CN108373499B - 一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，包括以下步骤：1)：将粗肽溶液使用碳酸氢铵水溶液的乙腈体系进行第一次纯化；2)：将上述收集的洗脱液使用硫酸钠/硫酸的乙腈体系进行第二次纯化；3)：将收集的洗脱液先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱进行高效液相转盐；4)：将转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸。本发明具有以下优点：通过多次纯化以及转盐后加入盐酸进行醋酸根等离子含量控制相结合，使用不同的色谱***，规模化制备得到的特立帕肽醋酸盐纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％，醋酸根离子含量≤5％，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，总收率大于60％。
Description
技术领域
本发明涉及一种多肽的纯化方法，尤其涉及符合USP 40质量要求的特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法。
背景技术
特立帕肽(PTH(1-34))，英文名Teriparatide，为一种长链的多肽药物，其肽序为：
H-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Glu-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Leu-Gln-Asp-Val-His-Asn-Phe-OH
特立帕肽为人甲状旁腺素(PTH)的1-34氨基酸片段，由美国Eli Lilly公司经基因重组技术研发制得，以醋酸盐的形式制成药品，于2002年被美国FDA批准上市。它是第一个被批准用于治疗严重骨质疏松的骨形成促进剂，具有广阔的市场前景。
目前涉及到特立帕肽合成的文献和专利较多，涉及分离纯化的较少，特别是本发明的利用高压反相色谱进行第一次纯化和第二次纯化以及转盐后加入盐酸进行醋酸根等离子含量控制相结合规模化制备(一批可得成品200克以上)纯度和离子含量均符合USP 40中特立帕肽醋酸盐原料药质量要求的更是没有涉及。
对于本品的纯化方法，已有专利技术进行公开。中国专利CN106167522A公开了将粗品溶解在30％乙腈水溶液中，以醋酸铵缓冲液纯化，控制pH为4.0～7.0，醋酸/乙腈C18柱转盐，制得醋酸特立帕肽的方法，虽然能得到纯度达到99％以上的醋酸特立帕肽醋酸盐，但未指出单杂含量，同时最终制得的醋酸特立帕肽中醋酸根含量未进行描述。
中国专利CN102993293A公开了将硫酸和醋酸混合水溶液用氨水调pH值至5.0～6.0的缓冲液进行纯化，收集95％～99％的样品进行调pH值至5.5～7.0后放至2～8℃降温析出产物，离心收集沉淀后用60％磷酸水溶液后，再用水稀释一倍，上反相柱后转盐，最终制得醋酸特立帕肽。其收率未在专利中体现。转盐前样品用60％磷酸溶解，存在产品不稳定降解、引入新杂质、收率不稳定的风险。最终制得的醋酸特立帕肽中醋酸根含量未进行描述，工艺中使用的其他阴离子的含量也未进行研究。
专利CN102731643A公开了一种特立帕肽的纯化方法，采用水溶解粗肽，然后采用0.2％TFA/乙腈为流动相，C18柱分离纯化，0.2％醋酸/乙腈C18柱转盐，总收率20.5～32.2％，同样也未研究最大单杂和醋酸特立帕肽中阴离子的具体含量。
为解决现有技术存在的杂质及离子含量不明确的难题，获得符合USP 40质量要求的特立帕肽原料药，还需对纯化及转盐方法进行进一步的研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特立帕肽醋酸盐的大规模分离纯化和离子控制的工艺方法，纯度高且收率好，冻干后醋酸根的含量≤5％，获得符合USP 40质量要求的特立帕肽原料药，达到工业化生产的要求，解决了现有技术中存在的杂质及离子含量不明确的难题
为了实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，包括以下步骤：
步骤1)：将粗肽溶液使用色谱柱进行第一次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为碳酸氢铵水溶液，用醋酸或氨水调pH，所述流动相B为乙腈；
步骤2)：将上述收集的洗脱液使用色谱柱进行第二次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为硫酸钠水溶液，用硫酸调pH，所述流动相B为乙腈；
步骤3)：将步骤2)中收集的洗脱液使用色谱柱进行高效液相转盐，其中先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱；
步骤4)：将步骤3)中转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸，使醋酸根的残留量控制在5％以下。
作为优选，所述步骤1)中流动相A的pH为7.0～9.5，其碳酸氢铵的浓度为0.01～0.2mol/L。
作为进一步优选，所述步骤1)中流动相A的pH为8.0，其碳酸氢铵的浓度为0.1mol/L。
作为优选，所述步骤2)中流动相A的pH为2.0～4.0，其硫酸钠的浓度为0.05～0.2mol/L。
作为进一步优选，所述步骤2)中流动相A的pH为3.0，其硫酸钠的浓度为0.1mol/L。
作为优选，所述步骤4)中调节醋酸根含量所用盐酸的量为1～4N。
作为进一步优选，所述步骤4)中调节醋酸根含量所用盐酸的量为3.3N。
作为进一步优选，所述步骤4)中将加入1～4当量1N盐酸的目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中进行冷冻干燥，得到的特立帕肽纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的醋酸特立帕肽，醋酸根离子含量≤5％，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，纯化收率为60％。
作为优选，所述步骤1)至步骤3)所述色谱柱使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶。
作为优选，进一步包括以下步骤：在上述步骤1)之前进行如下的样品处理，将粗肽使用体积比5～10％的乙腈水溶液按照浓度5～20g/L溶解，然后使用0.22～0.45μm的滤膜过滤，收集滤液待用。
作为更进一步的优选，一种特立帕肽醋酸盐的大规模分离纯化和离子控制的方法，具体包括以下步骤：
步骤1)：以体积比5～10％的乙腈水溶液按照浓度5～20g/L溶解粗肽，使用0.22～0.45μm的滤膜过滤。
步骤2)：使用高效液相色谱仪器对过滤后的粗品进行一次分离纯化：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱，将粗肽溶液以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行梯度纯化，将0.01～0.2mol/L碳酸氢铵水溶液用氨水调pH值7.0～9.5后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：10％～30％洗脱；流速为1000～1400ml/min，检测波长为220nm，分段收集。
步骤3)：通过DAC-CXTH200制备动态轴向加压柱将步骤2中收集的合格溶液中乙腈的比例降至10％以下直接进行第二次纯化，以十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱进行梯度洗脱纯化，以摩尔浓度为0.05～0.2mol/L的硫酸钠水溶液用硫酸调pH值2.0～4.0后的溶液为A相，乙腈为B相，梯度：B％：10～30％洗脱；流速为1000～1400ml/min，检测波长为220nm，分段收集。
步骤4)：用十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶进行高效液相转盐，将步骤3)所得溶液用3～5％的乙腈醋酸铵溶液冲洗20～30min，醋酸铵的浓度为10～100mM，然后用醋酸水溶液乙腈体系洗脱，收集特立帕肽溶液，所述醋酸水溶液中醋酸的体积比为0.1～0.2％，乙腈比例为35％以上。
步骤5)：将转盐后的洗脱液35℃以下减压浓缩，加入1～4N的盐酸调节冻干后产品中醋酸根离子含量，使醋酸根的残留控制在5％以下，将样品置于冷冻干燥机冻干。
本发明提供的一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，相对现有技术具有以下优点：通过利用高压反相色谱进行一次纯化和二次纯化控制杂质，以及转盐后加入盐酸进行醋酸根等离子含量控制相结合，多次纯化和转盐过程使用不同的色谱***，规模化制备(一批可得成品200克以上)纯度和离子含量均符合USP 40中质量要求的特立帕肽醋酸盐原料药，得到的特立帕肽纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％，醋酸根离子含量≤5％，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，纯化总收率大于60％。
附图说明
以下是采用实施例三得到特立帕肽醋酸盐的层析谱图以及HPLC谱图。
图1是实施例一中第1次纯化层析谱图。
图2是实施例一中第1次层析后收集的目标峰HPLC谱图。
图3是实施例一中第2次纯化层析谱图。
图4是实施例一中第2次纯化后收集的目标峰HPLC谱图。
图5是实施例二中转盐后直接冻干样品的离子色谱图。
图6是实施例二中转盐后添加盐酸冻干样品的离子色谱图。
具体实施方式
实施例一：
1.样品处理：每克特立帕肽粗肽溶解于50ml体积比：乙腈：水＝5:95的乙腈水溶液中，超声至完全溶解，0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.第1次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.1mol/L的碳酸氢铵水溶液，氨水调pH为8.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10～30％，45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于95％且相对保留时间RRT 0.9～1.1处最大单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率82％。第1次纯化层析谱图如图1所示，层析后收集的目标峰HPLC谱图如图2所示。
3.第2次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.1mol/L的硫酸钠水溶液，硫酸调pH为3.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，洗脱45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡1CV后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于99.5％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率84％。第2次纯化层析谱图如图3所示，层析后收集的目标峰HPLC谱图如图4所示。
4.转盐及离子控制
转盐条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.02mol/L的醋酸铵水溶液；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。进样量为80g。
转盐过程：将色谱柱用流动相A平衡后1CV后上样，上样量4L样品溶液。设置梯度5％B相的梯度等度洗脱15min；然后用质量浓度为0.1％醋酸的50％乙腈水溶液洗脱样品，收集的目标肽溶液35℃下减压浓缩至10～20mg/ml，加入3当量1N盐酸，待用。目标肽成分回收率97％。
5.冷冻干燥
将上步所得目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中，冷冻干燥后得到纯度99.5％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和0.38％且最大未知单杂0.06％的醋酸特立帕肽，其醋酸根离子含量3.9％，氯离子含量3.6％，三氟乙酸根含量0.09％和硫酸根含量0.08％，纯化总收率约为66.8％。
实施例二：
1.样品处理：每克特立帕肽粗肽溶解于50ml体积比：乙腈：水＝5:95的乙腈水溶液中，超声至完全溶解，0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.第1次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.01mol/L的碳酸氢铵水溶液，醋酸调pH为7.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于95％且相对保留时间RRT 0.9～1.1处最大单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率80％。
3.第2次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.05mol/L的硫酸钠水溶液，硫酸调pH为2.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，洗脱45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡1CV后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率80％。
4.转盐及离子控制
转盐条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.02mol/L的醋酸铵水溶液；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。进样量为80g。
转盐过程：将色谱柱用流动相A平衡后1CV后上样，上样量4L样品溶液。设置梯度5％B相的梯度等度洗脱15min；然后用质量浓度为0.1％醋酸的50％乙腈水溶液洗脱样品，收集的目标肽溶液35℃下减压浓缩至10～20mg/ml，取一半加入1.0当量1N盐酸，待用。目标肽成分回收率95％。
5.冷冻干燥
将上步所得未加入1.0当量1N盐酸目标肽溶液和加入1.0当量1N盐酸的目标肽溶液分别转移至大小合适的不锈钢托盘中，二者冷冻干燥后得到纯度均大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的醋酸特立帕肽，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，纯化总收率约为60.8％。区别在于前者醋酸根离子含量8％，后者醋酸根离子含量4％，此处加入盐酸的作用是控制醋酸根离子的含量。转盐后直接冻干样品的离子色谱图如图5所示，图中序号为1的峰为醋酸根离子，序号为2的峰为氯离子，序号为5的峰为硫酸根离子；转盐后添加盐酸后冻干样品的离子色谱图如图6所示，图中序号为2的峰为醋酸根离子，序号为4的峰为氯离子，序号为7的峰为硫酸根离子。
实施例三：
1.样品处理：每克特立帕肽粗肽溶解于50ml体积比：乙腈：水＝5:95的乙腈水溶液中，超声至完全溶解，0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.第1次纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.01mol/L的碳酸氢铵水溶液，氨水调pH为7.5；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于95％且相对保留时间RRT 0.9～1.1处最大单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率81％。
3.第2次纯化：
纯化条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.05mol/L的硫酸钠水溶液，硫酸调pH为2.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10～30％，洗脱45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡1CV后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率82％。
4.转盐及离子控制
转盐条件：色谱柱：以八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.02mol/L的醋酸铵水溶液；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。进样量为80g。
转盐过程：将色谱柱用流动相A平衡后1CV后上样，上样量4L样品溶液。设置梯度5％B相的梯度等度洗脱15min；然后用质量浓度为0.1％醋酸的50％乙腈水溶液洗脱样品，收集的目标肽溶液35℃下减压浓缩至10～20mg/ml，加入2.0当量1N盐酸，待用。目标肽成分回收率94％。
5.冷冻干燥
将上步所得目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中，冷冻干燥后得到纯度99.2％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和0.48％且最大未知单杂0.08％的醋酸特立帕肽，其醋酸根离子含量4.8％，氯离子含量3.5％，三氟乙酸根含量0.06％，硫酸根含量0.08％％，纯化总收率约为62.4％。
实施例四：
1.样品处理：每克特立帕肽粗肽溶解于50ml体积比：乙腈：水＝5:95的乙腈水溶液中，超声至完全溶解，0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.第1次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.2mol/L的碳酸氢铵水溶液，氨水调pH为9.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于95％且相对保留时间RRT 0.9～1.1处最大单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率83％。
3.第2次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.2mol/L的硫酸钠水溶液，硫酸调pH为3.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，洗脱45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡1CV后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率80％。
4.转盐及离子控制
转盐条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.02mol/L的醋酸铵水溶液；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。进样量为80g。
转盐过程：将色谱柱用流动相A平衡后1CV后上样，上样量4L样品溶液。设置梯度5％B相的梯度等度洗脱15min；然后用质量浓度为0.1％醋酸的50％乙腈水溶液洗脱样品，收集的目标肽溶液35℃下减压浓缩至10～20mg/ml，加入4.0当量1N盐酸，待用。目标肽成分回收率91％。
5.冷冻干燥
将上步所得目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中，冷冻干燥后得到纯度99.1％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和0.44％且最大未知单杂0.09％的醋酸特立帕肽，其醋酸根离子含量4.2％，氯离子含量3％，三氟乙酸根含量0.07％和硫酸根含量均0.05％，纯化总收率约为60.4％。
实施例五：
1.样品处理：每克特立帕肽粗肽溶解于50ml体积比：乙腈：水＝5:95的乙腈水溶液中，超声至完全溶解，0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
2.第1次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.01mol/L的碳酸氢铵水溶液，氨水调pH为9.5；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10％～30％，45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于95％且相对保留时间RRT 0.9～1.1处最大单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率80％。
3.第2次纯化：
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.05mol/L的硫酸钠水溶液，硫酸调pH为4.0；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。梯度：B％：10～30％，洗脱45min，进样量为80g。
纯化过程：将色谱柱用流动相A平衡1CV后上样，上样量4L样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目标峰。将收集的使用USP 40中特立帕肽有关物质检测方法检测的纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的目标肽溶液加水稀释一倍，待用。目标肽成分回收率81％。
4.转盐及离子控制
转盐条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的DAC-20动态轴向加压柱，柱子直径和填装长度为：20*25cm。流动相A：摩尔浓度为0.02mol/L的醋酸铵水溶液；B相：乙腈。流速：1200ml/min。检查波长220nm。进样量为80g。
转盐过程：将色谱柱用流动相A平衡后1CV后上样，上样量4L样品溶液。设置梯度5％B相的梯度等度洗脱15min；然后用质量浓度为0.1％醋酸的50％乙腈水溶液洗脱样品，收集的目标肽溶液35℃下减压浓缩至10～20mg/ml，加入3.5当量1N盐酸，待用。目标肽成分回收率94％。
5.冷冻干燥
将上步所得目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中，冷冻干燥后得到纯度99.3％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和0.5％且最大未知单杂0.10％的醋酸特立帕肽，其醋酸根离子含量5％，氯离子含量4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均0.1％，纯化总收率约为60.9％。
使用实施例一至实施例五的工艺生产所得的醋酸特立帕肽有关物质及离子含量均符合USP 40要求，其他各项指标也均符合USP 40，同时还符合EP 9.0要求，可作为醋酸特立帕肽原料药出口美国和欧洲，同时也可满足中国市场申报要求。
对比例一：
将实施例三中第1次纯化使用的流动相A替换为醋酸铵缓冲溶液，用醋酸或氨水调PH，没有经过二次纯化，最后转盐后也用盐酸处理，其余工艺和各参数均同实施例三。
最终冷冻干燥后得到纯度90.0％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和0.62％且最大未知单杂0.15％的醋酸特立帕肽，其醋酸根离子含量3.9％，氯离子含量4.8％，三氟乙酸根含量0.18％和硫酸根含量0.20％，纯化总收率约为60.2％。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演和替换，都应当视为属于本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种特立帕肽醋酸盐的纯化及离子控制方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤1)：将粗肽溶液使用色谱柱进行第一次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为碳酸氢铵水溶液，用醋酸或氨水调pH，所述流动相B为乙腈；
步骤2)：将上述收集的洗脱液使用色谱柱进行第二次梯度洗脱纯化，收集洗脱液；所述色谱柱使用的流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为硫酸钠水溶液，用硫酸调pH，所述流动相B为乙腈；
步骤3)：将步骤2)中收集的洗脱液使用色谱柱进行高效液相转盐，其中先用醋酸铵水溶液乙腈体系洗脱，再用醋酸水溶液乙腈体系洗脱；
步骤4)：将步骤3)中转盐后的洗脱液减压浓缩后加入盐酸，使醋酸根的残留量控制在5％以下；
所述步骤1)中流动相A的pH为7.0～9.5，其碳酸氢铵的浓度为0.01～0.2mol/L；所述步骤2)中流动相A的pH为2.0～4.0，其硫酸钠的浓度为0.05～0.2mol/L；所述步骤4)中调节醋酸根含量所用盐酸的量为1～4N。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中流动相A的pH为8.0，其碳酸氢铵的浓度为0.1mol/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中流动相A的pH为3.0，其硫酸钠的浓度为0.1mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中调节醋酸根含量所用盐酸的量为3.3N。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤4)中将加入1～4当量1N盐酸的目标肽溶液转移至大小合适的不锈钢托盘中进行冷冻干燥，得到的特立帕肽纯度大于99％，蛋氨酸亚砜特立帕肽杂质总和≤0.50％且最大未知单杂≤0.10％的醋酸特立帕肽，醋酸根离子含量≤5％，氯离子含量≤4％，三氟乙酸根和硫酸根含量均≤0.1％，纯化收率为60％。
6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：步骤1)至步骤3)所述色谱柱使用的固定相为十八烷基硅烷键合硅胶或八烷基硅烷键合硅胶。
7.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于：进一步包括以下步骤：在上述步骤1)之前进行如下的样品处理，将粗肽使用体积比5～10％的乙腈水溶液按照浓度5～20g/L溶解，然后使用0.22～0.45μm的滤膜过滤，收集滤液待用。
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