ITTO20120859A1 - Nuova applicazione terapeutica di un mezzo condizionato da cellule staminali mesenchimali placentari - Google Patents

Description

Descrizione dell’invenzione industriale dal titolo: “Nuova applicazione terapeutica di un mezzo condizionato da cellule staminali mesenchimali placentariâ€

DESCRIZIONE

La presente invenzione rientra nel campo dei trattamenti terapeutici delle patologie tumorali.

Negli ultimi decenni le terapie anti-tumorali hanno registrato importanti progressi, consentendo in un numero sempre crescente di casi di modificare la prognosi un tempo invariabilmente infausta di queste patologie, rendendole curabili e talvolta guaribili. Tuttavia, la terapia convenzionale dei tumori rimane a tutt’oggi primariamente l’intervento chirurgico, ove la sede tumorale e lo stadio non avanzato della malattia lo consentano, cui si affiancano in genere trattamenti chemioterapici e/o radioterapici, gravati purtroppo da effetti collaterali particolarmente intensi. La chemioterapia viene infatti somministrata per via sistemica, ed i suoi effetti citotossici possono colpire indiscriminatamente le cellule tumorali e quelle non-tumorali, soprattutto nei tessuti sede di attiva proliferazione cellulare, causando l’insorgenza di ulteriori condizioni patologiche quali la mielosoppressione e la mucosite. Anche nell’ambito dei trattamenti radioterapici gli effetti collaterali possono essere di notevole intensità, provocati essenzialmente dal danno causato al DNA delle cellule sane colpite durante l’irradiazione dell'area di localizzazione del tumore, sino a comportare l’insorgenza di tumori secondari.

La ricerca clinica oncologica si à ̈ pertanto indirizzata verso la verifica di approcci terapeutici alternativi che siano soprattutto in grado di esplicare un’azione più mirata sulle cellule bersaglio neoplastiche, ad esempio mediante l’impiego di agenti terapeutici atti ad interferire con i meccanismi cellulari selettivamente attivati nei processi di crescita ed invasione metastatica delle cellule neoplastiche nonché nei processi di neoangiogenesi tumorale.

Tra gli approcci più innovativi, riveste un ruolo particolare la terapia basata sull’impiego delle cellule staminali e dei fattori che queste cellule producono in condizioni fisiologiche. In particolare, recenti evidenze sperimentali suggeriscono che le cellule staminali embrionali umane sono in grado di secernere mediatori trofici capaci di inibire in modo selettivo la proliferazione e la tumorigenicità delle cellule cancerose in vitro. Un’azione anti-tumorale à ̈ stata anche osservata per le cellule staminali mesenchimali adulte (MSC), isolate dal midollo osseo o dall’adipe. Ad esempio à ̈ stato osservato che, in modelli murini in vivo, cellule MSC umane somministrate intra-vena migrano selettivamente verso il tessuto maligno, entrando a far parte dello stroma tumorale, ed inibiscono la proliferazione delle cellule cancerose. Sulla base del peculiare tropismo delle cellule MSC verso sedi attive di tumorigenesi, sono state sviluppate recentemente ulteriori applicazioni terapeutiche che prevedono l’impiego delle cellule mesenchimali per veicolare selettivamente nella sede tumorale molecole biologiche con attività antineoplastica.

Nonostante i promettenti risultati sopra illustrati, l’impiego di cellule staminali umane in campo clinico à ̈ tuttora di difficile applicazione. Problematiche diverse sia di tipo etico che di biosicurezza sono infatti legate alle cellule staminali embrionali umane, in quanto la loro limitata caratterizzazione rende difficile prevedere eventuali effetti collaterali del loro impiego, in particolare il tasso di incidenza di tumori secondari. D’altra parte, l’impiego terapeutico delle cellule MSC presuppone il loro prelievo dal midollo osseo o dall’adipe mediante procedure altamente invasive cui si accompagna la necessità di sottoporre queste cellule a processi difficili e costosi di espansione ex vivo a causa della loro bassa frequenza in questi tessuti (0,001% delle cellule mononucleate del midollo osseo).

Studi recenti hanno rivelato la presenza a livello del mesenchima dei villi coriali placentari e delle membrane amniotiche di una particolare popolazione di cellule, denominate cellule staminali mesenchimali placentari (PDMSC) (Huang YC, Yang ZM, Chen XH, Tan MY, Wang J, Li XQ, et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human placental decidua basalis and resistance to hypoxia and serum deprivation. Stem Cell Rev.

2009;5(3):247-55). In virtù della particolare natura del tessuto placentare, queste cellule sono dotate di un fenotipo mesenchimale-staminale che conferisce loro, accanto ad un elevato potenziale proliferativo e differenziativo, la caratteristica fondamentale di avere una durata di vita ben definita e di andare incontro ad una crescita controllata, riducendo in tal modo i rischi di sviluppo di tumori secondari potenzialmente associati al loro impiego in vivo. A tali caratteristiche si accompagna inoltre la capacità che le PDMSC hanno di esplicare un'azione immunosoppressiva ed anti-infiammatoria.

Sulla base delle singolari proprietà di plasticità funzionale e potenziale differenziativo sopra descritte, nonché della facilità di accesso e utilizzo dell’organo placenta in quanto tale, le cellule staminali mesenchimali placentari sono diventate oggetto di studio, principalmente nel campo della medicina rigenerativa. RÃ1⁄4ster B. e colleghi hanno osservato che le MSC possiedono la capacità di migrare spontaneamente verso organi e tessuti danneggiati per prendere parte al processo riparativo (RÃ1⁄4ster B, Göttig S, Ludwig RJ, Bistrian R, MÃ1⁄4ller S, Seifried E, et al. Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells. Blood.

2006;108(12):3938-44). Ad ulteriore supporto dell’impiego clinico nel campo della medicina rigenerativa, vi à ̈ l’assenza di immunogenicità che caratterizza queste popolazioni mesenchimali staminali, dovuta essenzialmente alla mancanza di espressione di HLA di tipo II e di molecole costimolatorie (CD80, CD86, CD40) necessarie per la stimolazione diretta dei linfociti T, nonché alla resistenza alla lisi da parte dei linfociti T citotossici. Ulteriori ricerche hanno inoltre rivelato che cellule PDMSCs derivate dalle membrane amniotiche di placente fisiologiche possono esercitare un’azione inibitoria sulla proliferazione di linee cellulari tumorali (Magatti M, De Munari S, Vertua E, Parolini O. Amniotic Membrane-Derived Cells Inhibit Proliferation of Cancer Cell Lines by Inducing Cell Cycle Arrest. J Cell Mol Med. 2012 Jan 19. doi: 10.1111/j.1582-4934.2012.01531.x.)

Nella domanda di brevetto italiano TO2011A001183 del 21/12/2011 à ̈ descritto l’impiego del mezzo condizionato di cellule PDMSC isolate dai villi coriali di placente umane fisiologiche a termine per il trattamento terapeutico della patologia preeclamptica. La preeclampsia à ̈ una grave sindrome gravidica umana caratterizzata da una esacerbata risposta infiammatoria maternoplacentare, danno endoteliale generalizzato e difettivo sviluppo placentare.

Come verrà illustrato più in dettaglio nella parte sperimentale che segue, i presenti inventori hanno osservato che il mezzo condizionato (“conditioned medium†, CM) prodotto coltivando in un mezzo di coltura liquido cellule staminali mesenchimali placentari isolate da placente umane complicate da preeclampsia, esercita un sorprendente effetto inibitorio sulla proliferazione e sulla vasculogenesi tumorale. In particolare, come illustrato dal grafico di Figura 1, il trattamento di espianti primari e metastatici di tessuto tumorale mammario con il mezzo condizionato suddetto induce, rispetto ad i controlli, una significativa e sorprendente riduzione dei livelli di espressione genica del fattore VEGF (“Vascular Endothelial Growth Factor†), noto quale principale fattore di crescita vascolare coinvolto nei processi di neo-angiogenesi tumorale, e del fattore trascrizionale JunB, oncogene appartenente alla famiglia Activator Protein-1 (AP-1) la cui espressione à ̈ direttamente associata ad una prognosi sfavorevole del tumore mammario. L’efficacia terapeutica di tali cellule appare alquanto sorprendente, considerato che il mezzo condizionato ottenuto coltivando cellule mesenchimali staminali da placente da gravidanze fisiologiche esercita su espianti tumorali un effetto opposto di stimolo dei processi di vasculogenesi.

Le attività inibitorie sul processo angiogenico e sulla proliferazione cellulare tumorale sperimentalmente dimostrate, che si sono rivelate di particolare efficacia anche nei confronti di tessuti cancerosi in stadio avanzato, sono fortemente indicative di un’efficacia clinica anti-tumorale del mezzo condizionato ottenibile dalla coltura in un mezzo di coltura liquido di cellule staminali mesenchimali placentari da placente umane complicate da preeclampsia.

L’approccio sperimentale seguito dagli inventori al fine di identificare le proteine secrete dalle cellule PDMSC da placenta preeclamptica che contribuiscono di concerto agli effetti anti-tumorali del CM precedentemente descritti, si à ̈ basato sull’analisi proteomica del mezzo suddetto mediante impiego di un array commerciale di anticorpi atti a riconoscere specificamente e simultaneamente una pluralità di citochine, chemochine e fattori di crescita. I risultati dello studio proteomico hanno consentito di individuare la presenza di numerosi fattori, indicati nel seguito, tra i quali sono essenziali la proteina 10 indotta dall’interferone gamma (IP-10) e la chemochina del timo regolante l’attivazione (TARC).

Quindi, forma oggetto dell’invenzione un mezzo condizionato (CM) ottenibile coltivando una cellula staminale mesenchimale placentare prelevata dalla placenta preeclamptica in un terreno di coltura liquido, e comprendente almeno i fattori IP-10 e TARC. Tale mezzo condizionato à ̈ particolarmente adatto per l’uso nel trattamento terapeutico di un tumore. Formano altresì oggetto dell’invenzione un procedimento per produrre il mezzo condizionato, l’uso del mezzo condizionato per la preparazione di un medicamento per il trattamento terapeutico di un tumore, una composizione farmaceutica comprendente le proteine IP-10 e TARC, il tutto come definito nelle annesse rivendicazioni che formano parte integrante della presente descrizione.

Nell’ambito della presente descrizione, il termine “cellula staminale mesenchimale placentare da placenta preeclamptica†indica una cellula staminale mesenchimale derivata dalla placenta di una gestante affetta da sindrome preeclamptica. La gestante à ̈ preferibilmente un soggetto umano.

Le cellule staminali mesenchimali di origine placentare appartengono a popolazioni diverse, sulla base del tessuto placentare di origine. La placenta umana à ̈ infatti un organo unico nella sua struttura, che comprende sia tessuti di origine fetale, quali il corion (corion frondoso e corion liscio) e l’amnion, sia tessuti di origine materna, quale la decidua.

In una forma di realizzazione preferita, il mezzo condizionato dell’invenzione à ̈ ottenibile dalla coltura di una cellula staminale mesenchimale placentare di origine coriale. Preferibilmente, ma in modo non limitativo, la cellula mesenchimale staminale coriale presenta le caratteristiche antigeniche di superficie illustrate nella tabella sottostante, che sono state rilevate mediante analisi per citofluorimetria.

Marcatore Analisi citofluorimetrica HLA I

CD105 (Endoglina)

CD166 (ALCAM)

CD90 (Thy-1)

CD73 (5’-nucleotidasi)

CD34 -HLA-DR -CD133 (Prominin-1) -CD20 -CD326 (EpCAM) -CD31 (PECAM-1) -CD45 (PTPRC) -CD14 -

In alternativa, per la preparazione del terreno condizionato à ̈ impiegata una cellula mesenchimale staminale derivata dall’amnion, la quale presenta le caratteristiche antigeniche di superficie illustrate nella suddetta tabella.

Il mezzo condizionato dell’invenzione comprende almeno i fattori IP-10 e TARC, proteine di secrezione cellulare di per sé note per la loro attività anti-tumorale. La chemochina IP-10, appartenente alla famiglia CXC, à ̈ un mediatore importante dell’azione anti-tumorale dell’interferone gamma (IFN gamma) poiché, indotta da quest’ultimo, à ̈ capace di esplicare una potente azione di richiamo dei linfociti T CD8+ e dei macrofagi in sede tumorale nonché di operare un effetto inibitorio sui processi di angiogenesi. Parimenti, un ruolo di richiamo chemotattico viene esercitato dalla chemochina TARC, che à ̈ responsabile della migrazione selettiva di cellule effettrici Th2 attivate verso i tessuti neoplastici.

Accanto alle citochine sopra-descritte, l’analisi del mezzo condizionato da cellule PDMSC condotta mediante impiego del kit RayBio® Human Cytokine Antibody Array 5 ha rivelato la presenza di ulteriori modulatori funzionali secreti dalle cellule staminali mesenchimali placentari derivate da placenta preeclamptica, identificando in tal modo un distinto profilo di espressione proteica.

Pertanto, in un’ulteriore forma di realizzazione, il mezzo condizionato dell’invenzione comprende inoltre la proteina tirosin-chinasi 1 fms-simile solubile (sFlt-1), l’interleuchina-6 (IL-6), l’interleuchina-8 (IL-8) e/o il fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa). La proteina sFlt-1 à ̈ una molecola solubile dall’elevato potenziale anti-angiogenico; le molecole IL-6, IL-8 e TNF-alfa sono potenti citochine pro-infiammatorie mediatrici di un’azione citotossica nei confronti delle cellule tumorali.

Preferibilmente, il mezzo condizionato dell’invenzione comprende inoltre una o più proteine scelte dal gruppo che consiste di ENA-78, GRO, GRO-alfa, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-16, MCP-1, MCP-2, MCSF, MDC, ANGIOGENIN, ONCOSTATIN m, VEGF, BDNF, BLC, CKb 8-1, EOTAXIN 2, EOTAXIN 3, FLT-3 LIGAND, FRACTALKINE, GCP-2, GDNF, HGF, IFN-gamma, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, LIF, LIGHT, MCP-3, MCP-4, MIF, MIG, MIP-3alpha, MIP-1beta, MIP-16, NAP-2, NT-3, OSTEOPONTIN , OSTOPROTEGERIN, PDGFBB, RANTES, SCF, SDF, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TIMP-1 e TIMP-2, EGF, Thrombopoietin, LEPTIN, Eotaxin, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-9, IGFBP-3, NT-4, PARC, PIGF, e qualsiasi loro combinazione.

L’analisi delle citochine che à ̈ stata eseguita dagli inventori non ha rilevato nel mezzo condizionato dell’invenzione le seguenti proteine, in quanto assenti o presenti in concentrazioni minime e/o inferiori al limite di rilevabilità del sistema array utilizzato: GM-CSF, I-309, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, p40p70, IL-13, MIP-1, TNF-beta, IGF-I, IGFBP-4, TGF-beta 3.

In una forma di realizzazione preferita, il mezzo condizionato à ̈ usato per il trattamento terapeutico di un tumore, preferibilmente un tumore epiteliale, più preferibilmente un tumore della mammella. Nel contesto della presente descrizione, il termine “epiteliale†indica l’origine istologica delle cellule tumorali proliferanti sede della trasformazione neoplastica.

In virtù dell’assenza di immunogenicità che caratterizza le cellule PDMSC, il mezzo condizionato dell’invenzione può opzionalmente comprendere una frazione cellulare che consiste delle cellule mesenchimali staminali placentari da placenta preeclamptica da cui à ̈ stato ottenuto. In alternativa, il mezzo condizionato à ̈ privo di elementi cellulari.

Nell’ambito della presente invenzione rientra anche un procedimento per ottenere il mezzo condizionato precedentemente descritto, che comprende le fasi di:

(i) coltivare una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta preeclamptica in un mezzo di coltura basale liquido privo di siero per almeno 3 ore;

(ii) separare in tutto o in parte la frazione cellulare dal mezzo di coltura liquido.

Nel contesto della presente descrizione il termine “basale†si intende riferito ad un mezzo di coltura che contiene sali inorganici, aminoacidi e vitamine normalmente necessari per supportare la crescita di cellule di mammifero che non abbiano particolari esigenze nutrizionali. A titolo esemplificativo e non limitativo, si citano i seguenti mezzi di coltura liquidi che differiscono tra loro essenzialmente per il contenuto di sali ed aminoacidi: il Basal Medium Eagles (BME), il Minimum Essential Medium (MEM), il Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), il Nutrient Mixture F-10 (HAM's F-10) e il Nutrient Mixture F-12 (HAM's F-12). La selezione del mezzo di coltura più adeguato rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

Secondo il procedimento dell’invenzione, il mezzo di coltura non à ̈ addizionato con siero, onde evitare che i fattori di crescita contenuti nel siero possano interferire ed alterare gli effetti prodotti dagli specifici fattori secreti dalle cellule PDMSC da placenta preeclamptica.

Prima di prelevare il mezzo condizionato, le cellule staminali mesenchimali placentari da placenta preeclamptica sono lasciate in coltura per un lasso di tempo sufficiente a consentire la loro adesione al substrato di coltura, la loro moltiplicazione e la secrezione dei componenti che caratterizzano il suddetto mezzo e che lo rendono vantaggiosamente efficace per il trattamento terapeutico di un tumore. Tale lasso di tempo à ̈ di almeno 3 ore, preferibilmente per almeno 12, almeno 24 ore, almeno 48 ore, almeno 72 ore o almeno 96 ore o almeno 120 ore o almeno 1 settimana o anche più.

Allo scopo di operare la separazione, totale o parziale, della frazione cellulare dal mezzo condizionato da cellule PDMSC da placenta preeclamptica, può essere impiegata qualsiasi metodologia di per sé nota. Ad esempio, il mezzo condizionato dell’invenzione può essere sottoposto a filtrazione utilizzando complessi filtranti di adeguata porosità che consentano di trattenere gli elementi cellulari ed i loro residui in sospensione. Alternativamente, la separazione del mezzo condizionato dalle cellule PDMSC da cui à ̈ stato ottenuto, può essere conseguita mediante centrifugazione e conseguente sedimentazione delle cellule stesse. Pertanto, in una forma di realizzazione preferita dell’invenzione, la fase di separazione del mezzo condizionato dell’invenzione dalla componente cellulare viene eseguita mediante filtrazione o centrifugazione o la combinazione di entrambe. La scelta delle procedure di separazione rientra ampiamente nelle conoscenze e nelle capacità del tecnico medio del settore.

Nell’ambito della presente invenzione rientra altresì una composizione farmaceutica comprendente almeno le proteine IP-10 e TARC sopra identificate come essenziali per l’attività anti-tumorale del mezzo condizionato che forma oggetto dell’invenzione. Ulteriori componenti facoltativi della composizione farmaceutica dell’invenzione sono le proteine sFlt-1, THF-alfa, ENA-78, GRO, GRO-alfa, IL-5, IL-7, IL-6, IL-8, IL-10, IL-15, IL-16, MCP-1, MCP-2, MCSF, MDC, ANGIOGENIN, ONCOSTATIN m, VEGF, BDNF, BLC, CKb 8-1, EOTAXIN 2, EOTAXIN 3, FLT-3 LIGAND, FRACTALKINE, GCP-2, GDNF, HGF, IFN-gamma, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, LIF, LIGHT, MCP-3, MCP-4, MIF, MIG, MIP-3alpha, MIP-1beta, MIP-16, NAP-2, NT-3, OSTEOPONTIN, OSTOPROTEGERIN, PDGFBB, RANTES, SCF, SDF, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TIMP-1 e TIMP-2, EGF, Thrombopoietin, LEPTIN, Eotaxin, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-9, IGFBP-3, NT-4, PARC, PIGF, e qualsiasi loro combinazione. Oltre alle molecole terapeuticamente attive, la composizione farmaceutica dell’invenzione comprende idonei eccipienti, veicoli e/o diluenti farmaceuticamente accettabili, la cui scelta ed impiego rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

Preferibilmente, la composizione farmaceutica dell’invenzione à ̈ in una forma idonea alla somministrazione per via sistemica, più preferibilmente per iniezione, allo scopo di garantire la sua diffusione in circolo in maniera efficace. Naturalmente nell’ambito della presente invenzione rientra l’impiego di sistemi iniettivi di qualsiasi tipologia, la cui selezione rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

In una forma di realizzazione alternativa, la composizione farmaceutica dell’invenzione à ̈ in una qualsivoglia forma farmaceutica idonea alla somministrazione orale, la cui selezione e preparazione rientra nelle capacità del tecnico medio del settore.

Gli esempi che seguono sono forniti a scopo illustrativo e non limitativo della portata dell’invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni.

ESEMPIO 1: Isolamento di Cellule Staminali Mesenchimali da Placenta preeclamptica (PDMSCs)

Le cellule mesenchimali staminali placentari (Placenta-derived Mesenchymal Stem Cells - PDMSCs) sono state isolate dal piatto basale di placente derivate da gravidanze complicate da preeclampsia. La diagnosi di preeclampsia à ̈ stata eseguita secondo i criteri stability dall’American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG): presenza di ipertensione indotta dalla gravidanza (sistolica ≥140 mmHg, diastolica ≥90 mmHg) e proteinuria (≥300mg/24h) dopo le 20 settimane di età gestazionale in donne precedentemente normotese.

Sono state escluse gravidanze con malformazioni congenite, anomalie cromosomiche (di numero e/o struttura) o infezioni intrauterine evidenti.

La raccolta delle placente e il successivo campionamento di tessuto placentare à ̈ stato eseguito dopo il parto previo ottenimento del consenso informato ed in accordo con le linee guida del comitato etico interaziendale O.I.R.M. Sant’Anna – Ospedale Mauriziano di Torino.

Dalla placenta sono state separate meccanicamente le membrane (amnion e corion liscio) e la placenta.

Dal piatto basale placentare (porzione della placenta formata dai villi coriali placentari e a contatto con la parete uterina) sono state prelevate biopsie di tessuto a tutto spessore previa rimozione meccanica della decidua basale (costituita da cellule endometriali materne modificate dall’interazione con il sinciziotrofoblasto).

Le biopsie placentari sono state successivamente sottoposte a ripetuti lavaggi a temperatura ambiente con HBSS (Hank’s Buffered Salt Solution, in soluzione acquosa) sterile (Gibco, Invitrogen by Life Technologies), sino alla completa rimozione del sangue in eccesso.

Le biopsie sono state quindi omogenizzate meccanicamente e sottoposte a digestione enzimatica con 100 U/ml di Collagenasi I (Gibco, Invitrogen by Life Technologies) e 5 µg/ml di Desossiribonucleasi I (DNAsi I, Invitrogen by Life Technologies) in DMEM LG (Dulbecco’s Modified Minimum Essential Medium Low Glucose senza L-glutamina e senza Fetal Bovine Serum-FBS), a 37°C per 3 ore in bagnetto termostatato con agitatore.

La sospensione cellulare così ottenuta à ̈ stata sottoposta a centrifugazione per 5 secondi a 540g alla temperatura di 4°C al fine di rimuovere il particolato non digerito. Il surnatante à ̈ stato raccolto e filtrato attraverso filtri Cells strainer con pori di 70 micron di diametro. Dopo la filtrazione, la soluzione à ̈ stata centrifugata a 540g per 5 minuti alla temperatura di 4°C al fine di ottenere la sedimentazione delle cellule. Il surnatante à ̈ stato quindi scartato e le cellule sono state risospese in HBSS sterile (30 ml per ogni 30 grammi di tessuto originario).

Sotto la soluzione così ottenuta à ̈ stato stratificato un volume di Ficoll Paque Premium 1.073 (GE Healthcare Europe) nella proporzione di 1:3 rispetto al volume di partenza. Il preparato à ̈ stato centrifugato a 540 g per 20 minuti a 20°C e l’anello di cellule mononucleate posizionato nella fase centrale del gradiente à ̈ stato raccolto, risospeso in HBSS (50ml per ogni 30 grammi di tessuto originario) e centrifugato a 540g per 10 minuti a 20°C al fine di rimuovere i residui di Ficoll.

Dopo la centrifugazione, il surnatante à ̈ stato scartato e le cellule risospese in DMEM LG addizionato con 10% di FBS (Gibco, Invitrogen by Life Technologies) e Gentamicina 0,1%. Le cellule sono state infine piastrate in fiasche da coltura cellulare e incubate a 37°C con il 5% di CO2.

Le cellule sono state mantenute in coltura a 37°C ed in presenza del 5% di CO2. Al raggiungimento del 90% di confluenza, le cellule in coltura sono state dissociate mediante trattamento con tripsina TrypLE Express (tripsina di origine vegetale senza derivati animali certificata GMP, Invitrogen by Life Technologies), al fine di promuoverne l’espansione.

ESEMPIO 2: Caratterizzazione delle cellule PDMSC da placenta preeclamptica

Le cellule staminali mesenchimali isolate dalle placente complicate da preeclampsia (piatto basale-porzione coriale) come descritto nell’Esempio 1, sono state caratterizzate mediante citofluorimetria analizzando i principali marcatori antigenici di superficie tipici di questo tipo cellulare.

La presenza o l’assenza di tali antigeni à ̈ stata valutata utilizzando anticorpi monoclonali coniugati con fluorocromi (Myltenyi, Bologna, Italia). Attraverso la misurazione della fluorescenza à ̈ stato possibile verificare che tutte le linee cellulari di PDMSC da placente preeclamptiche sono positive per l’espressione dei marcatori di superficie CD105, CD166, CD90 e CD73 e negative per l’espressione di HLAII, CD34, CD133, CD20, CD326, CD31, CD45 e CD14, mostrando così un appropriato fenotipo mesenchimale ed escludendo la presenza di possibili contaminazioni da parte di cellule trofoblastiche/epiteliali e di progenitori ematopoietici. Inoltre, l’analisi del fenotipo cellulare à ̈ stata anche condotta mediante esperimenti di RT-PCR dai quali à ̈ emerso che tutte le PDMSC esprimono anche i geni tipici delle cellule staminali embrionali, Oct4 (Octamer-binding transcription factor 4) e NANOG (Homeobox protein NANOG).

Al fine di valutare le caratteristiche di staminalità delle suddette cellule, al terzo passaggio di coltura le PDMSCs sono state esaminate per il loro potenziale differenziativo in tre diversi lineage: osteoblasti, adipociti e condroblasti. Il differenziamento à ̈ stato ottenuto mediante l’utilizzo di specifici medium di induzione. Per la differenziazione osteogenica, le colture cellulari sono state incubate in α-MEM addizionato con 20% di FCS, 100 U/ml penicillina, 100 µg/ml streptomicina, 2 mM L-glutammina, 20 mM β-glicerolo fosfato, 100 nM desametasone e 250 µM ascorbato 2-fosfato. Per la differenziazione adipogenica, le colture cellulari sono state incubate con α-MEM addizionato con 20% FCS, 100 U/ml penicillina, 100 µg/ml streptomicina, 12 mM L-glutammina, 5 µg/ml insulina, 50 µM indometacina, 1x10-6 M desametasone e 0,5 µM 3-isobutil-1-metilxantina. Per la differenziazione condrogenica, le colture sono state incubate in Chondrocyte Basal Medium addizionato con R3-IGF-1 1mL, bFGF 2,5 ml, transferring 0,5 mL, insulina bovina 1 M, FBS 25 mL e gentamicina/amfotericina-B 0,5 mL. Il mezzo à ̈ stato cambiato due volte a settimana per tre settimane. L’avvenuta differenziazione cellulare à ̈ stata valutata utilizzando opportune colorazioni. La differenziazione osteoblastica à ̈ stata valutata con la colorazione Alizarin Red S. L’Alizarina determina la formazione di placche calciche insolubili ed intensamente colorate, permettendo di mettere in evidenza la matrice ossea. La differenziazione condrogenica à ̈ stata valutata mediante colorazione Alcian Blue che forma ponti salini tra i polianioni dei mucopolisaccaridi acidi e permette di colorare di blu i glicosaminoglicani. La differenziazione adipogenica à ̈ stata evidenziata con colorazione Oil Red O che mette in evidenza i lipidi solubilizzati dal solvente presente nella soluzione colorante ed i depositi di grasso risultano di colore rosso.

ESEMPIO 3: Produzione del mezzo condizionato Allo scopo di ottenere il mezzo condizionato dell ́invenzione, le cellule PDMSC preeclamptiche sono state piastrate tra il terzo e il quinto passaggio di coltura, al raggiungimento dell’adeguato grado di purezza dimostrato dall’assenza di cellule contaminanti trofoblastiche e/o emopoietiche derivanti dal tessuto placentare originario. Più specificamente, le cellule sono state piastrate ad una confluenza di 1x10<5>cellule per millilitro in DMEM LG senza Siero Fetale Bovino (FBS), alla temperatura di 37°C ed in presenza di 5% di CO2. Le cellule PDMSC sono state mantenute in coltura per un tempo variabile da almeno 3 ore ad una settimana o più. I mezzi condizionati di coltura sono stati quindi raccolti a tempi prestabiliti, e sottoposti successivamente a centrifugazione e/o filtrazione, al fine di rimuovere i detriti cellulari contaminanti. Ove necessario, i mezzi condizionati così ottenuti possono essere conservati mediante congelamento a -80°C.

ESEMPIO 4: Analisi del mezzo condizionato mediante Array di Citochine

Allo scopo di investigare il profilo delle citochine secrete dalle cellule PDMSC preeclamptiche e presenti nel mezzo condizionato dell’invenzione, à ̈ stato impiegato il kit commerciale RayBio® Human Cytokine Antibody Array 5, secondo le indicazioni del produttore, che consente l’analisi simultanea di 80 diverse citochine nel medesimo campione. In particolare, la procedura si basa sull’impiego di una membrana array su cui sono state immobilizzate molecole anticorpali atte a riconoscere specificamente e catturare le citochine eventualmente presenti nel campione in esame. Nel contesto del presente esperimento, i segnali generati sulla membrana array in corrispondenza dei siti di formazione degli immunocomplessi sono stati quantificati mediante analisi densitometrica, utilizzando il software ImageQuant. I livelli di espressione delle citochine così identificate non sono stati determinati in misura assoluta, bensì normalizzati come valore percentuale rispetto ad un gruppo di controlli standard inclusi nel kit, assegnando ai controlli positivi il valore 100% e ai controlli negativi il valore 0%. I risultati dell’esperimento sopra descritto sono riportati nella tabella che segue:

Proteina % rispetto al campione standard ENA-78 38,1%

GRO 79,4%

GRO-alfa 11’1%

IL-6 105,8%

IL-7 6,4%

IL-8 128,9%

MCP-1 74,1%

MCP-2 8,7% MCSF 6,9% MDC 5,1% ANGIOGENIN 25,8% ONCOSTATIN m 8,5% VEGF 27,9% BDNF 19,8% BLC 10% CKb 8-1 4,8% EOTAXIN 2 2,5% EOTAXIN 3 1,3% FLT-3 LIGAND 11,6% FRACTALKINE 12,4% GCP-2 8,5% GDNF 8,3% HGF 2,1% IGFBP-1 3,8% IGFBP-2 14,5% IGFBP-4 16,9% IP-10 16,7% LIF 13,6% LIGHT 7,6% MCP-4 23,3% MIF 11% MIP-3alfa 4,3% NAP-2 16% NT-3 20,2% OSTEOPONTIN 43,7% OSTOPROTEGERIN 35% TGF-beta 2 29,9% TIMP-1 33,4% TIMP-2 71,4% MIG 7% IL-5 2,7% TGF-β3 8,7% MIP-1beta 13,7% PDGFBB 13,8% SDF 7,1% IL-10 2,7% IL-15 5,4% IFN-gamma 3,5% MCP3 13,3% MIP-1Ï 1,5% RANTES 7,4% SCF 5,2% TARC 15,4% TGF-beta1 6,8% TNF-alfa 11,1% EGF 4,7% Thrombopoietin 1,7% LEPTIN 14,9%

Eotaxin 2,3%

FGF4 2,4%

FGF6 7%

FGF7 3,9%

FGF9 9,8%

IGFBP-3 3,4%

IL-16 5,4%

NT-4 2%

PARC 9,8%

PlGF 12,8%

Inoltre, l’analisi delle citochine che à ̈ stata eseguita non ha rilevato nel mezzo condizionato dell’invenzione le seguenti proteine, in quanto assenti o presenti in concentrazioni inferiori al limite di rilevabilità del sistema array utilizzato: GM-CSF, I-309, IL-1a, IL-1b, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, p40p70, IL-13, MIP-1, TNF-beta, IGF-I, IGFBP-4, TGF-beta 3.

Si à ̈ invece proceduto all’individuazione dell’espressione della molecola anti-angiogenica sFlt-1 da parte delle cellule staminali mesenchimali preeclamptiche attraverso indagini di Real Time PCR (Polymerase Chain Reaction) per la determinazione dell’espressione genica e di Western Blotting per la determinazione dell’espressione proteica. L’analisi Real Time PCR à ̈ stata effettuata sull’mRNA (RNA messaggiero) estratto dalle suddette cellule placentari da placente preeclamptiche utilizzando un set di primers e sonda TaqMan prodotti su nostra richiesta dalla Life Technologies divisione Applied Biosystems, basati sulle sequenze precedentemente pubblicate da Nevo O. et al. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2008 93:285-292. L’analisi Western Blot à ̈ stata effettuata utilizzando un anticorpo policlonale specifico anti-sFlt-1 acquistato dalla Life Technologies divisione Invitrogen (Numero di catalogo 36-1100) secondo le indicazioni fornite dal produttore. Le indagini Real Time PCR e Western Blot hanno rivelato una produzione significativamente più elevata di sFlt-1 nelle cellule staminali mesenchimali preeclamptiche rispetto ai controlli fisiologici, sia a livello genico (incremento di 4,5 Fold, p<0,001) che proteico(incremento di 2 Fold, p<0,05).

ESEMPIO 5: Valutazione dell’efficacia terapeutica del mezzo condizionato ottenuto da coltura di cellule PDMSC da placenta preeclamptica

Allo scopo di valutare l’efficacia terapeutica del mezzo condizionato dell’invenzione, sono stati condotti studi su un modello in vitro rappresentato da espianti di tessuto tumorale primitivo e metastatico prelevati da tumori ottenuti da pazienti sottoposte ad intervento chirurgico per la rimozione del tumore mammario stesso e delle sue metastasi. In particolare, à ̈ stato verificato se il trattamento dei suddetti espianti con il mezzo condizionato dell’invenzione inducesse una riduzione dei livelli di espressione dei fattori VEGF e JunB quale indicazione di una significativa azione anti-angiogenica e anti-tumorale. Diverse evidenze clinico-sperimentali hanno infatti dimostrato che il VEGF à ̈ sovra-espresso nei tumori ed à ̈ indice di aggressività del tumore stesso inducendo la formazione di nuovi vasi che portano nutrimento al tessuto tumorale, mentre JunB à ̈ un oncogene la cui espressione à ̈ associata direttamente con una cattiva prognosi del tumore mammario.

Per le procedure sperimentali sono stati utilizzati campioni di tessuto tumorale di tre differenti pazienti prelevati da biopsie di scarto ottenuto dopo le normali procedure anatomo patologiche post-operatorie. Da ciascun tumore e dalle rispettive metastasi linfonodali sono stati ottenuti 8 espianti che sono stati messi in coltura su inserti contenenti matrigel. Le colture sono state sottoposte a trattamento per 48 ore con il mezzo condizionato ottenuto coltivando per 48 ore cellule PDMSC isolate da placente di gravidanze preeclamptiche, come precedentemente descritto.

Nel dettaglio, gli espianti costituiti da una porzione di tessuto tumorale primario o metastatico delle dimensioni di circa 5mm di diametro e con morfologia e struttura conservata e di pari peso, sono stati sezionati, appoggiati nell’inserto contenente 150µl di matrigel e mantenuti in 500 µl di terreno HAM F12 senza FBS per 12 ore alla temperatura di 37°C ed in presenza di 5% di CO2al fine di riequilibrare le loro condizioni a seguito dello stress post-operatorio. Trascorse 12 ore, il terreno à ̈ stato sostituito con 500 µl di mezzo condizionato (in 12 espianti) o alternativamente con 500 µl di terreno DMEM LG senza siero (in 12 espianti di controllo). Le colture sono state incubate nelle medesime condizioni per ulteriori 48 ore. Al termine dell’esperimento, gli espianti trattati e di controllo sono stati collezionati e processati per l’isolamento dell’mRNA utilizzando il reagente TRIzol (Invitrogen Life Techonologies), seguendo il protocollo della casa produttrice. Una volta isolato, il messaggero à ̈ stato purificato mediante trattamento con DNAasi (Sigma-Aldrich) al fine di rimuovere eventuali contaminazioni da DNA genomico. La quantità dell’RNA estratto à ̈ stata determinata tramite lettura spettrofotometrica alla lunghezza d’onda di 260 nm, mentre la purezza à ̈ stata stimata tramite i rapporti d’assorbanza A260/A280 a 1,8-2.

Il cDNA (DNA complementare) utile per la successiva analisi dei livelli di espressione del VEGF e di JunB Ã ̈ stato sintetizzato a partire da 5 µg di RNA totale precedentemente estratto, mediante RT-PCR utilizzando un approccio random hexamers con il kit RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis (Fermentas Life Science) secondo il protocollo consigliato dalla ditta.

L’analisi delle variazioni di espressione genica di VEGF e JunB a seguito del trattamento delle colture tumorali con il mezzo condizionato dell’invenzione à ̈ stata condotta mediante Real Time PCR utilizzando primers e probes TaqMan (Life Technologies, divisione Applied Biosystem). Al fine di operare una quantificazione relativa, i segnali della Real Time PCR sono stati comparati tra i due gruppi di campioni in esame dopo la normalizzazione con i segnali ottenuti per la subunità ribosomiale 18S, utilizzata come referenza interna.

I risultati dell’analisi di espressione genica differenziale, rappresentati dall ́istogramma di Figura 1, dimostrano chiaramente che il trattamento con il mezzo condizionato (CM) dell ́invenzione ha portato ad una riduzione statisticamente significativa rispetto ai controlli dei livelli di espressione sia di VEGF che di JunB negli espianti tumorali e di metastasi trattati (p<0,05).

Claims (21)

1. RIVENDICAZIONI 1. Mezzo condizionato ottenibile mediante coltura di una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta preeclamptica in un mezzo di coltura liquido, il mezzo condizionato comprendendo almeno la proteina 10 indotta dall’interferone gamma (IP-10) e la chemochina del timo regolante l’attivazione (TARC).
2. 2. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 1, che comprende inoltre almeno una proteina scelta dal gruppo che consiste di tirosin-chinasi 1 fmssimile solubile (sFlt-1), interleuchina-6 (IL-6), interleuchina-8 (IL-8) e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa), e qualsiasi loro combinazione.
3. 3. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 1 o 2, che comprende inoltre una o più proteine scelte dal gruppo che consiste di ENA-78, GRO, GRO-alfa, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-16, MCP-1, MCP-2, MCSF, MDC, ANGIOGENIN, ONCOSTATIN m, VEGF, BDNF, BLC, CKb 8-1, EOTAXIN 2, EOTAXIN 3, FLT-3 LIGAND, FRACTALKINE, GCP-2, GDNF, HGF, IFN-gamma, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, LIF, LIGHT, MCP-3, MCP-4, MIF, MIG, MIP-3alpha, MIP-1beta, MIP-16, NAP-2, NT-3, OSTEOPONTIN , OSTOPROTEGERIN, PDGFBB, RANTES, SCF, SDF, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TIMP-1 e TIMP-2, EGF, Thrombopoietin, LEPTIN, Eotaxin, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-9, IGFBP-3, NT-4, PARC, PIGF, e qualsiasi loro combinazione.
4. 4. Mezzo condizionato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, in cui la cellula staminale mesenchimale placentare à ̈ di origine coriale o amniotica.
5. 5. Mezzo condizionato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, che à ̈ esente da cellule.
6. 6. Mezzo condizionato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4, in cui la cellula staminale mesenchimale placentare da placenta preeclamptica à ̈ di origine umana.
7. 7. Mezzo condizionato secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 6, per l’impiego nel trattamento terapeutico di un tumore.
8. 8. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 7, in cui il tumore à ̈ un tumore epiteliale.
9. 9. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 8, in cui il tumore à ̈ un tumore della mammella.
10. 10. Procedimento per la preparazione di un mezzo condizionato secondo la rivendicazione 1, comprendente le fasi di: (i) coltivare una cellula staminale mesenchimale placentare da placenta preeclamptica in un mezzo di coltura basale liquido privo di siero per almeno 3 ore; e (ii) separare in tutto o in parte la frazione cellulare dal mezzo di coltura liquido.
11. 11. Procedimento secondo la rivendicazione 10, in cui il tempo di coltura à ̈ di almeno 6 ore o almeno 12 ore o almeno 48 ore o almeno 72 ore o almeno 96 ore o almeno 120 ore o almeno 1 settimana.
12. 12. Procedimento secondo la rivendicazione 11, in cui la frazione cellulare à ̈ separata dal mezzo di coltura liquido mediante filtrazione e/o centrifugazione.
13. 13. Procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12, in cui la cellula staminale mesenchimale placentare da placenta preeclamptica à ̈ di origine umana.
14. 14. Mezzo condizionato ottenibile mediante un procedimento secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 13.
15. 15. Mezzo condizionato secondo la rivendicazione 14, per l’impiego nel trattamento terapeutico di un tumore, preferibilmente un tumore epiteliale, più preferibilmente tumore della mammella.
16. 16. Composizione farmaceutica per l’impiego nel trattamento terapeutico di un tumore, comprendente almeno la proteina 10 indotta dall’interferone gamma (IP-10) e la chemochina del timo regolante l’attivazione (TARC), ed opzionali veicoli, eccipienti e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
17. 17. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 16, comprendente inoltre una proteina scelta dal gruppo che consiste di tirosinchinasi 1 fms-simile solubile (sFlt-1), interleuchina-6 (IL-6), interleuchina-8 (IL-8) e fattore di necrosi tumorale alfa (TNF-alfa), e qualsiasi loro combinazione.
18. 18. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 16 o 17, comprendente inoltre una o più proteine scelte dal gruppo che consiste di ENA-78, GRO, GRO-alfa, IL-5, IL-7, IL-10, IL-15, IL-16, MCP-1, MCP-2, MCSF, MDC, ANGIOGENIN, ONCOSTATIN m, VEGF, BDNF, BLC, CKb 8-1, EOTAXIN 2, EOTAXIN 3, FLT-3 LIGAND, FRACTALKINE, GCP-2, GDNF, HGF, IFN-gamma, IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-4, LIF, LIGHT, MCP-3, MCP-4, MIF, MIG, MIP-3alpha, MIP-1beta, MIP-16, NAP-2, NT-3, OSTEOPONTIN , OSTOPROTEGERIN, PDGFBB, RANTES, SCF, SDF, TGF-beta 1, TGF-beta 2, TGF-beta 3, TIMP-1 e TIMP-2, EGF, Thrombopoietin, LEPTIN, Eotaxin, FGF-4, FGF-6, FGF-7, FGF-9, IGFBP-3, NT-4, PARC, PIGF, e qualsiasi loro combinazione.
19. 19. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 16 a 18, che à ̈ in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per via sistemica.
20. 20. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, che à ̈ in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione per iniezione.
21. 21. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 19, che à ̈ in una forma farmaceutica idonea alla somministrazione via orale.