CN112080435A - 一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用 - Google Patents

一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用，该菌株是从云南省昆明市土壤中分离获得。该菌株为GZAC18‑2JMP，于2020年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.20249。经研究表明，该淡紫紫孢菌为中温菌，能降解鸡毛，其降解鸡毛的最佳培养方法是将该菌GZAC18‑2JMP菌株接种到加有鸡毛的基础发酵液中，在25℃下先静置48小时，然后再110rpm/min振荡培养96小时，发酵液中鸡毛成碎末状，可溶性蛋白为175.7μg/mL，鸡毛滤渣干重为0.36g，鸡毛降解率为64％。该菌株及其降解鸡毛培养方法可用于鸡毛的生物降解。

Description

一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用
技术领域
本发明属于生物降解领域，具体涉及一株淡紫紫孢菌及其在降解鸡毛中的应用。
背景技术
鸡毛是一种纤维性与难溶型的结构蛋白，富含角蛋白，是自然界中仅次于纤维素和几丁质的第三大丰富聚合物。当鸡毛等角蛋白废弃物自然堆积时，降解非常缓慢，易造成大量堆积，与此同时，因其自身富含的蛋白及附着的粪便、血液等含氮磷物质也易成为其它致病菌的营养源，从而引发对生态环境的二次污染及对人类健康的危害。对于角蛋白废弃物通常会采用填埋、焚烧等方式进行处理，但焚烧会对环境和人体健康带来安全隐患，所以运用绿色健康的方法来降解角蛋白尤为重要。且降解后的鸡毛是丰富的蛋白质或氨基酸来源，可用于生产饲料或包覆膜材料以及生物医学材料等。利用微生物降解鸡毛是一种温和、高效、绿色的方法，具有广阔的发展潜力和极高的实用价值。常用的微生物降解鸡毛主要是细菌、酵母及丝状真菌。在中国专利申请件中，涉及微生物角蛋白降解有6项发明专利，其降解菌株均为细菌，即：角蛋白降解菌NJY1(CN200810155958.2)为苏云金芽孢杆菌，一种羽毛角蛋白降解菌的固定化方法(CN200810039457.8)为解菌嗜麦芽寡养单胞菌，高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法(CN201010574642.4)为地衣芽孢杆菌，利用微生物菌株18D-TA厌氧降解羽毛角蛋白的方法(CN201110245892.8)和羽毛角蛋白厌氧降解菌株18D-TA(CN201110245892.8)为一种厌氧细菌和一种角蛋白降解菌NJK4(CN201310577095.9)为短小芽孢杆菌。真菌对鸡毛的降解未见有中国发明专利。而相比细菌和酵母菌，丝状真菌在鸡毛降解中具有诸多优势，如能产生丰富的降解酶系、高活性的角蛋白酶、更丰富和彻底的降解产物以及适宜温度下降解效率高。目前报道降解鸡毛的丝状真菌主要有拟青霉属、金孢属和毁丝霉属等真菌。紫孢霉属真菌主要应用于线虫的生物防治方面，在降解鸡毛方面尚未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一株能降解鸡毛的新的菌株及降解方法。
本发明的技术方案为：一株淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)GZAC18-2JMP，菌株保藏编号：CGMCC No.20249，2020年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)GZAC18-2JMP在降解鸡毛中的应用。
具体地，将淡紫紫孢菌接种到鸡毛降解发酵液中，在25℃下先静置48小时，然后再振荡培养96小时。
进一步地，所述鸡毛降解发酵液的组成为：鸡毛10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠1.2g/L、硫酸锌0.05g/L、氯化钙0.2/L g，pH7.0。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明经分离从土壤中得到了一株淡紫紫孢菌GZAC18-2JMP，为中国本土菌株，并非从国外引进，能适应本地自然环境。经实验表明，该淡紫紫孢菌具有非常出色的鸡毛降解能力，可用于鸡毛的生物降解，在微生物肥料、氨基酸饲料生产和生态环境保护中具有潜在应用价值。
保藏信息：
淡紫紫孢菌(Purpureocilliumlilacinum)GZAC18-2JMP，菌株保藏编号：CGMCCNo.20249，2020年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为淡紫紫孢菌GZAC18-2JMP在PDA培养基上的菌落形态与产孢结构；
图2为基于ITS rDNA序列构建的淡紫紫孢菌与相关菌株的***发育树；
图3为淡紫紫孢菌GZAC18-2JMP在脱脂奶粉培养基上产生的蛋白酶透明圈；
图4为淡紫紫孢菌GZAC18-2JMP在本研究培养方法发酵前后发酵液对比图；
图5为绘制的蛋白质标准曲线；
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述。
实施例1样品采集及菌株的分离描述
1.实验材料与方法
1.1土样的采集：采自云南省昆明市花坛土，采集深度为3-5cm，收集的土样装入无菌塑封袋中带回实验室备用。
1.2试验用培养基
马丁氏PDA培养基：称取削皮洗净的马铃薯200克，切块，水煮沸30min后过滤，收集滤液，加入葡萄糖20g，20g琼脂粉，充分搅拌均匀后，121℃高压灭菌30min后，冷却至40℃左右，加入1％的灭菌孟加拉红水溶液3mL，1％青霉素液3mL和1％链霉素液3mL。
1.3菌株的富集与分离：将土壤样品与10g鸡毛粉混合置于培养皿中，保湿25℃恒温培养1个月，待观察到鸡毛上长有菌丝，在超净工作台中，将菌丝挑出至另一干净培养皿中纯化，培养5d，待单菌落长出后转移至新的PDA试管斜面培养基上保存，获得纯化菌株GZAC18-2JMP，保存备用。
1.4菌株的DNA提取和PCR扩增
刮取培养至产孢后的GZAC18-2JMP菌株培养物放入灭菌的研钵中，加入能覆盖住培养物后的液氮对培养物进行研磨，至细小粉末后，放入1.5mL离心管中，按照真菌DNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)的操作流程进行DNA提取。提取完的真菌DNA存放于-20℃冰箱中保存备用。对真菌ITS-5.8S rDNA区域进行扩增，所用引物为ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3’和ITS5:5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’(由昆明硕擎生物技术有限公司合成)。PCR扩增反应体系为25μL体系：DNA模板2μL，mix21μL，引物ITS5和ITS4各为1μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。将检测合格的PCR产物送于昆明硕擎生物技术有限公司进行测序。
2实验结果
纯化GZAC18-2JMP菌株接种至PDA培养基25℃培养14天后(3个重复)，对菌落形态进行描述，制片后对显微形态进行测量和描述，具体如下：
GZAC18-2JMP菌株的形态学描述：如图1所示，在PDA培养基上，培养14d，25℃，菌落直径60-65mm，平展，稀疏绒毛状，紫灰色，表面具肉色细颗粒，有3个轮层，并有辐射状纹；背面白色。菌丝宽0.5-2μm，分隔，透明，光滑。分生孢子梗长17-35μm，个别可以达到65μm，长短差别较大；轮生体由3-6个瓶梗组成。瓶梗基部柱状膨大，向上突然变细，7-9×1.5-3μm；颈部短，直径小于0.5μm。分生孢子透明，光滑，核形至椭圆形，1.3-3.0×1.0-2.2μm，排列成长链。该菌株形态特征与已报道的淡紫紫孢菌一致。
基于ITS rDNA序列，下载相似性大的紫孢属菌株序列，用ClustaXI 5.3软件对菌株GZAC18-2JMP和下载的序列进行比对，用RxAML软件以Isaria farinosa为外群，对GZAC18-2JMP菌株与相关菌株构建ML***发育树(见图2)。结果表明，该菌株序列与淡紫紫孢菌的其余4个序列以高支持率较好地聚在一起。
综合形态特征和分子数据，GZAC18-2JMP菌株鉴定为淡紫紫孢菌。
实施例2菌株产蛋白酶初筛
1.实验材料与方法
1.1实验用培养基
脱脂奶粉固体培养基(g/L)：脱脂奶粉5g，琼脂粉20g,水补足1000mL。
1.2实验方法
将GZAC18-2JMP菌株点接种至脱脂奶粉固体培养基中心，置于25℃恒温培养箱中。测定透明圈和菌落直径，计算两者之比。
2.实验结果
如图3所示，GZAC18-2JMP菌株随着菌落的生长对脱脂奶粉的降解产生的透明圈直径随着增加。至第7天时，透明圈大小为41mm，菌落直径为35mm，二者比率为1.17.通过培养皿直观展示，结果表明GZAC18-2JMP菌株能较好降解脱脂奶粉中蛋白，可进一步进行对角蛋白酶降解研究。
实施例3淡紫紫孢霉菌株对鸡毛降解的效果评价
1.实验材料与方法
1.1鸡毛的处理：鸡毛采集于贵阳市花溪区一农贸家禽屠宰场，将采集的鸡毛自来水清洗并浸泡12h，流水冲洗干净，121℃高压灭菌30mins后，置于50℃烘箱里烘干，备用。
1.2发酵培养基的制备
鸡毛10g，磷酸二氢钾0.5g，氯化钠1.2g，硫酸锌0.05g，氯化钙0.2g，定容到1000mL，pH 7.0，121℃高压灭菌30mins，备用。
1.3淡紫紫孢霉菌株孢子悬浮液的制备
在超净工作台内，将淡紫紫孢菌GZAC18-2JMP菌株在PDA培养基上25℃培养7d的菌丝轻轻刮下，转移至已灭菌的装有10mL 0.05％Tween-80的试管中，一起置于漩涡震荡仪上震荡1min后静置，在超净工作台中用3层擦镜纸对悬浮液进行过滤，将过滤后的孢子悬浮液滴经血球计数板计数，并将孢子浓度调整至1×107个/mL，取1mL接种到发酵培养基中。
1.4降解鸡毛的培养方法
将装有100mL发酵培养基的三角瓶静置于25℃培养箱中培养48h，再置于摇床中110rpm，25℃摇床培养96h。
上述3个重复，发酵前后发酵液对比见图4所示。
1.5蛋白质标准曲线的绘制：
1)称取考马斯亮蓝G250，100mg溶于50mL 95％乙醇中，加入100ml 85％磷酸，用蒸馏水稀释至1L备用。
2)0.2mol/L，pH7.0磷酸缓冲液和标准蛋白溶液的配制：称取KH2PO4 2.12g和K2HPO4 5.56g用蒸馏水溶解，混合后定容至200mL。称取100mg牛血清蛋白，用上述缓冲液配制成1mg/mL的标准蛋白质溶液。
3)取7支试管，分别加入标准蛋白质溶液0、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL、100μL，再分别加入考马斯亮蓝溶液定容至5mL，摇匀，在595nm波长下测吸光度，并通过吸光度值计算样品中可溶性蛋白的含量。
绘制蛋白质标准曲线如图5所示。
1.6发酵液中可溶性蛋白含量的测定
取发酵一周的100μL发酵液，加入考马斯亮蓝定容至5mL，摇匀，在595nm波长下测吸光度，并通过蛋白质标准曲线计算样品中可溶性蛋白的含量。
1.7发酵液中鸡毛滤渣的重量
将发酵一周的发酵液用快速定性滤纸过滤，将过滤所得的鸡毛滤渣用烘箱烘干，测其重量。
2.实验结果
2.1发酵液中鸡毛结构完整性比较
鸡毛是富角蛋白基质，结构比较复杂，难以降解。由图4可见，经菌株GZAC18-2JMP降解后，原来完整的鸡毛结构被降解为鸡毛碎末，悬浮于发酵液中。
2.2发酵液中可溶性蛋白含量测定
发酵液中可溶性蛋白含量越高表明降解效果越好。由图5标准曲线计算，根据1.6配制好的发酵液，测定其OD值为1.2989，根据图5标准曲线公式y＝0.007x+0.069(y为OD值)计算可知，可溶性蛋白含量增加为175.7μg/mL，说明鸡毛降解效果较好。
2.3发酵液中鸡毛渣含量测定
经发酵培养1周，测定的鸡毛滤渣重量由对照的1g/100mL降低为0.36g/100mL，降解了0.64g，说明该菌株对鸡毛降解效果较好，降解率达到64％。

Claims (4)

1.一株淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)GZAC18-2JMP，菌株保藏编号：CGMCCNo.20249，2020年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
2.权利要求1所述的淡紫紫孢菌在鸡毛降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，将淡紫紫孢菌接种到鸡毛降解发酵液中，在25℃下先静置48小时，然后再振荡培养96小时。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述鸡毛降解发酵液的组成为：鸡毛10g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、氯化钠1.2g/L、硫酸锌0.05g/L、氯化钙0.2/L g，pH7.0。
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