CN108794618A - 一种纯化利拉鲁肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纯化利拉鲁肽的方法，包括如下步骤：步骤一，利拉鲁肽粗品预处理得到利拉鲁肽粗肽水溶液；步骤二，去除片段杂质的第一次HPLC纯化；步骤三，除去溶剂，得到利拉鲁肽第一步样品溶液；步骤四，去除合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、差向异构体的第二次HPLC纯化；步骤五，除去部分溶剂得到利拉鲁肽第二步样品溶液，调节PH值到6.5，得到利拉鲁肽最终样品溶液。本发明能够除去合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、差向异构体等杂质，提高拉鲁肽样品纯度和收率。

Description

一种纯化利拉鲁肽的方法
技术领域
本发明涉及肽纯化领域，特别是一种固相合成利拉鲁肽的纯化方法。
背景技术
利拉鲁肽，英文名：Liraglutide。
肽序列为：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly--Gln-
Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH
利拉鲁肽由丹麦诺和诺德公司开发的第一个长效GLP-1类似物，与人胰高糖素样肽-1(GLP-1)同源性达97％。利拉鲁肽具有降低血糖，促进胰岛细胞再生，轻微延长胃排空等多种作用，应用前景广泛。
利拉鲁肽作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，不仅作用时间长，而且充分保留了天然GLP-1的多项生理活性，可安全有效降糖并可能对多种心血管危害因素起保护作用。利拉鲁肽注射剂经皮下注射给药，血药浓度达峰时间为20～14小时，半衰期为11～13小时，每日注射一次，提供24h的血糖控制，其药代动力学特性不受性别或年龄影响。利拉鲁肽绝对是2型糖尿病治疗领域革命性药物。
固相合成利拉鲁肽，合成物中会产生“多Gly”、“缺Gly”及差向异构体(如D-His)等影响样品的纯度和收率的杂质，通过现有纯化技术分离得到利拉鲁肽样品纯度低，收率低；本发明解决这样的问题。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纯化利拉鲁肽的方法，能够除去合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、差向异构体(如D-His)等杂质，提高拉鲁肽样品纯度和收率。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
一种纯化利拉鲁肽的方法，包括如下步骤：
步骤一，利拉鲁肽粗品预处理得到利拉鲁肽粗肽水溶液；
步骤二，去除片段杂质的第一次HPLC纯化；
步骤三，除去溶剂，得到利拉鲁肽第一步样品溶液；
步骤四，去除合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、差向异构体的第二次HPLC纯化；第二次HPLC纯化去除的杂质包含：D-His1、D-Ser8、D-Ala19、D-Glu21、D-Arg30、Endo-Gly31、Endo-Gly29、Des-Gly16。
步骤五，除去溶剂得到利拉鲁肽第二步样品溶液，调节PH值到6.5，得到利拉鲁肽最终样品溶液。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，步骤一，利拉鲁肽粗品预处理得到利拉鲁肽粗肽水溶液；预处理的步骤包括：
1)将利拉鲁肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利拉鲁肽粗肽水溶液；
2)取利拉鲁肽水溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒。收集滤液备用。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，
步骤二，去除片段杂质的第一次HPLC纯化，片段杂质包
括:H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-OH，
H-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
第一次HPLC纯化的具体步骤包括：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行HPLC线性梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽样品的馏分。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，
流动相A采用0.5％磷酸溶液，磷酸溶液由1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0得到。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，步骤三，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利拉鲁肽第一步样品溶液，样品溶液为碱性。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，步骤四，去除合成产生的多Gly的序列、缺Gly的序列及差向异构体的第二次HPLC纯化；
第二次HPLC纯化的具体步骤为：以HILIC色谱柱填料为固定相，以三氟乙酸溶液与乙腈的混合液为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行HPLC梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽样品的馏分。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，流动相A为0.08％三氟乙酸溶液：乙腈＝70V:30V的混合液，0.08％三氟乙酸溶液由1000ml水加三氟乙酸0.8ml混合成。
前述的一种纯化利拉鲁肽的方法，步骤五，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利拉鲁肽第二步样品溶液，利拉鲁肽第二步样品溶液含三氟乙酸，溶液为酸性，用氨水调PH到6.5。
本发明的有益之处在于：
用八烷基硅烷键合硅胶填料与流动相磷酸相结合，可以去除利拉鲁肽大部份的未知杂质以及片段杂质(如：(1-17)片段、18-31片段)，收集的样品纯度达96％；
选用HILIC色谱柱填料为固定相与三氟乙酸溶液：乙腈＝70:30(V:V)为流动相相结合的色谱条件，对合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、及差向异构体(如D-His)等影响样品的纯度和收率的杂质有很好的分离效果；可一次收到纯度为99.6％以上的样品。进而解决了利拉鲁肽成品纯度不高，收率低的问题。
附图说明
图1是本发明纯化后成品的质谱图；
图2是本发明利拉鲁肽粗品的HPLC的1/2图；
图3是本发明利拉鲁肽粗品的HPLC的2/2图；
图4是本发明第一次HPLC纯化后利拉鲁肽的HPLC图；
图5是本发明第二次HPLC纯化后利拉鲁肽的HPLC图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。
一种纯化利拉鲁肽的方法，包括如下步骤：
步骤一，利拉鲁肽粗品预处理得到利拉鲁肽粗肽水溶液；所述预处理步骤包括：
1)将利拉鲁肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利拉鲁肽粗肽水溶液；
2)取利拉鲁肽水溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒。收集滤液备用，作为一种优选，滤膜为0.22μm滤膜。
步骤二，去除片段杂质的第一次HPLC纯化，片段杂质包
括:H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-OH，
H-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
第一次HPLC纯化的具体步骤包括：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行HPLC线性梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽样品的馏分；作为一种实施例，流动相A采用0.5％磷酸溶液，磷酸溶液由1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0得到。
步骤三，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利拉鲁肽第一步样品溶液，样品溶液为碱性。
步骤四，去除合成产生的多Gly的序列、缺Gly的序列及差向异构体的第二次HPLC纯化，包含杂质：D-His1、D-Ser8、D-Ala19、D-Glu21、D-Arg30、Endo-Gly31、Endo-Gly29、Des-Gly16；
第二次HPLC纯化的具体步骤为：以HILIC色谱柱填料为固定相，以三氟乙酸溶液与乙腈的混合液为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行HPLC梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽样品的馏分。作为一种实施例，流动相A为0.08％三氟乙酸溶液：乙腈＝70V:30V的混合液，0.08％三氟乙酸溶液由1000ml水加三氟乙酸0.8ml混合成。需要说明的是：在此基础上做出的配比调整的任意比例都在本发明的保护范围之内。
步骤五，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利拉鲁肽第二步样品溶液，利拉鲁肽第二步样品溶液含三氟乙酸，溶液为酸性，用氨水调PH到6.5。
为了证明本发明的纯化方法，能够去除杂质，得到纯度高，收率高的利拉鲁肽成品，用含2.9g、8g、32g、72g利拉鲁肽粗品样品用本方法做纯化实验，实验过程如下所示：
实施例1：
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含2.9g利拉鲁肽粗品(粗品重量：4克)样品溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的利拉鲁肽粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料固定相(30mm×250mm，10μm)为色谱柱；以0.5％磷酸(取1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为0.57g。
以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料(30mm×250mm，10μm)为色谱柱；以0.08％三氟乙酸溶液(取1000ml水加三氟乙酸0.8ml):乙腈＝70:30(V:V)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为20mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为0.36g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，溶液经对照品定量含利拉鲁肽2.40g，收率达83.0％。
实施例2
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含8g利拉鲁肽粗品(粗品重量：11.2克)溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(50mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.5％磷酸(取1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为60mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为1.6g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料为固定相(50mm×250mm，10μm)的色谱柱：以0.08％三氟乙酸溶液(取1000ml水加三氟乙酸0.8ml):乙腈＝70:30(V:V)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为60mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为1.0g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；溶液经对照品定量含利拉鲁肽6.40g，收率达80.0％。
实施例3
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含32g利拉鲁肽粗品(粗品重量：44.9克)溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的粗肽水溶液备用。
第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(100mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.5％磷酸(取1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为200mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为6.4g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料为固定相(100mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.08％三氟乙酸溶液(取1000ml水加三氟乙酸0.8ml):乙腈＝70:30(V:V)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为200mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为4.0g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；溶液经对照品定量含利拉鲁肽26.33g，收率达82.3％。
实施例4
取利拉鲁肽粗品
样品处理：将含72g利拉鲁肽粗品(粗品重量：101.1克)溶于乙腈水溶液，完全溶解后用0.22μm滤膜过滤。收集过滤后的粗肽水溶液备用，利拉鲁肽粗品的色谱图如图2、3所示。第一步HPLC纯化
色谱条件：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相(150mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.5％磷酸(取1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为600mL每分钟；检测波长为230nm；单针上样量为14.4g；以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于90％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈。得到利拉鲁肽第一步样品溶液，第一步HPLC纯化后的色谱图如图4所示。
第二步HPLC纯化
色谱条件：以HILIC色谱填料为固定相(150mm×250mm，10μm)的色谱柱；以0.08％三氟乙酸溶液(取1000ml水加三氟乙酸0.8ml):乙腈＝70:30(V:V)为流动相A；以乙腈为流动相B；流速为600mL每分钟；检测波长为230nm；上样量为9.0g。以下表洗脱梯度进行洗脱。
收取纯度大于99.6％的利拉鲁肽样品的馏分。用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈；溶液经对照品定量含利拉鲁肽58.68g，收率达81.5％。
由4个实施例可知，通过本方法纯化利拉鲁肽，都能得到高于80％的收率，且得到的利拉鲁肽的纯度大于99.6％，第二步HPLC纯化后的色谱图如图5所示。
本发明提供一种纯化利拉鲁肽的方法，能够除去合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、差向异构体(如D-His)等杂质，提高拉鲁肽样品纯度和收率，收率高于80％，利拉鲁肽的纯度大于99.6％。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，利拉鲁肽粗品预处理得到利拉鲁肽粗肽水溶液；
步骤二，去除片段杂质的第一次HPLC纯化；
步骤三，除去溶剂，得到利拉鲁肽第一步样品溶液；
步骤四，去除合成产生的多Gly序列的肽、缺Gly序列的肽、差向异构体的第二次HPLC纯化；
步骤五，除去溶剂得到利拉鲁肽第二步样品溶液，调节PH值到6.5，得到利拉鲁肽最终样品溶液。
2.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤一，利拉鲁肽粗品预处理得到利拉鲁肽粗肽水溶液；所述预处理的步骤包括：
1)将利拉鲁肽粗品溶于乙腈水溶液中得到利拉鲁肽粗肽水溶液；
2)取利拉鲁肽水溶液用滤膜过滤除去不溶性颗粒，收集滤液备用。
3.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，
步骤二，去除片段杂质的第一次HPLC纯化，所述片段杂质包括：
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-OH，H-Ala-Ala-Lys(Pal-γ-Glu)-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH；
第一次HPLC纯化的具体步骤包括：以八烷基硅烷键合硅胶填料为固定相，以磷酸为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行HPLC线性梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽样品的馏分。
4.根据权利要求3所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，
所述流动相A采用0.5％磷酸溶液，磷酸溶液由1000ml水，加5ml磷酸，混合均匀，用三乙胺调节pH值至7.0得到。
5.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤三，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利拉鲁肽第一步样品溶液，样品溶液为碱性。
6.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤四，去除合成产生的多Gly的序列、缺Gly的序列及差向异构体的第二次HPLC纯化；第二次HPLC纯化去除的杂质包括：D-His1、D-Ser8、D-Ala19、D-Glu21、D-Arg30、Endo-Gly31、Endo-Gly29、Des-Gly16；所述第二次HPLC纯化的具体步骤为：以HILIC色谱柱填料为固定相，以三氟乙酸溶液与乙腈的混合液为流动相A，以乙腈为流动相B，检测波长为230nm，进行HPLC梯度洗脱，收取含有利拉鲁肽样品的馏分。
7.根据权利要求6所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，流动相A为0.08％三氟乙酸溶液：乙腈＝70V:30V的混合液，0.08％三氟乙酸溶液由1000ml水加三氟乙酸0.8ml混合成。
8.根据权利要求1所述的一种纯化利拉鲁肽的方法，其特征在于，步骤五，用旋转蒸发器水浴温度在30～35℃，真空度在-0.09MPa以下除去部分乙腈，得到利拉鲁肽第二步样品溶液，利拉鲁肽第二步样品溶液含三氟乙酸，溶液为酸性，用氨水调PH到6.5。
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