CN113984911A - 一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时分析利拉鲁肽及其Boc‑利拉鲁肽主链的色谱方法，具体地，将含有利拉鲁肽及Boc‑利拉鲁肽主链的样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用如下高效液相色谱条件进行检测：键合硅胶色谱柱；流动相A为0.05mol/mL‑0.15mol/mL磷酸二氢铵水溶液，流动相B为乙腈；其中，流动相B体积占比为15％→95％进行梯度洗脱。该分析方法具有分析速度快、准确、简便、快捷，对于利拉鲁肽生产过程中的质量控制、分析纯化都能发挥良好的作用，且专属性好、灵敏度高、成本低等特点。

Description

一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，属于质量标准的建立和检测方法开发，涉及一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法。

背景技术

糖尿病是一种高发病，全球性的发病都在不断升高，据全球卫生组织公布数据显示：2000年发病人数为1.75亿，2010年发病人数为2.39亿，预计2025年将突破3亿,到2035年发病人数将接近6亿，全球糖尿病发病率正在迅速增长，中国糖尿病人数占据世界的1/4，患病率已高达11.6％，位居世界首位。糖尿病涉及人体各个生命***，严重影响人们的劳动生活，并威胁人类的生命安全。

利拉鲁肽是一种与肠道细胞分泌的肠促胰岛素激素肽类似物，具有高度同源性，因而几乎具备内源物所拥有的全部生理功能，可以用于治疗糖尿病及其对心血管并发症，是一种由丹麦诺和诺德公司开发的一个长效胰高血糖素样肽-1类似物,作为新一代以肠促胰岛素为基础的降血糖药物，可安全有效降糖并可能对多种心血管危害因素起保护作用。利拉鲁肽注射剂经皮下注射给药，每日注射一次，提供24h的血糖控制，其药代动力学特性不受性别或年龄影响，利拉鲁肽绝对是2型糖尿病治疗领域革命性药物。与二甲双胍或磺脲类药物相比具有很好的疗效，而且副作用小，不产生免疫反应等优点，利拉鲁肽的序列为H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH，在26位的Lys上连有一个棕榈酸和一个谷氨酸。市场上对于利拉鲁肽的需求量大,合成方法较多。基因工程的方法技术难度大，易产生副产物以及其他杂质，但来源稳定，产率大，生物活性高，所以采用发酵的方式生产，然后对产物进行结构修饰是比较好的选择，从而对利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的检测方法也提出更高的要求。

在得到利拉鲁肽的过程中，Boc-利拉鲁肽主链是重要中间产物，对其含量检测和控制是必不可少的过程，Boc-利拉鲁肽主链其序列为H2N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH，在26位的Lys上有一个BocHN-保护基团，为下一步结构修饰做好准备，所以有必要对现有技术中的利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链建立分析方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明针对以上技术上的需要，公开了一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法，目的在于提供一种稳定性好、重现性好、灵敏度高、操作简单、准确快速，用于利拉鲁肽质量控制方法。

本发明提供了一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的RP-HPLC色谱方法，其特征在于，将含有利拉鲁肽及Boc-利拉鲁肽主链的样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用如下高效液相色谱条件进行检测；

键合硅胶色谱柱；

流动相：流动相A为0.05mol/mL-0.15mol/mL磷酸二氢铵水溶液，

流动相B为乙腈；

其中，流动相B体积占比为15％→95％进行梯度洗脱。

在另一优选例中，流动相A为0.1mol/mL磷酸二氢铵水溶液。

在另一优选例中，所述流动相B体积占比为25％→90％。

在另一优选例中，所述键合基团选自：C8、C18。

在另一优选例中，所述的键合硅胶色谱柱为辛烷基键合硅胶C8柱(4.6×250mm)。

在另一优选例中，所述色谱条件还包括：

进样体积：10-100μL。

在另一优选例中，进样体积为20-60μL，较佳地50μL。

在另一优选例中，所述色谱条件还包括：

检测波长：210-230nm；

流速：0.5-1.0mL/min；

柱温：30-40℃。

在另一优选例中，流动相A磷酸二氢铵水溶液的pH为3.5-4.0。

在另一优选例中，所述流动相A磷酸二氢铵水溶液的pH为3.7。

在另一优选例中，所述的方法为定量、定性和/或杂质检测方法。

在另一优选例中，所述的方法非体外和/或辅助性方法。

在另一优选例中，所述的方法为非诊断性方法。

在另一优选例中，所述的含有利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的样品溶液是通过如下步骤制备的：

(s1)重组菌发酵得到菌体，

(s2)对所述菌体进行破碎、离心、溶解得到大分子蛋白，

(s3)加入蛋白酶进行切割所述大分子蛋白，得到Boc-利拉鲁肽主链，

(s4)对所述Boc-利拉鲁肽主链进行化学修饰，得到含有利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的样品溶液。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(s5)标准溶液的制备：将已知浓度的利拉鲁肽标准品溶液和经过纯化得到的Boc-利拉鲁肽主链溶液混合，得到已知浓度的标准品溶液。

在另一优选例中，所述步骤(s5)中，利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链标准物质纯度都在98％以上。

在另一优选例中，所述步骤(s5)中，利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链标准品溶液浓度分别为0.8mg/mL，0.5mg/mL。

在另一优选例中，样品溶液的进样浓度为0.05～1.5mg/mL。

在另一优选例中，所述梯度洗脱，洗脱时间及流动相B体积占比为0～20min从25％→60％，20～35min从60％→90％，35～40min再从90％→25％，然后25％运行至10min。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为Boc-利拉鲁肽主链的标准曲线。

图2为利拉鲁肽的标准曲线。

图3为利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链标准品的HPLC色谱图。

图4为利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品溶液的HPLC色谱图。

图5为流动相A为0.05％三氟乙酸水溶液的利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品溶液HPLC色谱图。

图6为流动相A为0.5％磷酸水溶液的利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品溶液HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，发现了一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法。该分析方法具有分析速度快、准确、简便、快捷，对于利拉鲁肽生产过程中的质量控制、分析纯化都能发挥良好的作用。在此基础上，完成了本发明。

利拉鲁肽

利拉鲁肽由诺和诺德公司研制，英文名Liraglutide，分子式：C₁₇₂H₂₆₅N₄₃O₅₁，分子量：3751.2，CAS号：204656-20-2，是一种人胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，序列为：H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys(Nε(Nα-PAL-γ-Glu))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-OH(SEQ IDNO.:1)，与人的天然GLP-1的序列同源性达97％。

利拉鲁肽的结构是将天然的GLP-1(7-37)分子的第28位赖氨酸用精氨酸取代，同时第20位的赖氨酸侧链的ε氨基用十六烷酸谷氨酸酰化。由于该脂肪链的存在能够降低DPP-4的降解作用，延长半衰期，给药频率到达一天一次。能够显著降低2型糖尿病患者空腹或者餐后的血糖而达到调节体内血糖水平，同时能够降低患者体重和降低心血管疾病患者的死亡风险。

重组菌

本发明所用重组菌是根据专利申请CN 202010066293.9的方法制备得到，优选地为表达利拉鲁肽主链融合蛋白FP-TEV-EK-GLP-1(20)的重组大肠杆菌菌株。

Boc-利拉鲁肽主链

Boc-利拉鲁肽主链其序列为H₂N-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gly-Arg-Gly-COOH(SEQ ID NO.:1)，在26位的Lys上有一个BocHN-保护基团，其通过重组菌(如重组大肠杆菌)发酵、破碎、清洗、离心、酶切、纯化等步骤得到。

利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品

本发明中，利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品是指主要包含利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的产品。

利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链通过如下步骤制备：

从Boc-利拉鲁肽主链(化合物1)制备Fmoc修饰的化合物2，化合物2脱Boc保护后得化合物3，化合物3与活化利拉鲁肽侧链Pal-Glu-(OSu)-OtBu反应，得到化合物4，再经脱去Fmoc反应得到化合物5，侧链脱除tBu保护基，最后得到利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链。

具体地，所述方法包括步骤：

(i)提供如上所述的Boc修饰的利拉鲁肽主链；

(ii)对所述的Boc修饰的利拉鲁肽主链进行Fmoc修饰，从而制得Fmoc和Boc修饰的利拉鲁肽主链；

(iii)对所述的Fmoc和Boc修饰的利拉鲁肽主链进行脱Boc处理，并将其与利拉鲁肽侧链进行反应，从而制得Fmoc修饰的利拉鲁肽；和

(iv)对所述的Fmoc修饰的利拉鲁肽进行脱Fmoc与侧链脱tBu处理，从而制得利拉鲁肽。

在另一优选例中，在步骤(ii)中，加入Fmoc-Osu、NaHCO₃和DMF/H₂O，从而进行Fmoc修饰。

在另一优选例中，加入的Fmoc-Osu、NaHCO₃与Boc修饰的利拉鲁肽主链的摩尔比为(0.8-1.5)：(1.5-2.5)：(0.8-1.2)，较佳地为(1.0-1.2)：(1.8-2.2)：(0.8-1.2)。

在另一优选例中，在步骤(ii)和步骤(iii)之间，还包括对制得的Fmoc和Boc修饰的利拉鲁肽主链进行纯化的步骤，较佳地，利用C8制备柱进行纯化，流动相为TFA的乙腈溶液。

在另一优选例中，在步骤(iii)中，还包括步骤：

(a)加入TFA溶液，低温搅拌，进行脱Boc处理，制得脱Boc产物；

(b)对脱Boc产物进行纯化处理，较佳地进行C8反相纯化处理；

(c)任选地，向纯化处理所得纯化收集液中加入有机溶剂，从而制得固体脱Boc产物，较佳地所述有机溶剂为甲叔醚：石油醚混合液；

(d)将脱Boc产物与利拉鲁肽侧链混合，制得Fmoc修饰的利拉鲁肽。

在另一优选例中，在步骤(i)中，包括步骤：

(ia)利用重组菌，制备本发明第二方面的所述的利拉鲁肽主链融合蛋白，

(ib)利用肠激酶对所述的利拉鲁肽融合蛋白进行酶切处理，从而获得Boc修饰的利拉鲁肽主链。

在另一优选例中，在步骤(ia)中，从所述重组菌的发酵液中分离获得利拉鲁肽主链融合蛋白包涵体，对所述的包涵体进行变复性和酶切后，获得Boc-利拉鲁肽主链融合蛋白。

本发明主要优点：

1、可以同时检测利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链，简单、方便，可以减少进样次数，提高监测效率。

2、可以同时监测反应效率和产物得率。

3、可以通过该分析方法纯化利拉鲁肽和Boc-利拉鲁肽主链物质。

4、建立良好的产品质量控制方法和生产工艺指纹图谱。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例

实施例1利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的制备

参照专利申请CN 202010066293.9中实施例的记载。

步骤1构建利拉鲁肽表达菌株

将融合蛋白FP-TEV-EK-GLP-1(20)的DNA片段，克隆至表达载体质粒pBAD/His A(购自NTCC公司，卡那霉素抗性)的araBAD启动子下游NcoI-XhoI位点，得到质粒pBAD-FP-TEV-EK-GLP-1(20)。再将pylRs的DNA序列，克隆至表达载体质粒pEvol-pBpF(购自NTCC公司，氯霉素抗性)的araBAD启动子下游SpeI-SalI位点，同时在proK启动子下游，以PCR方法***赖氨酰-tRNA合成酶的tRNA(pylTcua)的DNA序列。将构建的质粒pBAD-FP-TEV-EK-GLP-1(20)和pEvol-pylRs-pylT共同转化至大肠杆菌TOP10菌株，筛选获得表达利拉鲁肽主链融合蛋白FP-TEV-EK-GLP-1(20)的重组大肠杆菌菌株。

步骤2Boc-利拉鲁肽主链的表达

将重组大肠杆菌，按5％的接种量(体积比)接入大肠杆菌种子液(公司培育)，37℃，pH7.0，分批补料至pH上升至7.05，然后开始进行碳氮源分开补料，根据恒pH法进行碳源流加。补料11h-发酵结束，碳氮源质量比1:1.0。补料后通过补料及自动流加7.5M氨水，使pH控制在7.0-7.2。培养至4-6小时左右，开始添加2.5g/L L-***糖进行诱导，诱导持续14h，至发酵结束。获得包含利拉鲁肽主链融合蛋白的发酵液。

步骤3Boc-利拉鲁肽主链包涵体的制备

将步骤2所得发酵液离心后，将湿菌体按1：1体积与破菌缓冲液混合，悬浮3h，悬浮液使用高压均质机破菌三次，破菌后离心收集包涵体，对其进行两次清洗，缓冲液成分为：0.5％T-80，1mm EDTA-2Na，100mm NaCl，pH7.5。经清洗后称重包涵体的得率为41-45g/L。经菌体破碎、清洗、离心后获得Boc-利拉鲁肽主链包涵体。

步骤4Boc-利拉鲁肽主链包涵体的变复性及酶切

向步骤3所得包涵体中以重量体积比1:10的比例加入7.5mol/L尿素溶解缓冲液，室温搅拌溶解，Bradford法测定蛋白浓度，控制包涵体溶解液的总蛋白浓度在25mg/ml左右，NaOH调节pH 9.0±0.1。将包涵体溶解液滴加至含有5-10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，10mmol/L Na₂CO₃ 0.3-0.5mmol/L EDTA-2Na，的复性缓冲液中，使包涵体溶解液稀释5-10倍复性，维持融合蛋白复性液pH值在9.0-10.0，温度控制在4-8℃，复性时间为10-20h。

步骤5Boc-利拉鲁肽主链融合蛋白的初步纯化

取步骤4得到的融合蛋白复性液，经0.45μm的滤膜过滤，去除未溶解的物质；根据蛋白质等电点的差异，采用阴离子交换柱对融合蛋白进行初步纯化。

步骤6Boc-利拉鲁肽主链融合蛋白的酶切

将步骤5初步纯化的Boc-利拉鲁肽主链融合蛋白样本过疏水柱脱盐，纯水洗脱，洗脱体积约为柱体积的5倍。调节融合蛋白溶液的pH值为7.5-8.5，控制温度为25℃，加入肠激酶酶切，酶切时间为5-16h，获得Boc-利拉鲁肽主链。

步骤7Boc-利拉鲁肽主链的反相层析

根据多肽和蛋白质的疏水性差异，采用聚合物反相层析技术对Boc-利拉鲁肽主链进行纯化，除去一部分杂质。

步骤6获得的Boc-利拉鲁肽主链融合蛋白的酶切溶液，经过滤澄清后，进行反相层析分离纯化。以含有0.065％三氟乙酸的水溶液作为流动相A；以含有0.065％三氟乙酸的乙腈溶液作为流动相B。Boc-利拉鲁肽主链与填料结合，控制Boc-利拉鲁肽主链上样量＜10mg/ml，然后梯度洗脱，收集Boc-利拉鲁肽主链，可作为Boc-利拉鲁肽主链标准品。

步骤8利用Boc-利拉鲁肽主链制备利拉鲁肽标准品和Boc-利拉鲁肽主链样品溶液

取步骤7得到的Boc-利拉鲁肽主链化合物1，按照表1的摩尔比加入Fmoc-Osu、NaHCO₃及DMF/H₂O，反应8-12小时，制得Fmoc和Boc保护的GLP-1。利用C8柱进行纯化，含有0.065％(v/v)TFA的水溶液为流动相A，含有0.065％(v/v)TFA的乙腈作为流动相B，梯度洗脱。纯化收集溶液中加入甲叔醚，沉淀离心，用甲叔醚洗涤沉淀2～3次，获得Fmoc保护的化合物2：DiFmoc-GLP-1(Lys²⁰Boc)。

表1投料的摩尔比

	Boc-利拉鲁肽主链	Fmoc-OSu	NaHCO<sub>3</sub>	DMF/H<sub>2</sub>O
					当量或体积	1.0eq	1.1eq	2.0eq	30V/30V

取纯化后的化合物2，加入TFA溶液，低温搅拌10～20min，C8反相纯化脱保护反应物。纯化收集液中加入20倍体积甲叔醚：石油醚混合液(3:1)，沉淀离心，以混合液洗涤沉淀2～3次，最终获得脱除Boc的固体化合物3：DiFmoc-GLP-1(Lys²⁰NH₂)。

取Boc脱除后的化合物3，加入30eq.EDPA、NMP与水混合物(2:1)，室温温和搅拌5min。将当量的Pal-Glu-(OSu)-OtBu(23.7μmol)溶解于NMP(303μL)所得溶液，加入到所得混合物中，将反应混合物在室温下温和摇动2小时。向其中加入625μL含甘氨酸(6.5mg，86.9μmol)的50％乙醇水溶液，从而终止反应，获得化合物4：DiFmoc-GLP-1-(Pal-Glu-(Lys²⁰NH₂)-OtBu)。

取纯化后的化合物4(300mg)，加入含有20％哌啶的DMF溶液，室温反应30分钟。反应体系中内加入10倍体积的甲叔醚和石油醚混合溶剂，沉淀离心，固体用甲叔醚和石油醚混合溶剂洗涤3～5次，得到脱除Fmoc后的化合物5(270mg)：GLP-1-(Pal-Glu-(Lys²⁰NH₂)-OtBu)。

GLP-1取化合物5(270mg)，加入(TFA:TIS:H₂O＝95:2.5:2.5):DCM(v:v＝1:1)混合溶液10mL，室温震荡反应3～4小时脱除侧链tBu保护基，反应体系内加入10倍体积的甲叔醚和石油醚混合溶剂，沉淀离心，固体用甲叔醚和石油醚混合溶剂洗涤3次，得到250mg的终产物，即利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链溶液。HPLC纯化后，得到120mg纯度大于98％利拉鲁肽，即利拉鲁肽标准品。

实施例2利拉鲁肽及Boc-利拉鲁肽主链的标准曲线制备及含量测定

液相色谱条件：仪器：Waters 2695；检测器：Waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶C₈柱(4.6×250mm)；流动相：流动相A为0.1mol/mL磷酸二氢铵水溶液，pH为3.7，流动相B为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：50μL；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相B体积占比为0～20min从25％→60％，20～35min从60％→90％，35～40min再从90％→25％，然后25％运行至10min。

标准溶液的制备：将已知浓度的利拉鲁肽标准品溶液，和经过纯化得到的Boc-利拉鲁肽主链标准品溶液混合，精密移取标准品溶液，稀释定容，得到五个浓度梯度(即0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.06mg/mL、0.08mg/mL)，连续进样六次，以标准品浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到浓度和峰面积的标准曲线，Boc-利拉鲁肽主链的标准曲线如图1，利拉鲁肽的标准曲线如图2，标准品Boc-利拉鲁肽主链出峰时间为15.742min，利拉鲁肽出峰时间为22.106min，色谱图如图3。

取实施例1步骤8中反应30min反应液作为含利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的待测溶液，取样稀释，定容到合适浓度，测定其含量，样品溶液中Boc-利拉鲁肽主链出峰时间为15.806min，利拉鲁肽出峰时间为22.142min，色谱图如图4。

实施例3精密度试验

液相色谱条件：仪器：Waters 2695；检测器：Waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶C₈柱(4.6×250mm)；流动相：流动相A为0.1mol/mL磷酸二氢铵水溶液，pH为3.7，流动相B为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：50μL；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相B体积占比为0～20min从25％→60％，20～35min从60％→90％，35～40min再从90％→25％，然后25％运行至10min。

精密移取一定量的利拉鲁肽(0.4mg/mL)及其Boc-利拉鲁肽主链(0.25mg/mL)标准品溶液，稀释到合适浓度，定容，过0.45μm滤膜，连续进样6次，考察精密度，结果见表2。

表2

由表2可以知，进同一样品6次的峰面积RSD值分别为0.75％、0.91％，符合要求，说明***精密度良好，试验可信度高。

实施例4重复性试验

液相色谱条件：仪器：Waters 2695；检测器：Waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶C₈柱(4.6×250mm)；流动相：流动相A为0.1mol/mL磷酸二氢铵水溶液，pH为3.7，流动相B为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：50μL；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相B体积占比为0～20min从25％→60％，20～35min从60％→90％，35～40min再从90％→25％，然后25％运行至10min。

取经过小试生产工艺得到的样品溶液6份，分别稀释，定容到合适浓度(0.01mg/mL-0.1mg/mL)，过0.45μm滤膜，得到6个样品含量，结果见表3。

表3

由表3可以知，Boc-利拉鲁肽主链和利拉鲁肽RSD值分别为1.24％和1.06％，符合要求，重复性良好。

实施例5加样回收率试验

液相色谱条件：仪器：Waters 2695；检测器：Waters 2487紫外检测器；色谱柱：辛烷基键合硅胶C₈柱(4.6×250mm)；流动相：流动相A为0.1mol/mL磷酸二氢铵水溶液，pH为3.7，流动相B为乙腈；检测波长：215nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样体积：50μL；梯度洗脱为：洗脱时间及流动相B体积占比为0～20min从25％→60％，20～35min从60％→90％，35～40min再从90％→25％，然后25％运行至10min。

取样品溶液6份，分别加入接近浓度的标准品溶液，摇匀定容，过0.45μm滤膜，测6个样品含量，结果见表4

表4

由表4可知，Boc-利拉鲁肽主链和利拉鲁肽平均回收率分别为：100.29％，100.74％；RSD值分别为1.99％和1.23％，符合要求，回收率高。

对比例1使用流动相A为0.05％三氟乙酸水溶液对利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品溶液进行HPLC测试

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：流动相A为0.05％三氟乙酸水溶液，pH为2.5，流动相B为乙腈，

检测波长：215nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样体积：20μL。

实验结果如图5所示，出峰时间为7.8min左右的为Boc-利拉鲁肽主链。结果表明使用流动相A为三氟乙酸水溶液只能检测Boc-利拉鲁肽主链，不能检测利拉鲁肽，及反应得率。

对比例2使用流动相A为0.5％磷酸水溶液对利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链样品溶液进行HPLC测试

色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱；

流动相：流动相A为0.5％磷酸水溶液，pH为4.3，流动相B为乙腈，

检测波长：215nm；

流速：1.0mL/min；

柱温：30℃；

进样体积：20μL。

实验结果如图6所示，出峰时间为16.0min左右的为利拉鲁肽。结果表明使用流动相A为0.5％磷酸水溶液只能检测利拉鲁肽，不能检测Boc-利拉鲁肽主链及反应效率。

本发明所述的分析方法，具有高效、专属性好和灵敏度高的特点，能够有效分离利拉鲁肽及Boc-利拉鲁肽主链。

以上实施例仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进试验参数，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 宁波鲲鹏生物科技有限公司

<120> 一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的色谱方法

<130> P2020-0045

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

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Claims (10)

1.一种同时分析利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的RP-HPLC色谱方法，其特征在于，将含有利拉鲁肽及Boc-利拉鲁肽主链的样品溶液注入高效液相色谱仪，并采用如下高效液相色谱条件进行检测；

键合硅胶色谱柱；

流动相：流动相A为0.05mol/mL-0.15mol/mL磷酸二氢铵水溶液，

流动相B为乙腈；

其中，流动相B体积占比为15％→95％进行梯度洗脱。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相B体积占比为25％→90％。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述键合基团选自：C8、C18。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：

进样体积：10-100μL。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：

检测波长：210-230nm；

流速：0.5-1.0mL/min；

柱温：30-40℃。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，流动相A磷酸二氢铵水溶液的pH为3.5-4.0。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的含有利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的样品溶液是通过如下步骤制备的：

(s1)重组菌发酵得到菌体，

(s2)对所述菌体进行破碎、离心、溶解得到大分子蛋白，

(s3)加入蛋白酶进行切割所述大分子蛋白，得到Boc-利拉鲁肽主链，

(s4)对所述Boc-利拉鲁肽主链进行化学修饰，得到含有利拉鲁肽及其Boc-利拉鲁肽主链的样品溶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(s5)标准溶液的制备：将已知浓度的利拉鲁肽标准品溶液和经过纯化得到的Boc-利拉鲁肽主链溶液混合，得到已知浓度的标准品溶液。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，样品溶液的进样浓度为0.05～1.5mg/mL。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述梯度洗脱，洗脱时间及流动相B体积占比为0～20min从25％→60％，20～35min从60％→90％，35～40min再从90％→25％，然后25％运行至10min。

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