CN113520942B - 一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于化妆品技术领域，公开了一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物及其制备方法和应用。该五参发酵物的制备方法，包括以下步骤：1)将五参原料进行高压均质，得到五参原液；五参原料包括人参、丹参、苦参、沙参、玄参和核桃仁；2)利用水解酶对五参原液进行酶解，得到五参水解液；3)利用发酵菌株对五参水解液进行发酵，得到五参发酵物。本发明通过将高压均质、酶解反应和微生物发酵技术进行有机结合，有效增加五参发酵物中的活性成分的种类和含量，特别是提高了活性成分的含量，其中人参皂苷Rb1 18.9‑28.8μg/mL，丹酚酸B 311‑386μg/mL，苦参碱51‑64μg/mL，氧化苦参碱52‑76μg/mL。

Description

一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化妆品技术领域，特别涉及一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物及其制备方法和应用。
背景技术
《普济方》重视辨证论治，从脏腑气血辨治皮肤病。据普济方中记载，五参圆采用人参、丹参、苦参、沙参、玄参调配，用胡桃15克与诸药和捣为丸，茶水下，治酒刺，面疮。在古代的应用中，此方剂以药粉服用为主。基于该方剂中各原料具有的护肤效果，目前大多采用水煎煮的方法进行提取活性成分，作为保健品或化妆品使用。现有相关技术公开了一种伍参圆发酵原浆化妆品及其制备方法与应用。其制备方法的步骤如下：(1)伍参圆干粉的制备：将人参、丹参、苦参、沙参、玄参、核桃仁、绿茶茶叶混合，干燥，粉碎机粉碎，过筛，得到伍参圆干粉；(2)伍参圆发酵初始体系的制备：将酵母菌液与步骤(1)所得的伍参圆干粉和水混合，即得伍参圆发酵初始体系；(3)伍参圆发酵初原液的制备：对步骤(2)所得的伍参圆发酵初始体系进行发酵培养，得到伍参圆发酵初原液；(4)伍参圆发酵原浆的制备：将步骤(3)所得的伍参圆发酵初原液进行灭菌、然后进行离心，取离心后的上清液，即得到伍参圆发酵原浆。该方法得到的伍参圆发酵原浆中的活性成分含量较低。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物的制备方法，能够得到含有高含量的活性成分的五参发酵物。
本发明的第一方面提供一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物的制备方法，包括以下步骤：
1）将五参原料进行高压均质，得到五参原液；所述五参原料包括人参、丹参、苦参、沙参、玄参和核桃仁；所述高压均质的压力为40-100 MPa；
2）利用水解酶对所述五参原液进行酶解，得到五参水解液；
3）利用发酵菌株对所述五参水解液进行发酵，得到所述五参发酵物。
根据现代医药学研究，人参的主要成分为人参皂苷类、多肽类、多糖以及维生素等，能扩张皮肤的毛细血管，促进皮肤的血液循环，增强皮肤的营养，并能防止皮肤脱水、硬化、起皱，从而增强了皮肤的弹性，使细胞得到新生。丹参富含丹参酸和丹参酮，是天然的抗氧化剂，具有抗衰老，抗纤维化的功效。苦参能够平衡油脂分泌，疏通并收敛毛孔，清除皮肤内毒素杂质。沙参中的多糖具有抗辐射作用，对辐射损伤皮肤有明显的保护作用，其多糖还是优秀的天然保湿因子。玄参提取物具有降低炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量、提高抗炎因子 IL-10 浓度的作用，能通过影响 MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）通路实现抗炎作用。核桃仁中核桃仁多酚提取物不仅具有很好的抗氧化、清除自由基、抗菌的作用，而且对酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，是一种很有潜力的天然祛斑因子。
随着生物技术的发展，多种活性酶被分离、鉴定、结构解释、活性研究。其中纤维素酶已有广泛的研究及工业应用。另外，现代微生物学研究成果也给中药提取带来了新的启示。结合现代微生物工程而形成的新中药活性成分提取技术，利用微生物发酵技术获取植物中的活性成分，开发出特色微生物源原料成为了新趋势。微生物在生长过程中可以产生很多生物活性成分包括多种酶、小分子化合物等，研究表明这些物质是优良的护肤材料。可见，生物发酵过程可以提升终产物的整体护肤功效。
本发明通过将高压均质、酶解反应和微生物发酵技术进行有机结合，其中高压均质和酶解反应，可以使植物细胞充分破碎，使细胞内的内容物快速、充分释放，提高植物材料的生物利用效率，以便于后续的发酵操作，微生物发酵可以充分发挥微生物的生物转化能力，有效增加五参发酵物中的活性成分的种类和含量，从而提高五参发酵物的抗氧化和抗衰老功效。
优选地，所述水解酶包括纤维素酶和半纤维素酶。
优选地，所述五参原液、纤维素酶、半纤维素酶的质量比为（1-500）：（0.1-10）：0.1。
优选地，所述发酵菌株包括戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、红曲霉菌和双歧杆菌中的至少一种，优选为戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、红曲霉菌和双歧杆菌。
优选地，所述发酵菌株的浓度为105-108 CFU/mL。
具体的，本发明所述抗氧化、抗衰老的五参发酵物的制备方法，包括以下步骤：
1）取人参、丹参、苦参、玄参、沙参、核桃仁和去离子水混合后加入到高压均质机中，均质温度为20-40℃，均质压力为40-100 MPa，均质时间为3-30min，即得五参原液；
优选地，均质温度为25-35℃，均质压力为40-100 MPa，均质时间为3-15min；
2）将五参原液、纤维素酶和半纤维素酶按照质量比（1-500）：（0.1-10）：0.1进行混合，调节pH至4-7，于40-60℃、40-60 rpm/min下酶解1-4 h，随后在80-120℃下加热10-40min，得到五参水解液；
优选地，酶解pH为5-6，酶解温度为45-55，酶解时间为1.5-3h，加热温度为80-120℃，加热时间为10-40 min。
3）将五参水解液、发酵菌株、MRS肉汤培养基和去离子水按照用量比为（0.1-1000g）：（0.1-50mL）：（0.1-50g）：（0.1-1000g）混合，25-45℃下发酵12-120 h，发酵结束后将发酵液在100-121℃下灭菌20-30 min，然后在离心半径为15-18 cm，转速为4000 -4500rpm/min下，离心20-30 min，取离心后的上清液，得到所述五参发酵物；
优选地，用量比为（10-500g）：（1-10mL）：（1-10g）：（10-500g），发酵温度为30-40℃，发酵时间为12-96h。
本发明的第二方面提供一种抗氧化、抗衰老的五参发酵物，采用本发明所述的制备方法制备而成。
优选地，所述抗氧化、抗衰老的五参发酵物包括如下浓度的组分：人参皂苷Rb118.9-28.8μg/mL，丹酚酸B 311-386μg/mL，苦参碱51-64μg/mL，氧化苦参碱52-76μg/mL。
本发明的第三方面提供所述抗氧化、抗衰老的五参发酵物在化妆品中的应用。
具体的，所述化妆品的种类包括水剂、乳液类、膏霜类、喷雾类、精华类、皂类或洗护类。
优选地，一种精华液，包括本发明所述抗氧化、抗衰老的五参发酵物和辅料。
优选地，所述抗氧化、抗衰老的五参发酵物占所述精华液的质量百分比为0.1-90%。
优选地，所述辅料包括保湿剂、润肤剂、防腐剂中的至少一种。
相对于现有技术，本发明的有益效果如下：
本发明通过将高压均质、酶解反应和微生物发酵技术进行有机结合，有效增加五参发酵物中的活性成分的种类和含量，特别是提高了活性成分的含量，其中人参皂苷Rb118.9-28.8μg/mL，丹酚酸B 311-386μg/mL，苦参碱51-64μg/mL，氧化苦参碱52-76μg/mL。
本发明制备的五参发酵物的羟自由基清除率为43.6-58%，DPPH自由基清除率为50.19-69.96%，具有良好的抗氧化和抗衰老功效。
具体实施方式
为了让本领域技术人员更加清楚明白本发明所述技术方案，现列举以下实施例进行说明。需要指出的是，以下实施例对本发明要求的保护范围不构成限制作用。
以下实施例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有已知方法得到。
实施例1
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、5 mL戊糖乳杆菌菌液（浓度为107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，37℃下发酵72 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例2
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为25 ℃，均质压力为40 MPa，均质时间为15 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.1g纤维素酶、0.1g半纤维素酶，调节pH至5，于45℃、50rpm/min下酶解1.5 h，随后在110℃下加热15 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、1mL植物乳杆菌菌液（浓度为106 CFU/mL）、1 g MRS肉汤培养基和100 g去离子水混合，30℃下发酵96h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例3
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为35 ℃，均质压力为100 MPa，均质时间为3 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入10g纤维素酶、10g半纤维素酶，调节pH至6，于55℃、50rpm/min下酶解3 h，随后在90℃下加热30 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、10 mL双歧杆菌菌液（浓度为108 CFU/mL）、10 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，40℃下发酵50 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌30 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例4
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为20 ℃，均质压力为100 MPa，均质时间为15 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、5 mL红曲霉菌液（浓度为107CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，37℃下发酵72 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例5
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为戊糖乳杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为4：1，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例6
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为戊糖乳杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：1，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例7
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为戊糖乳杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：4，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例8
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为植物乳杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中植物乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为4：1，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例9
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为植物乳杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中植物乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：1，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例10
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为植物乳杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中植物乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：4，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例11
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为双歧杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为4：1，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例12
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为双歧杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：1，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例13
本实施例与实施例4相比，区别仅在于将步骤3）的红曲霉菌菌液替换为双歧杆菌和红曲霉菌的混合菌液，且混合菌液中双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）和红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：4，混合菌液的加入量与实施例4红曲霉菌菌液的加入量相同，其它方法步骤与实施例4相同。
实施例14
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤（3）所述戊糖乳杆菌菌液替换为戊糖乳杆菌和双歧杆菌的混合菌液，且所述混合菌液中戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）的比例为4：1，混合菌液的加入量与实施例1糖乳杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例1也相同。
实施例15
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤（3）所述戊糖乳杆菌菌液替换为戊糖乳杆菌和双歧杆菌的混合菌液，且所述混合菌液中戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：1，混合菌液的加入量与实施例1糖乳杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例1也相同。
实施例16
本实施例与实施例1相比，区别仅在于将步骤（3）所述戊糖乳杆菌菌液替换为戊糖乳杆菌和双歧杆菌的混合菌液，且所述混合菌液中戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）和双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）的比例为1：4，混合菌液的加入量与实施例1糖乳杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例1也相同。
实施例17
本实施例与实施例2相比，区别仅在于将步骤（3）所述植物乳杆菌菌液替换为植物乳杆菌和双歧杆菌的混合菌液，且所述混合菌液中植物乳杆菌菌液（106 CFU/mL）和双歧杆菌菌液（106CFU/mL）的比例为4：1，混合菌液的加入量与实施例2植物杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例2也相同。
实施例18
本实施例与实施例2相比，区别仅在于将步骤（3）所述植物乳杆菌菌液替换为植物乳杆菌和双歧杆菌的混合菌液，且所述混合菌液中植物乳杆菌菌液（106 CFU/mL）和双歧杆菌菌液（106CFU/mL）的比例为1：1，混合菌液的加入量与实施例2植物杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例2也相同。
实施例19
本实施例与实施例2相比，区别仅在于将步骤（3）所述植物乳杆菌菌液替换为植物乳杆菌和双歧杆菌的混合菌液，且所述混合菌液中植物乳杆菌菌液（106 CFU/mL）和双歧杆菌菌液（106CFU/mL）的比例为1：4，混合菌液的加入量与实施例2植物杆菌菌液的加入量相同，其它与实施例2也相同。
实施例20
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、1 mL植物乳杆菌菌液（107 CFU/mL）、3mL红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）、1mL双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，37℃下发酵84 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例21
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30℃，均质压力为60 MPa，均质时间为6min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、1 mL戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）、3mL红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）、1mL双歧杆菌菌液（107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，35℃下发酵84 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例22
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.3g纤维素酶、0.9g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、1 mL戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）、2mL红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）、1mL植物乳杆菌菌液（107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，35℃下发酵84 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例23
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30 ℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、5 mL酿酒酵母菌液（107 CFU/mL）、5 g YPD培养基和200 g去离子水混合，30℃下发酵72 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例24
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30 ℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、5 mL红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，30℃下发酵72 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
实施例25
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30 ℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，获得五参水解液；
3）将300 g五参水解液、5 mL红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，30℃下发酵72 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15 cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液，即获得五参发酵物。
对比例1（与实施例1的区别在于采用常规水煎煮）
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后，在100℃下加热提取物2h，过滤，收集滤液即得。
对比例2（与实施例1的区别在于未进行发酵）
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30 ℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，加入0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，过滤，收集滤液即得。
对比例3（与实施例1的区别在于未进行高压均质和发酵）
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g，加入去离子水540g、0.9g纤维素酶、0.3g半纤维素酶，调节pH至5.5，于50℃、50 rpm/min下酶解2 h，随后在100℃下加热20 min，过滤，收集滤液即得。
对比例4（与实施例7的区别在于未进行水解）
一种五参发酵物制备方法，包括如下步骤：
1）取人参10g、丹参10g、苦参10g、玄参10g、沙参10g、核桃仁10g、去离子水540 g混合后加入到高压均质机中，均质温度为30 ℃，均质压力为80 MPa，均质时间为4 min，即得五参原液；
2）取五参原液300g，在100℃下加热20 min，冷却至30℃后，加入1 mL戊糖乳杆菌菌液（107 CFU/mL）、4mL红曲霉菌菌液（107 CFU/mL）、5 g MRS肉汤培养基和200 g去离子水混合，37℃下发酵72 h，发酵结束后将发酵液在121℃下灭菌20 min，然后在离心半径为15cm，转速为4000 rpm/min下，离心30 min，取离心后的上清液即得。
对比例5
本对比例与实施例4相比，区别仅在于将步骤（3）所述菌液替换为去离子水，且加入量相同，其它与实施例4也相同。
试验例1：人参皂苷Rb1和丹酚酸B的含量测定
以实施例1-25和对比例1-5制备的样品进行下面试验。
样品制备：取50g的样品液，在60℃下减压蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1%磷酸溶液为流动相B；按下表1中的规定进行梯度洗脱；柱温设置为30℃，供试品溶液进样量为10μL；人参皂苷Rb1的检测波长为205nm，丹酚酸B的检测波长为286nm。
含量测定结果见表3所示。
表1
Figure 323536DEST_PATH_IMAGE001
试验例2：苦参碱和氧化苦参碱的含量测定
以实施例1-25和对比例1-5制备的样品进行下面试验。
样品制备：取20g的样品液，置分液漏斗中，加浓氨试液0.4mL，加入三氯甲烷进行萃取，每次25mL，合并三氯甲烷，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-[0.01mol/L乙酸铵溶液（浓氨试液调PH8.1）］（3:2）为流动相A，0.01mol/L乙酸铵溶液（浓氨试液调pH8.1）为流动相B，按下表2中的规定进行梯度洗脱；柱温设置为30℃，供试品溶液进样量为10μL；检测波长为225nm。
含量测定结果见表3所示。
表2
Figure 732651DEST_PATH_IMAGE002
表3
样品 人参皂苷Rb1（μg/mL） 丹酚酸B（μg/mL） 苦参碱 （μg/mL） 氧化苦参碱（μg/mL）
实施例1 20.1 311 51 54
实施例2 18.9 324 52 53
实施例3 21.4 329 56 52
实施例4 21.0 316 55 54
实施例5 25.5 375 59 63
实施例6 23.3 351 57 60
实施例7 23.0 369 61 58
实施例8 25.4 336 60 62
实施例9 23.1 335 58 61
实施例10 26.3 343 62 59
实施例11 25.9 338 63 55
实施例12 21.8 361 57 58
实施例13 23.3 344 59 60
实施例14 24.7 331 67 69
实施例15 21.6 359 60 59
实施例16 22.1 336 68 54
实施例17 25.4 335 63 66
实施例18 25.1 347 66 63
实施例19 25.3 345 58 63
实施例20 26.3 333 60 61
实施例21 25.5 349 67 62
实施例22 28.8 386 64 76
实施例23 15.5 300 46 47
实施例24 17.4 308 49 46
实施例25 16.8 303 48 49
对比例1 6.9 112 21 18
对比例2 8.1 248 40 40
对比例3 10.8 301 37 32
对比例4 9.4 273 39 41
对比例5 11.7 294 44 45
由表3可知，实施例1-4为采用单一菌液发酵，发酵物中人参皂苷Rb1的含量为18.9-21.4μg/mL，丹酚酸B的含量为311-329μg/mL，苦参碱的含量为51-56μg/mL，氧化苦参碱的含量为52-54μg/mL。实施例5-19为采用两种菌液共同发酵，发酵物中人参皂苷Rb1的含量为21.6-26.3μg/mL，丹酚酸B的含量为335-375μg/mL，苦参碱的含量为57-68μg/mL，氧化苦参碱的含量为55-69μg/mL。实施例20和21为采用三种菌液共同发酵，发酵物中人参皂苷Rb1的含量为26.3μg/mL 和25.5μg/mL，丹酚酸B的含量为333μg/mL和349μg/mL，苦参碱的含量为60μg/mL和67μg/mL，氧化苦参碱的含量为61μg/mL 和62μg/mL。实施例22为采用四种菌液共同发酵，发酵物中人参皂苷Rb1的含量为28.8μg/mL，丹酚酸B的含量为386μg/mL，苦参碱的含量为64μg/mL，氧化苦参碱的含量为76μg/mL。实施例23为采用酿酒酵母菌液发酵，发酵物中人参皂苷Rb1的含量为15.5μg/mL，丹酚酸B的含量为300μg/mL，苦参碱的含量为46μg/mL，氧化苦参碱的含量为47μg/mL。实施例24-25为采用单一酶水解，发酵物中人参皂苷Rb1的含量为16.8-17.4μg/mL，丹酚酸B的含量为303-308μg/mL，苦参碱的含量为48-49μg/mL，氧化苦参碱的含量为46-49μg/mL。实施例1-25中制备的五参发酵物，其中的活性成分含量，远高于对比例1-5中制备的样品，说明通过高压均质、水解和微生物发酵，药材中的不同类别的天然活性成分能够更好的释放，特别是水溶性较差的人参皂苷。实施例22采用四种菌液共发酵得到的活性成分含量最多，实施例23-25得到的活性成分含量最少。实施例23-25也是通过高压均质、水解和发酵得到，其发酵物中的各活性成分含量高于对比例1-5中制备的样品，而实施例23由于采用酿酒酵母菌液发酵，实施例24和实施例25均采用单一酶水解，导致五参发酵物中的各活性成分含量低于实施例1-22。
试验例3：红细胞溶血性评价
红细胞溶血实验是兔眼刺激性实验(Draizetest)替代方法之一，基本原理是通过测定血红蛋白溶出量及变性程度来评价化学品对眼组织细胞的损伤。国际上主要将RBC实验用于评价化妆品及原料等化学品的眼刺激性研究。
以实施例1-25和对比例1-5制备的样品进行红细胞溶血实验，本实验依照欧洲替代方法验证中心(ECVAM)的RBC实验测试方法及分级标准。其中HD50为50％红细胞发生溶血时的样品浓度，DI为蛋白质变性指数，L/D为HD50与DI的比值。评价标准见表4；评价结果见表5。
表4
Figure 925211DEST_PATH_IMAGE003
表5
Figure 151793DEST_PATH_IMAGE004
由表5可知，实施例1-25及对比例1-5制得的五参发酵物均对红细胞没有刺激性。
试验例4：羟自由基的清除能力评价
以实施例1-25和对比例1-5制备的样品进行下面试验。
反应体系中先加入1.0 mLFeSO4溶液（9.0 mmol/L）、1 mL水杨酸-乙醇溶液（9.0mmol/mL）、0.2 mL样品、0.8 mL去离子水，再加入1.0 mL H2O2（8.8 mmol/mL），于37 ℃水浴反应30 min，以无水乙醇为空白对照，于510 nm处测定其吸光度，按以下公式(1)计算各提取液对·OH的清除率(Y)：
Y（%）=[1-(A1-A2)/A3]×100% (1)
式中A1为提取液反应体系的吸光度；A2为不加H2O2的样品的吸光度（以无水乙醇代替H2O2）；A3为空白对照无水乙醇的吸光度。
结果见表6所示。
试验例5 ：DPPH自由基清除能力评价
清除DPPH自由基能力在一定程度上反应物质的抗氧化能力。自由基清除率越大，表明抗氧化能力越强，抗衰老能力越强。因此，可以通过样品对清除DPPH自由基能力的研究来判断其抗衰老效果。以实施例1-25和对比例1-5制备的样品进行下面试验。
向试管中加入质量浓度为45.8 mg/L的DPPH测试液2.0 mL和样品0.05 mL，总体积用50%乙醇（v/v）补充至3 mL，摇匀，避光反应30 min后，用1 cm比色皿在517 nm波长处测定吸光度，记为A1；向试管中加入无水乙醇2 mL和相应体积的待测样品，总体积用50%乙醇（v/v）补充至3 mL，测得的吸光度记为A2；向试管中加入DPPH测试液2 mL和50%乙醇（v/v）1 mL，测得的吸光度记为A3。按以下公式(2)计算待测液对DPPH自由基清除率(Y)；
DPPH自由基清除率的计算公式为：Y(％)＝[1-(A1-A2)/A3]×100 (2)
式中A1为空白对照清除DPPH后体系的吸光度值，A2为样品清除DPPH后体系的吸光度值，A3为未加药品前反应体系的吸光度值。
结果见表6所示。
表6
样品 羟自由基清除率（%） DPPH自由基清除率（%） 样品 羟自由基清除率（%） DPPH自由基清除率（%）
实施例1 45.04 50.19 实施例16 50.18 65.12
实施例2 44.50 54.38 实施例17 53.02 59.08
实施例3 47.34 52.09 实施例18 49.55 58.13
实施例4 43.60 55.30 实施例19 49.47 60.33
实施例5 51.33 67.79 实施例20 51.80 56.97
实施例6 48.65 63.01 实施例21 55.22 58.43
实施例7 48.23 56.68 实施例22 58.0 69.96
实施例8 55.12 60.03 实施例23 38.82 45.11
实施例9 48.07 63.66 实施例24 45.45 48.32
实施例10 49.36 62.22 实施例25 43.29 49.08
实施例11 56.19 59.54 对比例1 17.69 15.06
实施例12 54.77 66.36 对比例2 26.77 30.18
实施例13 50.06 63.21 对比例3 33.09 39.84
实施例14 47.76 63.44 对比例4 36.18 44.79
实施例15 48.10 57.29 对比例5 28.99 32.78
由表6可知，实施例1-4为采用单一菌液发酵，羟自由基清除率为43.60-47.34%，DPPH自由基清除率为50.19-55.30%。实施例5-19为采用两种菌液共同发酵，羟自由基清除率为47.76-56.19%，DPPH自由基清除率为56.68-67.79%。实施例20和21为采用三种菌液共同发酵，羟自由基清除率为51.80%和55.22%，DPPH自由基清除率为56.97%和58.43%。实施例22为采用四种菌液共同发酵，羟自由基清除率为58.0%，DPPH自由基清除率为69.96%。实施例23为采用酿酒酵母菌液发酵，羟自由基清除率为38.82%，DPPH自由基清除率为45.11%。实施例24-25为采用单一酶水解，羟自由基清除率为43.29-45.45%，DPPH自由基清除率为48.32-49.08%。实施例1-25中制备的五参发酵物，羟自由基清除率和DPPH自由基清除率，远高于对比例1-5中制备的样品，其中实施例22羟自由基清除率和DPPH自由基清除率最好，实施例23-25羟自由基清除率和DPPH自由基清除率偏低。
试验例6：抑制酪氨酸酶活性评价
抑制酪氨酸酶活性能力在一定程度上反应物质的美白能力，酪氨酸酶活性抑制率越大，表明美白能力越强，以实施例1-25和对比例1-5制备的样品进行试验。
按表7准确吸取样品溶液、pH值为6.8的磷酸盐缓冲溶液（PBS）和质量分数为0.1%的多巴溶液，充分混合，于30℃孵育5 min后，分别加入相应体积的酪氨酸酶溶液（活度为100 U/mL），在30℃下孵育10 min，迅速转移至比色皿中，在475 nm处测定吸光度。
表7
Figure 65522DEST_PATH_IMAGE005
按公式（3）计算样品溶液对酪氨酸酶的相对抑制率（I）。
I＝[(A1-A2)-(A3-A4)] /(A1-A2) ×100% （3）
式中，A1、A2、A3和A4分别为1-4组溶液的吸光度。
结果如表8所示。
表8
Figure 747170DEST_PATH_IMAGE006
由表8可知，实施例1-25中制备的五参发酵物对酪氨酸酶活性有很好的抑制作用，高于对比例1-5中制备的样品，表现出更强的美白功效。对比例1和对比例5是没有经过微生物发酵，其酪氨酸酶抑制活性非常弱。可见经过发酵处理后，活性有很明显提升，特别是实施例22中四种菌液共同发酵制备的发酵物，对酪氨酸酶活性抑制最高。
试验例7：UV照射后HaCaT细胞存活率
将HaCaT（人永生化角质细胞）细胞接种至6孔板中，在37℃，5% CO2的培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到50%-60%时，往空白对照组、阴性对照组中加入细胞培养基，往受试样品组加入含有5%对应浓度受试样品（5%）的细胞培养基，预处理1h，然后进行UVB辐照（30mJ/cm2）40min。于37℃，5% CO2的培养箱中继续培养24h后吸除培养基，用PBS清洗2-3次，采用MTT法测试细胞存活率，测试结果如表9所示。
表9
Figure 921800DEST_PATH_IMAGE007
由表9可知，相比于对比例1-5，实施例1-25制得的五参发酵物对UV照射后的HaCat细胞具有更好的保护作用，并且能够促进细胞的生长。在这方面，混合菌液发酵制备的发酵物优于单一菌液发酵制备的发酵物。
试验例8：UV照射后人皮肤成纤细胞（HSD）中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，MDA、MMP-1和COL-I含量
将细胞接种至6孔板中，在37 ℃下，质量分数5 % CO2培养箱孵育过夜。待6孔板中细胞铺板率达到60%-70%时，空白对照组、阴性对照组均加入细胞培养基，受试样品组加入含有5%对应浓度受试物的细胞培养基预处理1 h，然后进行UVB辐照（30 mJ/cm2）40 min。于37 ℃、质量分数5% CO2培养箱继续培养24 h。培养结束后，根据试剂盒操作方法，测定超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，丙二醛（MDA）含量。根据ELISA试剂盒操作方法，测定基质金属蛋白酶-1（MMP-1）和人I型胶原（COL-I）的含量。
表10
样品 SOD（U/mg 蛋白） GSH-Px（U/mg 蛋白） MDA含量（μg/mg 蛋白） MMP-1含量（ng/mL） COL-I含量（ng/mL）
实施例1 54.68 366 15.45 6.54 109
实施例2 56.75 351 15.39 6.32 112
实施例3 52.09 363 15.72 6.71 120
实施例4 53.14 371 15.11 6.83 116
实施例5 70.10 430 15.47 5.39 125
实施例6 64.31 403 14.88 6.02 127
实施例7 63.48 411 15.30 5.88 120
实施例8 66.77 425 15.76 5.63 141
实施例9 60.05 379 14.96 6.20 126
实施例10 62.38 396 15.43 5.21 124
实施例11 58.73 448 14.31 6.04 128
实施例12 62.19 415 14.20 6.02 124
实施例13 65.87 392 15.16 5.77 122
实施例14 67.08 394 15.64 6.37 133
实施例15 58.79 378 15.39 6.16 126
实施例16 64.43 403 15.25 5.09 123
实施例17 58.68 465 13.99 6.18 140
实施例18 59.59 413 14.17 5.69 126
实施例19 69.12 437 14.86 5.46 121
实施例20 68.28 404 14.16 5.87 137
实施例21 63.33 417 14.37 6.06 126
实施例22 70.91 450 13.04 5.11 147
实施例23 46.63 344 16.62 6.93 105
实施例24 50.03 323 16.23 6.99 102
实施例25 48.83 337 16.85 7.01 106
对比例1 19.88 142 22.17 9.11 52.4
对比例2 37.24 360 19.71 7.55 93.1
对比例3 21.70 206 16.88 7.08 103
对比例4 45.79 311 17.54 6.92 96.5
对比例5 34.97 243 20.76 9.73 72.4
表10结果表明，实验例1-25中的五参发酵物比对比例1-5中制备的样品更能提高HSD中SOD和GSH-Px的活性，更能降低MDA的含量，表现出更强的抗氧化活性。另外，实验例1-25中制备的五参发酵物比对比例1-5中制备的样品更能降低MMP-1的含量，提高COL-I的含量。MMP-1的提高和COL-I的降低会引起皮肤衰老、产生皱纹，结果表明实验例1-25中的五参发酵物有更强的抗衰老功效。在抗氧化和抗衰老作用方面，混合菌液发酵制备的发酵物优于单一菌液发酵制备的发酵物。
应用例1：精华液美白功效评价。
本应用例提供分别由实施例4或对比例1所得的五参发酵物制备的精华液，其具体配方如表11所示。
表11
Figure 929070DEST_PATH_IMAGE008
效果评价对象选取志愿者30名，年龄在20-45岁，男女各半。左侧脸使用实施例4所制备的护肤精华液，右侧脸使用对比例1所制备的护肤精华液，每天早午晚各使用一次，每次各涂抹1 g产品于脸部，并按摩2分钟。根据感官评价填写试用评价表。使用7天、14天、28天各统计一次。志愿者在使用过程中对样品进行白度(0-5分)、紧致度(0-5分)效果评价，其中最高分为5，表示效果显著，最低分为0表示没有效果。结果见表12所示。
表12
Figure 189150DEST_PATH_IMAGE009
应用例2：精华液淡纹功效评价。
效果评价对象选取志愿者30名，年龄在30-45岁女性。测试前，使用VISIA面部图像分析仪拍摄照片，分析志愿者眼部细纹的情况。请志愿者在洁面后使用相应组别的产品，1分钟后再次进行拍摄及分析，作为产品的即时淡纹效果。随后请志愿者连续试用待测样品（由实施例4或对比例1所得的五参发酵物制备的精华液），每日使用2次，每次使用0 .5g，连续试用28d，在第7天和第28天进行回访，拍摄面部照片并进行分析，作为产品的长效淡纹效果。同一个志愿者的检测由同一个检测人员完成。通过检测仪器内置的分析***，对眼部细纹的变化率进行计算，统计结果。结果见表13所示。
表13
Figure 408910DEST_PATH_IMAGE010
由表12、表13可知，志愿者认为使用实施例4制备的精华液后，皮肤白度、紧致度、舒缓方面得到显著改善，优于使用对比例1制备的精华液，此效果与五参发酵物清除自由基及提高细胞内活性酶的能力是相关的；实施例4制备的精华液还能改善眼部细纹，此效果与五参发酵物能够提高COL-I含量是相关，也优于对比例1制备的精华液。说明本发明的五参发酵物应用到化妆品中具有显著的抗氧化和抗衰老的功效。
以上对本发明的较佳实施方式进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出种种的等同变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种五参发酵物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将五参原料进行均质，得到五参原液；所述五参原料由人参、丹参、苦参、沙参、玄参和核桃仁组成；所述均质的压力为40-100MPa；
2)利用水解酶对所述五参原液进行酶解，得到五参水解液；
3)利用发酵菌株对所述五参水解液进行发酵，得到所述五参发酵物；
所述水解酶由纤维素酶和半纤维素酶组成；
所述发酵菌株由戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、红曲霉菌和双歧杆菌组成。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述五参原液、纤维素酶、半纤维素酶的质量比为(1-500)：(0.1-10)：0.1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵菌株的浓度为105-108CFU/mL。
4.一种五参发酵物，其特征在于，采用权利要求1-3任一项所述的制备方法制备而成，包括如下浓度的组分：人参皂苷Rb1 18.9-28.8μg/mL，丹酚酸B 311-386μg/mL，苦参碱51-64μg/mL，氧化苦参碱52-76μg/mL。
5.权利要求4所述的五参发酵物在制备化妆品中的应用。
6.一种精华液，其特征在于，包括权利要求4所述的五参发酵物和辅料。
7.根据权利要求6所述的精华液，其特征在于，所述五参发酵物占所述精华液的质量百分比为0.1-90％。
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