CN101718783B - 广谱抗人球蛋白卡的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种广谱抗人球蛋白卡的制备方法，所述卡上具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管皆为含有抗IgG+C₃d抗体的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：凝胶悬浮介质的配制、凝胶的制备、抗体的选择、凝胶的配制和分装。所述凝胶悬浮介质配方如下：对羟基苯甲酸甲酯(5.5-6.5)×10^-4g/ml，对羟基苯甲酸丙酯1.0-1.5)×10^-4g/ml，甘氨酸(1.6-1.9)×10^-2g/ml，氯化钠(1.7-1.8)×10^-3g/ml，磷酸二氢钾(2.1-2.4)×10^-4g/ml，磷酸氢二钠(4.6-4.8)×10^-4g/ml，牛血清白蛋白≤2％，以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。本发明方法制备的广谱抗人球蛋白卡灵敏度高、特异性好且质量稳定。

Description

广谱抗人球蛋白卡的制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种用于血型交叉配血、不规则抗体筛查、不规则抗体鉴定的微柱凝胶血型卡及其应用。更具体的说，本发明涉及一种广谱抗人球蛋白卡的组成、制备方法及其应用，涉及输血医学领域。

(二)背景技术

微柱凝胶抗球蛋白卡是近来逐渐兴起的一项免疫检测新方法，是不完全抗体与相应抗原的红细胞，在含有抗人球蛋白凝胶介质中进行的抗人球蛋白的试验，该法是凝胶柱与抗人球蛋白实验检测法相结合的产物，1984年法国Dr.YvesLapierre首先发明此方法，与传统试管法抗球蛋白试验比较，省略了传统的试管液体介质的繁琐洗涤程序，也省去了必须在阴性结果试管中加入不完全抗体致敏的红细胞，以确认阴性结果是否正确的步骤，因此具有标本用量少、操作简便、省时、人为因素小、易于标准化及自动化、结果易判读并可长期保存等优点，适于大批量标本的检测。

在国外微柱凝胶抗球蛋白卡已成为常规广泛应用于血型鉴定、不规则抗体检测及交叉配血等各种血型血清学试验。近年来，国内已开始采用进口微柱凝胶抗球蛋白卡进行不规则抗体的筛选和鉴定、致敏红细胞的检测等，但由于其售价高、设备昂贵，严重影响其在国内普及。另国内亦有微柱凝胶蛋白卡的生产，但国内外采用的凝胶为葡聚糖凝胶，此凝胶的颗粒大小为70纳米以上，颗粒较大，凝胶之间的缝隙较大，从而使得其检测的灵敏度降低。

(三)发明内容

本发明的目的在于克服上述不足，提供一种灵敏度高、特异性好且质量稳定的广谱抗人球蛋白卡的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：一种广谱抗人球蛋白卡的制备方法，所述卡上具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管皆为含有抗IgG+C₃d抗体的凝胶管，所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

选择广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)，

其中抗IgG成分灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集，

抗C₃d成分的灵敏度：要求：按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)必须对C₃d致敏的红细胞有肉眼可见凝集，与所述广谱抗人球蛋白试剂原液的反应强度≥1+，

广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与C₃d致敏红细胞产生阳性反应，与既无IgG抗体又无C₃d抗体致敏的红细胞反应为阴性；

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的抗体按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)的凝胶，

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的凝胶加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的广谱抗人球蛋白卡。

本发明的有益效果是：

本发明的第一个方面，提出了一种标准化的凝胶悬浮介质体系，用于凝胶的洗涤和悬浮，并可以长时间维持抗体以及凝胶的稳定，其特点在于：

1、设计了具有很强缓冲能力的缓冲体系，采用磷酸钾盐、钠盐以及氨基酸组成的缓冲体系，使体系的pH值维持在6.6-6.8。与输血领域通常采用的单一的枸橼酸缓冲体系相比，具有缓冲能力更强的特点，有利于保持整个体系处于要求的缓冲范围，同时保证了整个凝胶悬浮介质的离子强度。

2、具有更加有效的低盐浓度体系，从其组成可以看出，本发明的凝胶悬浮介质采用氨基酸和氯化钠作为添加剂，辅助以微量的磷酸盐来维持低离子强度环境，保持凝胶颗粒呈圆球颗粒并充分溶胀，并维持凝胶颗粒的直径大小在所要求的范围内(30-60纳米)。

3、本发明具有独特的润滑体系，采用一定浓度的牛蛋白、对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯，使得红细胞通过凝胶间隙时获得合适的润滑能力，使无凝集的红细胞具有完全通过凝胶颗粒间隙的能力，而凝集的红细胞则不能通过。

4、本发明具有优越的防腐体系，选择有机物苯甲酸酯类作为防腐剂，采用对羟基苯甲酸甲酯及对羟基苯甲酸丙酯协同作用(各种对羟基苯甲酸单酯中的侧面碳链长短的不同，因而其在穿透细胞膜的能力不同，并且其抑菌的作用位点也就不同，所以各种单酯针对不同种类微生物的抑制能力就不同。几种酯的复合，具有更好的防腐能力。国内外大量的实际应用也证实了复合的对羟基苯甲酸酯比单一的对羟基苯甲酸酯的抑菌效果好)，有效防止细菌的繁衍，获得较长时间的保存期，同时不仅避免使用叠氮钠化学防腐剂对凝胶悬浮介质体系的离子强度提升从而对广谱抗人球蛋白卡的灵敏度和特异性产生的不良影响，也避免使用抗生素类在保存过程中所代谢产生的中间体对广谱抗人球蛋白卡的特异性产生的不良影响。

本发明的另一方面，为了保证本发明广谱抗人球蛋白卡的质量，在制备过程中还需要对凝胶进行筛选，即，首先要选择适当的凝胶，一般应该满足的条件是：选择颗粒直径为30-60纳米，经过丙烯酰化后的葡聚糖凝胶。对筛选获得的凝胶原料需要进行溶胀、洗涤、悬浮，目的是让凝胶颗粒充分溶胀，洗涤去除破损的凝胶颗粒、聚集的凝胶颗粒、内径在30-60纳米以外的超大或超小凝胶颗粒以及凝胶以外的其它杂质成分。洗涤完成后用凝胶悬浮介质来悬浮凝胶。

本发明的再一方面，为了保证本发明广谱抗人球蛋白卡的质量，在制备过程中还对与凝胶混合的抗体原料进行筛选。

综上所述，本发明的广谱抗人球蛋白卡之所以可以具有优良的特异性、灵敏度以及长达1年的保存期，是在于整个体系各种成分的协同作用，缓冲体系可以维持微柱凝胶卡反应体系需要的pH；低盐浓度体系可以保证凝胶颗粒得到充分溶胀且凝胶颗粒直径在所需要的范围内。润滑体系可以保证凝胶颗粒之间适当的润滑能力。酯类防腐剂可以防止凝胶或抗体因为细菌繁殖而失效。丙烯酰化的凝胶可以保证凝胶颗粒之间的合适的间隙。标准化的抗体可以保障抗原的有效检出。合适的卡口密封材料和密封条件保证了广谱抗人球蛋白卡在保存过程中不会因为液体蒸发引发凝胶干枯而导致广谱抗人球蛋白卡失效。

此广谱抗人球蛋白卡一般在18-25℃条件下保存有效期不低于12个月。

总之，本发明的实施提供了标准化的广谱抗人球蛋白卡产品，各医院和采供血机构可以直接从生产供应商处得到标准一致的广谱抗人球蛋白卡，为临床准确进行血型鉴定、交叉配血、不规则抗体检测保证安全输血创造了条件。

(四)具体实施方式

以下通过具体实施例详细说明本发明的实施和所具有的有益效果，旨在帮助阅读者更好的理解本发明的精神和实质，并不能对本发明的实施范围构成任何限定。

实施例1：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8。

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米。用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的适用的凝胶。

步骤三、抗体的选择

选择广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)：与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与C₃d致敏红细胞产生阳性反应，与既无IgG抗体又无C₃d抗体致敏的红细胞反应为阴性。

其中抗IgG成分灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集；

其中抗C₃d成分的灵敏度：要求：按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)必须对C₃d致敏的红细胞有肉眼可见凝集。与所述广谱抗人球蛋白试剂原液的反应强度≥1+；

广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与C₃d致敏红细胞产生阳性反应，与既无IgG抗体又无C₃d抗体致敏的红细胞反应为阴性。

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的抗体按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)的凝胶。

步骤五、分装

按照每管28微升的量，将步骤四配制的凝胶加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的广谱抗人球蛋白卡。

步骤六、半成品测定

要求广谱抗人球蛋白卡(抗IgG+C₃d)检测的抗D抗体效价不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果；广谱抗人球蛋白卡(抗IgG+C₃d)检测的抗Fy^a抗体效价不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果；广谱抗人球蛋白卡(抗IgG+C₃d)与补体致敏的红细胞反应强度≥1+。要求与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应，而和O型RhD阴性红细胞反应为阴性；与O型Fy^a阳性红细胞反应为阳性，而和O型Fy^a阴性红细胞反应为阴性；与C₃d致敏的红细胞反应为阳性，与既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

步骤七、封口

用铝箔纸通过压膜方式将微柱管上口密封。贴标签标记后于18-25℃保存。

步骤八、保存试验

上述广谱抗人球蛋白卡保存了1年以上，在此保存期间，该广谱抗人球蛋白卡具有以下检测结果：

(1)外观：

微柱凝胶卡上微管内的凝胶应呈均匀淡蓝绿色，胶面上端有1～2mm清澈透明的液体，凝胶颗粒之间不应有气泡和异物。

(2)灵敏度：

抗IgG凝胶的灵敏度

要求广谱抗人球蛋白卡(抗IgG+C₃d)检测的Rh***的抗D抗体效价及Duffy***的抗Fy^a抗体效价均不低于试管间接抗人球蛋白法测定结果。

抗C₃d灵敏度

要求广谱抗人球蛋白卡(抗IgG+C₃d)与补体致敏的红细胞反应强度≥1+。

(3)特异性：

抗IgG成分的特异性

检测IgG性质抗D抗体，要求与O型RhD阳性红细胞产生阳性凝集反应，而和O型RhD阴性红细胞反应为阴性；检测IgG性质抗Fy^a抗体，要求与O型Fy^a阳性红细胞反应为阳性，而和O型Fy^a阴性红细胞反应为阴性。

抗C₃d成分的特异性

要求与C₃d致敏的红细胞反应为阳性。与既无IgG抗体又无C₃d致敏的红细胞反应为阴性。

Claims (1)

1.一种广谱抗人球蛋白卡的制备方法，所述卡上具有6个微柱凝胶管，所述6个微柱凝胶管皆为含有抗IgG+C₃d抗体的凝胶管，其特征在于所述方法包括以下工艺过程：

步骤一、凝胶悬浮介质的配制

所述凝胶悬浮介质配方如下：

对羟基苯甲酸甲酯    (5.5-6.5)×10^-4g/ml

对羟基苯甲酸丙酯    (1.0-1.5)×10^-4g/ml

甘氨酸              (1.6-1.9)×10^-2g/ml

氯化钠              (1.7-1.8)×10^-3g/ml

磷酸二氢钾          (2.1-2.4)×10^-4g/ml

磷酸氢二钠          (4.6-4.8)×10^-4g/ml

牛血清白蛋白        ≤2％，

以上试剂用蒸馏水溶解，调pH值为6.6-6.8；

步骤二、凝胶的制备

选用聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶，颗粒大小为30-60纳米，用步骤一配制的凝胶悬浮介质浸泡后再用该凝胶悬浮介质洗涤3-5次，除去凝胶破损碎片以及聚集的凝胶颗粒，收集得到颗粒大小均匀的、且完整呈球形的凝胶；

步骤三、抗体的选择

选择广谱抗人球蛋白试剂， 

其中抗IgG成分灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的IgG抗人球蛋白血清必须对照体积比1∶16稀释的抗D IgG致敏的红细胞有肉眼可见凝集，

抗C₃d成分的灵敏度：要求按照体积比1∶2和体积比1∶4稀释的抗人球蛋白试剂对C₃d致敏的红细胞有肉眼可见凝集，与所述广谱抗人球蛋白试剂原液的反应强度≥1+，

广谱抗人球蛋白试剂与IgG性质抗D致敏红细胞产生阳性反应，与C₃d致敏红细胞产生阳性反应，与既无IgG抗体又无C₃d抗体致敏的红细胞反应为阴性；

步骤四、凝胶的配制

将步骤二制备的凝胶与步骤三选择的抗体按照体积比2∶1～3∶1的比例混合，配制成含有广谱抗人球蛋白试剂(抗IgG+C₃d)的凝胶；

步骤五、分装

按照每管22～28微升的量，将步骤四配制的凝胶加入到一空白卡片的六个微柱管中，形成具有6个微柱凝胶管的广谱抗人球蛋白卡。