CN116183752A - 一种多肽杂质的液相色谱检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明多肽杂质的液相色谱检测方法，属于药物化学技术领域。本发明提供一种多肽杂质的液相色谱检测方法：以磷酸缓冲液作为流动相A，以有机试剂和水的混合溶液作为流动相B，以C18色谱柱为固定相，检测器为紫外检测器，采用高效液相色谱梯度洗脱多肽杂质。本方法可以有效检测多肽杂质中的难分离的杂质，可以作为多肽的有关物质检测的一种正交方法。

Description

一种多肽杂质的液相色谱检测方法
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种多肽杂质的液相色谱检测方法及其应用。
背景技术
合成多肽药物的杂质谱复杂，包含由起始物料引入的杂质、工艺相关的杂质和降解产生的杂质等。为实现有效检出各潜在杂质，通常需要采用多种不同原理的检测方法如反相HPLC 法、离子交换HPLC 法、分子排阻HPLC 法等。多肽杂质主要包括非对映异构体、缺失肽、***肽、断裂肽、差向肽、替代肽、侧链基团被修饰、二硫键修饰、脱酰胺杂质、氨基乙酰化等杂质，由于多肽杂质的复杂性，某个氨基酸发生变化就会产生一个新杂质，理论杂质很多，并且杂质与主成分差异很小。对于氨基酸个数较多的多肽，很难通过一个方法对所有杂质进行控制，某些特殊杂质需要专门的方法进行控制。
发明内容
本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题，提供一种多肽杂质的液相色谱检测方法及其应用。该方法针对多肽杂质的结构特征，提供了一种特殊的杂质分离方法，可以用来分离普通酸性体系下与主成分共洗脱的杂质。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特点是：以磷酸缓冲液作为流动相A，以有机试剂和水的混合溶液作为流动相B，以C18色谱柱为固定相，检测器为紫外检测器，采用高效液相色谱梯度洗脱多肽杂质。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述色谱柱包括C18反相色谱柱或C8反相色谱柱，优选C18反相色谱柱。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述色谱柱的填充粒径为1.7~10um，优选填充粒径为3um。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种，优选磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠水溶液，pH范围为7.0~10.0，优选pH9.0，所述有机试剂为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种，优选乙腈。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述有机试剂和水的混合溶液中有机试剂与水的的体积比为3：7~9：1，所述有机试剂与水的的体积比优选为7：3。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述流动相B的梯度范围为20~90%。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述梯度洗脱的过程中柱温为25~45℃，优选柱温为30℃，流速为0.4-1.5mL/min，优选流速为1.0mL/min。
本发明所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其进一步优选的技术方案是：所述紫外检测器的波长为210nm。
所述的多肽杂质的液相色谱检测方法在检测鉴定药物生产或存放过程中产生的多肽杂质中的应用。所述的应用中，所述杂质选自D-[Phe]22-利拉鲁肽、D-[Gln]17-利拉鲁肽、Des-[Thr]5-利拉鲁肽、Des-[Ala]24-利拉鲁肽和Des-[Gly]29利拉鲁肽。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本方法可以有效检测多肽杂质中的难分离的杂质，可以作为多肽的有关物质检测的一种正交方法。在碱性体系下分离多肽不易分离的杂质，可以作为酸性体系的方法补充，也可以作为主方法的正交方法，有着良好的应用前景。
附图说明
图1为实例1应用本方法检测包含D-[Phe]22-利拉鲁肽、D-[Gln]17-利拉鲁肽、Des-[Thr]5-利拉鲁肽、Des-[Ala]24-利拉鲁肽和Des-[Gly]29利拉鲁肽5个杂质的分离度色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的上述目的、特征和有点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明，但但本发明的内容并不局限于此。
实施例1，一种多肽杂质的液相色谱检测方法，
该方法以磷酸缓冲液作为流动相A，以有机试剂和水的混合溶液作为流动相B，以C18色谱柱为固定相，检测器为紫外检测器，采用高效液相色谱梯度洗脱多肽杂质。
所述色谱柱为C18反相色谱柱；
所述色谱柱的填充粒径为1.7um；
所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠或磷酸氢二钠，pH为7.0，所述有机试剂为乙腈或甲醇；
所述有机试剂和水的混合溶液中有机试剂与水的的体积比为3：7；
所述流动相B的梯度范围为20~90%；
所述梯度洗脱的过程中柱温为25℃，流速为0.4mL/min；
所述紫外检测器的波长为210nm。
所述的多肽杂质的液相色谱检测方法在检测鉴定药物生产或存放过程中产生的多肽杂质中的应用。所述杂质选自D-[Phe]22-利拉鲁肽、D-[Gln]17-利拉鲁肽、Des-[Thr]5-利拉鲁肽、Des-[Ala]24-利拉鲁肽和Des-[Gly]29利拉鲁肽。
实施例2，一种多肽杂质的液相色谱检测方法，
该方法以磷酸缓冲液作为流动相A，以有机试剂和水的混合溶液作为流动相B，以C18色谱柱为固定相，检测器为紫外检测器，采用高效液相色谱梯度洗脱多肽杂质。
所述色谱柱为C8反相色谱柱；
所述色谱柱的填充粒径为10um；
所述磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钾或者磷酸氢二钾，pH为10.0，所述有机试剂为乙醇或者异丙醇；
所述有机试剂和水的混合溶液中有机试剂与水的的体积比为9：1；
所述流动相B的梯度范围为20~90%；
所述梯度洗脱的过程中柱温为45℃，流速为1.5mL/min；
所述紫外检测器的波长为210nm。
所述的多肽杂质的液相色谱检测方法在检测鉴定药物生产或存放过程中产生的多肽杂质中的应用。所述杂质选自D-[Phe]22-利拉鲁肽、D-[Gln]17-利拉鲁肽、Des-[Thr]5-利拉鲁肽、Des-[Ala]24-利拉鲁肽和Des-[Gly]29利拉鲁肽。
实施例3，检测实验：
仪器：赛默飞U3000高效液相色谱仪
色谱柱： C18色谱柱；
检测波长：210nm；
流速：1.0ml/min；
柱温：30℃；
样品：利拉鲁肽分离度溶液（含利拉鲁肽：0.5mg/ml，Z28：5µg /ml，Z2：5µg /ml，Z57：5µg /ml，Z48：5µg /ml，Z73：5µg /ml）
进样量：40μl；
流动相A：50mmol磷酸二氢钠至1L水中，用NaOH溶液调pH至9.0；
流动相B：乙腈：水=70:30(v/v)；
采集时间：60min
洗脱条件：如下表1
表1 梯度洗脱
Figure DEST_PATH_IMAGE001
分离效果:如图1所示，5个杂质与主成分的分离度都大于1.5，分离效果好；三个杂质的检测限为0.002%，灵敏度良好。
表2高效液相色谱检测结果
Figure 77084DEST_PATH_IMAGE002
/>

Claims (10)

1.一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：该方法以磷酸缓冲液作为流动相A，以有机试剂和水的混合溶液作为流动相B，以C18色谱柱为固定相，检测器为紫外检测器，采用高效液相色谱梯度洗脱多肽杂质。
2.如权利要求1所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述色谱柱包括C18反相色谱柱或C8反相色谱柱，优选C18反相色谱柱。
3.如权利要求2所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述色谱柱的填充粒径为1.7~10um，优选填充粒径为3um。
4.如权利要求1所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液包括磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的至少一种，优选磷酸盐缓冲液为磷酸二氢钠水溶液，pH范围为7.0~10.0，优选pH9.0，所述有机试剂为乙腈、甲醇、乙醇、异丙醇中的至少一种，优选乙腈。
5.如权利要求1所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述有机试剂和水的混合溶液中有机试剂与水的的体积比为3：7~9：1，所述有机试剂与水的的体积比优选为7：3。
6.如权利要求1所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述流动相B的梯度范围为20~90%。
7.如权利要求1所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述梯度洗脱的过程中柱温为25~45℃，优选柱温为30℃，流速为0.4-1.5mL/min，优选流速为1.0mL/min。
8.如权利要求1所述的一种多肽杂质的液相色谱检测方法，其特征在于：所述紫外检测器的波长为210nm。
9.如权利要求1-8任一所述的多肽杂质的液相色谱检测方法在检测鉴定药物生产或存放过程中产生的多肽杂质中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述杂质选自D-[Phe]22-利拉鲁肽、D-[Gln]17-利拉鲁肽、Des-[Thr]5-利拉鲁肽、Des-[Ala]24-利拉鲁肽和Des-[Gly]29利拉鲁肽。
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