CN108693355B - 抗人球蛋白检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种氧化锆(ZrO₂)微珠抗人球蛋白检测试剂卡及其制备方法，所述检测试剂卡包括：微柱管，管内装有含有抗IgG+C3d抗体的氧化锆微珠。本发明制备的广谱抗人球蛋白检测试剂卡灵敏度高、特异性好且质量稳定。

Description

抗人球蛋白检测试剂卡及其制备方法

技术领域

本发明涉及医疗检测领域，更具体的，涉及一种广谱抗人球蛋白检测试剂卡的组成、制备方法及其应用。

背景技术

1984年法国Yves Lapierre首先发明凝胶抗球蛋白方法，与传统试管法抗球蛋白试验比较，省略了试管液体介质的繁琐洗涤步骤，也省去了必须在阴性结果试管中加入不完全抗体致敏的红细胞，以确认阴性结果是否正确的步骤，因此具有标本用量少、操作简便、省时、人为因素小、易于标准化及自动化、结果易判读并可长期保存等优点，适于大批量标本的检测。

在国外凝胶抗球蛋白检测试剂卡已成为常规广泛应用于血型鉴定、不规则抗体检测及交叉配血等各种血型血清学试验。近年来，国内己开始采用凝胶抗球蛋白检测试剂卡进行不规则抗体的筛选和鉴定、致敏红细胞的检测等。但是多采用葡聚糖凝胶。但是葡聚糖凝胶会受温度、盐浓度、渗透压、pH的变化而致颗粒的孔径会改变，床外的空间也会改变，导致离心层析结果受影响。由于是一种凝胶状的颗粒，物理强度较差，随着保存期的延长，会导致变形，非特异吸附高，会影响试验结果。另外，价格也比较昂贵。

因此，本领域迫切需要研发灵敏度高、特异性好且质量稳定的新的抗球蛋白检测试剂卡。

发明内容

本发明的目的在于克服传统试管法的不足，提供一种灵敏度高、特异性好且质量稳定的广谱抗人球蛋白检测试剂卡的制备方法。

本发明提供一种抗人球蛋白检测试剂卡，所述检测试剂卡包括：

微柱管，管内装有含有抗IgG+C3d抗体的氧化锆微珠。

上述微柱管为4-12管。上述微柱管为8管。

上述氧化锆微珠颗粒直径为63-125微米。

上述氧化锆微珠与抗体的体积比为2:1。

上述微柱管开口处有铝箔封片。

上述试剂卡上贴有标签纸。

本发明第二方面，提供上述氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡的制备方法，所述方法包括步骤：

(a)筛选出颗粒直径为63-125微米的氧化锆微珠，用微珠悬浮介洗涤3-5次，除去微珠破损碎片以及聚集的微珠颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的微珠；所述微珠悬浮介质的组份为：

(b)将步骤(a)制备的微珠与抗体分别按照体积比2：1的比例混合，配制成含有抗IgG+C3d抗体的微珠；

(c)按照每管22-28微升的量，将步骤(b)配制的微珠分别分装到检测卡的微柱管中。

上述方法还包括以下步骤：

(d)用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。

本发明所述微珠悬浮介质中“水”为蒸馏水、纯化水或去离子水，优选蒸馏水。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面，提出了一种标准化的氧化锆微珠悬浮介质体系，用于氧化锆微珠的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及氧化锆微珠的稳定，其特点在于：

1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个氧化锆微珠悬浮介质的离子强度。

2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的氧化锆微珠悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持氧化锆微珠颗粒呈圆球颗粒，并维持氧化锆微珠颗粒的直径大小在所要求的范围内(63-125微米)。

3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛血清白蛋白，使得红细胞通过氧化锆微珠间隙时获得合适的涧滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过氧化锆微珠颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。

4、本发明具有优越的防腐体系，选择苯甲酸钠作为防腐剂。采用聚乙烯吡咯烷酮协同作用，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就不同。几种酯的复合，具有更好的防腐能力，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对氧化锆微珠悬浮介质体系的离子强度提升从而对氧化锆微珠稀有血型检测试剂卡的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对氧化锆微珠稀有血型检测试剂卡的特异性产生的不良影响。

另一方面，为了保证本发明氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡的质量，在制备过程中还需要对氧化锆微珠进行筛选，即，首先要选择适当的氧化锆微珠，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为63-125微米，对筛选获得的氧化锆微珠原料需要进行洗涤、悬浮，目的是让氧化锆微珠颗粒洗涤去除破损的氧化锆微珠颗粒、聚集的氧化锆微珠颗粒、内径在63-125微米以外的超大或超小氧化锆微珠颗粒以及氧化锆微珠以外的其它杂质成分。洗涤完成后用氧化锆微珠悬浮介质来悬浮氧化锆微珠。

再一方面，为了保证本发明氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡的质量，在制备过程中还对与氧化锆微珠混合的抗体原料进行筛选。

综上所述，本发明的氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用。含有8个抗IgG+C3d的氧化锆微珠微柱管排列于一张卡上可以保证仅使用一张氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡就能完成最多8个样本的抗人球蛋白检测。缓冲体系可以维持检测试剂卡反应体系需要的pH。低盐浓度体系可以保证氧化锆微珠颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证氧化锆微珠颗粒之间适当的润滑能力。苯甲酸钠防腐剂可以防止氧化锆微珠或抗体因为细菌繁殖而失效。标准化的氧化锆微珠可以保证氧化锆微珠颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。

用此氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡检测稀有血型，产生的阳性反应均不低于1+。一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。

总之，本发明的实施提供了标准化的氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡，为准确鉴定稀有血型分型、保证安全输血、尽早诊断和治疗新生儿溶血病创造了条件。

附图说明

图1为氧化锆微珠显微镜图；

图2为本发明抗人球蛋白检测试剂卡的结构示意图。

1-8.氧化锆微珠微柱管；9.检测试剂卡；11.氧化锆微珠；12.抗IgG+C3d抗体；13.微柱管；14.空白卡片。

具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实旋和所具有的有益效果，旨在帮助阅读的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。

实施例1本发明氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡的制备和保存

步骤一、氧化锆微珠悬浮介质的配制

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、氧化锆微珠的制备

选用氧化锆微珠，颗粒直径为63-125微米，用步骤一配制的氧化锆微珠悬浮介质洗涤3-5次，除去氧化锆破损碎片以及聚集氧化锆颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的氧化锆微珠。

步骤三、抗体的选择

选择广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C3d)。

其中抗IgG成分灵敏度：要求按照体积比1：2和体积比1：4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1：128稀释的抗D(IgG)致敏的红细胞有肉眼可见凝集；

其中抗C3d成分的灵敏度：要求按照体积比1：4和体积比1：8稀释的抗人球蛋白试剂(抗IgG+C3d)必须对C3d致敏的红细胞有肉眼可见凝集。与所述广谱抗人球蛋白试剂原液的反应强度≥1+；

广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C3d)与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与C3d致敏红细胞产生阳性反应，与既无IgG抗体又无C3d抗体致敏的红细胞反应为阴性。

步骤四、氧化锆微珠的配制

将步骤二制备的氧化锆微珠与步骤三选择的抗体按照体积比2：1的比例混合，配制成含广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C3d)的氧化锆微珠。

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的氧化锆微珠分别加入到一块空白卡片的九个微柱管中，形成具有9个氧化锆微珠微柱管的氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡。为了便于识别标记，在试剂卡下方贴有标签纸。

步骤六、半成品测定

要求氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡(抗IgG+C3d)检测的抗D抗体效价不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果；氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡(抗IgG+C3d)检测的抗Fy^a抗体效价不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果；氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡(抗IgG+C3d)与补体致敏的红细胞反应强度≥1+。要求与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应，而和O型RhD阴性红细胞反应为阴性；与O型Fy^a阳性红细胞反应为阳性，而和O型Fy^a阴性红细胞反应为阴性；与C3d致敏的红细胞反应为阳性，与既无IgG抗体又无C3d致敏的红细胞反应为阴性。

步骤七、封口

用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。

步骤八、保存试验

上述广谱抗人球蛋白卡保存了1年以上，在此保存期间，该广谱抗人球蛋白卡具

有以下检测结果：

(1)外观：

氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡上微管内的氧化锆微珠应呈均匀白色，氧化锆微珠上端有1～2毫米清澈透明的液体，氧化锆微珠颗粒之间不应有气泡和异物。

(2)灵敏度：

抗IgG氧化锆微珠的灵敏度：要求氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡(抗IgG+C3d)检测的Rh***的抗D抗体效价及Duffy***的抗Fy^a抗体效价均不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果。

抗C3d灵敏度：要求氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡(抗IgG+C3d)与补体致敏的红细胞反应强度≥1+。

(3)特异性：

抗IgG成分的特异性：检测IgG性质抗D抗体，要求与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应，而和O型RhD阴性红细胞反应为阴性；检测IgG性质抗Fy^a抗体，要求与O型Fy^a阳性红细胞反应为阳性，而和O型Fy^a阴性红细胞反应为阴性。

抗C3d成分的特异性：要求与C3d致敏的红细胞反应为阳性。与既无IgG抗体又无C3d致敏的红细胞反应为阴性。

实施例2本发明检测试剂卡的使用和检测

1、本实施例中氧化锆微珠广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C3D)检测卡具有8个氧化锆微珠微柱管，8个氧化锆微珠微柱管皆为含有抗IgG+C3d抗体的氧化锆微珠微柱管。

2、分离全血中的人血红细胞和血清(或血浆)，用生理盐水或LISS溶液将待检红细胞配制成1％-2％(体积百分比)红细胞溶液，待用。

3、直接抗人球蛋白试验(DAT)：

3.1取待检红细胞溶液20微升加入1至第7号管中，8号管中加入1％-2％(体积百分比)正常人红细胞溶液20微升，做为阴性对照.

3.2用专用离心机离心，1200rpm离心4分钟，取出肉眼判定结果。

3.3结果判定：第8号管呈阴性反应，实验结果成立，反之实验结果不成立。1至7号管中呈阴性结果的，表明红细胞标本在体内未被致敏；1至7号管中呈阳性结果的，表明红细胞标本在体内已被致敏；

4、间接抗人球蛋白试验(IAT)

4.1取1％-2％标准O型红细胞溶液分别加入1至8号管中，每管20uL。

4.2取待检血清20-25微升加入1至7管中，8号管中加入AB型人阴性对照血清20-25微升。

4.3加样后的试剂卡，置37℃孵育器中15分钟。

4.4用专用离心机离心，1200rpm离心4分钟，取出肉眼判定结果。

4.5结果判定：8号管呈阴性反应，实验结果成立，反之实验结果不成立。1至7号管中呈阴性结果的，表明被检血清中不含有该标准O型红细胞抗原特异性的不完全抗体；1至7号管中呈阳性结果的，表明被检者血清中含有该标准O型红细胞抗原特异性的不完全抗体；结果判读标准：红细胞悬浮于微珠表面或微柱内为阳性结果，红细胞全部沉降至微管底部为阴性结果。

每个样品可以同时做2-3管，以便实验结果准确可靠。

通常葡聚糖凝胶价格是氧化锆的30余倍。另外，氧化锆是白色无臭无味晶体，不溶于水、盐酸和稀硫酸。化学性质不活泼，且高熔点、高电阻率、高析射率和低热膨胀系数的性质，是重要的耐高温材料，陶瓷绝缘材料。

氧化锆微珠的特点是化学物理稳定性高，非特异性吸附低，细菌等微生物不会生长，填料反压特低。

以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例。

Claims (8)

1.一种抗人球蛋白检测试剂卡，其特征在于，所述检测试剂卡包括：

微柱管，管内装有含有抗IgG+C3d抗体的氧化锆微珠；所述氧化锆微珠颗粒直径为63-125微米；所述氧化锆微珠通过微珠悬浮介质进行悬浮，所述微珠悬浮介质的组份为：

2.如权利要求1所述抗人球蛋白检测试剂卡，其特征在于，所述微柱管为4-12管。

3.如权利要求1所述抗人球蛋白检测试剂卡，其特征在于，所述微柱管为8管。

4.如权利要求1、2或3所述抗人球蛋白检测试剂卡，其特征在于，所述氧化锆微珠与抗体的体积比为2:1。

5.如权利要求4所述抗人球蛋白检测试剂卡，其特征在于，所述微柱管开口处设铝箔封片。

6.如权利要求5所述抗人球蛋白检测试剂卡，其特征在于，所述试剂卡上贴有标签纸。

7.如权利要求1所述抗人球蛋白检测试剂卡的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)筛选出颗粒直径为63-125微米的氧化锆微珠，用微珠悬浮介质洗涤3-5次，除去微珠破损碎片以及聚集的微珠颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的微珠；

(b)将步骤(a)制备的微珠与抗体分别按照体积比2：1的比例混合，配制成含有抗IgG+C3d抗体的微珠；

(c)按照每管22-28微升的量，将步骤(b)配制的微珠分别分装到检测卡的微柱管中。

8.如权利要求7所述氧化锆微珠抗人球蛋白检测试剂卡的制备方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(d)用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。

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