FI96723C - Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä - Google Patents

Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä Download PDF

Info

Publication number
FI96723C
FI96723C FI901468A FI901468A FI96723C FI 96723 C FI96723 C FI 96723C FI 901468 A FI901468 A FI 901468A FI 901468 A FI901468 A FI 901468A FI 96723 C FI96723 C FI 96723C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
cells
solid support
enzyme
cell
test kit
Prior art date
Application number
FI901468A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI96723B (fi
FI901468A0 (fi
Inventor
Dominique Carriere
Original Assignee
Sanofi Sa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sanofi Sa filed Critical Sanofi Sa
Publication of FI901468A0 publication Critical patent/FI901468A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI96723B publication Critical patent/FI96723B/fi
Publication of FI96723C publication Critical patent/FI96723C/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56977—HLA or MHC typing

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

96723
Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä
Keksintö koskee testipakkausta sekä tämän testipakkauksen avulla suoritettavaa entsymaattista määritysmene-5 telmää solupopulaatioille tai solun alapopulaatioille luonteenomaisten endogeenisten entsyymien määrittämiseksi. Entsymaattinen määritysmenetelmä ja vastaava testipakkaus on tarkoitettu myös itse solujen määrittämiseen niiden endogeenisten entsyymien kautta. Näitä määritysmenetelmiä 10 voidaan käyttää diagnosointiin.
Keksinnön mukaisessa menetelmässä immobilisoidaan spesifisesti solupopulaatio immuunisieppauksella kiinteällä kantajalla, minkä jälkeen määritetään tälle populaatiolle tai solun alapopulaatiolle spesifinen endogeeninen 15 entsyymi käyttäen tälle entsyymille sopivaa substraattia ja mahdollisesti välttämättömiä kofaktoreita tai apuaineita.
Keksinnön mukaisesti seuraavassa esitetyissä keksinnön kuvauksessa ja vaatimuksissa termi "endogeeninen 20 entsyymi" tarkoittaa solun sytoplasmassa olevaa entsyymiä, jonka substraatti on pienimolekyylipainoinen molekyyli, joka pystyy tunkeutumaan solun sisään, jossa entsyymi muuttaa sitä, jolloin väliaineeseen vapautuu värillinen tai fluoresoiva reaktiotuote, joka lopuksi voidaan mitata 25 entsyymin aktiivisuuteen suhteessa olevana signaalina.
*' Immuunisieppaus on menetelmä, jossa solut pidäte tään kiinteään kantajaan näiden solujen yhden tai useampien pinta-antigeenien ja tälle antigeenille tai näille antigeeneille spesifisen yhden tai useampien monoklonaa-30 listen vasta-aineiden välisen sidoksen avulla.
Solun pinta-antigeenien tai merkkiaineiden tuntemus on edistynyt valtavasti lymfosyyttihybridisaation kehittämisen ja Köhlerin ja Milsteinin [Nature 256 (1975) 495 -497] monoklonaalisten vasta-aineiden keksimisen jälkeen.
2 96723
Erityisesti monoklonaaliset vasta-aineet ovat mahdollistaneet mitä erilaisimpien solujen pinnan merkkiaineiden tai membraaniantigeenien osoittamisen ja analysoimisen. Nämä merkkiaineet (tai antigeenit) voivat olla proteiineja, 5 glykoproteiineja tai glykolipidejä. Karakterisointia sovelletaan pääasiassa kudos- tai elinmerkkiaineisiin, nor-maalisolujen erilaistumistilaa tai aktivaatiota kuvastaviin merkkiaineisiin ja normaali- tai syöpäsolujen identifiointiin tai tyypitykseen. Erityisen tärkeä sovellutus-10 alue on hematopoieesisolulinjojen (punasolu, megakaryo-syytti, granulosyytti, monosyytti, lymfosyytti) tutkiminen.
Siten monoklonaaliset vasta-aineet ovat mahdollistaneet esimerkiksi T- ja B-lymfosyyttien vastaavien pinta-15 ominaisuuksien määrittämisen. Vastaavat merkkiaineet yksin tai yhdessä identifioivat lymfosyyttien erilaistumistiloja ja toiminnallista erikoistumista. Kansainvälisellä sopimuksella vuonna 1984 IUIS-WHO-alakomitea on luokitellut ihmisen valkosolujen pintamerkkiaineet erilaistumisryhmiin 20 eli erilaistumisluokkiin (CD) ja ne on kuvattu julkaisussa Bulletin of World Health Organization 62(5) (1984) 813 -815.
Monoklonaaliset vasta-aineet ovat nykyisin korvaamattomia välineitä kliinisessä biologiassa soluanalyysei- 25 hin sovellettuina.
On olemassa solujen mittausmenetelmiä, joissa käy tetään niiden pinta-antigeenien leimausta, mutta nämä menetelmät ovat usein pitkiä, työläitä ja vaikeita suorittaa ja niiden tulokset ovat joskus satunnaisia.
30 Eräs menetelmäryhmä antigeenien mittaamiseksi pe rustuu koko solupopulaation pintamerkkiaineiden kvantitatiivisen määrittämiseen. Näillä menetelmillä on mahdollista mitata antigeenejä joko suoraan’tai epäsuorasti leimaamalla, joista viimeksi mainittu suoritetaan useimmiten 35 kahdessa, kolmessa tai neljässä menetelmävaiheessa. Kai- il ‘ Ht t rillit I I HEI ! 3 96723 kissa tapauksissa viimeisessä leimausvaiheessa käytetty reagenssi on leimattu joko isotoopilla, esimerkiksi jodi-125:llä radioimmunometrisessä määritysmenetelmässä [Brow et ai., J. Immunol Methods 31 (1979) 201, Stocker ja Heus-5 ser, J. Immunol. Methods 26 (1979) 87 - 95], tai entsyymillä, useimmiten peroksidaasilla, alkalisella fosfataa-silla tai beeta-galaktosidaasilla [van Leuven et ai., J. Immunol. Methods 23 (1978) 109 - 116, Morris, Transplantation 36(3) (1983) 719, Baumgarten, J. Immunol. Methods 94 10 (1986) 91 -98] entsyymi-immunometrisessä määritysmenetel mässä.
On syytä mainita, että näissä menetelmissä käytetyt entsyymit ovat analyyttisiä reagensseja, joita käytetään määrityksessä solumembraanin ulkopuolelle avoimena olevan 15 antigeenin tunnistavan vasta-aineen konjugaatteina. Näitä entsyymejä ei siten voida sekoittaa solun endogeenisiin entsyymeihin, jotka muodostavat osan solun luonnollisesta entsyymivarustuksesta.
Nämä menetelmät ovat melko epämukavia, työläitä ja 20 riskialttiita käyttää, koska solumateriaalia on pestävä ja sentrifugoitava useaan kertaan; joskus on tarpeen ottaa näyte entsyymireaktiosta saadusta värillisestä väliaineesta lopullisen spektrofotometrisen mittauksen suorittamiseksi; lopuksi, kemiallinen solujen kiinnittäminen, jota 25 käytetään useimmissa tapauksissa, aiheuttaa tiettyjen, tavanomaisille kemiallisille kiinnitysaineille, kuten glu-taraldehydille tai metanolille, erityisen herkkien antigeenien irreversiibeliä tuhoutumista [Drover et ai., J. Immunol. Methods 90 (1986) 275 - 281].
30 Solun immuunisieppaus kiinteällä kantajalla on ku vattu patenttihakemusjulkaisussa W0 86/02091, jossa tavoitteena on poistaa ei-toivotut solut siirrännäisiin tarkoitetuista luuydinnäytteistä. Mainitussa patenttihakemus-julkaisussa solun sieppaus toteutetaan kelluvien mikrohel-35 mien avulla ja se vaatii käytetyn vasta-aineen kiinnittä- 4 96723 mistä kiinteään kantajaan monimutkaisen makromolekylaari-sen, verkkoviestiksi nimitetyn rakenteen avulla, joka pystyy varmistamaan vasta-aineen edullisen orientaation vastaavaan solun antigeeniin nähden. Mainitussa patenttihake-5 musjulkaisussa ei osoiteta menetelmän soveltamista solu-entsyymin kvantitatiiviseen määritykseen.
Solun immuunisieppaus on kuvattu myös patenttihakemus julkaisussa W0 84/03151 analyyttiseen käyttöön. Mainitussa patenttihakemusjulkaisussa tavoitteena on identi-10 fioida kudosryhmät, joihin tutkittavat solut kuuluvat (tätä toimenpidettä kutsutaan yleisesti HLA-tyypityksek-si). Solun sieppaus toteutetaan tiettyyn geometriaan erittäin erikoisilla kantajilla (mikroskoopin peitinlaseilla) järjestettyjen vasta-aineiden avulla. Tulokset saadaan 15 yksinkertaisesti tarkastelemalla kantajaa visuaalisesti, jolloin saadaan "kaikki tai ei mitään" -vasteet.
Siten tähän mennessä kuvatut solun immuunisieppaus-systeemit eivät johda analyyttisiin sovellutuksiin, jotka sallisivat solulle spesifisen merkkiaineen kvantitatiivi-20 sen määrityksen.
Keksinnön kohteena olevalla määritysmenetelmällä on huomattavia etuja kaikkiin alalla tunnettuihin ja. käytettyihin menetelmiin nähden, koska se sallii solupopulaation minkä tahansa endogeenisen entsyymin kvantitatiivisen mit-25 tauksen yhden määritysvaiheen avulla. Tämä määritys suori- • «· tetaan soluille, joihin ei ole kohdistunut minkäänlaista kemiallista tai fysikaalista käsittelyä niiden spesifisen sieppauksen hetkellä ja jotka ovat siten fysiologisen koskemattomuuden tilassaan. Lisäksi keksinnön mukaiselle mää-30 ritysmenetelmälle on ominaista erittäin suuri spesifisyys, . joka perustuu kaksi saman solun erilaista spesifistä merk kiainetta käsittäviin kaksoistunnistussysteemeihin, jolloin toinen merkkiaineista on analysoitavien solujen im-muunisieppausta varten valittu antigeeni ja toinen on mää-35 ritettävä endogeeninen entsyymi, jota esiintyy siepatuissa si s a«i! i i 1 3 5 96723 soluissa. Tämä menetelmä on yksinkertainen, nopea ja toistettava. Se sopii täydellisesti suuren näytemäärän analysointiin, mikä mahdollistaa sen käytön diagnostisiin tarkoituksiin kliinisen biologian laboratorioissa, joissa 5 käsitellään tällaisia suuria näytemääriä.
Siten keksintö koskee testipakkausta solupopulaatiolle tai solun alapopulaatiolle luonteenomaisen endogee-nisen entsyymin määrittämiseksi. Testipakkaukselle on tunnusomaista, että se sisältää seuraavat komponentit: 10 a) kiinteän kantajan, johon on kovalenttisesti si tomalla tai fysikaalisen adsorption avulla kiinnitetty yksi tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on muodostettu määritettävän solupopulaation pinta-antigeene-ja vastaan; 15 b) yhden tai useamman liuoksen, joka sisältää ent syymin aktiivisuuden kehittämiseksi tarvittavat reagenssit (substraatin ja mahdollisesti kromogeenin), jolloin substraatti on pienimolekyylipainoinen molekyyli, joka pystyy tunkeutumaan mainitun solun (ala)populaation sisään; ja 20 c) lisäkomponentin, joka muodostuu puskuroidusta pesuliuoksesta ja mahdollisesti näytteistä, jotka sallivat määrityksen vakioinnin ja laaduntarkkailun.
Tässä selitysosassa ja myöhemmin esitetyissä vaatimuksissa käytettynä termi "solu" käsittää ihmis- tai 25 eläinsolut ja erityisesti verisolut verihiutaleet mukaan ' lukien.
Keksinnön mukaisessa määritysmenetelmässä käytetään kokonaisia soluja, toisin sanoen hajottamattomia soluja.
Näitä soluja ei ole käsitelty mitenkään fysikaali-30 sesti tai kemiallisesti niiden immuunisieppauksen hetkellä ja niitä käytetään täydellisen fysiologisen koskemattomuuden tilassa. Tämä tilanne takaa parhaiten sieppaukseen käytetyn antigeenin ja määrityksen kohteeksi valitun endo-geenisen entsyymin koskemattomuuden.
6 96723
Kiinteänä kantajana on mahdollista käyttää mitä tahansa välinettä, joka soveltuu solususpensioiden käsittelyyn, edullisesti koeputkia, partikkelimuodossa olevia magneettisia kantajia tai jäykkiä tai taipuisia mikrotiit-5 terilevyjä, jotka on valmistettu polyetyleenistä, polysty-reenistä, polyvinyylikloridista tai nitroselluloosasta ja jotka sisältävät mikrokuoppia. Solujen immobilisointiin tarkoitetut monoklonaaliset vasta-aineet voidaan kiinnittää kiinteisiin kantajiin joko kovalenttisesti sitomalla 10 tai fysikaalisen adsorption avulla alan ammattimiesten hyvin tuntemia, klassisia menetelmiä, kuten Stocker'in ja Heusser'in [J. Immunol. Methods 26 (1979) 87 - 95] kuvaamia menetelmiä käyttäen. Edullisesti kantaja voidaan etukäteen kyllästää proteiinilla.
15 Keksinnön mukaisesti kiinteään kantajaan kiinnite tyn monoklonaalisen vasta-aineen tai kiinnitettyjen mono-klonaalisten vasta-aineiden täytyy sallia määritettävää entsyymiä sisältävän solupopulaation tai solupopulaatiot sisältävän solupopulaation immuunisieppaus. Kun tämä popu-20 laatio muodostuu ihmissoluista, edullisia monoklonaalisia vasta-aineita immuunisieppaukseen ovat anti-HLA luokka I -vasta-aineet, jotka ovat spesifisiä valkosoluissa ja monissa muissa organismin solulinjoissa esiintyvien HLA-A-, . HLA-B- ja HLA-C-antigeenien yhteiselle osalle. Samoin ovat . 25 edullisia valkosoluilla määritetyille erilaistumisluokkien antigeeneille spesifiset monoklonaaliset vasta-aineet. Näistä vasta-aineista S-luokka I:ksi kutsuttu vasta-aine (Biosys) on erityisen edullinen.
Muissa tapauksissa, joissa tutkittavat solut ovat 30 ihmissoluja, ja kaikissa tapauksissa, kun nämä solut eivät ole ihmissoluja, tutkittaviin solutyyppeihin sopivia monoklonaalisia vasta-aineita voidaan myös käyttää keksinnön • mukaiseen immuunisieppaukseen.
Määritettävän endogeenisen entsyymin substraatti ja 35 reagenssit valitaan siten, että näitä aineita sisältävä 7 96723 entsyymin aiheuttaman reaktion tai reaktiosekvenssin lopputuote, on joko värillinen tai fluoresoiva aine, joka diffun-doituu soluja ympäröivään nestemäiseen väliaineeseen ja 5 joka lopuksi mitataan spektrofotometrisesti tai vastaavasti fluorometrisesti, tai liukenematon värillinen aine, joka saostuu solujen pinnalle tai seinille, joihin solut ovat kiinnittyneet, ja jotka arvioidaan joko reflektiofotometrisesti tai 10 visuaalisesti mahdollisesti käyttäen vakioväriasteikkoa.
Siten ei ole tarpeellista käyttää kromogeenia, jos pelkästään substraatin avulla saadaan värillinen tai fluoresoiva aine.
Lisäkomponenttina testipakkaus sisältää puskuri-15 liuosta, joka on tarkoitettu kiinteän kantajan pesuun sen jälkeen, kun solujen immobilisointi on suoritettu.
Lisäkomponentteina testipakkaus voi sisältää myös määrityksen vakiointiin ja laadunvalvontaan tarvittavat näytteet.
20 Keksintö koskee lisäksi menetelmää solupopulaation tai solun alapopulaation endogeenisten entsyymien määrittämiseksi. Menetelmälle on tunnusomaista, että a) immobilisoidaan määritettävää entsyymiä sisältävä solupopulaatio tai solupopulaatio, joka sisältää määri- 25 tettävää entsyymiä sisältävän solun alapopulaation, kiinteään kantajaan käyttäen yhtä tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on etukäteen kiinnitetty kiinteään kantajaan kovalenttisesti sitomalla tai fysikaalisen adsorption avulla ja jotka pystyvät tunnistamaan solujen 30 pinnalla olevan antigeenin; b) odotetaan inkubointiaika; c) pestään kantaja immobilisoitumattomien solujen poistamiseksi; ja d) lisätään endogeenisen entsyymin aktiivisuuden 35 kehittämiseksi tarvittava(t) reagenssi(t) (substraatti ja 8 96723 kromogeeni), jolloin substraatti on pienimolekyylipainoi-nen molekyyli, joka pystyy tunkeutumaan mainitun solun (ala)populaation sisään; ja e) luetaan tulokset mittaamalla valosignaalit (vä-5 rinmuodostuminen tai fluoresenssi) mahdollisesti vakioas-teikkoon verrattuna.
Siten määritettävä endogeeninen entsyymi, joka kuuluu immobilisoituun solupopulaatioon tai johonkin sen ala-populaatioihin, kehitetään suoraan käyttäen tälle endogee-10 niselle entsyymille spesifistä substraattia, jonka jälkeen endogeenisen entsyymin varsinainen määritys suoritetaan transmissio- tai reflektiofotometrisesti tai mittaamalla fluoresenssiemissio.
Keksinnön mukainen testipakkaus ja menetelmä ovat 15 erityisen yksinkertaisia sen vuoksi, että kun saatavissa on etukäteen valmistettuja immuunisieppauskantajia, ne käsittävät vain liuoksen tai liuoksia, jotka sisältävät entsyymin aktiivisuuden mittaamiseksi tarvittavat spesifiset reagenssit (substraatin ja mahdollisesti kromogeenin). 20 Keksinnön mukaista testipakkausta ja entsymaattista menetelmää käytetään edullisesti ihmisen veren, erityisesti valkosolujen ja erityisemmin granulosyyttien, endogee-nisten entsyymien määrittämiseen.
Keksinnön mukainen testipakkaus ja entsymaattinen 25 menetelmä mahdollistavat sekä tutkittavassa solupopulaatiossa olevien solujen lukumäärästä että näissä soluissa mitattujen endogeenisten entsyymien pitoisuudesta riippuvien signaalien (absorboitu tai emittoitu valo) mittaamisen. Näiden signaalien mittaus sallii tutkittavan 30 solupopulaation tai solun alapopulaation sisältämän entsyymin molekyylien aktiivisuuden määrittämisen.
Eräs keksinnön käyttösovellutus on ilmeinen, jos kiinteäksi kantajaksi valitaan mikrotiitterilevy. Silloin keksinnön mukaista testipakkausta ja entsymaattista mene-35 telmää voidaan edullisesti käyttää tutkittavan solupopu- · · «H i 9:111 Il 1 U . .
9 96723 laation muodostavien erilaisten alapopulaatioille ominaisten endogeenisten entsyymien määritykseen yhdellä ainoalla levyllä. Tässä käyttösovellutuksessa on mahdollista toisaalta käyttää käyttövalmiita mikrotiitterilevyjä, joihin 5 on etukäteen kiinnitetty yksi tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka pystyvät pidättämään tutkittavan populaation kaikki solut, ja toisaalta voi olla sarja substraatteja, jotka kukin ovat spesifisiä jollekin määritettävän solun alapopulaation endogeeniselle entsyymille. 10 Siten yhdellä ja samalla kantajalla on mahdollista suorittaa valittujen alapopulaatioiden karakterisoimiseksi tarvittavien endogeenisten entsyymien kvantitatiivinen määritys.
Tämän keksinnön sovellutuksena voidaan mainita ih-15 misen valkosolut, joiden erityinen solun alapopulaatio ovat polynukleaariset valkosolut eli granulosyytit.
Ihmisen granulosyyttien läsnäolo voidaan määrittää verestä tai virtsasta. Niinpä virtsatietulehduksissa, kuten kystiitissä tai pyelonefriitissä, on erityisen arvo-20 kasta, että saatavissa on yksinkertainen menetelmä virt sassa olevien granulosyyttien määrittämiseksi.
Keksinnön mukaista testipakkausta ja menetelmää voidaan käyttää granulosyyttien määrittämiseksi. Tällöin tutkittavassa näytteessä olevien granulosyyttien spesifi-, 25 nen immobilisointi toteutetaan kiinteällä kantajalla ja granulosyyteille ominaisen endogeenisen entsyymin määritys suoritetaan sopivaa substraattia käyttäen. Myeloperoksi-daasi on granulosyyttien endogeeninen entsyymi ja sen määritys suoritetaan käyttäen vetyperoksidia peroksidaasin 30 substraattina.
Granulosyyttien spesifinen immobilisointi toteutetaan käyttäen anti-CD-15 monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on kiinnitetty kiinteään kantajaan, kuten esimerkiksi mikrotiitterilevyjen mikrokuoppien seiniin.
10 96723 Näin valmistetut levyt voidaan kylmäkuivata ja varastoida edullisesti 4 °C:ssa. Tämä vaihe voidaan suorittaa teollisessa mittakaavassa ja siten on mahdollista saada käyttövalmiita levyjä testipakkauksiin, joita voi-5 daan käyttää tutkittavan veri- tai virtsanäytteen granulo-syytteihin.
Näytteitä, jotka sisältävät verestä tai mistä tahansa sopivasta biologisesta nesteestä, erityisesti virtsasta, saatuja määritettäviä normaali- tai patologisia 10 soluja, voidaan käyttää sellaisenaan tai valmistuksen jälkeen, erityisesti konsentroinnin jälkeen.
Pienet määrät sopivaa solususpensiota saatetaan kosketukseen kiinteän kantajan kanssa, esimerkiksi etukäteen valmistettujen mikropartikkelimuodossa olevaa kiin-15 teää kantajaa sisältävissä koeputkissa tai mikrotiltteri-levyn mikrokuopissa. Pesun jälkeen lisätään testipakkaukseen kuuluvaa liuosta, joka sisältää kohdesolupopulaatiol-le ominaisen endogeenisen entsyymin substraattia.
Solujen immobilisointiin tarvittava aika on edul-20 lisesti alle 15 minuuttia tai 15 minuuttia. Tänä aikana kiinteä kantaja voidaan tarvittaessa sentrifugoida solujen immobilisoitumisen tehostamiseksi. Sitten kiinteä kantaja, esimerkiksi koeputki tai mikrotiitterilevy, pestään kiinnittymättömien solujen poistamiseksi.
25 Värillinen tai fluoresoiva tuote saatetaan näky väksi lisäämällä kiinteään kantajaan, johon määritettävää endogeenista entsyymiä sisältävä solupopulaatio on kiinnitetty, liuosta, joka sisältää entsyymin substraatin ja mahdollisesti yhden tai useamman apureagenssin, jolloin 30 lopuksi saatava reaktiotuote on joko väliaineeseen liukeneva värillinen tuote tai liukenematon värillinen tuote tai liukeneva fluoresoiva tuote, kuten aikaisemmin on selitetty. Sitten näin käsitellyistä näytteistä tuleva valo-signaali mitataan kussakin tapauksessa sopivalla laitteis-35 tolia, toisin sanoen transmissio- tai reflektiofotometril- <1 au i H·III I I * *1' 1 11 96723 la tai vastaavasti fluorometrillä. Kun kiinteä kantaja on mikrotiitterilevy, valosignaali voidaan lukea tämän jälkeen yhden ja saman levyn kaikista kuopista käyttäen biologisissa laboratorioissa tavallisesti käytettyjä auto-5 maattisia lukulaitteita, kuten esimerkiksi Titertek-levyn-lukulaitetta tai Fluoroscan-levynlukulaitetta spektrofoto-metrisiin tai vastaavasti fluorometrisiin luentoihin.
Endogeenisen peroksidaasin tai endogeenisen myelo-peroksidaasin kehittämiseksi käytetyt reagenssit sisältä-10 vät vetyperoksidia, joka on entsyymin substraatti, ja sopivaa kromogeenia, esimerkiksi ortofenyleenidiamiinia tai 2,2'-atsino-bis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihap-poa) (ABTS), jolloin saadaan värillinen, väliaineeseen liukeneva reaktion lopputuote, tai 3,3'-diaminobentsidii-15 niä, 3-amino-9-etyylikarbatsolia tai 4-kloorialfanaftolia, jolloin saadaan liukenematon reaktion lopputuote, tai pa-rahydroksifenyylipropionihappoa, jolloin saadaan fluoresoiva, väliaineeseen liukeneva reaktiotuote.
Edullisessa muodossa keksinnön mukainen testipak-20 kaus granulosyyteille ominaisen myeloperoksidaasin määrittämiseksi sisältää: a) mikrotiitterilevyn, jonka kuoppiin on kiinnitetty yksi tai useampia anti-granulosyytti monoklonaalisia vasta-aineita; 25 bl) liuosta, joka sisältää entsyymin substraattia, vetyperoksidia, sopivassa puskurissa; b2) liuosta, joka sisältää entsyymin aktiivisuuden ilmaisemisen kehittämiseksi käytettävää kromogeenia ja mahdollisesti reagenssia, joka parantaa solumembraanin 30 läpäisevyyttä.
Toisessa edullisessa muodossa keksinnön mukainen testipakkaus granulosyyteille ominaisen myeloperoksidaasin määrittämiseksi sisältää, kiinteänä kantajana koeputkia tai vaihtoehtoisesti partikkelimuodossa olevia magneetti- 12 96723 siä kantajia, joihin on kiinnitetty yksi tai useampia anti -granulosyytti monoklonaalisia vasta-aineita.
Keksinnön mukaisen endogeenisten entsyymien määrityksen tulokset voidaan ilmaista minkä tahansa suoritetul-5 le tutkimukselle sopivan menetelmän avulla. Tarkemmin sanottuna nämä tulokset voidaan ilmaista tietyn, määrätyssä tilavuudessa tutkittavaa näytettä (esimerkiksi mikrolit-rassa verta) läsnä olevan endogeenisen entsyymin kokonais-aktiivisuutena.
10 Näytteessä olevan tietyn endogeenisen entsyymin aktiivisuus määritetään edullisesti käyttäen vakioasteik-koa, joka muodostuu sopivista, endogeenista entsyymiä sisältävistä soluista tai soluvalmisteista, jotka on kalibroitu etukäteen tunnetun vertailumenetelmän avulla. Nämä 15 vakiot muodostuvat edullisesti soluista, jotka ovat alkuperältään identtisiä määrityksen kohteena olevien solujen kanssa, tai vakiintuneiden, haluttua endogeenista entsyymiä sisältävien solulinjojen soluista tai valittua entsyymiä sisältävistä soluttomista valmisteista.
20 Näitä vakioita käsitellään täsmälleen samalla ta valla kuin tutkittavia näytteitä. Saatujen signaalien avulla muodostetaan vakioasteikko, johon näytteistä saatuja signaaleja verrataan. Tämän jälkeen suoritettavat laskutoimitukset ovat tavanomaisia.
25 Keksinnön mukainen entsymaattinen määritysmenetelmä on yksinkertainen, nopea ja toistettava. Se sopii hyvin käytettäväksi suuren näytemäärän analysointiin. Jotta ymmärrettäisiin sen edut muihin kuvattuihin menetelmiin verrattuna, eri vaiheet tulisi analysoida.
30 Solujen immobilisointi kiinteään kantajaan on mene- telmävaihe, joka tavallisesti tuottaa eniten vaikeuksia tai joka on kriittisin suoritusvaihe. Yleisesti käytetty keino on solujen kemiallinen kiinnittäminen glutaraldehy-din tai metanolin avulla kuppeihin, jotka on mahdollisesti 35 käsitelty poly-L-lysiinillä [van Leuven, F. et ai., J.
13 96723
Immunol. Methods 23 (1978) 109], Näin suoritettu kemiallinen kiinnittäminen voi kuitenkin vähentää tai jopa estää halutun spesifisen toteamisen tai päinvastoin sen seurauksena saattaa esiintyä väärää positiivista solujen leimau-5 tumista, mikä on erittäin vakava haitta [Drover ja Marshall, J. Immunol. Methods 90 (1986) 275 - 281].
Edelleen kemiallinen kiinnittämismenetelmä on suoritettava monissa vaiheissa: solujen sentrifugointi, kiinni tysseoksen valmistus ja sitten kiinnitettyjen solujen 10 pesu moneen kertaan.
Solujen kuivausta 37 °C:ssa, jota mahdollisesti seuraa kiinnittäminen metanolilla mikrokuopissa, on myös ehdotettu [Baumgarten, J. Immunol. Methods 94 (1986) 91 -98]. Itse asiassa solujen kuivaus 37 °C:ssa voi hajottaa 15 tietyt hauraat antigeenit, jotka saattaisivat olla käyttökelpoisia solujen immuunisieppaukseen, samoin kuin määritettävät endogeeniset entsyymit.
Lisäksi tämän menetelmän toistettavuus on epäilyttävä; itse asiassa solujen laskeutuminen määrityksessä 20 käytettyihin mikrokuoppiin ja solujen kuivuminen saattaa vaihdella kokeesta toiseen. Tämä määrityksen suorittaminen kestää vielä pitkään, koska yksin solujen kuivausvaihe vie yli kaksi tuntia.
Lymfosyyttipopulaatioiden immobilisointi on toteu-25 tettu myös mikrokuoppiin adsorboitujen polyklonaalisten ** vasta-aineiden avulla [Stocker ja Heusser, J. Immunol.
Methods 26 (1979) 87 - 95]. Tässä menetelmässä on mahdollista kiinnittää paikoilleen soluja, jotka eivät kuulu siihen ainoaan populaatioon, joka halutaan analysoida. 30 Tämä on myös melkoinen haitta.
Kiinteään kantajaan, erityisesti määrityskuoppiin, koeputkiin tai partikkelimuodossa olevaan kantajaan, adsorboitujen tai kiinnitettyjen erittäin spesifisten ja läheistä sukua keskenään olevien monoklonaalisten vasta-35 aineiden käyttö sallii yksinomaan haluttujen solujen siep- 14 96723 pauksen, jolloin muut tarttumattomat solupopulaatiot poistetaan pesuvaiheissa. Lisäksi mikään kemiallinen tai fysikaalinen aine ei modifioi antigeenien ominaisuuksia tässä vaiheessa, sillä erilaiset toimenpiteet solujen kiinnittä-5 miseksi kemiallisesti tai fysikaalisesti jäävät pois.
Siten keksinnön mukaisesti on havaittu, että solujen immobilisointi monoklonaalisten vasta-aineiden avulla on menetelmä, jolla on mahdollista yksinkertaistaa määritettävää entsyymiä sisältävien solujen immobilisointivai-10 hetta, jolloin samalla saadaan luotettavampia tuloksia.
Keksinnön mukainen menetelmä, joka käsittää yhdessä menetelmävaiheessa kokonaisten solujen immuunisieppauksen ilman solujen fysikaalista tai kemiallista käsittelyä ja kaikkien solujen tai joidenkin näistä soluista endogeeni-15 sen entsyymin mittauksen sen spesifistä substraattia käyttäen, on ensimmäinen menetelmä, joka sallii valittujen endogeenisten entsyymien kvantitatiivisen määrityksen soluissa itsessään.
Keksinnön mukaisesti immunologisesti immobilisoitu-20 jen solujen suora leimaus säästää reagensseja; parantaa luotettavuutta vähentämällä vaiheita ja toimenpiteitä; säästää aikaa; ja 25 mahdollistaa suurten näytemäärien käsittelyn sa manaikaisesti pelkästään tavanomaisia välineitä ja laitteita käyttäen.
Keksinnön mukaisen määrityksen suorittamiseen tarvittava kokonaisaika on yleensä alle 30 minuuttia tai 30 30 minuuttia.
Aika määritettävän solupopulaation solun alapopu-laation immobilisoimiseksi on lyhyt. Se on alle 15 minuuttia tai 15 minuuttia veren tai virtsan granulosyyttien määrityksessä. Samoin endogeenisen entsyymin aktiivisuuden 35 määritys vie alle 15 minuuttia tai 15 minuuttia.
Ί U i lilll I I i a ; , 15 96723
Kun kiinteä kantaja on pesty, varsinainen analyysi suoritetaan tavanomaisia laitteita käyttäen tarkan ja yksinkertaisen signaalin, nimittäin valon absorption tai emission havaitsemiseksi.
5 Niinpä kaiken kaikkiaan keksinnön mukaisella mene telmällä on lukuisia etuja: se on nopea, luotettava, taloudellinen ja yksinkertainen.
On osoitettu, että luetut signaalit (fotometriset mittaukset) mahdollistavat tyydyttävien, yhtenäisten va-10 kiokuvaajien saamisen käytettyjen solujen funktiona tavanomaisissa käsittelyolosuhteissa.
Alla olevissa esimerkeissä käytetään satunnaisesti seuraavia termejä tai niiden lyhenteitä: BSA: naudan seerumin albumiini
15 PBS: fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos, pH
7,4.
Esimerkki 1
Ihmisen veren polynukleaaristen valkosolujen myelo-peroksidaasin määritys: mikrotiitterilevyllä suoritettu 20 määritys
Myeloperoksidaasi on glykoproteiinientsyymi, jolla on hemirakenne. Tämä entsyymi, jota esiintyy runsaasti ihmisen veren polynukleaarisissa valkosoluissa, liittyy solujen bakteereja tappaviin ja mikrobienvastaisiin toi-25 mintoihin [Klebanoff, S.J., J. Bacteriol. 95 (1968) 2131; Diamond et ai., J. Clin. Invest. 66 (1980) 908 - 917].
Keksinnön menetelmän mukaisesti polynukleaaristen valkosolujen myeloperoksidaasin määritys käsittää kolme peräkkäistä menetelmävaihetta: 30 1. polynukleaaristen valkosolujen erottaminen koko- verestä.
2. solujen sieppaus ja immobilisointi mikrotiitte-rilevyn mikrokuoppiin etukäteen adsorboidun monoklonaali-sen vasta-aineen avulla, ja 35 3. soluentsyymin aktiivisuuden kehittäminen.
( 16 96723 a) Levyn valmistus Käytetty levy on 96 mikrokuoppaa sisältävä muovinen mikrotiitterilevy (tuotekoodi 64394, Nunc). Jokaiseen mik-rokuoppaan viedään 200 μΐ liuosta, joka sisältää puhdis-5 tettua anti-CD15-monoklonaalista vasta-ainetta (jota kutsutaan nimellä SMY 15a), jota käytetään polynukleaaristen valkosolujen immobilisoimiseksi, toisin sanoen niiden immuuni sieppauksen suorittamiseksi. Tätä vasta-ainetta (Bio-sys, Compiägne, Ranska, tuotekoodi SMY 15a) käytetään pi-10 toisuutena 5 μΐ/ml fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa (PBS), pH 7,4.
Monoklonaalisen vasta-aineen adsorbointi suoritetaan 4 °C:ssa 12 tunnin ajan. Ylimääräinen vasta-aine poistetaan kääntämällä levy ylösalaisin.
15 Valmistetaan liuos, joka sisältää 0,1 % gelatiinia ja 0,3 % BSA:ta fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa. 250 μΐ tätä liuosta viedään jokaiseen mikrokuoppaan kuoppien pinnan kyllästämiseksi proteiinilla, mikä vie yhden tunnin 37 eC:ssa, ja levyt pestään kol-20 mesti fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella. Näin valmistetut levyt varastoidaan 4 °C:ssa.
b) Polynukleaaristen valkosolujen erotus
Verinäyte otetaan antikoagulanttia (hepariini) sisältävään putkeen. 2 ml Mono-Poly-erotusväliainetta (Flow, 25 tuotekoodi 16.980-49) viedään 5 ml:n hemolyysiputkeen ja 2 ml verta lisätään päälle. Sitten putkea sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 400 x g 40 minuutin ajan laboratorion lämpötilassa. Muodostuu kaksi solususpensiorengasta, joista alempi rengas sisältää polynukleaariset valkosolut, jotka 30 sitten otetaan talteen mikropipetillä.
: c) Solujen immuunisieppaus
Solujen sieppaus toteutetaan käyttäen adsorboitua anti-CD15-monoklonaalista vasta-ainetta.
100 pl:aa solususpensiota (5 x 105 solua/ml PBS:ää) 35 viedään levyn mikrokuoppiin. Kiinnittymisen kantajaan 17 96723 edistämiseksi levyä sentrifugoidaan kolme minuuttia kiihtyvyydellä 150 x g sen jälkeen, kun niitä on seisotettu 10 minuuttia huoneenlämpötilassa.
d) Myeloperoksidaasin kehitys ja mittaus 5 Mikrokuopat tyhjennetään kääntämällä levy ylösalai sin. Ne pestään kahdesti 200 pl:lla PBS:ää kuoppaa kohti ei-toivottujen solupopulaatioiden, kuten monosyyttien tai punasolujen, poistamiseksi, jotka sopupopulaatiot saattaisivat aiheuttaa väärän absorbanssisignaalin. Toisen pesun 10 jälkeen jokaiseen kuoppaan lisätään 100 μΐ juuri ennen käyttöä valmistettua kehitysliuosta.
Kehitysliuos saadaan seuraavalla tavalla: valmistetaan 0,1 mol/1 sitraattipuskuri liuottamalla sitruunahapon monohydraattia niin, että saadaan 2-%:nen liuos, ja säätä-15 mällä liuoksen pH arvoon 5 lisäämällä 7 mol/1 natriumhyd-roksidiliuosta. Sitten valmistetaan 2-%:nen heksadekyyli-trimetyyliammoniumbromidin (CETAB, Touzart ja Matignon, tuotekoodi T 5650) liuos puskurissa. Reagenssi tekee solu-membraanit läpäiseviksi ja parantaa myeloperoksidaasin 20 aktiivisuutta substraatin suhteen. 30 mg ortofenyleenidi-amiinidihydrokloridia ja sitten 40 μΐ vetyperoksidia (entsyymin substraatti) lisätään 20 ml:aan tätä liuosta ennen käyttöä.
Kymmenen minuutin inkuboinnin jälkeen absorbanssi 25 mitataan spektrofotometrisesti aallonpituudella 450 nm (Titertek Multiscan -laite, tyyppi 310 C, Flow Laboratories).
Eräässä kokeessa 50 000 solua käyttäen saadut ab-sorbanssit annetaan alla olevassa taulukossa 1: 18 96723
Taulukko 1
Pelkät Solut + reagens- Solut + rea- solut si ilman CETABda genssit CETAftinkanssi 5
Absorbanssi 0^003 0^370 1^545 CETAB:in läsnäolo kehitysväliaineessa tuottaa nelinkertaisen lisäyksen myeloperoksldaasin katalysoiman 10 reaktion absorbanssissa, jolloin on mahdollista vähentää määrityksessä tarvittavien solujen lukumäärää.
Esimerkki 2
Ihmisen veren polynukleaaristen valkosolujen myelo-peroksidaasin määritys: magneettisilla helmillä suoritettu 15 määritys Tämän esimerkin tarkoituksena on osoittaa, että endogeenisen entsyymin määritykseen kuluvaa aikaa voidaan lyhentää verrattuna esimerkissä 1 kuvattuihin olosuhteisiin modifioimalla solun immuunisieppausmenetelmää. Solu-20 jen sieppaukseen käytetään kantajana magneettisia helmiä, jotka tunnetaan nimellä Dynabeads. Helmien (tuotekoodi DYN-11001, Biosys) pintaan on kiinnitetty anti-hiiren im-munoglobuliini -vasta-aineita. Ennen käyttöä helmet käsitellään anti-CD15 -monoklonaalisten vasta-aineiden (tuote-25 koodi SMY 15a, Biosys, Ranska) liuoksella 12 tunnin ajan 4 eC:ssa. Tämä tehdään sekoittamalla 25 μΐ helmisuspensio-ta 0,5 ml:aan vasta-aineliuosta, joka sisältää 100 pg/ml PBS:ää. Tämän jälkeen helmet pestään kolmesti PBS:llä, minkä jälkeen ne kyllästetään 12 tunnin ajan 4 eC:ssa 30 0,3-%:11a naudan seerumin albumiini (BSA) -liuoksella.
Käyttövalmiita helmiä säilytetään 4 °C:ssa.
Myeloperoksidaasi määritetään 5 ml:n hemolyysiput-kessa. 300 μΐ PBS:ää, 25 μΐ helmisuspensiota ja 100 μΐ litiumheparinaattia sisältävään putkeen (Vacutainer-putki, 35 tuotekoodi 606 484) otettua kokoverta viedään putkeen. Kun • MM IIIH I M S! ' - 19 96723 putkea on ravisteltu kevyesti viiden minuutin ajan, helmet erotetaan magneetin avulla ja helmiin kiinnittyneet solut pestään viidesti PBS:llä.
Myeloperoksidaasi kehitetään sekareagenssilla, joka 5 sisältää substraattia (vetyperoksidi) ja kromogeenia (or-tofenyleenidiamiini) ja joka on valmistettu esimerkissä 1 kuvatulla tavalla ja joka joko sisältää tai ei sisällä CETAB:ia. Absorbanssi mitataan esimerkissä 1 kuvatuissa olosuhteissa. Tulökset annetaan taulukossa 2.
10 Taulukko 2
Absorbanssi Helmet + ke- Helmet + Helmet + so- Helmet + so-hitysrea- pelkät so- lut kehitys- lut kehitys-genssi lut reagenssi il-reagenssi man CETAB:ia CETAB:in 15 kanssa
Kokoveri 0,025 0,011 0^0323 1,324
Virtsa 0,025 0,008 0,286 1,115 20 ----- Tässä esimerkissä kuvatun menetelmän mukaisesti määritys suoritettiin suoraan verinäytteestä ja virtsanäytteestä sentrifugoimatta etukäteen analysoitavaa solu-populaatiota. Lisäksi inkubointiaika on vain viisi minuut-25 tia. Siten käytettäessä magneettisia helmiä kiinteänä kantajana määritykset kokonaisuudessaan ovat erityisen yksinkertaisia ja nopeita.

Claims (14)

96723
1. Testipakkaus solupopulaatiolle tai solujen ala-populaatiolle luonteenomaisen endogeenisen entsyymin mää-5 rittämiseksi, tunnettu siitä, että se sisältää seuraavat komponentit: a) kiinteän kantajan, johon on kovalenttisesti sitomalla tai fysikaalisen adsorption avulla kiinnitetty yksi tai useampia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on 10 muodostettu määritettävän solupopulaation pinta-antigeene-ja vastaan; b) yhden tai useamman liuoksen, joka sisältää entsyymin aktiivisuuden kehittämiseksi tarvittavat reagenssit (substraatin ja mahdollisesti kromogeenin), jolloin sub- 15 straatti on pienimolekyylipainoinen molekyyli, joka pystyy tunkeutumaan mainitun solun (ala)populaation sisään; ja c) lisäkomponentin, joka muodostuu puskuroidusta pesuliuoksesta ja mahdollisesti näytteistä, jotka sallivat määrityksen vakioinnin ja laaduntarkkailun.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi reagens-sin, joka parantaa solumembraanin läpäisevyyttä.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että komponentti a) on kiin- 25 teä kantaja, joka voi olla mikrotiitterilevy, jonka kuoppiin on kiinnitetty vasta-aine tai vasta-aineita, joiden tarkoituksena on kiinnittää paikoilleen solut, mukaan lukien määritettävää entsyymiä sisältävän solupopulaation tai solujen alapopulaation solut.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen testipak- . kaus, tunnettu siitä, että komponentti a) on par tikkelimuodossa oleva magneettinen kantaja.
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että komponentti a) on 35 putken muodossa. il : II) tili I: t HI i 96723
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että komponentti a) muodostuu kiinteästä kantajasta, johon on kiinnitetty yksi tai useampia monoklonaallsia vasta-aineita, jotka on muo- 5 dostettu HLA luokan I antigeenejä vastaan.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen testipakkaus, tunnettu siitä, että kiinnitetty monoklonaalinen vasta-aine on S-luokka I:ksi kutsuttu vasta-aine.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen tes-10 tipakkaus, tunnettu siltä, että komponentti (b) sisältää oleellisesti vetyperoksidia ja kromogeenla, joka voi olla ortofenyleenidiamiini, 2,2'-atsino-bis(3-etyyli-bentsotiatsoliini-6-sulfonihappo), 3,3’-diaminobentsi-diini, 3-amino-9-etyylikarbatsoli tai jokin näiden vesi-15 liukoinen suola.
9. Menetelmä solupopulaation tai solun alapopulaa-tion endogeenisten entsyymien määrittämiseksi, tunnettu siitä, että a) immobilisoidaan määritettävää entsyymiä sisältä-20 vä solupopulaatio tai solupopulaatio, joka sisältää määritettävää entsyymiä sisältävän solun alapopulaation, kiinteään kantajaan käyttäen yhtä tai useampia monoklonaallsia vasta-aineita, jotka on etukäteen kiinnitetty kiinteään kantajaan kovalenttisesti sitomalla tai fysikaalisen ad- 25 sorption avulla ja jotka pystyvät tunnistamaan solujen pinnalla olevan antigeenin; b) odotetaan inkubointiaika; c) pestään kantaja immobilisoitumattomien solujen poistamiseksi; ja 30 d) lisätään endogeenisen entsyymin aktiivisuuden . kehittämiseksi tarvittavatt) reagenssi(t) (substraatti ja kromogeeni), jolloin substraatti on pienimolekyylipainoi-nen molekyyli, joka pystyy tunkeutumaan mainitun solun (ala)populaation sisään; ja 96723 e) luetaan tulokset mittaamalla valosignaalit (vä-rlnmuodostumlnen tai fluoresenssi) mahdollisesti vakioas-telkkoon verrattuna. '
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen määritysmenetel-5 mä, tunnettu siitä, että kiinteä kantaja on jossakin patenttivaatimuksessa 3-5 määritelty kiinteä kantaja.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen määritysmenetelmä, tunnettu siitä, että entsyymin ak- 10 tiivisuus kehitetään vetyperoksidin ja kromogeenin avulla, jolloin kromogeeni voi olla ortofenyleenidiamiini, 2,2'-atsino-bis(3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo), 3,3'-diaminobentsidiini, 3-amino-9-etyylikarbatsoli tai jokin näiden vesiliukoinen suola.
12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen määritysmenetel mä, tunnettu siitä, että kiinteään kantajaan kiinnitetty monoklonaalinen vasta-aine tai monoklonaaliset vasta-aineet ovat vasta-aineita, jotka on muodostettu HLA luokan I antigeenejä vastaan.
13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen määritysmenetel mä, tunnettu siitä, että kiinteään kantajaan kiinnitetty monoklonaalinen vasta-aine on S-luokka I:ksi kutsuttu vasta-aine.
14. Patenttivaatimuksen 9 mukainen määritysmenetel- 25 mä ihmisen veren tai virtsan granulosyyttien endogeenisen myeloperoksidaasin määrittämiseksi. :i 1H Ί n» I l i m : : 96723
FI901468A 1989-03-24 1990-03-23 Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä FI96723C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR8903943 1989-03-24
FR8903943A FR2644894B1 (fr) 1989-03-24 1989-03-24 Trousse et methode de dosage enzymatique applicables a des cellules entieres

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI901468A0 FI901468A0 (fi) 1990-03-23
FI96723B FI96723B (fi) 1996-04-30
FI96723C true FI96723C (fi) 1996-08-12

Family

ID=9380065

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI901468A FI96723C (fi) 1989-03-24 1990-03-23 Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP0389381B1 (fi)
JP (1) JPH02298866A (fi)
KR (1) KR900014887A (fi)
AT (1) ATE113725T1 (fi)
CA (1) CA2012934A1 (fi)
DE (1) DE69013730T2 (fi)
FI (1) FI96723C (fi)
FR (1) FR2644894B1 (fi)
IE (1) IE66587B1 (fi)
IL (1) IL93862A0 (fi)
PT (1) PT93548A (fi)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5256532A (en) * 1988-05-02 1993-10-26 Zynaxis Technologies, Inc. Methods, reagents and test kits for determination of subpopulations of biological entities
US5385822A (en) * 1988-05-02 1995-01-31 Zynaxis, Inc. Methods for detection and quantification of cell subsets within subpopulations of a mixed cell population
DE19952155A1 (de) * 1999-10-29 2001-05-03 Volkswagen Ag Cliphalterung für zu befestigende Gegenstände
US7780950B2 (en) 2002-01-02 2010-08-24 The Cleveland Clinic Foundation Systemic marker for monitoring anti-inflammatory and antioxidant actions of therapeutic agents
US7223552B2 (en) 2001-01-02 2007-05-29 The Cleveland Clinic Foundation Myeloperoxidase, a risk indicator for cardiovascular disease
US7459286B1 (en) 2003-10-22 2008-12-02 The Cleveland Clinic Foundation Assessing the risk of a major adverse cardiac event in patients with chest pain
ES2606716T3 (es) * 2009-05-18 2017-03-27 Technische Universität Graz Método para detectar la infección de una herida
CN104950111A (zh) * 2015-05-22 2015-09-30 北京协和洛克生物技术有限责任公司 一种定量检测样本中髓过氧化物酶浓度的液态芯片试剂盒及其制备方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3047860A1 (de) * 1980-12-18 1982-07-15 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung von hla-antigenen
US4591570A (en) * 1983-02-02 1986-05-27 Centocor, Inc. Matrix of antibody-coated spots for determination of antigens
FR2571498B1 (fr) * 1984-10-04 1988-04-08 Immunotech Sa Procede de separation de cellules utilisant des anticorps et des billes de faible densite
DE3438683A1 (de) * 1984-10-22 1986-04-24 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur bestimmung von peroxidase
US4770995A (en) * 1985-08-29 1988-09-13 New York Blood Center, Inc Detection of the sensitivity of cells to the effects of tumor necrosis factor and lymphotoxin
DE3541033A1 (de) * 1985-11-19 1987-05-21 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur quantifizierung von zellpopulationen bzw. subpopulationen sowie hierfuer geeignetes reagenz
CA1326435C (en) * 1987-03-13 1994-01-25 Wallace H. Coulter Method and apparatus for rapid mixing of small volumes for enhancing biological reactions
US5100777A (en) * 1987-04-27 1992-03-31 Tanox Biosystems, Inc. Antibody matrix device and method for evaluating immune status

Also Published As

Publication number Publication date
CA2012934A1 (en) 1990-09-24
EP0389381B1 (fr) 1994-11-02
ATE113725T1 (de) 1994-11-15
IE901081L (en) 1990-09-24
DE69013730T2 (de) 1995-06-01
IE66587B1 (en) 1996-01-24
FR2644894B1 (fr) 1994-05-13
DE69013730D1 (de) 1994-12-08
FI96723B (fi) 1996-04-30
FI901468A0 (fi) 1990-03-23
KR900014887A (ko) 1990-10-25
FR2644894A1 (fr) 1990-09-28
IL93862A0 (en) 1990-12-23
EP0389381A1 (fr) 1990-09-26
JPH02298866A (ja) 1990-12-11
PT93548A (pt) 1990-11-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5122453A (en) Method for discriminating surface stained lymphocytes
US4200690A (en) Immunoassay with membrane immobilized antibody
US4407943A (en) Immobilized antibody or antigen for immunoassay
US4962023A (en) Single incubation immuno sorbent assay method using particle labels to detect test antigen specific antibodies in presence of other antibodies
US4302536A (en) Colorimetric immunoassay process
US5051356A (en) Specific binding composition comprising a low pI protein or carbohydrate and a diagnostic test kit and method of use
JP3330604B2 (ja) 固相免疫学的検定法
EP0171150A2 (en) Method and apparatus for assaying with optional reagent quality control
FI95752B (fi) Määrityskitti ja -menetelmä kokonaisten solujen immunologiseen määritykseen
CN105785030A (zh) 一种血清特异性IgE光激化学发光免疫分析试剂盒
US4499183A (en) Detecting intracellular antigens in swelled and fixed cells with labeled antibody
US5919419A (en) Analyzer cuvette, method and diagnostic test kit for determination of analytes in whole blood samples
FI96723C (fi) Testipakkaus entsyymien määritykseen ja määritysmenetelmä
US4729961A (en) Process for the detection and assay by erythroadsorption
US6461825B1 (en) Immunometric assay kit and method applicable to whole cells
CA1254134A (en) Specific binding flow cytometry method
EP0217845B1 (fr) Procede de determination immunologique d&#39;une substance biologique dans un echantillon
GB1597345A (en) Diagnostic immunochemical test materials and procedure
US5856113A (en) Antigen and method for measuring anti-erythrocyte antibody
CN112129933A (zh) 一种免疫分析***中抗生物素干扰的试剂、试剂盒及方法
JPH05346428A (ja) 顆粒球の迅速なカウントのためのキット及び前記キットを使用する方法
CN118169399A (zh) 糖化血红蛋白检测试剂盒及检测方法
CN113866426A (zh) 一种检测d-二聚体的试剂盒及其制备方法
JPH02291966A (ja) 全細胞に適用できる検定キットおよび方法
JPH02103468A (ja) 不均質免疫定量法

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Owner name: SANOFI

BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: SANOFI-SYNTHELABO

MA Patent expired