CN108785167A - 白芷液体生物发酵物及其制备方法和在化妆品方面的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种白芷液体生物发酵物及其制备方法和在化妆品方面的用途，所述白芷液体生物发酵物，其有效成分为将发酵菌添加到白芷水煎液中进行发酵，经灭菌、离心而得到的上清液。本发明所提供的白芷液体生物发酵物中富含具有抵制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质，从而对皮肤具有美白作用。三、本发明所提供的白芷液体生物发酵物具有很好的保湿作用。

Description

白芷液体生物发酵物及其制备方法和在化妆品方面的用途
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及白芷液体发酵物及其制备方法和在化妆品方面的用途。
背景技术
白芷为传统中药材，自古在化妆品中有着广泛的应用，《本草纲目》谓白芷“长肌肤，润泽颜色，可作面脂”，是历代医家喜用的美容药。但现代研究表明，白芷中含有光敏性成分，会引起皮肤发黑长斑，甚至引起抽搐、高血压、孕妇流产，已被***颁布的《化妆品安全技术规范》中被例为禁止添加成分。由于白芷所含的光敏毒性物质，大大限制了其在化妆品领域中的应用，白芷中所含的光敏毒性物质主要为香豆素类成分。
微生物转化的本质是利用微生物生长代谢过程中产生的酶对特定底物进行结构修饰的化学反应，利用微生物发酵炮制中药的过程实际上就是一种生物转化反应，中药成分的生物转化是研究开发新药的重要方面。
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），是芽孢杆菌属的一种，属于益生菌，在自然界中广泛存在，对人无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种白芷液体生物发酵物及其制备方法。
所述的白芷液体生物发酵物，其有效成分为将发酵菌添加到白芷水煎液中进行发酵，经灭菌、离心而得到的上清液。
进一步地，所述发酵菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。
进一步地，所述发酵菌是以菌液的形态添加到白芷水煎液中；
进一步地，所述发酵步骤中，温度为30℃-40℃，发酵时间为48小时；
所述离心步骤中，转速为12000r/min，离心半径为9cm，离心时间为20分钟。
进一步地，本发明所述的白芷液体生物发酵物不含有欧前胡素和异欧前胡素；
本发明的另一目的是提供一种白芷液体生物发酵物的用途。
进一步地，所述的白芷液体生物发酵物具有抑制酪氨酸酶的活性，酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，通过抑制酪氨酸酶的活性而达到抑制黑色素合成，进而发挥美白的作用。
进一步地，所述的白芷液体生物发酵物具有保湿作用。
进一步地，所述的白芷液体生物发酵物在制备化妆品中的应用。
本发明的另一目的是提供一种含有白芷液体生物发酵物的化妆品，其制备方法包括如下步骤：
分别取所述白芷液体生物发酵物0.3份，用甘油2份和橄榄油2份混匀。在搅拌下依次加入D-泛醇0.5份，谷胱甘肽10份，透明质酸1份，吡咯烷酮羧酸钠1份，乳酸钠1份，充分搅拌使完全溶解，混匀，调节溶液的pH至5.6-6.8之间，最后用5份纯化水补足配方总量，除菌过滤，分装。
本发明提供了一种白芷液体生物发酵物及其制备方法和在化妆品方面的用途。本发明所具有的优点是：一、通过微生物转化，去除了白芷中所含的光敏性成分，保留了白芷的美白、保湿作用。二、本发明所提供的白芷液体生物发酵物中富含具有抵制酪氨酸酶活性和抑制黑色素合成的活性物质，从而对皮肤具有美白作用。三、本发明所提供的白芷液体生物发酵物具有很好的保湿作用。
附图说明
图1 白芷药材含量测定欧前胡素、异欧前胡素对照品HPLC色谱图，其中，1号峰为欧前胡素，2号峰为异欧前胡素；
图2 白芷药材含量测定供试品HPLC色谱图，其中，1号峰为欧前胡素，2号峰为异欧前胡素；
图3 白芷水煎液HPLC色谱图，其中，1号峰为欧前胡素，2号峰为异欧前胡素；
图4 白芷液体生物发酵液HPLC色谱图。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1：白芷液体生物发酵物的制备、质量及其活性试验
（一）白芷液体生物发酵物的制备
材料与设备
本发明所用的白芷购自亳州远光中药饮片厂，枯草芽孢杆菌1389（Bacillus subtilis）购自中国农业微生物菌种保藏中心。
枯草芽孢杆菌菌株培养液 葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L, 牛肉膏10g/L，氯化钠5g/L，琼脂2g/L，硫酸锰30mg/L，硫酸镁30mg/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钠3g/L，植物油2ml/L，pH值7.0，接种枯草芽孢杆菌，30℃培养24小时。
具体过程如下：
1、取白芷粉末（24目）1kg，加入8L水煎煮1小时，滤过，药渣继续用6L水煎煮1小时，滤过，合并滤液，浓缩至1L，得到白芷水煎液。
2、将枯草芽孢杆菌菌株培养液200ml添加到白芷水煎液中，30℃-40℃发酵48小时，得到液体发酵液。
3、将所得发酵液进行115℃、20min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在12000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20分钟，收集上清液，即为本发明所述的白芷液体生物发酵物。
该实施例制备的所述的白芷液体生物发酵物外观为粘稠液体，颜色为淡黄色。pH值6.3-7.0，粘度200-500cP，可溶性固含物含量1.5-3.5%，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出。符合化妆品质量要求。
（二）、光敏性物质含量测定
白芷中所含的光敏毒性物质主要为香豆素类化合物，其中欧前胡素和异欧前胡素含量最高，因此，采用高效液相色谱分析，以欧前胡素、异欧前胡素为对照品，对白芷药材、白芷水煎液、白芷生物发酵液进行含量测定
1、色谱备件 色谱柱型号为Aglient Zorbax SB-C18（4.6×250mm，5μm）；柱温控制为25℃；以甲醇-水（55:45)为流动相；检测波长为300nm。
2、对照品溶剂的制备
取欧前胡素及异欧前胡素对照品10mg，置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
3、供试品溶液的制备
（1）取白芷粉末（过三号筛）0.4g，置50ml量瓶中，加甲醇45ml，超声处理l小时，取出，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（2）取白芷10g，置具塞锥形瓶中，加入水10ml，回流提取1小时，滤过，取滤液0.4ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
（3）取白芷液体生物发酵液0.4ml，置50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
含量测定结果见表1，附图1-4。
表1 白芷药材及液体生物发酵物中欧前胡素和异欧前胡素含量对比
由此可见，通过生物发酵可将白芷中的光敏毒性物质去除。
（三）、白芷液体生物发酵物体外抑制酪氨酸酶活性实验
1、白芷液体生物发酵物的制备
1.1材料
本发明所用的白芷购自亳州远光中药饮片厂，枯草芽孢杆菌1389（Bacillus subtilis）购自中国农业微生物菌种保藏中心。
枯草芽孢杆菌菌株培养液 葡萄糖50g/L，蛋白胨10g/L, 牛肉膏10g/L，氯化钠5g/L，琼脂2g/L，硫酸锰30mg/L，硫酸镁30mg/L，磷酸二氢钠1.5g/L，磷酸氢二钠3g/L，植物油2ml/L，pH值7.0，接种枯草芽孢杆菌，30℃培养24小时。
酪氨酸酶（Sigma）购自北京索莱宝科技有限公司；PBS（Gibco Company, USA）购自赛默飞世尔科技有限公司；水为去离子水，其余试剂均为国产分析纯。PBS：按药典配置成pH6. 85 的缓冲液。酪氨酸酶：用PBS 配制成200 U/ml的溶液。L-酪氨酸：用PBS 配制成1.5mmol /L 的溶液。
仪器：UV—1900 型紫外分光光度计( 上海光谱仪器有限公司)；AR1140电子分析天平（奥豪斯国际贸易有限公司）；ZKXF型真空干燥箱（上海树立仪器仪表有限公司）。
1.2具体过程如下
（1）、取白芷粉末（24目）2kg，1kg加入8L水煎煮1小时，滤过，药渣继续用6L水煎煮1小时，滤过，合并滤液，浓缩至2L。
（2）、取白芷水煎液1L，将枯草芽孢杆菌菌株培养液200ml添加到白芷水煎液中，30℃-40℃发酵48小时，得到液体发酵液。
（3）、将所得发酵液进行115℃、20min高压灭菌，使菌失活，将灭菌后的发酵液在12000r/min、离心半径为9cm的条件下离心20分钟，收集上清液，即为本发明所述的白芷液体生物发酵物。
2、采用多巴速率法测定样品对酪氨酸酶活性的抑制作用。微量移液器按表2-3的体积依次准确吸取C1，C2，T1，T2 4组分析液置于试管中，在37℃水浴中恒温10分钟后，各加入0.5ml L-酪氨酸溶液，反应15分钟，迅速移入比色皿，在475nm处测吸光度AC1、AC2、AT1、AC2。按下式计算白芷液体生物发酵物对酪氨酸酶的抑制率：
酶抑制率＝1-△AT/△AC=[1-(AT1-AT2)/(AC1-AC2)]×100%
表2 白芷水煎液反应液的组成
表3 白芷液体生物发酵物反应液的组成
白芷水煎液、白芷液体生物发酵物对酪氨酸酶活性抑制作用结果见表4。
表4 白芷水煎液、白芷液体生物发酵物对酪氨酸酶活性抑制作用
以上结果表明，白芷液体生物发酵物对酪氨酸酶活性的抑制作用比白芷水煎液略强，在去除光敏物质的同时保留了美白作用。
实施例2：
（一）、白芷液体生物发酵物化妆品的制备
分别取白芷液体生物发酵物0.3份，加甘油2份和橄榄油2份混匀，在搅拌下依次加入D-泛醇0.5份，谷胱甘肽10份，透明质酸1份，吡咯烷酮羧酸钠1份，乳酸钠1份，充分搅拌使完全溶解，混匀，调节溶液的pH至5.6-6.8之间，最后用5份纯化水补足配方总量，除菌过滤，分装，即为含有白芷液体生物发酵物的化妆品。
分别取甘油2份和橄榄油2份混匀。在搅拌下依次加入D-泛醇0.5份，谷胱甘肽10份，透明质酸1份，吡咯烷酮羧酸钠1份，乳酸钠1份，充分搅拌使完全溶解，混匀，调节溶液的pH至5.6-6.8之间，最后用5份纯化水补足配方总量，除菌过滤，分装，即为不含有白芷液体生物发酵物的化妆品。
（二）、白芷液体生物发酵物化妆品的保湿度及保湿时间检测
MMV（moisture measurement value）法检测MMV值反应皮肤角质层结合水的能力。采用CM825型皮肤油水酸碱测试仪测试皮肤的水合作用。
受试者为健康无皮肤病的志愿者。试验条件为测试期间环境的温度和湿度恒定，温度为25℃±2℃，相对湿度为40%-60%。
选取健康志愿者50名进行测试。测试方法为：确定左右前臂4块测试区域，区域面积为4cm×4cm，分别测试该区域的空白值。将样本涂敷于测试区域，用量为5mg/cm2。使用后120分钟进行最终的测试，每块区域测试5个点，取平均值。保湿效果评价公式：相对保湿率%＝(P样t=x-P空白)/ (P标t=x-P空白)×100%。式中：P样t=x：使用一定时间后产品的电导率；P空白：未涂样品的电导率；P标t=x：使用一定时间后参照物的电导率，本发明的化妆品以及甘油比较的保湿率情况（%）结果如下表所示：
表5白芷液体生物发酵物化妆品的保湿度及保湿时间检测
由以上实验结果可知，本发明所述的化妆品的保湿率明显高于甘油及不含有白芷液体生物发酵物的化妆品。

Claims (9)

1.一种白芷液体生物发酵物，其特征在于，其有效成分为将发酵菌添加到白芷水煎液中进行发酵，经灭菌、离心而得到的上清液。
2.根据权利要求1所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，所述发酵菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。
3.根据权利要求1或2所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，所述发酵菌是以菌液的形式添加到白芷水煎液中。
4.根据权利要求1或2所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，所述发酵步骤中，温度为30℃-40℃，发酵时间为48小时，所述离心步骤中，转速为12000r/min，离心半径为9cm，离心时间为20分钟。
5.根据权利要求1或2所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，不含有欧前胡素和异欧前胡素。
6.根据权利要求1或2所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，可抑制酪氨酸酶活性。
7.根据权利要求1或2所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，具有保湿作用。
8.根据权利要求1或2所述的白芷液体生物发酵物，其特征在于，在制备化妆品中的应用。
9.一种制备权利要求1或2或5所述的白芷液体生物发酵物化妆品的方法，其特征在于，包括如下步骤：
分别取白芷液体生物发酵物0.3份，用甘油2份和橄榄油2份进行溶解，在搅拌下依次加入D-泛醇0.5份，谷胱甘肽10份，透明质酸1份，吡咯烷酮羧酸钠1份，乳酸钠1份，充分搅拌使完全溶解，混匀，调节溶液的pH至5.6-6.8之间，最后用5份纯化水补足配方总量，除菌过滤，分装。
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