CN110721149A - 一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，涉及微生物发酵及化妆品技术领域，包括步骤一：将摇床活化好的双歧杆菌接种到培养基中进行发酵；步骤二：发酵结束后，灭活菌液，低速离心后收集上清液；步骤三：将银耳进行高温精粹提取，并搅拌过滤，并添加防腐剂；步骤四：将野大豆粉碎，通过超声提取、加热提取和回流搅拌提取之后，过滤，浓缩，分离纯化，并配置成丁二醇溶液；步骤五：取步骤二中的发酵液，按比例添加分子量不同的透明质酸、烟酰胺、步骤三中的银耳提取物、步骤四中的野大豆提取物，加热搅拌溶解获取最终的组合物。本发明能够有效解决化妆品中存在化学污染大，温和性、活性不足的问题。

Description

一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵及化妆品技术领域，尤其涉及一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法。
背景技术
随着发酵产品被广大用户所熟知，人们对发酵产品的认知也越来越加深。经双歧杆菌发酵后处理得到的发酵产物滤液，含有丰富的氨基酸、多肽、矿物质以及各种维生素，它们是人体的重要组成部分，在改善皮肤条件上起着重要的作用。但是随着发酵产品的不断增多，发酵产品的质量也备受关注。
中国专利CN108272645A，公开了一种含二裂酵母发酵产物胞溶物的抗衰面膜精华液及其制备方法，其采用配方组分：燕麦β葡聚糖、锁水磁石、二裂酵母发酵产物胞溶物、对羟基苯乙酮、己二醇组合。抗衰面膜精华液使用后，可达到补充面部肌肤水分、提亮肤色、降低皱纹数量和深度等一系列延缓皮肤衰老的技术功效。
本发明公开的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物，经双歧杆菌发酵后处理得到的发酵产物滤液，添加不同分子量的透明质酸钠，烟酰胺，高温精粹提取的银耳，超声提取的野大豆，在发酵原有的基础上，通过添加透明质酸钠、烟酰胺、银耳提取物、野大豆提取物等活性物，它们分别在美白和保湿方面有着良好的效果，进而提升发酵液的功效。
发明内容
为克服现有技术中的化妆品中存在化学污染大，温和性、活性不足的问题，提出了一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，包括步骤一：将摇床活化好的双歧杆菌接种到培养基中进行发酵；步骤二：发酵结束后，灭活菌液，低速离心后收集上清液；步骤三：将银耳进行高温精粹提取，并搅拌过滤，并添加防腐剂；步骤四：将野大豆粉碎，通过超声提取、加热提取和回流搅拌提取之后，过滤，浓缩，分离纯化，并配置成丁二醇溶液；步骤五：取步骤二中的发酵液，按比例添加分子量不同的透明质酸、烟酰胺、步骤三中的银耳提取物、步骤四中的野大豆提取物，加热搅拌溶解获取最终的组合物。
通过采用上述技术方案，将双歧杆菌作为发酵的菌株，具有美白和保湿方面的功效，添加透明质酸钠、烟酰胺、银耳和野大豆中提取的活性物来提高发酵液的保湿、美白效果，并兼具抗衰老抗氧化、美容养颜的效果。
作为优选的，所述双歧杆菌选用乳酸双歧杆菌，且发酵用的培养基为BBL 液体培养基。
通过采用上述技术方案，乳酸双歧杆菌为益生菌，能够很好的进行发酵，采用最常用的液体培养基，可以根据需要去添加营养药剂，有利于乳酸双歧杆菌的培养。
作为优选的，分子量不同的所述透明质酸钠包括为分子量为1万道尔顿的超小分子量透明质酸钠、10万道尔顿的小分子量透明质酸钠、140万道尔顿的大分子透明质酸钠、230万道尔顿超大分子的透明质酸钠中的一种。
通过采用上述技术方案，透明质酸有多种类型的选择，分子量的不同决定了颗粒大小不同的，产生了不同的可能，对于该组合物具有不用的功效，用于制造不同的类型的化妆品，例如膏、霜、蜜、奶液、面膜、香波等产品。
作为优选的，所述银耳提取物，经过高温精粹提取，趁热通过纱布过滤，并添加防腐剂，最后通过1um滤芯过滤获得得到银耳提取物。
通过采用上述技术方案，银耳提取物中经过高温提取，获得了较好的菌液中，添加的防腐剂能够有效防止银耳经过高温过滤之后易变质的特点，最后再通过滤芯进行过滤，过滤掉其中的杂质，最终获得银耳提取物。
作为优选的，所述野大豆提取物通过粉碎之后，加入乙醇，并通过超声辅助提取，再浓缩，最后将大孔树脂分离纯化获得野大豆提取物。
通过采用上述技术方案，野大豆经过了粉碎变成颗粒物之后，与加入的乙醇最大限度的混合，使其反应完全，通过超声辅助的提取，提取完成之后，通过采用大孔树脂分离纯化得到最终的野大豆提取物，保留了野大豆中的有益成份。
作为优选的，所述乳酸双歧杆菌发酵的条件为pH值范围6.5～7.0，发酵温度37～42℃，摇床速度80～200rpm，发酵时间5～10小时。
通过采用上述技术方案，双歧杆菌在其适宜的环境中，通过摇床混合发酵，将其他组份混合均匀，发酵之后用于形成最终的组合物。
作为优选的，所述透明质酸钠中的添加量如下：其中1万道尔顿的超小分子量透明质酸钠添加量：0.01～1％，10万道尔顿的小分子量透明质酸钠：0.01～0.5％， 140万道尔顿的大分子透明质酸钠：0.01～0.3％，230万道尔顿超大分子的透明质酸钠，0.001～0.2％。
通过采用上述技术方案，透明质酸钠中所在该组合物中的成份不变，因此分子量越大，所占的比例就越小，从而保证整体个比例结构的稳定。
作为优选的，所述银耳提取物提取时的温度是80～100℃，料液比为1:3～6，提取时间为3～8小时，所用防腐剂为1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮。
通过采用上述技术方案，1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮为一种新型的防腐物质，用于化妆品防腐，对于水剂、乳剂、膏剂均具有很好的效果。
作为优选的，所述野大豆所用的乙醇的浓度为40～80％，料液比为1:5～20，超声辅助提取的时间为30～60分钟，之后加热提取2～4小时，提取温度50～70℃，再在60～70℃浓缩掉乙醇，AB-8大孔树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是3～6ml/min，60～80％乙醇，1～4ml/min，最后配成含固量为0.1％的 30％的丁二醇溶液。
通过采用上述技术方案，采用中高浓度的乙醇将野大豆中的有效成份析出，并且经过了超声辅助提取之后再加热提取，浓缩掉乙醇之后再进行分离纯化，获得野大豆提取物。
作为优选的，烟酰胺的添加量为0.5～5％，银耳提取物的添加量为1～10％；野大豆提取物的添加量为0.5～5％。
通过采用上述技术方案，组合的发酵产物占大部分，添加少部分植物提取物和活性物质，提高其化妆品组合物的稳定性。
综上所述，本发明的优点：利用微生物发酵技术与植物提取技术相结合，在二裂酵母发酵产物滤液原有的基础上，通过添加植物提取物及其他活性物，增强发酵产品在美白和保湿方面的功效。与化工合成的活性物相比，植物提取来源的活性物，其安全性、刺激性方面较化工合成的活性物更好。
附图说明
图1是一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法工艺流程图；
图2是一种二裂酵母发酵产物滤液组合物发酵上清液的制备方法。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
1、将摇床活化好的双歧杆菌接种到双歧杆菌培养基(BBL液体培养基)中发酵，发酵条件是：所用的双歧杆菌是乳酸(B.lactis)双歧杆菌，pH值范围 6.5～7.0，发酵温度37℃，摇床速度100rpm，发酵时间5小时。
2、发酵结束后，灭活菌液，用TDL-80-2B低速离心机，转速7000转/分进行菌液离心，收集离心上清液备用
3、银耳提取的温度是80℃，料液比为1:4，提取时间为8小时，搅拌提取，搅拌速度200转/分钟，取样检测固含量大于1％，即提取完成，趁热纱布过滤(低温过不动)，1um滤纸板过滤，添加1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮作为防腐剂。
4、野大豆粉碎处理后，以浓度为60％的乙醇作为提取溶剂，常温超声辅助提取30分钟，之后加热提取2小时，提取温度70℃，回流搅拌提取，提取结束后，1um滤纸板过滤，70℃浓缩掉乙醇后，用AB-8大孔树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是3ml/min，60％乙醇，1ml/min。收集含花色素、原花色素含量高的组分，浓缩后，配成含固量为0.1％的30％的丁二醇溶液。
5、取步骤2中的发酵液，添加0.1％的1万道尔顿左右的超小分子量透明质酸钠，添加0.05％的10万道尔顿左右的小分子量透明质酸钠，添加0.03％的140 万道尔顿左右的大分子透明质酸钠，添加0.01％的230万道尔顿左右超大分子的透明质酸钠，添加1％的烟酰胺粉末，添加1％的步骤3中的银耳提取物，添加0.5％的步骤4中的野大豆提取物，50℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的产品。
实施例2
1、将摇床活化好的双歧杆菌接种到双歧杆菌培养基(BBL液体培养基)中发酵，发酵条件是：所用的双歧杆菌是乳酸(B.lactis)双歧杆菌，pH值范围 6.5～7.0，发酵温度39℃，摇床速度120rpm，发酵时间7小时。
2、发酵结束后，灭活菌液，用TDL-80-2B低速离心机，转速7000转/分进行菌液离心，收集离心上清液备用
3、银耳提取的温度是90℃，料液比为1:4，提取时间为6小时，搅拌提取，搅拌速度200转/分钟，取样检测固含量大于1％，即提取完成，趁热纱布过滤(低温过不动)，1um滤纸板过滤，添加1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮作为防腐剂。
4、野大豆粉碎处理后，以浓度为70％的乙醇作为提取溶剂，常温超声辅助提取30分钟，之后加热提取3小时，提取温度60℃，回流搅拌提取，提取结束后，1um滤纸板过滤，70℃浓缩掉乙醇后，用AB-8大孔树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是3ml/min，60％乙醇，1ml/min。收集含花色素、原花色素含量高的组分，浓缩后，配成含固量为0.1％的30％的丁二醇溶液。
5、取步骤2中的发酵液，添加0.2％的1万道尔顿左右的超小分子量透明质酸钠，添加0.1％的10万道尔顿左右的小分子量透明质酸钠，添加0.03％的140 万道尔顿左右的大分子透明质酸钠，添加0.02％的230万道尔顿左右超大分子的透明质酸钠，添加2％的烟酰胺粉末，添加2％的步骤3中的银耳提取物，添加0.5％的步骤4中的野大豆提取物，50℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的产品。
实施例3
1、将摇床活化好的双歧杆菌接种到双歧杆菌培养基(BBL液体培养基)中发酵，发酵条件是：所用的双歧杆菌是乳酸(B.lactis)双歧杆菌，pH值范围 6.5～7.0，发酵温度41℃，摇床速度120rpm，发酵时间8小时。
2、发酵结束后，灭活菌液，用TDL-80-2B低速离心机，转速7000转/分进行菌液离心，收集离心上清液备用。
3、银耳提取的温度是95℃，料液比为1:5，提取时间为4小时，搅拌提取，搅拌速度200转/分钟，取样检测固含量大于1％，即提取完成，趁热纱布过滤(低温过不动)，1um滤纸板过滤，添加1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮作为防腐剂。
4、野大豆粉碎处理后，以浓度为70％的乙醇作为提取溶剂，常温超声辅助提取60分钟，之后加热提取3小时，提取温度65℃，回流搅拌提取，提取结束后，1um滤纸板过滤，70℃浓缩掉乙醇后，用AB-8大孔树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是3ml/min，60％乙醇，1ml/min。收集含花色素、原花色素含量高的组分，浓缩后，配成含固量为0.1％的30％的丁二醇溶液。
5、取步骤2中的发酵液，添加0.5％的1万道尔顿左右的超小分子量透明质酸钠，添加0.1％的10万道尔顿左右的小分子量透明质酸钠，添加0.05％的140 万道尔顿左右的大分子透明质酸钠，添加0.02％的230万道尔顿左右超大分子的透明质酸钠，添加2％的烟酰胺粉末，添加2％的步骤3中的银耳提取物，添加1％的步骤4中的野大豆提取物，50℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的产品。
实施例4
1、将摇床活化好的双歧杆菌接种到双歧杆菌培养基(BBL液体培养基)中发酵，发酵条件是：所用的双歧杆菌是乳酸(B.lactis)双歧杆菌，pH值范围 7.0～7.5，发酵温度41℃，摇床速度120rpm，发酵时间8小时。
2、发酵结束后，灭活菌液，用TDL-80-2B低速离心机，转速7000转/分进行菌液离心，收集离心上清液备用
3、银耳提取的温度是95℃，料液比为1:5，提取时间为6小时，搅拌提取，搅拌速度200转/分钟，取样检测固含量大于1％，即提取完成，趁热纱布过滤(低温过不动)，1um滤纸板过滤，添加1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮作为防腐剂。
4、野大豆粉碎处理后，以浓度为75％的乙醇作为提取溶剂，常温超声辅助提取30分钟，之后加热提取3小时，提取温度70℃，回流搅拌提取，提取结束后，1um滤纸板过滤，70℃浓缩掉乙醇后，用AB-8大孔树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是3ml/min，60％乙醇，1ml/min。收集含花色素、原花色素含量高的组分，浓缩后，配成含固量为0.1％的30％的丁二醇溶液。
5、取步骤2中的发酵液，添加0.5％的1万道尔顿左右的超小分子量透明质酸钠，添加0.1％的10万道尔顿左右的小分子量透明质酸钠，添加0.05％的140 万道尔顿左右的大分子透明质酸钠，添加0.02％的230万道尔顿左右超大分子的透明质酸钠，添加5％的烟酰胺粉末，添加4％的步骤3中的银耳提取物，添加3％的步骤4中的野大豆提取物，50℃加热搅拌溶解，最后即为我们需要的产品。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
效果实施例：
美白效果的检测：酪氨酸酶活性抑制试验
实验原理：酪氨酸经过酪氨酸酶催化生成多巴，多巴脱氢后形成多巴醌，多巴醌最大吸收波长在475nm，通过测量475nm波长的吸光率，可以反应出生成多巴醌的浓度的大小。酪氨酸酶与美白活性成分同时存在时，酪氨酸酶的催化活性会受到一定程度的抑制，从而减少多巴醌的生成。根据前后吸光度对比，可以判断美白活性成分对酪氨酸酶活性的抑制程度，进而评估美白成分在体外的美白功效。
材料：缓冲液：K2HPO4(8.71g/500mL)+KH2PO4(6.805g/mL)(pH＝6.80
±0.02)；
底物：0.3mg/mL左右的L-酪氨酸；
分光光度计：uv(475nm)
实验方法：取少量的酶，用缓冲液溶解；取1.5ml离心管加入(L-酪氨酸 (0.3mg/ml)500μL+缓冲液500μL+水450μL+酶50μL)；加酶前，37℃，20min；加酶后，37℃，(加酶-测试)10min后，分光光度计波长475nm处，测吸光度。调整酶浓度，使吸光度(ABS)在0.45-0.55之间。此浓度的酶作为实验用酶液。
Figure BDA0002283619030000071
酪氨酸酶抑制率(％)＝[1-(A-B)/(C-D)]*100
酪氨酸酶抑制率测试结果如下表一：
表一
实施例 抑制率
实施例1 51.36％
实施例2 53.22％
实施例3 52.45％
实施例4 58.71％
(1)保湿效果的检测：皮肤角质层水合率实验
采用世界公认的Cornemeter法—电容法：基于水(81)和其他物质的介电常数(＜7)变化相当大，按照含水量的不同，适当形状的测量用电容器会随着皮肤的电容量的变化而变化，而皮肤的电容量又是在测量的范围内，这样就可以测量出皮肤的水分含量。电容量的测量方法比其他方法更优越，由于被测试皮肤和测试探头没有不自然的接触，几乎没有电流通过被测试皮肤，因此测试结果实际上不受极化效应和离子导电率的影响。仪器探头和皮肤中水分建立平衡过程中没有惯性，可以实现快速测量，这样同时也消除了活性皮肤对测量结果的影响。
实验方法：测试区域：手前臂内侧
试验前，受试者需要统一清洁前臂内侧，用干的面巾纸搽拭干净，清洁后在受试者前臂内侧做好测量区域标记，正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少30min，前臂暴露，呈测试状态放置，保持轻松。
实验中前臂内侧标记2×4cm2实验区域，同一手臂可同时标记多个区域，区域间隔2cm。测试产品和空白对照均随机分布在手前臂上，先测量各测试区域清洁后30min的空白值，然后按2.0±0.1mg样品/cm2的用量，使用乳胶指套将受试样均匀涂布于实验区内，涂抹后分别测量0.5h、1h、2h、4h受试区域和对照区域的皮肤水分含量。同一个志愿者的测量由同一个测量人员完成。
水合率＝(测试值-空白对照值)/空白对照值*100％
保湿效果的测试结果如下表二：
表二
实施例1 实施例2 实施例3 实施例4
0.5h 70.25％ 75.36％ 80.46％ 81.75％
1h 65.05％ 71.32％ 78.27％ 77.56％
2h 60.38％ 59.24％ 73.22％ 74.63％
4h 40.12％ 38.25％ 60.64％ 63.56％
应用实施例：
应用实施例1积雪草精华液
Figure BDA0002283619030000091
积雪草精华液工艺：
1.A相依次投入釜中升温到70℃搅拌溶解(卡波U21先用丁二醇分散)
2.A相完全溶解好后，降温到50℃左右，B相依次加入其中，搅拌溶解
3.C相边搅拌边加入，D相外部溶解好后再投入釜中搅拌混匀即可
应用实施例2清爽乳液
Figure BDA0002283619030000092
Figure BDA0002283619030000101
清爽乳液工艺：
1.A相于一个搅拌釜中80℃加热溶解
2.B相于另一釜中80℃加热搅拌溶解(卡波U21先用甘油分散)
3.B相完全溶解好后，C相边搅拌边投入
4.A相加入B相中搅拌混匀10分钟后，开启乳化，3000rpm/min，乳化5min
5.乳化完成后，降温到60℃，D，E相分别加入其中，搅拌20分钟后，开启乳化，2000rpm/min，乳化3min即可
应用实施例3美白面霜
Figure BDA0002283619030000102
Figure BDA0002283619030000111
美白面霜工艺：
1.A相于一个搅拌釜中80℃加热溶解
2.E相于另一乳化罐中85℃加热搅拌溶解
3.C，D相依次加入乳化罐中搅拌溶解
4.完全溶解后，F，G，H依次加入乳化罐中搅拌溶解
5.溶解好的A相乳化罐中搅拌混匀，B相也投入釜中
6.混匀10分钟后，开启乳化，3500rpm/min，乳化4min。

Claims (10)

1.一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：包括步骤一：将摇床活化好的双歧杆菌接种到培养基中进行发酵；步骤二：发酵结束后，灭活菌液，低速离心后收集上清液；步骤三：将银耳进行高温精粹提取，并搅拌过滤，并添加防腐剂；步骤四：将野大豆粉碎，通过超声提取、加热提取和回流搅拌提取之后，过滤，浓缩，分离纯化，并配置成丁二醇溶液；步骤五：取步骤二中的发酵液，按比例添加分子量不同的透明质酸、烟酰胺、步骤三中的银耳提取物、步骤四中的野大豆提取物，加热搅拌溶解获取最终的组合物。
2.根据权利要求1所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述双歧杆菌选用乳酸双歧杆菌，且发酵用的培养基为BBL液体培养基。
3.根据权利要求1所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：分子量不同的所述透明质酸钠包括为分子量为1万道尔顿的超小分子量透明质酸钠、10万道尔顿的小分子量透明质酸钠、140万道尔顿的大分子透明质酸钠、230万道尔顿超大分子的透明质酸钠。
4.根据权利要求1所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述银耳提取物，经过高温精粹提取，趁热通过纱布过滤，并添加防腐剂，最后通过1um滤芯过滤获得得到银耳提取物。
5.根据权利要求1所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述野大豆提取物通过粉碎之后，加入乙醇，并通过超声辅助提取，再浓缩，最后将大孔树脂分离纯化获得野大豆提取物。
6.根据权利要求2所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述乳酸双歧杆菌发酵的条件为pH值范围6.5～7.0，发酵温度37～42℃，摇床速度80～200rpm，发酵时间5～10小时。
7.根据权利要求3所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述透明质酸钠中的添加量如下：其中1万道尔顿的超小分子量透明质酸钠添加量：0.01～1％，10万道尔顿的小分子量透明质酸钠：0.01～0.5％，140万道尔顿的大分子透明质酸钠：0.01～0.3％，230万道尔顿超大分子的透明质酸钠，0.001～0.2％。
8.根据权利要求4所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述银耳提取物提取时的温度是80～100℃，料液比为1:3～6，提取时间为3～8小时，所用防腐剂为1,2-己二醇复配对羟基苯乙酮。
9.根据权利要求5所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：所述野大豆所用的乙醇的浓度为40～80％，料液比为1:5～20，超声辅助提取的时间为30～60分钟，之后加热提取2～4小时，提取温度50～70℃，再在60～70℃浓缩掉乙醇，AB-8大孔树脂分离纯化，进样速度、洗脱剂浓度和洗脱速度分别是3～6ml/min，60～80％乙醇，1～4ml/min，最后配成含固量为0.1％的30％的丁二醇溶液。
10.根据权利要求1所述的一种二裂酵母发酵产物滤液组合物的制备方法，其特征在于：烟酰胺的添加量为0.5～5％，银耳提取物的添加量为1～10％；野大豆提取物的添加量为0.5～5％。
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