CN111249218B - 一种雪莲发酵原液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种雪莲发酵原液及其制备方法和应用，所述方法为混合雪莲粉末、发酵菌菌液、葡萄糖和水得初始体系，所述发酵菌菌液为植物乳杆菌与嗜热链球菌混合菌液，调节pH至4.5‑6.5发酵，发酵温度35‑43℃，发酵时间12‑60h，得发酵液，将所述发酵液进行灭菌、离心、收集上清液，得到所述雪莲发酵原液。本发明采用植物乳杆菌与嗜热链球菌对雪莲进行发酵，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，避免了提取方法造成的活性成分流失。本发明提供的雪莲发酵原液中富含具有DPPH抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的物质，从而对皮肤具有较强的抗氧化和美白功能，同时与发酵滤液中的成分具有协同作用。

Description

一种雪莲发酵原液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化妆品领域，更具体地说，涉及一种雪莲发酵原液及其制备方法和应用。
背景技术
随着现代生物技术的快速发展以及人们对于纯天然原料产品的日渐青睐，越来越多的人关注植物酵素这一类新产品，然而现在酵素在花类上的应用还较少，远没有在蔬菜水果上的应用广泛，且不同植物发酵条件不同效果会有很大差别。雪莲花富含绿原酸、黄酮化合物、生物碱、内酯、甾醇、多糖及挥发油和一些微量的元素，它具有抗缺氧、抗风湿、镇痛、调节心血管***、防止染色体畸变、抗癌、抗辐射、抗炎、清除自由基、延缓衰老、增强免疫力等显著药理作用。现有文献尝试不同发酵菌发酵雪莲或者其提取物，但其有效成分不稳定容易破坏。
CN 107468533A公开了具有抗辐射美白活性的雪莲槲皮素及其制备方法和应用，将雪莲残渣干燥后加入复合菌粉，封口发酵后水浴蒸干，过筛得发酵雪莲残渣粉末，将残渣粉末加入有机提取剂，超声抽滤得浓缩提取液，萃取分离纯化得雪莲槲皮素。使用雪莲提取残渣和复合菌粉对雪莲的有效成分破坏大。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明第一个目的在于提供一种雪莲发酵原液的制备方法，其优点是采用植物乳杆菌与嗜热链球菌对雪莲进行发酵，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，避免了提取过程中雪莲活性成分的流失。
本发明第二个目的在于提供一种雪莲发酵原液。
本发明第三个目的在于提供雪莲发酵原液的在制备化妆品中的应用。
本发明第四个目的在于提供一种雪莲发酵原液美白精华。
为实现上述第一个目的，本发明提供了如下技术方案：一种雪莲发酵原液的制备方法，所述方法为混合雪莲粉末、发酵菌菌液、葡萄糖和水得初始体系，所述发酵菌菌液为植物乳杆菌与嗜热链球菌混合菌液，调节初始体系pH至4.5-6.5发酵，发酵温度35-43℃，发酵时间12-60h，得发酵液，将所述发酵液进行灭菌、离心、收集上清液，得到所述雪莲发酵原液。
作为一个优选方案，所述发酵菌菌液的发酵菌浓度为106-108CFU/ml。发酵菌浓度为106-108CFU/ml时具有较好的发酵效率，且产率高。
作为一个优选方案，所述雪莲粉末的目数为40—70目，优选50目。雪莲粉末的目数为40—70目时适合发酵反应进行，发酵效率高。
作为一个优选方案，所述发酵温度为37℃；发酵时间为33h。在优选的发酵温度和发酵时间下，植物活性成分结构最大程度不被破坏，避免了提取方法造成的活性成分流失。
作为一个优选方案，所述初始体系中雪莲粉末与水的质量比为1:20-1:40，优选1:20。
作为一个优选方案，所述初始体系中葡萄糖的质量百分比浓度为2％-10％，优选6％。
作为一个优选方案，所述初始体系中发酵菌菌液的体积百分比浓度为0.2％-1％，优选1％。
发酵液进行灭菌、离心、收集上清液时，选用常规操作步骤，优选离心转速为10000r/min，离心温度为4℃，离心时间为10min。
为实现上述第二个目的，本发明提供了如下技术方案：利用上述制备方法制备获得的雪莲发酵原液。
为实现上述第三个目的，本发明提供了如下技术方案：利用上述制备方法制备获得的雪莲发酵原液在制备化妆品中的应用。雪莲发酵原液中富含具有DPPH抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的物质，同时发酵原液与发酵滤液中的成分具有协同作用，对皮肤具有较强的抗氧化和美白功能。
作为一个优选方案，所述化妆品为具有清除DPPH自由基和/或抑制酪氨酸酶活性的功能性化妆品。
为实现上述第四个目的，本发明提供了如下技术方案：一种雪莲发酵原液美白精华，按质量份计，包括以下组分：
Figure BDA0002420379180000021
Figure BDA0002420379180000031
三乙醇胺适量
水加至100。
适量三乙醇胺是指待体系分散均匀后，向体系滴加三乙醇胺，直至体系pH为中性且体系明显变得粘稠。
本发明的雪莲粉末是指雪莲花粉末，雪莲花(学名：Saussureainvolucrata(Kar.et Kir.)Sch.-Bip.)为菊科、风毛菊属多年生草本，因其顶形似莲花，故得名雪莲花，简称雪莲。
本发明发酵菌菌液为植物乳杆菌与嗜热链球菌混合菌液，混合菌液有协同增效的作用。植物乳杆菌MRS-P89(Lactobacillus plantarum)与嗜热链球菌是目前在食品工业上的应用比较广泛，例如在食品发酵后能改善食品风味、有一定的保健作用、能够提高食品的保藏性能、能够提高食品的营养价值等。通过发酵菌的代谢活动，将碳水化合物和糖分转化成皮肤喜好的酶和氨基酸，有效成分被分解和微化，有害细菌和毒素被自然清除，既天然又安全。同时，发酵使有效成分变为更易被吸收的小分子，提高了产品的功效。
本发明葡萄糖为食品级发酵用葡萄糖。本发明提供的雪莲发酵原液可直接作为化妆品进行应用，也可作为功效原料添加于皮肤护理化妆品中，发挥其抗氧化和美白等功效。其中，所述的皮肤护理化妆品包括但不限于膏霜、乳液、化妆水、精华素、凝胶、面膜、洗面奶等。
本发明具有以下有益效果：本发明采用植物乳杆菌与嗜热链球菌对雪莲进行发酵，发酵温度和发酵pH温和，植物活性成分结构不被破坏，避免了提取方法造成的活性成分流失。本发明提供的雪莲发酵原液中富含具有DPPH抗氧化和抑制酪氨酸酶活性的物质，从而对皮肤具有较强的抗氧化和美白功能，同时与发酵滤液中的成分具有协同作用。本发明提供的化妆品发酵完成后，发酵原液中不添加香精等化学成分，确保产品对人体的安全性。
具体实施方式
以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同意义。本发明不对所采用的原料的来源进行限定，如无特殊说明，均为普通市售产品。
下述实施例所用发酵菌菌液均按照如下步骤进行预处理：
发酵过程中首先将菌种进行活化，使保持更高的生活力；然后将菌纯化；接着扩培使菌大量繁殖。具体过程如下：
(1)菌种活化：从保藏的斜面中挑取菌落放入液体培养基中，放入摇床中将菌种活化。
(2)菌种纯化：将活化的菌种梯度稀释铺板，以便获取单菌落。
(3)菌种扩培：将待用菌种接种到相应液体培养基中，在35～38℃的摇床中培养，菌种处在对数期，即为合适的接种浓度106-108CFU/ml。所用培养基组成为：MRS琼脂6.6％，MRS肉汤5％。
实施例1.雪莲发酵原液的制备
取料液质量比为1:20的雪莲粉末与去离子水的混合液加入质量百分比浓度为6％的食品级葡萄糖，雪莲粉末的目数为40目，再用食用级Na2CO3调节初始pH至6.0，灭菌冷却后，加入浓度为106CFU/ml，体积百分比浓度为1％的植物乳杆菌与嗜热链球菌菌液，于42℃恒温摇床内培养50h。发酵结束后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15min，10000r/min离心10min，取上清液，即为雪莲发酵原液。
实施例2.雪莲发酵原液的制备
取料液质量比为1:30的雪莲粉末与去离子水的混合液加入质量百分比浓度为10％的食品级葡萄糖，雪莲粉末的目数为70目，再用食用级Na2CO3调节初始pH至5.5，灭菌冷却后，加入浓度为108CFU/ml，体积百分比浓度为0.2％的植物乳杆菌与嗜热链球菌菌液，于37℃恒温摇床内培养33h。发酵结束后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15min，10000r/min离心10min，取上清液，即为雪莲发酵原液。
实施例3.雪莲发酵原液的制备
取料液质量比为1:40的雪莲粉末与去离子水的混合液加入质量百分比浓度为10％的食品级葡萄糖，雪莲粉末的目数为50目，再用食用级Na2CO3调节初始pH至4.5，灭菌冷却后，加入浓度为108CFU/ml，体积百分比浓度为0.8％的植物乳杆菌与嗜热链球菌菌液，于35℃恒温摇床内培养12h。发酵结束后在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌15min，10000r/min离心10min，取上清液，即为雪莲发酵原液。
实施例1—3制备所得雪莲发酵原液的外观为褐色。pH值为3.2-4.8，粘度为50-300cP，可溶性固含物的质量百分含量为1.5-5.0％，菌落总数小于50CFU/ml，无致病菌检出，符合化妆品原料质量要求。
实施例4.雪莲发酵原液抗氧化功效分析
DPPH是一种早期合成的有机自由基，常用来评估抗氧化物的供氢能力，它在有机溶剂中非常稳定，呈紫色，而且在处有一个特征吸收峰，当遇到自由基清除剂时，DPPH的孤对电子被配对而使其退色，也就是在最大吸收波长处的吸光值变小。因此，可通过测定吸光值的变化来评价样品对DPPH自由基的清除效果。
DPPH自由基清除实验的具体实验步骤为：
用无水乙醇配制浓度2×10-4mol/L的DPPH溶液，取2mL中配好的DPPH溶液放入试管中，再加入2mL去离子水摇匀，共4mL，测其吸光度为A0；取2mL配好的DPPH溶液放入试管中，再加入稀释100倍后发酵液2mL，在37℃下遮光静置30min后测其吸光度为A1；在517nm下测吸光度值。
清除率计算公式为：清除率(％)＝(A0-A1)÷A0×100％，清除率越大表明抗氧化能力越强。
参照实施例1的制备方法，调整不同的发酵温度，发酵时间，以及葡萄糖用量，发酵得雪莲发酵原液，检测结果如下表所示。
表1不同发酵温度的雪莲发酵原液稀释100倍后DPPH自由基清除率
发酵温度(℃) DPPH自由基清除率(％)
35 82.94
37 89.05
39 89.73
41 84.28
43 82.37
未发酵 58.20
表2不同发酵时间的雪莲发酵原液稀释100倍后DPPH自由基清除率
发酵时间(h) DPPH自由基清除率(％)
12 81.68
24 80.89
36 78.95
48 82.37
60 81.11
未发酵 58.20
表3不同葡萄糖用量的雪莲发酵原液稀释100倍后DPPH自由基清除率
葡萄糖用量(％) DPPH自由基清除率(％)
2 77.04
4 79.57
6 81.85
8 82.94
10 83.16
未发酵 58.20
由表1-3可知，在不同发酵条件下，发酵上清液在稀释100倍后对DPPH自由基的清除率依然能够达到80％左右，抗氧化效果良好。并且与未发酵时相比，均有明显提高。
DPPH清除能力可用EC50值来评价,EC50被定义为清除DPPH初始量一半时的样品有效浓度。维生素C的EC50为0.005mg/ml，雪莲发酵液为EC50为0.492μg/ml。
实施例5.雪莲发酵原液的美白功效分析
酪氨酸酶是黑素生成的关键酶，它控制着黑素的形成过程，其活性程度对色素的沉积起主要作用。目前市场上销售的许多美白、祛斑产品都是以抑制酪氨酸酶达到美白作用，故对酪氨酸酶抑制作用的强弱是评价增白化妆品的主要指标。
通过测定样品对酪氨酸酶的影响来评价样品的美白功能，具体方法如下：按表4配置溶液：
表4溶液配制列表
单位(ml) C1 C2 T1 T2
L-酪氨酸 2 2 2 2
样品 0 0 2 2
PBS 4 5 2 3
络氨酸酶 1 0 1 0
总体积 7 7 7 7
注：C1和T1加入1mL酪氨酸酶，酶活为100U/mL。
(1)C2管配好摇匀后，在37℃水浴锅中水浴加热10min，波长475nm下调零。
(2)C1管溶液配好摇匀，37℃水浴10min后，加酪氨酸酶1ml，继续水浴10分钟，测定C1吸光度值。
(3)按(1)(2)同样方法，以T2调零测定T1吸光度值。
(4)计算样品对酪氨酸酶的活性抑制率T(％)。T(％)＝(C1-T1)/C1×100％。
参照实施例1的制备方法，调整不同的发酵温度，发酵时间，以及葡萄糖用量，发酵得雪莲发酵原液，检测结果如下表所示。
表5不同发酵温度的雪莲发酵原液对酪氨酸酶的抑制率
发酵温度(℃) 酪氨酸酶抑制率(％)
35 21.82
37 44.89
39 53.48
41 39.55
43 30.64
未发酵 8.43
表6不同发酵时间的雪莲发酵原液对酪氨酸酶的抑制率
发酵时间(h) 酪氨酸酶抑制率(％)
12 33.40
24 54.82
36 61.89
48 64.96
60 56.56
未发酵 8.43
表7不同葡萄糖用量的雪莲发酵原液对酪氨酸酶的抑制率
葡萄糖用量(％) 酪氨酸酶抑制率(％)
2 14.06
4 38.75
6 46.21
8 49.77
10 77.59
未发酵 8.43
由表5-7可知，不同发酵条件的雪莲发酵原液的酪氨酸酶抑制率是有所区别的，但是也很明显的看出，雪莲发酵原液有良好的美白效果。并且与未发酵时相比，均有明显提高。
实施例6.雪莲发酵原液的功效成分分析
雪莲中富含绿原酸与黄酮类化合物，绿原酸具有抗菌、抗病毒、抗炎、保肝、降糖降脂、调节免疫、神经保护、降压、抗氧化等多种生物活性，临床上可用于抗菌解毒、消炎利胆。而黄酮类化合物是一种天然抗氧化剂，对自由基具有良好的清除作用。检测雪莲发酵原液发酵前后绿原酸及黄酮类化合物含量，是此发酵液的重要指标。
(1)绿原酸含量的测定绿原酸标准曲线的绘制
精密称取绿原酸标准样品7.2mg(0.25mmol)，用95％乙醇容解，转移到250mL容量瓶中，加95％乙醇到刻度，混匀。此时溶液浓度为1μmol/mL，精密吸取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1mL到25mL容量瓶中，加95％乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。在330nm处测定吸光度，以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制绿原酸标准曲线并求出相应的回归方程。
样品中绿原酸含量的测定
准确吸取样品发酵液5ml于25ml容量瓶中，加95％的乙醇稀释到刻度，得到待测样品液。以95％的乙醇作空白，在330nm处测定吸光度，由标准曲线计算出待测样品液浓度。
(2)黄酮含量的测定
芦丁标准曲线：以95％乙醇为溶剂配制0.2mg/mL的芦丁标准品溶液。然后精密吸取0、1、2、3、4、5、6mL分别置于25mL容量瓶中，加入1mL 4％NaNO2溶液混匀，6min后加入1mL8％Al(NO3)3溶液混匀，6min后加入10mL 12％NaOH溶液，定容后静置15min，于在510nm处，测吸光度。横纵坐标分别为芦丁浓度、吸光度。
黄酮含量测定：精密吸取1mL雪莲发酵液在510nm处，测吸光度，吸光度带入标准曲线方程计算出黄酮含量。
表8发酵前后绿原酸与黄酮含量的对比
Figure BDA0002420379180000071
Figure BDA0002420379180000081
由表8可知，发酵前的雪莲提取液与雪莲发酵原液相比，发酵后绿原酸含量提升34％；而黄酮含量则提升接近17倍，提升效果显著。
实施例7.雪莲发酵原液的应用
表9发酵雪莲美白精华的制备配方表
原料 用量/g
去离子水 加至100
雪莲发酵原液 5.0
甘油 5.0
1，3-丁二醇 3.0
卡波U-20 0.1
汉生胶 0.1
尿囊素 0.05
烟酰胺 0.05
抗坏血酸 0.05
熊果苷 0.01
透明质酸钠 0.01
三乙醇胺 适量
制备工艺：
1.预先称量85g去离子水和0.1g的卡波。将去离子水高速搅拌(以不溅出烧杯为准)，将称量好的卡波缓慢倒入去离子水中，高速搅拌5分钟左右。
2.称量其余组分，降低搅拌速度，向分散均匀的卡波溶液中加入剩余组分。补足水。
3.待体系分散均匀后，向体系滴加三乙醇胺，直至体系pH为中性且体系明显变得粘稠。
注：整个操作过程可以在不加热条件下进行，但也可以适当加热，溶解一些难溶组分。需要注意的是，三乙醇胺需要在加热后冷却至45摄氏度后滴加。另外此工艺制备得到的透明凝胶含有气泡，但在静置一段时间后，气泡会自动消失。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述方法为混合雪莲花粉末、发酵菌菌液、葡萄糖和水得初始体系，所述发酵菌菌液为植物乳杆菌与嗜热链球菌混合菌液，调节初始体系pH至4.5-6.5发酵，发酵温度35-43℃，发酵时间12-60h，得发酵液，将所述发酵液进行灭菌、离心、收集上清液，得到所述雪莲花发酵原液。
2.根据权利要求1所述的一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述发酵菌菌液的发酵菌浓度为106-108CFU/ml。
3.根据权利要求1所述的一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述雪莲花粉末的目数为40—70目。
4.根据权利要求1所述的一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述发酵温度为37℃；发酵时间为33h。
5.根据权利要求1所述的一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述初始体系中雪莲花粉末与水的质量比为1:20-1:40。
6.根据权利要求1所述的一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述初始体系中葡萄糖的质量百分比浓度为2%-10%。
7.根据权利要求1所述的一种雪莲花发酵原液的制备方法，其特征在于，所述初始体系中发酵菌菌液的体积百分比浓度为0.2%-1%。
8.权利要求1—7任一所述制备方法制备获得的雪莲花发酵原液。
9.权利要求8所述雪莲花发酵原液在制备化妆品中的应用。
10.根据权利要求9所述雪莲花发酵原液在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品为具有清除DPPH自由基和/或抑制酪氨酸酶活性的功能性化妆品。
11.一种雪莲花发酵原液美白精华，其特征在于，按质量份计，包括以下组分：
权利要求8所述雪莲花发酵原液 4.0~5.0
甘油 4.0~5.0
1，3-丁二醇 2.0~3.0
卡波Ｕ-20 0.1~0.2
汉生胶0.1~0.2
尿囊素0.05~0.1
烟酰胺0.03~0.06
抗坏血酸0.03~0.06
熊果苷0.01~0.02
透明质酸钠0.01~0.02
三乙醇胺适量
水加至100。
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