CN108610391A - 一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法，属于天然产物有效成分提取领域技术领域。其特征在于，通过连续回流的方法提取桑黄子实体颗粒中的有效成分，通过大孔树脂吸附‑脱附原理将桑黄中多糖和腺苷有效地分离，多糖收率为6.5％以上，纯度可达65％以上，腺苷收率不低于0.04％，纯度不低于92％，本发明操作简单，效率高，易于推广。

Description

一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法
技术领域
本发明涉及天然产物有效成分提取领域，尤其涉及一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法。
背景技术
在中国，桑黄自古就是一味名贵的中药，中国民间将桑黄作为一种治疗肝病、癌症的神药。近几十年，桑黄的药理作用渐渐得到现代医学的解释，桑黄具有刺激体液免疫调节和细胞免疫调节的活性，身体因而释放出很多的免疫产物。桑黄主要的有效功能成分有桑黄多糖、黄酮、三萜类、酶类物质，还有大量人体有益的氨基酸、微量元素等。日本、韩国是较早研究桑黄抗肿瘤的国家，日本国家癌症研究中心进行大量的研究发现，桑黄对于肿瘤抑制率为96.7％。就肿瘤的免疫代替疗法而言，桑黄的效果在国际上被公认为第一位。
腺苷是桑黄中另一种具有广泛药用价值的有效成分，它具有抗癫痫和强效扩张冠脉的作用，可用于治疗心绞痛、心肌梗塞、冠脉功能不全、动脉硬化等病症，同时还是重要的医药中间体，可合成治疗恶性肿瘤药物8-氯腺苷等。
桑黄子实体质地较硬，成份复杂，致使多糖分离纯化较为困难，传统的样品前处理方法一般采用高温水煮、超声的方法，而高温水煮耗时长、有效成分挥发严重、效率低，超声波过强时会破坏多糖等的结构。另外，现有桑黄多糖提取方法只能单纯的提取多糖，而忽略了桑黄中其他有药用价值的活性物质，无疑造成了资源的浪费。
发明内容
本发明提供一种原料利用率高、操作简单、成本低、产物获得率高的一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法。本发明的技术方案如下：
(1)将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后，投入提取罐中；
(2)向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水，连续回流1.5-3小时，抽滤，滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时，抽滤；
(3)将步骤(2)中两次抽滤所得滤液混合，浓缩后获得0.3-0.5g/ml的桑黄溶液；
(4)用氢氧化钠溶液调节步骤(3)中桑黄溶液的pH值至9-10，将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中，控制流出液的流速，所得流出液即为桑黄多糖粗溶液；
(5)将步骤(4)中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性，并透过可以过滤掉蛋白质等大分子的第一超滤膜，收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜，所得截留液通过减压真空浓缩的方式，获得桑黄多糖；
(6)将步骤(4)中大孔树脂中吸附的吸附物用乙醇溶液洗脱，所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏；
(7)取步骤(6)中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样，上层析柱，先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱，再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱，每1500ml收集一个流份，液相检测，将流份中的第24-29流份合并，减压真空浓缩，将出现的沉淀物合并，滤取沉淀，滤液再静置，析晶后滤出，滤出的沉淀与原有的沉淀混合，混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶，得无色针状结晶腺苷，抽滤，于真空干燥器中50℃真空干燥，得腺苷成品。
通过采用上述技术方案，本发明达到的有益效果如下：
(1)桑黄子实体样品前处理采用两次连续回流的方式，药物提取效率高，有效地节省了原料，最大限度的提高了桑黄子实体的利用率。
(2)本发明采用大孔树脂吸附-脱附的方法在提纯多糖的同时，还有效的分离了腺苷，不仅分离效率高、杂质少，同时免去了静置沉淀、浓缩等耗时的工序，节约了成本。
(3)多糖精制采用超滤膜过滤，有效地控制了多糖分子量范围，提高了多糖的纯度。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
具体实施方式
一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后，投入提取罐中；
(2)向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水，连续回流1.5-3小时，抽滤，滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时，抽滤；
(3)将步骤(2)中两次抽滤所得滤液混合，浓缩后获得0.3-0.5g/ml的桑黄溶液；
(4)用氢氧化钠溶液调节步骤(3)中桑黄溶液的pH值至9-10，将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中，控制流出液的流速，所得流出液即为桑黄多糖粗溶液；
(5)将步骤(4)中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性，并透过可以过滤掉蛋白质等大分子的第一超滤膜，收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜，所得截留液通过减压真空浓缩的方式，获得桑黄多糖；
(6)将步骤(4)中大孔树脂中吸附的腺苷(吸附物)用乙醇溶液洗脱，所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏；
(7)取步骤(6)中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样，上层析柱，先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱，再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱，每1500ml收集一个流份，液相检测，将流份中的第24-29流份合并，减压真空浓缩，将出现的沉淀物合并，滤取沉淀，滤液再静置，析晶后滤出，滤出的沉淀与原有的沉淀混合，混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶，得无色针状结晶腺苷，抽滤，于真空干燥器中50℃真空干燥，得腺苷成品。
本发明步骤(1)中所述桑黄子实体颗粒尺寸为20-30目。
本发明步骤(4)中所述大孔树脂采用HPD-D型吸附树脂，流出液的流速为15-40ml/min。
本发明步骤(5)中所述第一超滤膜为200KDa的超滤膜，第二超滤膜为10KDa的超滤膜。
本发明步骤(6)中所述乙醇溶液的浓度为15％，乙醇洗脱的量为两个柱体积。
本发明步骤(7)中所述乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂中乙酸乙酯与丙酮的体积比为2:1。
实施例1
一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法，具体包括如下步骤：
(1)将3Kg桑黄子实体粉碎成尺寸为20目桑黄子实体颗粒后，投入提取罐中；
(2)向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积7倍量的水，连续回流1.5小时，抽滤，滤渣继续用滤渣体积4倍量的水连续回流3小时，抽滤；
(3)将步骤(2)中两次抽滤所得滤液混合，浓缩后获得10L质量浓度为0.3g/ml的桑黄溶液；
(4)用1mol/L氢氧化钠溶液调节步骤(3)中桑黄溶液的pH至9左右，将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱中，控制流出液的流速为20ml/min，所得流出液即为桑黄多糖粗溶液；
(5)将步骤(4)中的桑黄多糖粗溶液用0.1mol/L硫酸溶液调节pH至中性，温度为35℃，压力差为0.02MPa条件下，桑黄多糖粗溶液透过可以过滤掉蛋白质等大分子的200KDa的第一超滤膜，收集滤液并通过10KDa的第二超滤膜，去除小分子杂质，所得截留液通过减压真空浓缩的方式，获得桑黄多糖，得率为生药的6.6％，通过苯酚-硫酸法测得多糖纯度为65.8％；
(6)将步骤(4)中的装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱用15％乙醇洗脱1个柱体积，所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏690g；
(7)取步骤(6)中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样，上玻璃层析柱，先用乙酸乙酯洗脱，再以体积比为2:1的乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱，每1500ml收集一个流份，液相检测，将流份中的第24-29流份合并，减压真空浓缩，将出现的沉底物合并，滤取沉淀，滤液再静置，析晶后滤出，滤出后的沉淀与原沉淀混合，混合沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶，得无色针状结晶腺苷，抽滤，于真空干燥器中50℃真空干燥，得腺苷成品，得率为0.04％，经HPLC检测，腺苷纯度为92.1％。
实施例2
一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法，具体包括如下步骤：
(1)将3Kg桑黄子实体粉碎成尺寸为25目桑黄子实体颗粒后，投入提取罐中；
(2)向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积8倍量的水，连续回流2小时，抽滤，滤渣继续用滤渣体积5倍量的水连续回流2小时，抽滤；
(3)将步骤(2)中两次抽滤所得滤液混合，浓缩后获得6L质量浓度为0.5g/ml的桑黄溶液；
(4)用1mol/L氢氧化钠溶液调节步骤(3)中桑黄溶液的pH至10左右，将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱中，控制流出液的流速为30ml/min，所得流出液即为桑黄多糖粗溶液；
(5)将步骤(4)中的桑黄多糖粗溶液用0.1mol/L硫酸溶液调节pH至中性，温度为35℃，压力差为0.02MPa条件下，桑黄多糖粗溶液透过可以过滤掉蛋白质等大分子的200KDa的第一超滤膜，收集滤液并通过10KDa的第二超滤膜，去除小分子杂质，所得截留液通过减压真空浓缩的方式，获得桑黄多糖，得率为生药的6.7％，通过苯酚-硫酸法测得多糖纯度为66.0％；
(6)将步骤(4)中的装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱用15％乙醇洗脱2个柱体积，所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏700g；
(7)取步骤(6)中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样，上玻璃层析柱，先用乙酸乙酯洗脱，再以体积比为2:1的乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱，每1500ml收集一个流份，液相检测，将流份中的第24-29流份合并，减压真空浓缩，将出现的沉底物合并，滤取沉淀，滤液再静置，析晶后滤出，滤出后的沉淀与原沉淀混合，混合沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶，得无色针状结晶腺苷，抽滤，于真空干燥器中50℃真空干燥，得腺苷成品，得率为0.04％，经HPLC检测，腺苷纯度为92.4％。
实施例3
一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法，具体包括如下步骤：
(1)将3Kg桑黄子实体粉碎成尺寸为30目桑黄子实体颗粒后，投入提取罐中；
(2)向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积9倍量的水，连续回流3小时，抽滤，滤渣继续用滤渣体积5倍量的水连续回流2小时，抽滤；
(3)将步骤(2)中两次抽滤所得滤液混合，浓缩后获得7.5L质量浓度为0.4g/ml的桑黄溶液；
(4)用1mol/L氢氧化钠溶液调节步骤(3)中桑黄溶液的pH至10左右，将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱中，控制流出液的流速为40ml/min，所得流出液即为桑黄多糖粗溶液；
(5)将步骤(4)中的桑黄多糖粗溶液用0.1mol/L硫酸溶液调节pH至中性，温度为35℃，压力差为0.02MPa条件下，桑黄多糖粗溶液透过可以过滤掉蛋白质等大分子的200KDa的第一超滤膜，收集滤液并通过10KDa的第二超滤膜，去除小分子杂质，所得截留液通过减压真空浓缩的方式，获得桑黄多糖，得率为生药的6.5％，通过苯酚-硫酸法测得多糖纯度为65.3％；
(6)将步骤(4)中的装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱用15％乙醇洗脱2个柱体积，所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏698g；
(7)取步骤(6)中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样，上玻璃层析柱，先用乙酸乙酯洗脱，再以体积比为2:1的乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱，每1500ml收集一个流份，液相检测，将流份中的第24-29流份合并，减压真空浓缩，将出现的沉底物合并，滤取沉淀，滤液再静置，析晶后滤出，滤出后的沉淀与原沉淀混合，混合沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶，得无色针状结晶腺苷，抽滤，于真空干燥器中50℃真空干燥，得腺苷成品，得率为0.04％，经HPLC检测，腺苷纯度为92.9％。
所需设备主要包括：
中药材料粉碎机，型号YKF20B，青州市益康中药机械配件厂；
电加热提取罐，型号YP-TQ-50，杭州玉派轻工机械设备有限公司；
HPD树脂由沧州宝恩化工有限公司提供，不锈钢层析柱、玻璃层析柱由江阴金确层析设备有限公司提供；
台式真空干燥箱，型号DZF-6020，镇江市科密仪器仪表有限公司；
超滤膜分离机采用RNF-2500多功能卷式膜中试设备，由厦门福美科技有限公司提供；
HPLC高效液相色谱仪，型号LC2000，上海天美仪器有限公司。
其中，装有HPD-D型吸附树脂的不锈钢层析柱使用完毕后，先用95％的乙醇洗脱至无色，再用大量的水去醇化，以备下次使用。

Claims (6)

1.一种从桑黄子实体中提取多糖和腺苷的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将桑黄子实体粉碎为桑黄子实体颗粒后，投入提取罐中；
(2)向提取罐中加入桑黄子实体颗粒体积6-10倍量的水，连续回流1.5-3小时，抽滤，滤渣继续用滤渣体积4-5倍量的水连续回流2-3小时，抽滤；
(3)将步骤(2)中两次抽滤所得滤液混合，浓缩后获得0.3-0.5g/ml的桑黄溶液；
(4)用氢氧化钠溶液调节步骤(3)中桑黄溶液的pH值至9-10，将调节好pH值的桑黄溶液上样至装有大孔树脂的不锈钢层析柱中，控制流出液的流速，所得流出液即为桑黄多糖粗溶液；
(5)将步骤(4)中的桑黄多糖粗溶液用硫酸溶液调节pH至中性，并透过可以过滤掉蛋白质等大分子的第一超滤膜，收集滤液并通过去除小分子杂质的第二超滤膜，所得截留液通过减压真空浓缩的方式，获得桑黄多糖；
(6)将步骤(4)中大孔树脂中吸附的吸附物用乙醇溶液洗脱，所得洗脱液经减压真空浓缩后获得浸膏；
(7)取步骤(6)中的浸膏与硅胶按质量比1:1.2干法拌样，上层析柱，先用1-2个柱体积乙酸乙酯洗脱，再以乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂洗脱，每1500ml收集一个流份，液相检测，将流份中的第24-29流份合并，减压真空浓缩，将出现的沉淀物合并，滤取沉淀，滤液再静置，析晶后滤出，滤出的沉淀与原有的沉淀混合，混合的沉淀在体积比为6:4的丙酮-乙醇溶液中重结晶，得无色针状结晶腺苷，抽滤，于真空干燥器中50℃真空干燥，得腺苷成品。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述桑黄子实体颗粒尺寸为20-30目。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述大孔树脂采用HPD-D型吸附树脂，流出液的流速为15-40ml/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述第一超滤膜为200KDa的超滤膜，第二超滤膜为10KDa的超滤膜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)中所述乙醇溶液的浓度为15％，乙醇洗脱的量为两个柱体积。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(7)中所述乙酸乙酯与丙酮混合洗脱剂中乙酸乙酯与丙酮的体积比为2:1。
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