CN103033619A - 一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法。一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，包括：（1）同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述芯片底膜上形成若干个独立识别位点；（2）反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。本发明的试剂盒和方法可同时检测NSE、SCC、CEA、CA19-9、CYFRA21-1和pro-GRP六项指标，提高检测的准确率，减少重复的实验步骤，节省时间和成本。

Description

一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒及方法。

背景技术

生物芯片技术是近十几年兴起的生物技术，因其在一次反应中可以平行分析多种信息，迅速在诸多生物学领域得到应用。生物芯片技术按检测对象分类，主要分为基因芯片和蛋白质芯片两类。蛋白质芯片是一种前沿技术，它通过固定于支持介质上的多种蛋白质构成的微阵列，直接检测特定功能物质。现有的检测尿液、血清及其他体液的方法，ELISA、放射性同位素标记、金标、荧光、化学发光、时间分辨荧光等，大多是单指标检测，信息量少。与传统的检测方式相比，蛋白质芯片技术具有如下优点：1、高通量，同时可进行多样本的检测；2、所需样本量小；3、节省试剂、时间、人工等，节省成本。

肺癌目前是全世界癌症死因的第一名。1995年全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，2003年世界卫生组织（WHO）公布的死亡率是110万/年，发病率是120万/年。而女性患肺癌的发生率尤其有上升的趋势。本病多在40岁以上发病，发病年龄高峰在60～79岁之间。男女患病率为2.3:1。另外种族、家属史与吸烟对肺癌的发病均有影响。

目前检测肺癌的标志物有SCC（鳞状细胞癌相关抗原）、CEA（癌胚抗原）、CA19-9（糖类抗原）、CYFRA21-1(细胞角蛋白19片段)、NSE（神经元特异性烯醇化酶）、pro-GRP（胃泌素释放肽前体），每种标志物诊断肺癌的特异性和敏感度都不够高，综合这六种指标诊断肺癌能提高诊断的特异性和敏感度，但目前临床上使用的都是检测单项指标的产品。

发明内容

本发明的目的提供一种蛋白质芯片试剂盒，该试剂盒把多项指标综合在同一反应下测定，提高检测效率，同时提高检测的特异性和敏感度。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，包括：

（1）同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于所述芯片底膜形成成若干个独立识别位点；

（2）反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。

所述特异性抗体是分别针对如下肺癌标志物的抗体：鳞状细胞癌相关抗原（SCC）、癌胚抗原（CEA）、糖类抗原（CA19-9）、细胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、胃泌素释放肽前体（pro-GRP）。

所述反应剂为抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合液，且所述特异性抗体标记有生物素。

所述检测剂为用于识别生物素标记的链霉亲和素(streptavidin，SA)，所述链霉亲和素标记有铕元素。

所述的芯片底膜为硝酸纤维素膜。

本发明的另一个目的是提供一种综合检测肺癌标志物的方法，具体步骤为：

（1）、把制备好的芯片用双面胶粘帖到聚苯乙烯小杯的底部；

（2）、把100微升样本血清、100微升质控品混合液分别加入不同的上述小杯中，37度，震荡，温育1小时；洗涤液洗涤6次；

（3）、加入反应剂100微升，37度，震荡，温育1小时；洗涤液洗涤6次；

（4）、加入90微升稀释液和10微升检测剂，37度，震荡，温育20分钟；洗涤液洗涤6次；

（5）、用冷空气吹干或离心甩干；

（6）、用时间分辨荧光扫描仪测量发光值；

（7）、各标志物根据各自的标准品的系列浓度的发光值为Y轴、标准品浓度为X轴做标准曲线，由测量的样本血清的发光值根据不同标志物的标准曲线计算出各标志物的含量。

所述的质控品是SCC、CEA、CA19-9、NSE、CYFRA21-1和pro-GRP的标准品。

本发明的综合检测肺癌的蛋白质芯片试剂盒和方法可同时检测NSE、SCC、CEA、CA19-9、CYFRA21-1和pro-GRP六项指标。将肺癌六项指标纳入同一试剂盒中检测，降低了不同产品、不同实验条件下产生的检测误差；在同一实验条件下，同时检测肺癌六项指标，提高检测的准确率，减少重复的的实验步骤，节省时间和成本。

附图说明

图1为本发明检测肺癌标记物的蛋白质芯片试剂盒的芯片点样示意图；

图2为本发明蛋白芯片试剂盒检测肺癌病人血样结果的示意图。

具体实施方式

实施例1本发明的一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒的制备：

一、芯片的制作：

1、把孔径为0.2微米的硝酸纤维素膜（Bio-Rad公司生产）剪成5mm*5mm的小块；

2、配制包被缓冲液：PH7.8的50mM/L的Tri s—Hcl缓冲液；用包被缓冲液分别把抗NSE抗体10-7938（Fitzgerald公司）、抗pro-GRP抗体H00002922-M03（Abnova公司）、抗CA19-9抗体ab3982(Abcam公司)、抗CEA抗体MAM02-008（Meridian公司）、抗CYFRA21-1抗体M01300M（Meridian公司）、抗SCC抗体H00006317M01（Abnova公司）、人血清白蛋白（阴性对照）按照0.7–4mg/L的浓度稀释成溶液；

3、点膜：用BioDot公司的BiojetPlus点样***将步骤2中稀释好的抗体溶液按照0.1～2微升/点分别点样到已剪好的硝酸纤维素膜上，56点/平方厘米，点阵排布如图1所示；

4、封闭：把点样后的硝酸纤维素膜用封闭液封闭2小时；封闭液：每升50m M/L PH7.4的磷酸盐缓冲液中包含5%的BSA，5%的海藻糖，0.2%的Tween20，0.5%的叠氮钠；

5、把封闭后的硝酸纤维素膜用蒸馏水洗涤10次，2～6度保存备用。

二、反应剂的制备：

将标记有生物素的抗NSE抗体10-7936、抗pro-GRP抗体PAB4986、抗CA19-9抗体ab116024、抗CEA抗体MAM02-88、抗CYFRA21-1抗体、抗SCC抗体H00025816-A01用稀释液（稀释液配方为50mM/L PH7.8的Tris缓冲液，包含50克/升的BSA，1mM/L的叠氮钠）稀释成抗体混合液，备用；

三、检测剂的制备：

1、把5～10毫克的聚乙烯胺盐（PVA）溶入800微升0.05M/L的PH9.1碳酸盐缓冲液中；

2、把500～1000微克的超长臂生物素硫代琥珀酰亚胺酯（NHS–LC–LC–Biotin）溶入80微升的0.05M/L的PH9.1碳酸盐缓冲液中；

3、把上述的步骤1和2的两种溶液混合，室温放置2小时；

4、称取10～20毫克4，7–二苯氯磺基–1，10邻菲啰啉–二羧酸（BCPDA）,加入步骤3的混合液中，用0.05M/L的PH9.1碳酸盐缓冲液调整体积至4毫升，室温剧烈摇动3～4小时，至溶液澄清；

5、把步骤4中的澄清溶液转入到截留分子量为12000的透析袋中，放入5升0.1M/L的NaHCO3溶液中，磁力搅拌过夜；更换透析液重复3次；

6、把步骤5中的透析后的溶液加入到截留分子量为30000的离心浓缩管中，把溶液的体积浓缩至0.4～0.6毫升；然后把浓缩液注射入HPLC中，用TSK–250硅凝胶分子筛柱，在0.5毫升/分钟的流速、0.05M/L PH8.0的Tris缓冲液为流动相的条件下过柱，在325nm的最大吸收峰处收集组分，约得到收集液4毫升；

7、在步骤6中的收集液中加入0.4～0.7毫克的链霉亲和素（SA）、0.2～0.3克的EuCl3，用PH7.80.05M/L的Tris缓冲液调整到80毫升，同时里面包含50克/升的BSA、0.2%的叠氮钠，即制成检测剂SA–B–PVA–BCPDA–Eu3+的储藏液，4度保存。

四、洗涤液的配制：50mM/L PH7.8的Tris缓冲液，包含150mM/L NaCl，0.05%的Tween20,1mM/L的叠氮钠。

五、稀释液的配制：50mM/L PH7.8的Tris缓冲液，包含50克/升的BSA，1mM/L的叠氮钠。

实施例2采用本发明的试剂盒综合检测肺癌标志物的方法，具体步骤为：

1、把制备好的芯片用双面胶粘帖到聚苯乙烯小杯的底部；

2、将SCC、CEA、CA19-9、NSE、CYFRA21-1、pro-GRP标准品混合物作为质控品稀释成系列梯度浓度的混合液；SCC购自abnova公司，CEA购自abnova公司，CA19-9购自Acris公司，CYFRA21-1购自Meridian公司，NSE购自Fitzgerald公司，pro-GRP购自abnova公司；

3、把100微升病人样本血清和不同浓度的质控品混合液各100微升分别加入到粘帖有芯片的不同小杯中，37度，震荡，温育1小时；洗涤液洗涤6次；

4、加入反应剂100微升，其中包含15ng的10-7936，80ng的PAB4986，22ng的ab116024，27ng的MAM02-88，36ng的CY2685，31ng的H00025816-A01；37度，震荡，温育1小时；洗涤液洗涤6次；

5、加入90微升稀释液和10微升检测剂，37度，震荡，温育20分钟；洗涤液洗涤6次；

6、用冷空气吹干或离心甩干。

7、用时间分辨荧光扫描仪测量发光值；

8、每个标志物根据各自的标准品的系列梯度浓度的发光值为Y值、标准品浓度为X值作标准曲线，根据待测的病人血样发光值和不同标志物的标准曲线计算出待测的病人血样各标志物的含量。

本发明的综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒的各标志物的阳性参考值分别为：SCC>1.5ng/ml；CEA>5ng/ml；CA19-9>35U/ml；CYFRA21-1>3.5ng/ml；NSE>25ng/ml；pro-GRP>35pg/ml。

实施例3本发明的综合检测肺癌标记物的蛋白质芯片试剂盒的质量评估

1、用稀释液把标准品SCC、CEA、CA19-9、CYFRA21-1、NSE、pro-GRP的混合物稀释成系列的梯度浓度；

2、然后把指标SCC和深圳新产业生物医学工程公司的相应检测试剂盒做对比；指标CEA和Abbott公司的相应检测试剂盒做对比；指标CA19-9和深圳新产业生物医学工程公司的相应检测试剂盒做对比；指标CYFRA21-1和罗氏公司的相应检测试剂盒做对比；指标NSE和罗氏公司的相应检测试剂盒做对比；指标pro-GRP和CanAg公司的相应检测试剂盒做对比；每个指标分别测试40个不同的浓度；

3、将使用本发明的试剂盒的检测结果与其他厂家的试剂盒检测结果做相关性分析，分析结果见表1。

表1本发明的综合检测肺癌标记物的蛋白质芯片试剂盒与现有试剂盒的比较

指标	SCC	CEA	CA19-9	CYFRA21-1	NSE	pro-GRP
							相关性（R值）	0.938	0.973	0.952	0.963	0.945	0.935

对本发明的试剂盒进行批内和批间质量评估，结果见表2：

表2本发明的综合检测肺癌标记物的蛋白质芯片试剂盒的批内、批间变异系数

结果表明，本发明的综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒和现有其它单一指标的试剂盒的检测结果高度相关，说明本发明的试剂盒的灵敏性和特异性极高；批内和批间变异系数较低，说明本发明的试剂盒精密度较高；另外，现有的其他厂家的试剂盒为检测各单项指标的试剂盒，而本发明的试剂盒是采用同一试剂盒综合检测肺癌六项指标的蛋白质芯片试剂盒，在提高检测的灵敏度和特异性的同时，降低成本，省时省力，提高检测效率。

Claims (6)

1.一种综合检测肺癌标志物的蛋白质芯片试剂盒，其特征在于包括：

（1）同时固定有若干种特异性抗体的芯片，所述特异性抗体能够与肺癌标志物发生抗体-抗原反应，每种特异性抗体分别固定于芯片底膜上，形成若干个独立识别位点；（2）反应剂和检测剂，用于通过TRFIA方法检测待测样品中是否存在能够与所述特异性抗体发生抗体-抗原反应的物质。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述的特异性抗体是分别针对如下肺癌标志物的特异性抗体：鳞状细胞癌相关抗原、癌胚抗原、糖类抗原、细胞角蛋白19片段、神经元特异性烯醇化酶和胃泌素释放肽前体。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述反应剂为抗体混合液，所述抗体混合液为所述若干种特异性抗体的混合液，且所述特异性抗体标记有生物素。

4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述检测剂包含用于识别生物素标记的链霉亲和素，所述链霉亲和素标记有铕元素。

5.一种综合检测肺癌标志物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）、把制备好的芯片用双面胶粘帖到聚苯乙烯小杯的底部；

（2）、把100微升样本血清、100微升质控品混合液分别加入不同的上述小杯中，37度，震荡，温育1小时；洗涤液洗涤6次；

（3）、加入反应剂100微升，37度，震荡，温育1小时；洗涤液洗涤6次；

（4）、加入90微升稀释液和10微升检测剂，37度，震荡，温育20分钟；洗涤液洗涤6次；

（5）、用冷空气吹干或离心甩干；

（6）、用时间分辨荧光扫描仪测量发光值；

（7）、各标志物根据各自的标准品的系列浓度的发光值为Y轴、标准品浓度为X轴做标准曲线，由测量的样本血清的发光值根据不同标志物的标准曲线计算出各标志物的含量。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述的质控品是SCC、CEA、CA19-9、NSE、CYFRA21-1和pro-GRP的标准品。

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