CN108939051A - 先兆子痫胎盘间充质干细胞条件培养基在肿瘤治疗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了先兆子痫胎盘间充质干细胞条件培养基在肿瘤治疗的应用，描述了通过在液体培养基中培养来自先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞可获得的条件培养基(CM)。本发明的目的条件培养基包含至少IP‑10和TARC蛋白质并且将它用于肿瘤，优选上皮肿瘤的治疗性疗法。

Description

先兆子痫胎盘间充质干细胞条件培养基在肿瘤治疗的应用
本申请是申请日为2013年10月2日、发明名称为“先兆子痫胎盘间充质干细胞条件培养基用于在肿瘤治疗中的应用”的中国专利申请号201380062876.2的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于肿瘤病理的疗法治疗的领域。
背景技术
在过去几十年间，抗肿瘤疗法取得了重大进展，因此使得越来越多的病例有效地改善预后，一旦预兆不好，从而使它们可以治疗或有时可以治愈。然而，如果肿瘤部位和疾病阶段确实允许外科手术的话，常规的肿瘤治疗仍然是基于外科手术。外科手术通常伴随化疗和/或放射疗法治疗，不幸的是伴有严重的副作用。化疗是全身给药的，因此它的细胞毒性作用可不加区别地以癌症和健康细胞为作用目标，特别是那些表征为高增殖速率的组织。实际上，化疗可能导致另外的病理状态的发作，如骨髓抑制和粘膜炎。放射治疗也会诱导实际上由肿瘤区域辐射过程中的健康细胞DNA的损伤引起的严重的副作用。这种现象甚至可以导致继发性肿瘤的形成。
因此，临床肿瘤研究集中在评估能够在肿瘤细胞上施加更强的靶向作用的替代性治疗方法，例如通过使用治疗剂在癌细胞的生长和肿瘤细胞的转移性侵袭期间以及在肿瘤新血管生成期间选择性地干扰这些特别活化的细胞机制。
在更创新的解决方案中，基于干细胞的疗法，包括使用干细胞和在生理条件下由干细胞产生的因子的那些方法起着重要的作用。
特别地，最近的实验证据表明人胚胎干细胞能够分泌可以选择性抑制癌细胞的体外增殖和肿瘤发生的营养因子。在分离自骨髓和脂肪组织的成人间充质干细胞(MSC)中也报道了抗肿瘤活性。例如，在体内小鼠模型中观察到，静脉给药的人MSC能够选择性地迁移向恶性组织，以在肿瘤基质中结合并且抑制癌细胞增殖。基于这种特殊的MSC朝着活性肿瘤发生部位的定向运动，近来已经研发了针对MSC的另外的治疗应用。这些方法包括直接在肿瘤区域利用间充质细胞作为载体来选择性地运载具有抗肿瘤活性的生物分子。
尽管上面描述的很有前景的结果，但人干细胞在临床实践中的应用仍然是一个挑战。人胚胎干细胞伴随着重要的伦理和生物安全问题，因为它们有限的特性使得难以预测潜在的副作用，如继发性肿瘤的发生。另一方面，MSC的治疗性应用意味着通过高度侵袭性的方法从骨髓或脂肪组织收获它们，以及由于其天然的低浓度(骨髓中0.001％的单核细胞)，需要将这些细胞暴露于困难的和昂贵的体外扩增方法。
最近的研究报道了间充质中存在的胎盘绒毛膜绒毛和羊膜中存在的特定细胞群，命名为胎盘间充质干细胞(PDMSC)(Huang YC,Yang ZM,Chen XH,Tan MY,Wang J,Li XQ,etal.Isolation of mesenchymal stem cells from human placental decidua basalisand resistance to hypoxia and serum deprivation.Stem Cell Rev.2009；5(3):247-55)。由于胎盘组织的独特的特征，这些细胞具有干细胞-间充质细胞表型，这赋予它们连同增高的增殖和分化潜能，以及具有良好限定的寿命和受控的增殖速率的基本特征，从而降低了与其体内使用相关的继发性肿瘤潜在形成的风险。此外，PDMSC能够发挥免疫抑制和抗炎活性。
基于上述独特的可塑性和分化性能，以及易于恢复和使用，胎盘组织、胎盘间充质干细胞已经成为深入研究的主题，主要在再生医学领域。Rüster B.和他的同事报道了MSC具备能力以便自发地迁移至损伤的器官和组织，以参与修复过程(Rüster B,S,Ludwig RJ,Bistrian R,Müller S,Seifried E,et al.Mesenchymal stem cells displaycoordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells.Blood.2006；108(12):3938-44)。间充质干细胞的特有的缺乏免疫原性进一步支持其在再生医学中的应用，免疫原型的缺乏是由于HLA-II和共刺激分子(CD80、CD86、CD40)缺乏表达，需要这种表达直接刺激T淋巴细胞并且赋予针对细胞毒性T淋巴细胞的抗裂解性。其它研究表明来源于生理性胎盘的羊膜上的PDMSC可以对肿瘤细胞系增殖施加抑制性作用(Magatti M,De MunariS,Vertua E,Parolini O.Amniotic Membrane-Derived Cells Inhibit Proliferationof Cancer Cell Lines by Inducing Cell Cycle Arrest.J Cell Mol Med.2012Jan19.doi:10.1111/j.1582-4934.2012.01531.x.)。
国际专利申请第WO 2013/093878号公开了使用由分离自足月的生理性人胎盘的绒毛膜绒毛的PDMSC细胞调节的培养基用于治疗先兆子痫综合征。先兆子痫是一种严重的人怀孕相关的综合征，表征为加剧的母体-胎盘炎症反应，普遍的内皮损伤和缺陷的胎盘发育。
发明内容
如在以下实验部分进行进一步的详细说明，本发明人观察到，通过在液体培养基中培养由分离自患先兆子痫的人胎盘的胎盘间充质干细胞产生的条件培养基(CM)，对肿瘤增殖和血管生成产生了令人惊讶的抑制效果。特别地，如图1所示，相比于对照组，通过上述条件培养基治疗原发性和转移性肿瘤乳腺组织外植体诱导显著的和令人惊讶的VEGF表达水平的下降(“血管内皮生长因子”)，已知作为主要的血管生长因子参与肿瘤新血管发生过程，以及转录因子JunB(激活蛋白-1(AP-1)家族的癌基因成员，其表达与差的乳腺癌预后直接相关。这些细胞的治疗功效确实令人惊讶，因为通过培养生理胎盘间充质干细胞获得的条件培养基通过刺激血管发生对肿瘤外植体施加相反的作用。
施加于血管发生过程和肿瘤细胞增殖的实验证实的抑制作用(其证明对于晚期癌症组织是特别有效的)强烈地表明条件培养基(通过在液体培养基中培养来自人先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞可获得)的临床抗肿瘤效果。
本发明人遵循的以鉴定由先兆子痫PDMSC分泌的有助于协调上述CM抗肿瘤作用的蛋白质的实验方法，是基于通过使用能够特异性地和同时地识别多种不同细胞因子、趋化因子和生长因子的可商购的抗体芯片(antibody array)的培养基的蛋白质组学分析。蛋白质组分析的结果允许鉴定以下提及的多个因子，其中，IP-10(干扰素γ诱导的蛋白10)和TARC(胸腺和活化调节的趋化因子)是关键的。
因此，本发明的主题是通过在不含血清的液体基础培养基中培养分离自先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞可获得条件培养基(CM)，并且该条件培养基包含至少IP-10和TARC因子，用于在肿瘤的治疗性疗法中应用。此外，本发明的主题包括产生条件培养基和药物组合物(其包括IP-10和TARC蛋白质)的方法。
附图说明
图1示出了相比于对照组，通过本发明的条件培养基治疗原发性和转移性肿瘤乳腺组织外植体诱导显著的和令人惊讶的VEGF和JunB表达水平的下降。
图2示出了在肿瘤外植体中，用本发明的目的条件培养基(CM)处理诱导了PARP基因表达水平统计上显著的降低，伴随着CASP3和p16Ink4A的基因的表达水平的增加(p<0.05)。
具体实施方式
在本说明书中，术语“来自先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞”是指来源于患先兆子痫综合征的孕妇的胎盘的间充质干细胞。怀孕个体优选是人类个体。
基于胎盘组织的来源，胎盘来源的间充质干细胞属于不同的群体。实际上，人的胎盘中具有独特结构，其包括胎儿组织，如绒毛膜(叶状绒毛膜和平滑绒毛膜)和羊膜，以及母体来源的组织，如蜕膜。
在优选的实施方式中，本发明的主题的条件培养基通过培养绒毛膜来源的胎盘间充质干细胞是可获得的。优选地，但以非限制性的方式，绒毛膜间充质干细胞表征为以下表中示出的通过细胞荧光分析检测到的表面抗原特征。
标记物 细胞荧光分析
HLAI +
CD105(内皮糖蛋白) +
CD166(ALCAM) +
CD90(Thy-1) +
CD73(5'-核苷酸酶) +
CD34 -
HLA-DR -
CD133(Prominin-1) -
CD20 -
CD326(Ep-CAM) -
CD31(PECAM-1) -
CD45(PTPRC) -
CD14 -
可替换地，为了制备条件培养基，使用表现在上述表中示出的表面抗原特征的羊膜来源的间充质干细胞。
本发明主题的条件培养基包含至少P-10和TARC(因为它们的抗肿瘤活性而著称的分泌蛋白)。IP-10趋化因子，CXC家族的成员，是干扰素γ(IFNγ)抗肿瘤活性的关键调节因子，因为IP-10在被IFNγ诱导后能够将CD8+T淋巴细胞和巨噬细胞吸引到肿瘤位点，并且能够发挥抗血管生成作用。类似地，由TARC趋化因子施加趋化吸引的作用，其是负责活化的Th2效应细胞向肿瘤组织选择性迁移。
与上面提到的细胞因子一起，由Human Cytokine Antibody Array 5试剂盒进行的PDMSC条件培养基分析表明存在由来自先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞分泌的其它功能调节剂，从而鉴定出不同的蛋白质表达谱(profile)。
因此，在另一实施方式中，本发明主题的条件培养基也包含可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和/或肿瘤坏死因子α(TNF-α)。sFlt-1是具有强大抗血管生成活性的可溶性分子；IL-6、IL-8和TNF-α是针对肿瘤细胞的细胞毒性的潜在的促炎细胞因子介质。
优选地，本发明主题的条件培养基包含选自由以下组成的组中的一种或多种蛋白：ENA-78、GRO、GRO-α、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-16、MCP-1、MCP-2、MCSF、MDC、血管生成素，抑瘤素m、VEGF、BDNF、BLC、CKb 8-1、嗜酸粒细胞趋化因子2、嗜酸粒细胞趋化因子3、FLT-3配体，FRACTALKINE、GCP-2、GDNF、HGF、IFN-γ、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4、LIF、LIGHT、MCP-3、MCP-4、MIF、MIG、MIP-3α、MIP-1β，MIP-16、NAP-2、NT-3、骨桥蛋白、骨保护素、PDGFBB、RANTES、SCF、SDF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TIMP-1和TIMP-2、EGF、促血小板生成素、瘦蛋白、嗜酸粒细胞趋化因子、FGF-4、FGF-6、FGF-7、FGF-9、IGFBP-3、NT-4、PARC、PIGF，以及它们的任意组合。
由发明人进行的细胞因子分析在本发明的主题的条件培养基中并没有发现以下蛋白质，因为它们不存在或以非常低的浓度和/或浓度低于使用的芯片的检测限度：GM-CSF、I-309、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、p40p70、IL-13、MIP-1、TNF-β、IGF-I、IGFBP-4、TGF-β3。
在优选的实施方式中，使用条件培养基用于上皮肿瘤，更优选乳腺肿瘤的治疗性疗法。在本说明书的上下文中，术语“上皮”表示肿瘤转化的增殖的肿瘤细胞部位的组织学起源。
由于缺乏表征PDMSC细胞的免疫原性，本发明的条件培养基可以可选地包括细胞部分，该细胞部分由先兆子痫胎盘的间充质干细胞组成(细胞部分由其获得)。可替代地，条件培养基不包含细胞部分。
在本发明的范围内，还包括获得上述条件培养基的方法，该方法包括以下步骤：
(i)在无血清液体基础培养基中培养来自先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞至少3小时；
(ii)从液体培养基中全部或部分地分离细胞部分。
在本说明书的上下文中，术语“基础”是指包含通常需要无机盐、氨基酸和维生素以支持没有特殊的营养需求的哺乳动物细胞生长的培养基。作为示例而不是限制，采用了以下由于盐和氨基酸的含量而本质上不同的液体培养基：伊格尔基础培养基(BasalMedium Eagles)(BME)、最低基础培养基(Minimum Essential Medium)(MEM)，达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)(DMEM)，F-10营养培养基(Nutrient Mixture F-10)(Ham′s F-10)和营养培养基F-12(Nutrient Mixture F-12)(HAM's F-12)。选择更合适的培养基是在本领域技术人员的技术范畴内。
根据本发明的方法，培养基中不补充血清，以避免包含于血清中的生长因子将干扰和改变由来自先兆子痫胎盘的PDMSC细胞分泌的特定的因子引起的作用。
在收集条件培养基之前，将来自先兆子痫胎盘的胎盘间充质干细胞培养充足的时间以允许它们粘附于培养基质，它们的扩增和组分的分泌，表征为上述培养基并且使其有利且有效地用于肿瘤的治疗性疗法。时间周期至少3小时，优选至少12小时、至少24小时、至少48小时、至少72小时或至少96小时或120小时或至少1周或1周以上。
为了从来自先兆子痫胎盘的PDMSC细胞获得的条件培养基中完全或部分地分离出细胞部分，本质上可以使用任何已知的方法。例如，本发明可以使用适当的多孔性的过滤复合物过滤条件培养基以保留细胞组分并将它们的残留物保留在悬液中。可替换地，通过离心可以实现将条件培养基与PDMSC细胞(从分离中获得)分离，并且导致细胞本身的沉降。因此，在本发明优选的实施方式中，通过过滤或离心或二者的组合进行本发明的条件培养基与细胞组分的分离。分离方法的选择大部分位于本领域技术人员的知识及技术范畴内。
本发明的范围还包括包含至少蛋白IP-10和TARC(对于本发明的主题的条件培养基的抗肿瘤活性，上面确定为关键的)的药物组合物。根据本发明的药物组合物的另外可选的组分是以下蛋白：sFlt-1、TNF-α、ENA-78、GRO、GRO-α、IL-5、IL-7、IL-6、IL-8、IL-10、IL-15、IL-16、MCP-1、MCP-2、MCSF、MDC、血管生成素、抑瘤素m、VEGF、BDNF、BLC、CKb 8-1、嗜酸粒细胞趋化因子2、嗜酸粒细胞趋化因子3、FLT-3配体、FRACTALKINE、GCP-2、GDNF、HGF、IFN-γ、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4、LIF、LIGHT、MCP-3、MCP-4、MIF、MIG、MIP-3α、MIP-1β，MIP-16、NAP-2、NT-3、骨桥蛋白、骨保护素、PDGFBB、RANTES、SCF、SDF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TIMP-1和TIMP-2、EGF、血小板生成素、瘦蛋白、嗜酸粒细胞趋化因子、FGF-4、FGF-6、FGF-7、FGF-9、IGFBP-3、NT-4、PARC、PIGF，以及它们的任意组合。除治疗性活性分子、本发明目的的药物组合物包括合适的赋形剂、载体和/或药学上可接受的稀释剂，其选择在本领域技术人员的技术范畴内。
优选地，根据本发明的药物组合物是在适合用于全身给药的制剂中，更优选通过注射，以确保其有效地扩散至全身的血流。当然，在本发明的上下文中包括使用的任何类型的注射***，它的选择在本领域技术人员技术范畴内。
在可替代的实施方式中，本发明的药物组合物是适合用于口服给药的任何药物制剂，其选择和制备在本领域技术人员的技术范畴之内。
提供以下实施方式以进一步说明而不是限制如所附权利要求所限定的本发明的范围。
实施例1:分离自先兆子痫胎盘的间充质干细胞(PDMSC)
胎盘来源的间充质干细胞(PDMSC)分离自从先兆子痫孕妇获得的胎盘的基底板。
根据由American College of Obstetricians and Gynecologists(ACOG)所建立的标准进行先兆子痫的诊断：在先前血压正常的妇女中，妊娠20周后存在妊娠诱导的高血压(收缩≥140mm Hg，舒张≥90mm Hg)和蛋白尿(≥300mg/24h)。排除具有先天性畸形、染色体异常(数目和/或结构)或明显的子宫内感染的妊娠。
在患者知情同意后并且依据OIRM Sant'Anna-Mauriziano Hospital of Turin的伦理委员会的指南，在分娩后进行胎盘的收集和后续的胎盘组织制样。
将膜(羊膜和绒毛膜留下)从胎盘板上机械分离。
在机械去除基蜕膜(包括由与合胞体滋养层的相互作用修饰的母体子宫内膜细胞)之后，从胎盘基底板(由绒毛膜绒毛形成的胎盘区域并且与子宫壁直接接触)上切下全厚度组织活检样品。
接着，在室温下使用无菌HBSS(Hank′s缓冲盐溶液，水溶液)将胎盘活检样品洗涤数次(Gibco，Invitrogen，LifeTechnologies)，以便完全除去血液残留。
接着将活检样品机械匀化并且通过使用溶于DMEM LG(达尔伯克改良的最低基础培养基低葡萄糖无L-谷氨酰胺并且无胎牛血清-FBS)的100U/ml的胶原酶I(Gibco，Invitrogen by Life Technologies)、5μg/ml的脱氧核糖核酸酶I(DNAse I，Invitrogenby Life Technologies)，在37℃恒温水浴中振荡3小时进行酶消化处理。
然后将所得细胞悬浮液在540g，4℃下离心5秒以除去未消化的组织残留物。收集上清液并且通过具有70微米直径的细胞滤网过滤器过滤。过滤后，将溶液在540g，4℃下离心5分钟以沉淀细胞。然后弃去上清液，并且在无菌HBSS(30ml/30克原始组织)中重悬细胞。
将一定体积的Ficoll Paque Premium 1,073(GE Healthcare Europe)以相对于起始体积1:3的比例铺在如上所述的获得的细胞溶液下。在540g，20℃下离心制备物20分钟，收集位于梯度中间相的单核细胞环，在HBSS(50ml/30克的原始组织)中重悬以及在540g、20℃离心10分钟以除去Ficoll残留物。
离心后，弃去上清液，并且在补充有10％FBS(Gibco，Invitrogen，LifeTechnologies)和0.1％庆大霉素的DMEM LG中重悬细胞。然后将细胞铺在细胞培养瓶中，并且在37℃和5％CO2下培养。
在37℃，5％CO2下将细胞保持在培养基中。在90％融合时，通过用胰蛋白酶TrypLEExpress(植物来源而不含动物来源的胰蛋白酶，GMP认证，Invitrogen LifeTechnologies)处理分离细胞以促进细胞扩增。
实施例2：来自先兆子痫胎盘的PDMSC细胞的表征
如实施例1所述，分离自并发先兆子痫的胎盘(基底板的绒毛膜部分)的间充质干细胞由通过分析该细胞类型通常的主要表面抗原标记物的细胞荧光检测表征。
通过使用与荧光染料偶联的单克隆抗体(Myltenyi，Bologna，Italy)评价这些抗原存在或不存在。通过荧光评价，证实了来自先兆子痫胎盘的所有PDMSC细胞系对于表面标记物CD105、CD166、CD90和CD73的表达为阳性，而对于HLAII、CD34、CD133、CD20、CD326、CD31、CD45和CD14的表达为阴性，从而表现出适当的间充质表型，并排除来自上皮/滋养层细胞和造血祖细胞的任何污染。此外，通过进行RT-PCR实验对细胞表型进行分析，该RT-PCR实验显示了通过PDMSC细胞的Oct4(八聚物-结合转录因子4)基因和NANOG(同源异形盒蛋白NANOG)基因(胚胎干细胞通常具有)的表达。
为了评价PDMSC干性(stemness)，在培养细胞第三次传代时，在三个不同的细胞系中检测它们的分化潜能：成骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞。通过使用特定的诱导培养基实现分化。对于成骨分化，细胞培养物在补充了20％FCS，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷氨酰胺、20mmβ-磷酸甘油酯、100nM***和250μM抗坏血酸-2-磷酸酯的α-MEM中孵育。对于成脂分化，用补充有20％FCS，100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、12mM L-谷氨酰胺、5μg/ml胰岛素、50μM吲哚美辛、1x10-6M***和0.5μM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的α-MEM孵育细胞培养物。对于成软骨分化，培养物在补充了1ml R3-IGF-1、2.5ml bFGF、0.5ml转铁蛋白、1M牛胰岛素、25ml FBS和5ml庆大霉素/两性霉素B-0的软骨细胞基础培养基中孵育。该培养基每周更换2次持续3周。通过使用适当染色评价细胞分化。通过用茜素红S染色评价成骨细胞分化。茜素确定了形成的不溶的和强烈着色的钙斑，从而允许突出骨基质。用在酸性粘多糖聚阴离子之间形成盐桥的阿尔新蓝染色评价成软骨分化，并且使糖胺聚糖染成蓝色。通过油红染色评价成脂分化，其突出了通过存在于染料溶液中的溶剂所溶解的脂质并且脂肪沉淀是红色的。
实施例3：条件培养基的生产
为了获得本发明的主题的条件培养基，当先兆子痫PDMSC达到合适的纯度时，如通过不存在来自于胎盘组织来源的滋养层污染细胞和/或造血污染细胞所证明的，在传代3到5次之间对先兆子痫PDMSC铺板。特别地，在37℃的温度和5％的CO2下，在不含胎牛血清(FBS)的DMEM LG中，细胞以1x105细胞/ml的密度铺板。培养PDMSC至少3小时至一周或更长。然后在确定的时间点收集条件培养基，随后离心和/或过滤以除去细胞碎片污染物。必要时，如刚才所述的获得的条件培养基可以通过将其冷冻在-80℃保存。
实施例4：通过细胞因子芯片分析条件培养基
根据制造商的说明书，使用可商购的Human Cytokine Antibody Array5试剂盒，这使得能够同时分析相同的样品中的80种不同的细胞因子以研究细胞因子谱，该细胞因子由先兆子痫PDMSC细胞分泌并且存在于条件培养基中。具体地，该方法是基于印迹于芯片膜(array membrane)上的抗体并且当细胞因子存在于分析样品中时，能够识别并捕获细胞因子。在本实验上下文中，在芯片膜上免疫复合物形成的位点产生的信号通过光密度分析使用ImageQuant软件定量。鉴定的细胞因子的表达水平并不是测定为绝对值，而是标准化为相对于试剂盒内包括的标准对照的百分比，分配的阳性对照值为100％和阴性对照值为0％。上述试验的结果示于下表：
此外，细胞因子分析在本发明的目的条件培养基中并没有检测到以下蛋白质的存在，因为它们不存在或低于芯片的检测极限：GM-CSF、I-309、IL-1a、IL-1b、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、p40p70、IL-13、MIP-1，TNF-β、IGF-I、IGFBP-4、TGF-β3。
通过实时PCR(聚合酶链式反应以评估基因表达水平)和Western Blot分析(以评估蛋白质表达水平)检测由先兆子痫间充质干细胞产生的抗-血管生成sFlt-1。使用特别定制的由Life Technologies-Applied Biosystems Division按照我们的请求生产的一套引物和探针TaqMan，对分离自上面提及的来源于先兆子痫胎盘的胎盘细胞的mRNA(信使RNA)进行实时PCR。这些引物和探针是基于由Nevo O.等人在J.Clin.Endocrinol.Metab.200893:285-292上的之前出版的序列。通过使用购自Life Technologies-Invitrogen(目录号36-1100)的抗sFlt-1的特异性多克隆抗体，按照制造商的说明进行Western Blot分析。实时PCR和Western Blot分析显示出相对于生理对照，由先兆子痫胎盘间充质干细胞的sFlt-1在基因(4、5倍增加，p<0.001)水平和蛋白质(2倍增加，p<0.05)水平二者的显著增加的生产。
实施例5：评估从来自先兆子痫胎盘的培养的PDMSC细胞获得的条件培养基的治疗 功效
为了评价本发明的目的条件培养基的治疗功效，使用由从原发和转移性肿瘤上切下的肿瘤组织外植体代表的体外模型进行特定研究，该原发和转移性肿瘤获得自经过切除乳腺肿瘤及其转移的手术的患者。特别地，证实的是利用本发明的条件培养基治疗这类外植体是否诱导VEGF、JunB和PARP的表达水平下降和Caspase 3(CASP3)和p16INK4a的表达增加，作为明显的抗血管生成和抗肿瘤活性的指示。多个临床和实验证据证实VEGF在癌症中是过表达的，并且由于它诱导将营养物质运输到肿瘤组织的新血管的形成，它是肿瘤侵袭性的标记。JunB是癌基因，它的表达与乳腺癌的不良预后直接相关。PARP(多-(ADP-核糖)聚合酶)是修复由化学疗法试剂引起的DNA损伤的核蛋白，从而赋予肿瘤组织对化学疗法的抗性。CASP3和p16Ink4A是能够诱导凋亡并且阻断细胞增殖的两个有效的癌-抑制子。
对于实验程序，使用从组织残留上切下的肿瘤组织样品，所述组织残留取自解剖学-病理程序常规手术后的三个不同的患者。从每个肿瘤上切下八个外植体并且培养于基质胶(Matrigel)填充的插件中。使用条件培养基处理培养物48小时，如前所述，该条件培养基通过培养先兆子痫PDSMC 48小时获得。
详细地说，切取由具有保守的形态和结构和相同重量的原发肿瘤组织(5mm直径)组成的外植体，在包含150μl的基质胶的插件中铺板并在不含FBS的500μl Ham F12培养基中在37℃，5％CO2下保持12小时以平衡它们的术后应激。12小时后，用500μl条件培养基(12个外植体)或无血清的500μl DMEM LG培养基(12个对照外植体)替换培养基。在相同的实验条件下，将培养物再培养48小时。按照制造商的说明，在实验结束时，收集实验外植体和对照外植体并且使用TRIzol试剂处理用于mRNA分离(Invitrogen Life Techonologies)。一旦分离，通过DNAase处理(Sigma-Aldrich)纯化mRNA以除去基因组DNA污染。通过分光光度计在260nm波长读取测定RNA浓度，且通过评价A260/A280吸光度率为1.8-2来评估RNA的纯度。
通过RT-PCR由5μg的之前提取的总RNA，使用随机六聚体方法和RevertAid HMinus First Strand cDNASynthesis试剂盒(Fermentas Life Science)根据制造商的方案合成cDNA(互补的DNA)，该cDNA对于进行后续的分析以研究VEGF、JunB、PARP、CASP3和p16INK4a表达水平是有用的。
用本发明的条件培养基处理肿瘤培养物后，通过实时PCR使用TaqMan引物和探针(Life Technologies-Applied Biosystem Division)进行VEGF、JunB、PARP、CASP3和p16Ink4A基因表达分析。为了进行相对定量，在用核糖体18S亚基信号标准化用作内部参考后，比较两组样品之间的实时PCR信号。
由图1和图2中记录的直方图表示的差别的基因表达结清楚地证明在肿瘤外植体中，用本发明的目的条件培养基(CM)处理诱导了VEGF、JunB和PARP基因表达水平统计上显著的降低，伴随着CASP3和p16Ink4A的基因的表达水平的增加(p<0.05)。

Claims (6)

1.一种用于在肿瘤的治疗性疗法中应用的药物组合物，至少包含干扰素γ-诱导的蛋白10(IP-10)和胸腺活化调节的趋化因子(TARC)，以及可选的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，进一步包含选自由以下组成的组中的蛋白质：可溶性fms-样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，以及它们的任意组合。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，进一步包含选自由以下组成的组中的一种或多种蛋白质：ENA-78、GRO、GRO-α、IL-5、IL-7、IL-10、IL-15、IL-16、MCP-1、MCP-2、MCSF、MDC、血管生成素、抑瘤素m、VEGF、BDNF、BLC、CKb 8-1、嗜酸粒细胞趋化因子2、嗜酸粒细胞趋化因子3、FLT-3配体、FRACTALKINE、GCP-2、GDNF、HGF、IFN-γ、IGFBP-1、IGFBP-2、IGFBP-4、LIF、LIGHT、MCP-3、MCP-4、MIF、MIG、MIP-3α、MIP-1β、MIP-16、NAP-2、NT-3、骨桥蛋白、骨保护素、PDGFBB、RANTES、SCF、SDF、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TIMP-1和TIMP-2、EGF、血小板生成素、瘦蛋白、嗜酸粒细胞趋化因子、FGF-4、FGF-6、FGF-7、FGF-9、IGFBP-3、NT-4、PARC、PIGF，以及它们的任意组合。
4.权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物是适于全身给药的药物形式。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物是适于注射给药的药物形式。
6.根据权利要求4所述的药物组合物，所述药物组合物是适于口服给药的药物形式。
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