CN113209279A - 用于保护原始卵泡的组合物、应用及间充质干细胞功能评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明具体涉及用于保护原始卵泡的组合物、应用及间充质干细胞功能评价方法。本发明研究发现，间充质干细胞条件培养基与透明质酸或HGF与透明质酸的组合能够明显激活卵巢中PI3K‑AKT信号通路，具有保护原始卵泡以及延缓生理性卵巢衰老的效果。另一方面，通过检测干细胞条件培养基中细胞因子HGF、SCF、EGF和bFGF水平，检测干细胞条件培养基对VCD损伤后原始卵泡存活的作用，以及观察干细胞条件培养基对原始卵泡激活的效果，可用于鉴定不同批次间充质干细胞的分泌功能，并评估其改善卵巢功能的潜在应用价值。本发明提供的上述组合物及方法简便、全面、特异、有效，可行性好，具有良好的实际应用之价值。

Description

用于保护原始卵泡的组合物、应用及间充质干细胞功能评价 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及用于保护原始卵泡的组合物，所述组合物在制备生殖细胞保存或卵巢功能修复产品中的应用，以及一种间充质干细胞功能评价方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
卵巢是女性重要的生殖内分泌器官，主要功能是产生卵子和分泌女性激素。成年卵巢内含有不同发育阶段的卵泡，由***和周围的体细胞构成。卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，按照发育的先后顺序依次分为原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡和***前卵泡(成熟卵泡)。卵巢内含有的所有原始卵泡称为卵巢储备。女性出生后，卵巢内的原始卵泡数量不再增加。由各种原因引起的原始卵泡丢失过多会引起卵巢储备减少和功能减退，进而影响女性身心健康。研究表明，正常水平的PI3K-AKT信号通路对于维持卵巢功能至关重要。如果***中该通路活性增强会引起原始卵泡过度激活，卵泡过度生长，耗竭加快，卵巢功能过早衰竭。但是，维持PI3K-AKT信号通路一定水平的激活对于原始卵泡的存活也是必需的。***中该通路下游S6激酶1(S6K1)磷酸化核糖体蛋白S6(rpS6)，促进蛋白翻译及核糖体生成，增加细胞生长存活所需的蛋白储备，参与维持原始卵泡的长期存活。动物研究发现，环境毒性物质去氧乙烯基环己烯(4-vinylcyclonhexene diepoxide，VCD)能抑制卵巢中的PI3K-AKT信号通路，特异性地杀伤原始卵泡及初级卵泡，导致卵巢储备减少和卵巢功能不全。
干细胞在组织工程、疾病治疗等领域具有良好的应用前景，其中间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)是目前研究和应用较多的一种成体干细胞。现有研究表明，旁分泌是MSC发挥作用的重要方式，高质量MSC的标准之一是细胞具有较强的旁分泌功能。旁分泌是指干细胞通过分泌细胞因子、胞外囊泡、microRNAs等多种物质作用于靶细胞并发挥调控功能。有研究报道，MSC可以通过旁分泌激活PI3K-AKT信号通路从而促进胃粘膜、皮肤、脑等多种组织损伤修复，提示MSC也可能通过旁分泌方式激活该信号通路从而促进卵巢内原始卵泡的存活。
随着人类社会发展和人们生活水平的提高，如何延长卵巢寿命受到越来越多的关注。研究人员已尝试使用白藜芦醇、褪黑素、烟酰胺单核苷酸等多种抗氧化剂或通过敲除TNFα受体、IL1和NLRP3基因抑制炎症反应等方式，在一定程度上改善了卵巢微环境，延缓了卵巢衰老。但这些方式仍处于研究阶段，其安全性和有效性需要进一步确定，而且对原始卵泡存活的影响也不清楚。由于原始卵泡的数量是卵巢储备的决定因素，因此目前亟需寻找简便、安全、有效的保护原始卵泡的方法。
发明内容
本发明通过研究发现，脐带间充质干细胞条件培养基(Mesenchymal stem cells-conditioned medium，MSC-CM)能激活PI3K-AKT信号通路，挽救VCD损伤造成的卵泡减少。另外，经验证肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)是MSC-CM中的一种有效成分，对VCD诱导的体外卵泡损伤有保护作用。本发明进一步发现，将MSC-CM联合透明质酸或单独HGF联合透明质酸进行卵巢注射能够延缓体内生理性卵巢衰老导致的原始卵泡减少。因此，本发明第一方面，提供用于保护原始卵泡的组合物，所述组合物中至少包括MSC-CM与透明质酸的组合，或HGF与透明质酸的组合。
本发明第二方面，提供第一方面所述保护原始卵泡的组合物在制备生殖细胞保存或卵巢功能修复产品中的应用。
卵巢早衰是指女性40岁之前卵巢功能衰竭，表现为原发性或继发性闭经伴随血清***水平升高和***水平降低，目前临床缺乏有效的治疗方法。干细胞移植是卵巢早衰治疗研究中的热点领域，将干细胞注射至卵巢组织中，能够提高卵巢储备，改善卵巢功能。除了直接应用干细胞之外，干细胞相关产品如条件培养基、外泌体等在改善卵巢功能方面也显示出良好的应用前景。本发明提供的组合物可以用于干细胞相关产品的制备。
另外，既往研究以及本发明研究过程中发现，MSC的功能随供体来源、组织器官来源、分离方法、体外制备方法等不同而存在差异，即不同批次的干细胞存在较大的异质性。这种功能差异有时难以直观的通过细胞形态等方式进行判断，但会给干细胞治疗效果或相关制剂开发带来诸多问题。因此，在干细胞应用之前提供一种有效且便捷的功能评价方法具有重要意义。基于上述研究结果，本发明联想到通过观察MSC-CM对原始卵泡存活的促进作用从而对所述MSC功能进行评价。此外，MSC通过旁分泌激活PI3K-AKT信号通路可能对原始卵泡的激活也有促进作用。
因此，本发明第三方面，提供一种间充质干细胞功能评价方法，获取所述间充质干细胞的条件培养基，直接检测所述条件培养基中对原始卵泡存活或激活有促进作用的细胞因子，并将所述条件培养基用于培养卵巢组织。所述评价方法具体包括：检测所述条件培养基中细胞因子HGF、SCF、EGF、bFGF的含量、所述条件培养基对VCD损伤后原始卵泡存活的影响以及所述条件培养基对正常培养条件下原始卵泡激活的影响。
以上一个或多个技术方案的有益效果是：
1、本发明首先提供一种简便、安全、有效的体外以及体内促进损伤及衰老后原始卵泡存活的方法。经过研究发现，老龄小鼠卵巢通过注射MSC-CM联合透明质酸或HGF联合透明质酸能够促进PI3K-AKT信号通路的激活，促进体内原始卵泡的存活，延缓卵巢衰老，具有良好的实际应用之价值。
2、本发明其次还提供一种简便、特异、全面、有效的评估不同批次MSC分泌功能的方法。经过研究发现，可以有效地对干细胞是否具有改善卵巢功能的潜在作用进行真实、客观的评估。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中卵巢VCD损伤培养8天同时加入MSC-CM，促进小鼠卵泡存活的H&E染色结果。
图2为实施例1中卵巢VCD损伤培养8天同时加入MSC-CM，促进小鼠卵泡存活的计数结果。
图3为实施例1中夹心抗体阵列法检测MSC-CM及成纤维细胞条件培养基(Fib-CM)中440个细胞因子芯片散点图结果。
图4为实施例1中细胞因子芯片差异蛋白KEGG通路分析结果。
图5为实施例1中卵巢培养VCD损伤同时加入HGF中和抗体后MSC-CM效果减弱的结果。
图6为实施例1中卵巢培养VCD损伤同时单独加入HGF促进PI3K-AKT通路激活及生殖细胞存活的结果。
图7为实施例1中老龄小鼠卵巢给予MSC-CM联合透明质酸、HGF联合透明质酸原位注射激活PI3K-AKT通路的结果。
图8为实施例1中老龄小鼠卵巢给予MSC-CM联合透明质酸、HGF联合透明质酸原位注射促进生殖细胞存活的结果。
图9为实施例2中ELISA检测MSC-CM和Fib-CM中关键细胞因子HGF、SCF、EGF、bFGF的结果。
图10为实施例2中卵巢培养VCD损伤同时加入MSC-CM或Fib-CM 4天后，Westernblot检测PI3K-AKT信号通路激活的结果。
图11为实施例2中卵巢培养VCD损伤同时加入MSC-CM或Fib-CM 8天后，Westernblot检测生殖细胞标志物DDX4表达的结果。
图12为实施例2中正常卵巢培养添加MSC-CM 4天后，Western blot检测PI3K-AKT信号通路激活的结果。
图13为实施例2中正常卵巢培养添加MSC-CM 12天后，卵巢切片形态学观察和卵泡计数结果。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。
正如背景技术所介绍的，原始卵泡的数量是卵巢储备的决定性因素，在治疗卵巢早衰和延缓卵巢衰老等领域具有重要意义。为了解决如上的技术问题，本发明提出了用于保护原始卵泡的组合物，所述组合物能够激活PI3K-AKT信号通路，促进原始卵泡存活，有望应用于所述生理性卵巢衰老或卵巢早衰的治疗以及医用干细胞制剂的开发。本发明还基于上述促进作用提供了一种间充质干细胞功能评价方法。
本发明第一方面，提供用于保护原始卵泡的组合物，所述组合物中至少包括MSC-CM与透明质酸的组合，或HGF与透明质酸的组合。
通常来说，上述技术方案中所述间充质干细胞不局限来源，本领域目前已知的间充质干细胞提取来源包括脐带、骨髓、脂肪、脐带血、子宫内膜、羊膜、胎盘、牙髓等，上述来源的间充质干细胞条件培养基均可能在本发明的技术方案中起到相似的技术效果。本领域技术人员可以依据使用需求从上述来源的干细胞中进行选择。
本发明提供一种具体实施方式，所采用的间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞(Umbilical cord-mesenchymal stem cells，UC-MSC)。
本发明提供一种具体的间充质干细胞条件培养基制备方法，所述制备方法如下：将间充质干细胞接种于培养瓶进行培养，待细胞融合度达到85～95％后，更换无血清替代物的基础培养基，继续培养24～72h后收集干细胞上清液；所述干细胞上清液离心、过虑后，再通过超滤浓缩，浓缩倍数为25-50倍，优选为50倍。
所述间充质干细胞条件培养基中包括间充质干细胞分泌的细胞因子，所述细胞因子的具体实例如肝细胞生长因子(HGF)、干细胞因子(SCF)、表皮生长因子(EGF)或碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)；另外，所述条件培养基中包括间充质干细胞的培养基成分，进一步的，为无血清替代物的基础培养基。
本发明的技术方案中，所述透明质酸优选交联型透明质酸。透明质酸是广泛存在于细胞外基质的线性多糖，具有良好的生物相容性和安全性，经过交联后黏性增大，对干细胞具有积极的生物学作用。发明人既往研究发现，交联型透明质酸不仅对于MSC的分泌功能具有促进作用，而且能够作为细胞支架延长干细胞移植后在卵巢局部的存留时间。而本发明则进一步应用交联型透明质酸在体内存留时间长的特性，将其作为药物载体与干细胞条件培养基或HGF混合后进行卵巢局部注射，从而有效延长活性因子的作用时间。
所述间充质干细胞条件培养基与透明质酸的混合方式如下：向浓缩50倍的干细胞条件培养基中加入透明质酸，使透明质酸的终浓度为0.1-0.3mg/ml，优选为0.3mg/ml。
所述HGF与透明质酸的混合方式如下：利用PBS配制透明质酸溶液，使透明质酸的终浓度为0.1-0.3mg/ml，优选为0.3mg/ml；然后利用透明质酸溶液溶解HGF，使HGF的终浓度为100-800ng/ml，优选为800ng/ml。
本发明第二方面，提供第一方面所述保护原始卵泡的组合物在制备生殖细胞保存或卵巢功能修复产品中的应用。
所述生殖细胞包括动物体内与繁衍相关的全部细胞，优选为雌性动物携带的生殖细胞，即***，包括初级***和次级***。
本发明提供的效果较好的实施方式中，所述生殖细胞为原始卵泡中的初级***。与雄性动物睾丸终生含有生殖干细胞不同，雌性哺乳动物的原始卵泡储备是有限的，并且在成年期不可更新；一旦动物进入老龄期，原始卵泡数量明显减少，卵巢机能退化。本发明提供的上述组合物经验证对原始卵泡具有保护作用：在体外，所述组合物中的MSC-CM或HGF可激活PI3K-AKT通路，起到保护原始卵泡的作用；在动物体内，所述组合物也能够激活PI3K-AKT通路并延长老龄小鼠卵巢中原始卵泡的存活时间。需要特别说明的是，所述组合物保护体内原始卵泡的效果是在卵巢注射8周后检测的。理论依据是，此时卵巢内的生殖细胞全部来自于注射时尚处于静息状态的原始卵泡，而8周前注射时卵巢内的生长卵泡已经消耗殆尽。因此，卵巢注射8周后，检测生殖细胞标志物如DDX4的表达量就可以反映所述组合物对原始卵泡的保护作用。基于此，所述组合物可以用于制备生殖细胞保存或卵巢功能修复产品。
优选的，所述生殖细胞保存产品具体实例如组织或细胞培养基、受精培养基。本发明所提供的组合物对于哺乳动物的生殖细胞存活具有良好的促进作用，体外应用的主要产品包括卵巢组织或生殖细胞培养基及受精培养基，可应用于哺乳动物卵巢组织培养、***体外成熟及体外受精过程等。
优选的，所述卵巢功能修复产品具体实例如抗卵巢早衰药物或医疗美容制剂。
本发明进一步提供了一种用于治疗生理性卵巢衰老或卵巢早衰的药物，所述药物优选为注射剂，所述注射剂中组合物作为主要活性成分，所述组合物中包括MSC-CM与透明质酸或HGF与透明质酸。基于所述组合物带来的抗衰老效果，上述组合物还可能用于抗衰老相关的医疗美容制剂。
本发明第三方面，提供一种间充质干细胞功能评价方法，所述评价方法包括：获取所述间充质干细胞的条件培养基，检测所述条件培养基中的细胞因子；或将所述条件培养基用于培养卵巢组织，检测所述条件培养基对损伤后卵巢组织中原始卵泡存活的影响，或所述条件培养基对正常培养条件下卵巢组织中原始卵泡激活的影响。
优选的，所述间充质干细胞条件培养基的获得方式按照第一方面所述间充质干细胞条件培养基制备方法即可。
优选的，所述检测条件培养基中细胞因子的含量，其中，所述细胞因子可以为HGF以及SCF、EGF、bFGF中一种或几种的组合。既往及发明人的研究发现，肝细胞生长因子(HGF)和干细胞因子(SCF)都具有促进原始卵泡存活和激活的作用，而表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)都可以促进原始卵泡激活，促进卵泡发育，并且这些因子都能通过激活PI3K-AKT信号通路发挥作用。本领域技术人员可通过专业知识判断上述细胞因子或细胞因子的组合与间充质干细胞功能的关系，本发明选择HGF及另外一种或几种因子作为检测对象，通过组合检测提高准确性，所述检测手段优选为酶联免疫吸附法(ELISA)。
优选的，将所述条件培养基用于培养卵巢组织后，检测对象包括卵巢中PI3K-AKT信号通路激活水平、生殖细胞标志物表达量以及组织结构、细胞形态、数量等。
一种实施方式中，体外培养卵巢组织给予VCD造成损伤的同时添加所述条件培养基，培养一段时间后检测卵巢组织中AKT表达量及其磷酸化水平(p-AKT)，以及所述卵巢组织中生殖细胞标志物DDX4表达量。
又一种实施方式中，正常条件卵巢体外培养的同时添加上述条件培养基，培养一段时间后检测卵巢组织中AKT表达量及其磷酸化水平(p-AKT)，以及原始卵泡的激活状态。所述原始卵泡的激活状态，本领域技术人员可通过判断卵巢切面中***的大小以及周围颗粒细胞的形态进行确定。
进一步的，本发明研究还针对上述培养、检测过程的具体参数进行研究，提供了一种最为优选的评价方法：卵巢组织体外培养3～5天后检测所述卵巢组织中PI3K-AKT信号通路的激活水平；培养7～9天后检测VCD损伤卵巢组织中原始卵泡的存活状态；培养11～13天后检测正常条件培养卵巢组织中原始卵泡的激活状态。
本发明研究发现，通过这三个时间点收取培养后的卵巢组织对干细胞条件培养基促进原始卵泡存活与激活的作用进行评估，可以全面、有效地判断MSC的分泌功能。该方法简便、可行，应用前景好。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。以下实施例中，所用材料如下：
1.人重组HGF(Peprotech，100-39)；
2.MEM-alpha培养基(GIBCO，12571-063)；
3.MEM培养基(GIBCO，11095080)；
4.血清替代物(Helios，HPCFDCRL05)；
5.滤器(0.22μM，Millipore，SLGP033RB)；
6.超滤离心管(3KDa，Millipore，UFC900308)；
7.p-AKT、AKT抗体(CST，#9271、#9272)；SOHLH1抗体(Abcam，ab41520)；
DDX4抗体(Abcam，ab13840)；β-Actin抗体(Proteintech,66009-1-Ig)；
8.嵌入型细胞培养小室(Sigma，PICM0RG50)；
9.VCD(4-vinylcyclonhexene diepoxide，Sigma，94956)；
10.DMEM/F12(1:1)培养基(GIBCO，11320-033)；
11.Leibovitz's L-15培养基(GIBCO，11415064)；
12.ITS液体培养基添加物(Sigma，I3146)；
13.牛血清白蛋白(BSA，Sigma，A1933)；
14.Albumax II(Gibco，11021029)；
15.L-ascorbic acid(Sigma，A4403)；
16.青霉素/链霉素溶液(Hyclone，SV30010)
17.蛋白提取试剂盒(Invent，SD-001/SN-002)；
18.T75培养瓶(Corning，430641)；
19.人HGF中和抗体(Novus biological，AF-294-SP)；
20.宫安康(宫腔用交联透明质酸钠凝胶，规格：5mg/ml，常州百瑞吉生物医药有限公司)；
21.Bouin’s液(Sigma,HT10132)；
22.苏木素染色液、伊红染色液(迈威生物)；
23.野生型C57BL/6乳鼠购买于山东大学实验动物中心；
24.C57BL/6老龄鼠购买于北京维通利华实验动物技术有限公司；
25.人脐带间充质干细胞为本实验室制备。
实施例1
1.1体外卵巢培养检测干细胞条件培养基对原始卵泡存活的影响
S1.将相同数量的UC-MSC及成纤维细胞(Fibroblast)接种于75cm2培养瓶培养5天，其中第3天时换液，换液后继续培养。UC-MSC的培养基为MEM-alpha+5％血清替代物+1％青霉素/链霉素；成纤维细胞的培养基为MEM+5％血清替代物+1％青霉素/链霉素。
S2. 5天后当两组细胞达到约90％融合度后，弃上清，PBS清洗3次，将两组细胞更换无血清替代物的DMEM/F12基础培养基12ml，培养48h后收集两组细胞上清液。
S3.将两组细胞上清液1500×g离心5min后，经0.22μM滤器过滤，再经3KDa超滤离心管在常温下5000×g离心50min，浓缩25倍得到约480μl条件培养基，保存至-80℃或直接用于后续实验。
S4.配制卵巢解剖液。用L15培养基配制含有10％FBS以及1％青霉素-链霉素的卵巢解剖液。
S5.进行卵巢培养准备。配制正常或浓缩的卵巢培养基，然后按比例配制VCD(30μM)组、VCD+MSC-CM(终浓度浓缩5倍)组以及VCD+成纤维细胞条件培养基(Fib-CM，终浓度浓缩5倍)组培养基，将嵌入型细胞培养小室放入6孔板培养基(每孔1.5ml)中平衡2h。正常卵巢培养基为DMEM/F12培养基添加1mg/ml BSA、1mg/ml Ablumax II、5％ITS、100uM L-ascorbic acid和1％青霉素/链霉素。
S6.体视镜下在新鲜配置的解剖液中分离出生后4天(PD4)的乳鼠卵巢。轻轻剥离卵巢周围组织及包膜，注意动作迅速并且不要损伤卵巢组织。
S7.将取得的卵巢用解剖液清洗3次，尽快转移至无菌操作台。在置于各组小室之前，用各组相应培养基再次清洗3次，清洗结束后，放置于各组培养小室中间位置，间隔放置，隔天换液。
S8.卵巢经体外培养8天后，收集卵巢，用Bouin’s液固定、梯度脱水后，包埋，5μm连续切片。各组切片进行H&E染色，显微镜下观察拍照。每个卵巢的所有切片每5张取1张进行卵泡计数并分类，将计数结果乘以5得到每个卵巢中的总卵泡数以及各级卵泡总数。
结果表明：如图1所示，由H&E染色结果可见，正常培养的卵巢中存在数量较多的卵泡；经VCD损伤后，卵巢体积减小且卵泡数目明显减少；与Fib-CM相比，MSC-CM对VCD损伤起到挽救作用，卵巢体积增大并且存活的卵泡增加。同时，如图2所示，总卵泡计数及卵泡分类计数显示，与VCD组相比，VCD+MSC-CM组总卵泡数及原始卵泡数显著增加，有统计学差异(*P<0.05)。
1.2利用细胞因子芯片检测干细胞条件培养基并解析其有效成分
收集MSC-CM及Fib-CM步骤如“1.1”部分所述。将浓缩后的两组细胞条件培养基送瑞博奥生物科技有限公司进行细胞因子芯片(Raybiotech，GSH-CAA-440)检测，并进行散点图分析及差异蛋白KEGG通路富集分析。
结果表明：如图3所示，与Fib-CM相比，许多细胞因子在MSC-CM中的表达上调。共检测440个细胞因子，按照fold change>1.2或<0.83进行差异因子的筛选，一共有328个差异表达因子，其中MSC-CM有255个上调因子，73个下调因子。KEGG通路富集分析结果如图4所示，与Fib-CM相比，MSC-CM中上调的差异细胞因子富集于PI3K-AKT、MAPK、JAK-STAT等信号通路，其中PI3K-AKT通路富集的细胞因子数最多。
1.3干细胞条件培养基中关键有效成分HGF的确定
S1.根据细胞因子芯片的结果，对MSC-CM与Fib-CM中的差异因子进行筛选。首先选择差异表达富集在PI3K-AKT通路上的因子(59/246)，并对这些因子设定更严格的标准进行筛选。在这59个因子中，需同时满足(1)在MSC-CM中表达上调；(2)fold change>2；(3)检测信号值>150。同时满足这三个条件的因子共有22个，按照fold change值大小进行排序，其中HGF的fold change值最高，MSC-CM为Fib-CM的20119倍，优先选择该因子进行验证。
S2.卵巢培养方案如“1.1”部分所述。在卵巢培养时加入VCD(30μM)造成卵泡损伤，同时加入MSC-CM(终浓度浓缩5倍)以及不同浓度的HGF中和抗体(HGF Ab，0.1-1ng/ml)对条件培养基中HGF的作用进行阻断。以MSC-CM作为阳性对照，培养4天或8天后收集卵巢，利用Western blot检测PI3K-AKT通路激活水平或生殖细胞标志物SOHLH1。
S3.体外卵巢培养方案步骤如“1.1”部分所述。在卵巢培养时加入VCD(30μM)造成卵泡损伤，同时加入不同浓度的HGF(100-800ng/ml)。以MSC-CM作为阳性对照，培养4天或8天后收集卵巢，利用Western blot检测PI3K-AKT通路激活水平或生殖细胞标志物SOHLH1。
结果表明：当MSC-CM加入HGF中和抗体后，结果如图5所示，卵巢培养4天后，不同浓度中和抗体(0.1、0.5、1ng/ml)逐渐阻断了干细胞条件培养基对通路的激活作用，p-AKT蛋白水平不再升高；培养8天后，不同浓度中和抗体逐渐阻断了MSC-CM对生殖细胞的挽救，随着中和抗体浓度增加，MSC-CM的保护作用逐渐降低。
当卵巢体外培养VCD损伤的同时单独加入HGF后，结果如图6所示，培养4天经VCD损伤的同时单独加入不同浓度HGF(100、400、800ng/ml)后，p-AKT蛋白水平升高，800ng/mlHGF效果最明显。卵巢培养8天后，经过VCD损伤，生殖细胞标志物SOHLH1表达降低，但随着同时添加HGF浓度的升高，SOHLH1表达逐渐增高，说明HGF对生殖细胞起到保护作用，800ng/mlHGF效果最明显。
1.4干细胞条件培养基和HGF对老龄小鼠体内原始卵泡的保护作用
S1.自然衰老小鼠(10月龄)分为对照组，MSC-CM卵巢注射组，MSC-CM+HGF Ab卵巢注射组及HGF卵巢注射组。
S2.配置各组卵巢注射用液。MSC-CM组：收集干细胞条件培养基如“1.1”部分所述，不同之处是将最后的离心时间延长至60-70min，最终浓缩50倍得240μl左右条件培养基，条件培养基中加入交联型透明质酸(终浓度0.3mg/ml)；MSC-CM+HGF Ab组：用浓缩后含有0.3mg/ml交联型透明质酸的MSC-CM溶解HGF中和抗体(终浓度1ng/ml)；HGF组：用0.3mg/ml交联型透明质酸溶液溶解HGF粉末(终浓度800ng/ml)。对照组小鼠卵巢注射含有0.3mg/ml交联型透明质酸的PBS溶液作为对照。
S3.各组小鼠按照分组进行卵巢原位注射，步骤为：小鼠用4％水合氯醛进行麻醉，剪去背部毛发，消毒后在脊柱两侧做0.5cm纵行切口，逐层剪开皮肤、筋膜、肌肉，用弯镊轻轻夹住脂肪垫，暴露双侧卵巢。用Hamilton微量注射器缓慢吸取10μl注射用液，沿卵巢长轴注射于双侧卵巢，每侧卵巢注射5μl。将卵巢归位，逐层缝合。
S4.各组小鼠注射4天或8周后收集卵巢，用试剂盒提取卵巢蛋白，Western blot检测PI3K-AKT通路激活水平或生殖细胞标志物DDX4表达变化。
结果表明：卵巢原位注射4天后结果如图7所示，老龄组PI3K-AKT通路激活(p-AKT)水平较低，当MSC-CM联合交联型透明质酸注射后，该通路明显激活，当MSC-CM中加入HGF中和抗体后对该通路的激活作用减弱，单独注射HGF联合交联型透明质酸也可以激活该信号通路，但弱于MSC-CM注射组。
卵巢原位注射8周后结果如图8所示，对照组老龄小鼠生殖细胞标志物DDX4表达量较低，当MSC-CM联合交联型透明质酸注射后，DDX4表达明显升高，当MSC-CM中加入HGF中和抗体后DDX4表达减弱，单独注射HGF联合交联型透明质酸同样可以升高DDX4表达，但弱于MSC-CM注射组，说明不管是MSC-CM还是单独HGF联合交联型透明质酸，都可以保护老龄小鼠卵巢中更多的原始卵泡存活。
实施例2
2.1ELISA检测干细胞条件培养基中的细胞因子
S1.收集干细胞或成纤维细胞条件培养基如“1.1”部分所述，不同之处是将最后的离心时间延长至60-70min，最终浓缩50倍得240μl左右条件培养基。
S2.将浓缩后的条件培养基送至北京北方生物技术研究所有限公司，利用ELISA检测细胞因子，包括HGF、SCF、EGF和bFGF。
结果表明：如图9所示，MSC-CM中4种促进原始卵泡存活或激活的因子HGF、SCF、EGF和bFGF的水平均显著高于Fib-CM(*P<0.05)。
2.2干细胞条件培养基促进PI3K-AKT通路激活及原始卵泡存活
S1.收集干细胞或成纤维细胞条件培养基如“1.1”部分所述。
S2.进行卵巢培养及分组如“1.1”部分所述。
S3.卵巢经体外培养4天或8天后收集卵巢组织提蛋白，利用Western blot方法检测4天时各组p-AKT及AKT蛋白水平变化和8天时各组生殖细胞标志物DDX4表达。
结果表明：如图10所示，4天时，对照组卵巢有一定水平p-AKT的表达；经过VCD损伤后，p-AKT表达水平显著降低；与Fib-CM相比，MSC-CM能够一定程度上逆转VCD损伤引起的p-AKT降低。各组AKT蛋白表达水平基本一致。如图11所示，8天时，正常培养的卵巢中存在较高的DDX4表达；经VCD损伤后，DDX4表达明显降低；与Fib-CM相比，MSC-CM对VCD损伤引起的生殖细胞减少有一定程度的挽救作用，生殖细胞标志物DDX4表达升高。
2.3干细胞条件培养基促进原始卵泡激活的检测
S1.收集干细胞条件培养基以及卵巢体外培养准备如“1.1”部分所述。
S2.配制对照组以及MSC-CM(终浓度浓缩10倍)组培养基，进行小鼠卵巢体外培养，隔天换液。
S3.培养4天后收集两组卵巢，提取蛋白，利用Western blot方法检测两组p-AKT及AKT蛋白水平变化。
S4.培养12天后收集两组卵巢，Bouin’s液固定后脱水，石蜡包埋后以5μm厚度进行连续切片。卵巢切片进行H&E染色，显微镜下观察并拍照。每5张切片取1张进行观察，计数卵泡并分类，其中以单层扁平颗粒细胞包绕***为原始卵泡，单层鳞状与立方状颗粒细胞混合包绕增大的***或增大的***被一层或多层立方状颗粒细胞包绕为激活状态的卵泡。将计数结果乘以5得到每个卵巢中的总卵泡数，并计算卵泡激活比例＝(激活状态卵泡数/总卵泡数)×100％。
结果表明：如图12所示，卵巢体外培养4天后，与对照组相比，干细胞条件培养基组p-AKT表达升高，两组AKT表达水平基本一致。如图13所示，卵巢培养12天后，干细胞条件培养基组卵巢体积增大，且处于激活状态的卵泡增多。经统计，两组总卵泡数没有明显差异，但干细胞条件培养基组处于激活状态的卵泡比例明显增加(n＝6，***P<0.001)，说明干细胞条件培养基可以促进原始卵泡激活。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于保护原始卵泡的组合物，其特征在于，所述组合物中至少包括间充质干细胞条件培养基与透明质酸的组合，或HGF与透明质酸的组合。
2.如权利要求1所述用于保护原始卵泡的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带、骨髓、脂肪、脐带血、子宫内膜、羊膜、胎盘或牙髓；
优选的，所述间充质干细胞为脐带来源的间充质干细胞；
优选的，所述间充质干细胞条件培养基为浓缩的干细胞培养上清液，浓缩倍数为25-50倍，优选为50倍；
优选的，所述透明质酸优选交联型透明质酸；交联型透明质酸的浓度为0.1-0.3mg/ml，优选为0.3mg/ml；
优选的，所述HGF的浓度为100-800ng/ml，进一步的，为800ng/ml。
3.如权利要求1所述用于保护原始卵泡的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞条件培养基的制备方法如下：将间充质干细胞接种于培养瓶进行培养，待细胞融合度达到85～95％后，更换无血清替代物的基础培养基，继续培养24～72h后收集干细胞上清液；所述干细胞上清液离心、过虑后，再通过超滤浓缩，浓缩倍数为25-50倍，优选为50倍。
4.如权利要求1所述用于保护原始卵泡的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞条件培养基与透明质酸组合物的制备方式如下：向浓缩50倍的干细胞条件培养基中加入透明质酸，使透明质酸的终浓度为0.1-0.3mg/ml，优选为0.3mg/ml。
5.如权利要求1所述用于保护原始卵泡的组合物，其特征在于，所述HGF与透明质酸组合物的制备方式如下：利用PBS配制透明质酸溶液，使透明质酸的终浓度为0.1-0.3mg/ml，优选为0.3mg/ml；然后利用透明质酸溶液溶解HGF，使HGF的终浓度为100-800ng/ml，优选为800ng/ml。
6.权利要求1-5任一项所述用于保护原始卵泡的组合物在制备生殖细胞保存或卵巢功能修复产品中的应用；
优选的，所述生殖细胞包括动物体内与繁衍相关的全部细胞，进一步为雌性动物携带的生殖细胞，即***，包括初级***和次级***；更进一步的，所述生殖细胞为原始卵泡中的初级***；
优选的，所述生殖细胞保存产品包括组织或细胞培养基、受精培养基；
优选的，所述卵巢功能修复产品包括抗卵巢衰老/早衰药物或医疗美容制剂。
7.权利要求6所述用于保护原始卵泡的组合物在制备生殖细胞保存或卵巢功能修复产品中的应用，其特征在于，所述卵巢功能修复产品为用于治疗生理性卵巢衰老或卵巢早衰的药物，所述药物为注射剂，所述注射剂中组合物作为主要活性成分，所述组合物包括间充质干细胞条件培养基与透明质酸或HGF与透明质酸。
8.一种间充质干细胞功能评价方法，其特征在于，获取所述间充质干细胞的条件培养基，检测所述条件培养基中对原始卵泡存活或激活有促进作用的细胞因子的含量；
或，将所述条件培养基用于卵巢组织培养，检测所述条件培养基对损伤条件下卵巢组织中原始卵泡存活的影响；
或，所述条件培养基对正常培养条件下卵巢组织中原始卵泡激活的影响。
9.如权利要求8所述间充质干细胞功能评价方法，其特征在于，所述细胞因子为HGF以及SCF、EGF、bFGF中一种或几种的组合；所述检测手段优选为酶联免疫吸附法；
或，体外培养卵巢组织给予VCD造成损伤的同时添加所述条件培养基，培养一段时间后检测卵巢组织中PI3K-AKT信号通路的激活水平，以及所述卵巢组织中原始卵泡的存活状态；
或，正常条件下卵巢体外培养的同时添加所述条件培养基，培养一段时间后检测卵巢组织中PI3K-AKT信号通路的激活水平，以及所述原始卵泡的激活状态。
10.如权利要求9所述间充质干细胞功能评价方法，其特征在于，所述评价方法中，卵巢组织体外培养3～5天后检测所述卵巢组织中AKT表达量及其磷酸化水平；
或，培养7～9天后检测VCD损伤卵巢组织中生殖细胞标志物DDX4表达量；
或，培养11～13天后检测正常培养条件卵巢组织中原始卵泡的激活状态。
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