注意不要带出培养基。
8)在接种液管液面上沿内壁转动棉签，使菌体附着在内壁上，同时将菌体均匀打散。9)倾斜接种液管，用棉签将菌体分散于接种液中。
10)调整OD600＝0.6。
筛选液的配制
DSF(diffusible signal factor)是一种短链脂肪酸，在水中的溶解度为0.5mg/mL(25℃)，因此，将DSF配制成浓度为0.5mg/mL的水溶液，分别取100μL加入96孔细胞培养板内，并以无菌水作为阴性对照。每孔加入50μL的四唑紫(0.1mg/mL，H2O)以及150μL的接种液，置于28℃培养12-16h后观察颜色变化。
筛选结果
目前为止，从不同生境获得5000余株细菌中，共筛选出57株具有降解DSF的阳性菌株，经16SrRNA测序鉴定分别属于Bacillus、Paenibacillus、Microbacterium、Staphylococcus、Pseudomonas属。

Claims (2)

1.用于筛选可扩散的信号因子即DSF降解菌的方法，其筛选方法主要利用的是四唑紫的颜色变化，若细菌能够利用DSF为碳源就能发生氧化还原反应，有电子转移，通过四唑紫由无色变为紫色，进而筛选能够降解DSF的阳性菌株。
2.权利要求1的筛选方法，其步骤为：
(1)将待测菌株于NA培养基上28℃培养24h后，取无菌棉签在接种液即0.4％NaCl水溶液中蘸湿；(2)将棉签在菌落表面滚动，粘取菌体，转移于接种液中，调整OD600＝0.6；(3)取100μL 0.5mg/mL的DSF水溶液，加入96孔细胞培养板内，每孔加入50μL的0.1mg/mL四唑紫水溶液，加入150μL的接种液，置于28℃培养12-16h后观察颜色变化。
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PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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