CN105929177A - 一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒及其制备方法,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分:试剂R1:缓冲液、无机盐离子、加速剂、防腐剂,试剂R2:缓冲液、稳定剂、助悬剂、防腐剂、胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体,制备方法为:按照组分含量配制好试剂;将待测样本与试剂R1和试剂R2混合,使其充分反应;用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值;根据吸光度变化值计算出样本中的抗环瓜氨酸肽的浓度。本发明具有准确度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及医学及生物化学技术领域,具体来说是一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒及其制备方法。
背景技术
抗环瓜氨酸肽抗体,是环状聚丝蛋白的多肽片段,是以IgG型为主的抗体,对类风湿性关节炎(RA)具有很好的敏感性和特异性,且抗CCP抗体阳性的RA病人骨破坏较抗CCP抗体阴性者严重,类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种常见的慢性自身免疫性疾病,类风湿性关节炎(RA)能引起关节的疼痛、僵直及肿胀,在发病2年内即可能出现不可逆的骨关节损伤,并可引起多种并发症,如神经***疾病、心包炎、淋巴腺炎等,因此,及早诊断RA及给予缓解病情的药物治疗,对控制病情非常重要,1998年,国外,首次报道的抗环瓜氨酸肽抗体的检测,对类风湿性关节炎具有较高的敏感性和特异性,是类风湿性关节炎新的血清标志物。
抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)对RA具有相当高的特异性和敏感性(68%-75%),即使是类风湿性关节炎早期患者,敏感度也有40%-60%,在类风湿性关节炎的早期阶段即可出现阳性,抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)是类风湿性关节炎早期诊断的特异性指标,而RF可作为疾病损伤严重性的较好的标记物。因此,联合检测抗抗环瓜氨酸肽抗体和RF对RA的诊断及预后有很大的意义。
目前,检测抗环瓜氨酸肽抗体(CCP)的方法有酶联免疫吸附法、胶体金法,但是酶联免疫吸附法操作复杂、耗时长,且对操作人员要求较高,胶体金法只能定性或半定量,无法完成定量检测,而且上述两种方法的检测的准确度也不是很高,因此需要进行改进。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术操作复杂、测定准确度低的缺陷,而提供一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒及其制备方法。
本发明解决上述技术问题提供的技术方案是:本发明公开了一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~400 mmol/L
加速剂 5~30 g/L
防腐剂 0.6~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
缓冲液 50~150 mmol/L
稳定剂 5~35 g/L
助悬剂 10~90 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 1~6 g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选,本发明公开了一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 200 mmol/L
加速剂 17g/L
防腐剂 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 20g/L
助悬剂 50mmol/L
防腐剂 0.7 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 3g/L
其溶剂为纯化水。
作为优选,所述的试剂R1中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合,所述的无机盐离子为氯化钠,所述的加速剂为聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种,所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合。
作为优选,所述的试剂R2中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合,所述的稳定剂采用牛血清白蛋白,所述的助悬剂采用乙二醇、丙三醇或麦芽糖中的一种或多种的组合,所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合。
作为优选,所述的试剂R2中,所述的胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体的制备方法为:用浓度为50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含有的聚苯乙烯微球的重量浓度为1%-5%的溶液,然后在每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在20-37℃的条件下反应1小时,反应完成后,加入猝灭剂,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后使用超声分散仪进行超声分散,再使用离心机,在25000rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后边搅拌边加入等体积的抗环瓜氨酸肽抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的重量浓度为0.5%-2.0%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白的质量浓度为15g/L时为止,然后在4℃的条件下封闭8-12小时,即可制备得到胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体。
作为优选,所述的猝灭剂为2,2’-硫代双镍、2-甲基-1,3-丁二烯、反-1,3-戊二烯中的一种。
作为优选,本发明还公开了上述测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒的制备方法和使用方法,包括以下步骤:
(a)按照下列组分含量配制好试剂:
试剂R1:
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~400 mmol/L
加速剂 5~30 g/L
防腐剂 0.6~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
缓冲液 50~150 mmol/L
稳定剂 5~35 g/L
助悬剂 10~90 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 1~6 g/L
其溶剂为纯化水;
(b)将待测样本与试剂R1和试剂R2混合,使其充分反应;
(c)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值;
(d)根据吸光度变化值计算出样本中的抗环瓜氨酸肽的浓度。
作为优选,步骤(b)中,所述的试剂R1和试剂R2的体积比为3:1。
作为优选,步骤(b)中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1:40之间。
本发明的检测原理是:本试剂盒采用乳胶增强免疫比浊法定量检测人血清中抗环瓜氨酸肽(CCP)抗体。将抗环瓜氨酸结合HAS吸附于乳胶颗粒上,通过孵育使稀释人血清或血浆中的特异性抗体与抗原结合,经孵育后,产生的吸光度变化量与检测样本中的特异性抗体浓度成正比。
样本中抗环瓜氨酸肽(CCP)的活性(U/mL)= CS × (U/mL)
式中:ΔAT以空白管吸光度作对照的样品管吸光度值
ΔAS以空白管吸光度作对照的校准管吸光度值
CS校准液中CCP的浓度。
与现有技术相比,本发明具有以下有益优点:在R2试剂中添加了助悬剂,这样有效的增加了胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体的悬浮稳定性,在和稳定剂牛血清白蛋白的作用下,共同维持了胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体在试剂R2中的分散稳定,防止相互聚集成大物质,在无机盐离子吐温-80的作用下,增加了胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体在R2液中的溶解度,因此本发明的检测准确度也就大大提高,另外本发明的操作也比较简单。
具体实施方式
以下结合具体实施例进一步说明,但本发明并不仅限于这些实施例。
实施例1
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,其中
试剂R1:
Tris缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
聚乙二醇-8000 17g/L
硫柳汞 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
Tris缓冲液 100mmol/L
牛血清白蛋白 20g/L
丙三醇 50mmol/L
山梨酸钠 0.7 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 3g/L
其溶剂为纯化水。
实施例2
本发明的试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,其中
试剂R1:
磷酸盐缓冲液 185 mmol/L
氯化钠 150 mmol/L
聚乙二醇-2000 5 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
Tris缓冲液 150 mmol/L
牛血清白蛋白 5 g/L
丙三醇 10 mmol/L
山梨酸钠 0.6 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 6g/L
其溶剂为纯化水。
实施例3
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体的制备:用浓度为50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为120nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含有的聚苯乙烯微球的重量浓度为3%的溶液,然后在每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在25℃的条件下反应1小时,反应完成后,加入2,2’-硫代双镍,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后使用超声分散仪进行超声分散,再使用离心机,在25000rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后边搅拌边加入等体积的抗环瓜氨酸肽抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的重量浓度为2.0%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白的质量浓度为15g/L时为止,然后在4℃的条件下封闭10小时,即可制备得到胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体;
2、按照下列组分含量配制好试剂:
试剂R1:
Tris缓冲液 100 mmol/L
氯化钠 200 mmol/L
聚乙二醇-8000 17g/L
硫柳汞 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
Tris缓冲液 100 mmol/L
牛血清白蛋白 20g/L
丙三醇 50mmol/L
山梨酸钠 0.7 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 3g/L
其溶剂为纯化水;
3、全自动生化分析仪参数设置
(a)检测温度:37℃;
(b)检测波长:主波长546nm,副波长800nm;
(c)反应时间 :10min,其中,孵育时间 5min,加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1,5min后读取吸光度 A2,计算吸光度变化 ΔA = A2-A1 ;
(d)反应方向:正反应;
4、检测步骤
(a)取150μl试剂R1与5μl待测样本混匀;
(b)将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min;
(c)加入50μl试剂R2,立即测定读取吸光度A1,5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化ΔA=A2-A1;
(d)根据样本中抗环瓜氨酸肽(CCP)的活性(U/mL)=CS×(U/mL)计算出样本中的抗环瓜氨酸肽的浓度。
实施例4
试剂盒的制备和使用方法
1、胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体的制备:用浓度为50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含有的聚苯乙烯微球的重量浓度为3%的溶液,然后在每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在26℃的条件下反应1小时,反应完成后,加入2-甲基-1,3-丁二烯,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后使用超声分散仪进行超声分散,再使用离心机,在25000rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后边搅拌边加入等体积的抗环瓜氨酸肽抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的重量浓度为1.0%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白的质量浓度为15g/L时为止,然后在4℃的条件下封闭8小时,即可制备得到胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体;
2、按照下列组分含量配制好试剂:
试剂R1:
磷酸盐缓冲液 185 mmol/L
氯化钠 150 mmol/L
聚乙二醇-2000 5 g/L
叠氮钠 0.6 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
Tris缓冲液 150 mmol/L
牛血清白蛋白 5g/L
丙三醇 10 mmol/L
山梨酸钠 0.6 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 6g/L
其溶剂为纯化水;
3、全自动生化分析仪参数设置
(a)检测温度:37℃;
(b)检测波长:主波长546nm,副波长800nm;
(c)反应时间 :10min,其中,孵育时间 5min,加入试剂 R2 后立即测定读取吸光度A1,5min后读取吸光度 A2,计算吸光度变化 ΔA = A2-A1 ;
(d)反应方向:正反应;
4、检测步骤
(a)取150μl试剂R1与5μl待测样本混匀;
(b)将混匀后的溶液在37℃的条件下孵育5min;
(c)加入50μl试剂R2,立即测定读取吸光度A1,5min后读取吸光度A2,计算吸光度变化ΔA=A2-A1;
(d)根据样本中抗环瓜氨酸肽(CCP)的活性(U/mL)=CS×(U/mL)计算出样本中的抗环瓜氨酸肽的浓度。
表1为实施例1所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒以及实施例2所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒分别对质控品1进行测定的结果,其中质控品1中的抗环瓜氨酸肽的浓度为 30 U/mL,测定结果见表1:
表1
第1次(U/mL) | 第2次(U/mL) | 第3次(U/mL) | 均值(U/mL) | 偏差(%) | |
实施例1 | 32 | 32 | 29 | 31 | 3.33 |
实施例2 | 28 | 29 | 28 | 28.3 | 5.67 |
由表1可知,本发明所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒对质控品1的测定结果偏差较小,因此测定准确度高,而且实施例1为最优的选择。
表2为实施例1所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒以及实施例2所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒分别对质控品2进行测定的结果,其中质控品2中的抗环瓜氨酸肽的浓度为50 U/mL,测定结果见表2:
表2
第1次(U/mL) | 第2次(U/mL) | 第3次(U/mL) | 均值(U/mL) | 偏差(%) | |
实施例1 | 52 | 49 | 53 | 51.3 | 2.60 |
实施例2 | 53 | 52 | 53 | 52.7 | 5.40 |
由表2可知,本发明所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒对质控品2的测定结果偏差较小,因此测定准确度高,而且实施例1为最优的选择。
表3为实施例3所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定以及实施例4所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒对同一待测样本进行的多次反复测定,对所得的结果进行SD和CV的计算,结果如下:
表3
由表3可知本发明所制得的测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒的精密度比较好,而且由表3可知,实施例3为最优的选择。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效,而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下,对上述实施例进行修饰或改变。因此,举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变,仍应由本发明的权利要求所涵盖 。
Claims (9)
1.一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~400 mmol/L
加速剂 5~30 g/L
防腐剂 0.6~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
缓冲液 50~150 mmol/L
稳定剂 5~35 g/L
助悬剂 10~90 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 1~6 g/L
其溶剂为纯化水。
2.根据权利要求1所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,其特征在于:包括彼此独立的试剂R1和试剂R2双液体组分,包括的成分及相应含量为:
试剂R1:
缓冲液 100 mmol/L
无机盐离子 200 mmol/L
加速剂 17g/L
防腐剂 0.7 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
缓冲液 100 mmol/L
稳定剂 20g/L
助悬剂 50mmol/L
防腐剂 0.7 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 3g/L
其溶剂为纯化水。
3.根据权利要求1或2所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,其特征在于:所述的试剂R1中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合,所述的无机盐离子为氯化钠,所述的加速剂为聚乙二醇-2000、聚乙二醇-8000、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种,所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,其特征在于:所述的试剂R2中,所述的缓冲液采用Tris缓冲液、MES缓冲液、磷酸盐缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种或多种的组合,所述的稳定剂采用牛血清白蛋白,所述的助悬剂采用乙二醇、丙三醇或麦芽糖中的一种或多种的组合,所述的防腐剂采用山梨酸钠、苯甲酸钠、叠氮钠、硫柳汞、苯酚中的一种或多种的组合。
5.根据权利要求1或2所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,其特征在于:所述的试剂R2中,所述的胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体的制备方法为:用浓度为50 mmol/L的MES缓冲液将粒径为80-500nm的聚苯乙烯微球稀释成为所含有的聚苯乙烯微球的重量浓度为1%-5%的溶液,然后在每毫升溶液中加入1.0 mg的1-乙基-3-(3-二甲基胺丙基)碳化二亚胺盐酸盐,在20-37℃的条件下反应1小时,反应完成后,加入猝灭剂,使用离心机,在25000 rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后使用超声分散仪进行超声分散,再使用离心机,在25000rpm/min的转速下离心30分钟,去上清,再将沉淀用50 mmol/L的MES缓冲液稀释,然后边搅拌边加入等体积的抗环瓜氨酸肽抗体,直至溶液中聚苯乙烯微球的重量浓度为0.5%-2.0%时为止,最后加入牛血清白蛋白,直至牛血清白蛋白的质量浓度为15g/L时为止,然后在4℃的条件下封闭8-12小时,即可制备得到胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体。
6.根据权利要求5所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒,其特征在于:所述的猝灭剂为2,2’-硫代双镍、2-甲基-1,3-丁二烯、反-1,3-戊二烯中的一种。
7.根据权利要求1或2所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒的制备方法和使用方法,其特征在于:包括以下步骤:
(a)按照下列组分含量配制好试剂:
试剂R1:
缓冲液 15~185 mmol/L
无机盐离子 150~400mmol/L
加速剂 5~30 g/L
防腐剂 0.6~0.8 g/L
其溶剂为纯化水
试剂R2:
缓冲液 50~150 mmol/L
稳定剂 5~35 g/L
助悬剂 10~90 mmol/L
防腐剂 0.6~0.9 g/L
胶乳包被抗环瓜氨酸肽抗体 1~6 g/L
其溶剂为纯化水;
(b)将待测样本与试剂R1和试剂R2混合,使其充分反应;
(c)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值;
(d)根据吸光度变化值计算出样本中的抗环瓜氨酸肽的浓度。
8.根据权利要求7所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒的制备方法和使用方法,其特征在于:步骤(b)中,所述的试剂R1和试剂R2的体积比为3:1。
9.根据权利要求7所述的一种测定抗环瓜氨酸肽的试剂盒的制备方法和使用方法,其特征在于:步骤(b)中,所述的待测样本与试剂R1和试剂R2的总体积的体积比在1:10到1:40之间。
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