CN108500059A - 粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌wz-2及其制备的降解剂和用途 - Google Patents

粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌wz-2及其制备的降解剂和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株粪产碱杆菌WZ‑2，该降解菌从戊唑醇污染的菜地土壤中分离获得。该菌株已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15301。本发明提供的降解菌WZ‑2制成菌悬液后，可以通过直接加入土壤的方式应用于土壤中戊唑醇的降解，能快速的降解土壤中残留的戊唑醇，从而降低戊唑醇对土壤环境的生态压力，起到修复戊唑醇污染土壤，保护生态环境的作用。该菌株的菌剂制备工艺简单，效率高，成本低，无二次污染，具有良好的应用前景。

Description

粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌WZ-2及其制备的降解剂和 用途
技术领域
本发明属于生物降解技术领域，涉及粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌WZ-2及其制备的降解剂和用途。
背景技术
戊唑醇，化学名称为(RS)-1-(4-氯苯基)-4,4-二甲基-3-(1H-1,2,4***-1-基甲基)戊-3-醇，分子式C16H22ClN3O，分子量307.8。其作为一种高效、广谱、内吸性的***类杀菌农药，目前已在世界上50多个国家60多种作物上获得登记，广泛用于防治锈病、白粉病、根腐病等作物叶面和真菌土传病害。戊唑醇1995年在中国取得登记，目前已成我国杀菌剂市场主打品种之一。
随着戊唑醇的大量使用，加之具有较长的稳定性，其在不同土壤中的降解半衰期短则十几天长则达几百天，因此有关该农药的残留问题及其危害日益严重。大量研究表明，戊唑醇对哺乳动物非靶标生物均有一定毒性作用，如可以导致斑马鱼胚胎畸形和干扰内分泌效应；对意大利蜂和玉米赤眼蜂具有高风险性，还具有一定的蓄积毒性作用，引起潜在的慢性中毒。除此之外，戊唑醇对土壤微生物多样性及群落结构具有一定的负效应，对土壤生态***健康具有潜在的毒性效应。因此，消除环境中戊唑醇残留污染已成为科研工作者亟待解决的具有重大经济和社会意义的命题。
利用微生物修复污染土壤因其操作简单、经济适用、环境友好等特点已成为降低土壤中农药残留量的有效措施。迄今，国内外报道多株戊唑醇降解菌，如哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)和荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)等。但本发明所筛选的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)是首次发现对戊唑醇具有降解能力，这对戊唑醇污染土壤的生物修复以及丰富戊唑醇生物降解微生物资源具有重要的意义
发明内容
本发明的目的在于提供一株降解菌WZ-2用于土壤中杀菌剂百菌清，该降解菌从戊唑醇污染的菜地土壤中分离获得。该菌株已于2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号CGMCC NO.15301，经鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)。形态特征及生物学特性为格兰氏染色阴性，不产芽孢，菌落光滑粘稠，呈黄色，不透明。接触氧化酶、硝酸盐还原酶呈阳性，甲基红、吲哚、明胶液化、淀粉水解试验均呈阴性，不产生H2S气体。
以戊唑醇降解菌WZ-2的总DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物(27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGA CTT-3')进行PCR扩增，得到约为1.5kb的扩增产物，测序由上海生工生物工程股份有限公司完成，其核苷酸序列如SEQ IDNO 1所示，该序列已上传GenBank(MG 828834)。
根据GenBank序列同源性比较，戊唑醇降解菌WZ-2与粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalis)同处于一个最小的分支，同源性达到100％。结合菌株的生理生化特性，将戊唑醇降解菌WZ-2初步鉴定为产碱菌属粪产碱菌种，命名为戊唑醇降解菌Alcaligenes faecalisWZ-2)。
通过对戊唑醇降解菌WZ-2的降解特性研究发现：适宜菌株WZ-2生长及其对戊唑醇降解率达到最大时的最适温度是35℃，最适pH为7；在最佳温度和pH条件下，将制备好的吸光度值OD600为1.0的戊唑醇降解菌WZ-2菌悬液按3％的比例接种到含50mg/L戊唑醇的无机盐培养基中，7d内对戊唑醇的降解率达90％以上，在戊唑醇浓度为100mg/L时仍被降解70％以上。
将戊唑醇降解菌ZW-2按107CFU/g的量接种于含50mg/kg戊唑醇的土壤中(棕壤土，pH 6.8，有机质25.3g/kg)，与不接菌的对照相比，戊唑醇的降解半衰期从72.6d缩短至15.3d。说明戊唑醇降解菌WZ-2能够有效的降解土壤中戊唑醇残留。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一株戊唑醇高效降解菌WZ-2，将该菌株制成菌悬液后，可以通过直接加入土壤的方式应用于土壤中戊唑醇的降解，能快速的降解土壤中残留的戊唑醇，从而降低戊唑醇对土壤环境的生态压力，起到修复戊唑醇污染土壤，保护生态环境的作用。该菌株的菌剂制备工艺简单，效率高，成本低，无二次污染，具有良好的应用前景。
附图说明
图1是戊唑醇色谱图；
图2是16S rDNA序列建立的菌株WZ-2***发育树；
图3是WZ-2菌对不同浓度戊唑醇的降解效果；
图4是WZ-2菌在不同温度条件下对戊唑醇的降解效果；
图5是WZ-2菌在不同pH条件下对戊唑醇的降解效果；
图6是WZ-2菌处理与未处理下土壤中戊唑醇的降解。
具体实施方式
下述具体实施例仅用于说明本发明，但不限定本发明的范围，不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体条件的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法或条件
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
戊唑醇降解菌WZ-2的筛选与鉴定
本发明人通过富集培养法分离、筛选戊唑醇降解菌。用来富集戊唑醇的环境样品采集自山东省博形县店子镇般若村受戊唑醇污染的土壤。取土壤样品10g加入100mL基础培养基(配方为：NH4NO3，1.0g；K2HPO4，1.5g；KH2PO4，0.5g；NaCl,0.5g；MgSO4，0.2g；蒸馏水1000mL，pH 7.0)中。同时加入戊唑醇原药母液(丙酮为溶剂)，使戊唑醇最终质量浓度为50mg/L，于30℃、150r/min摇床下进行降解微生物富集培养。培养7d后，按10％的接种量接入到第二批含100mg/L戊唑醇的基础培养基中。相同条件下培养7d后，再按10％的接种量转接到含200mg/L的基础培养基中，继续培养7d。以此类推，不断增加戊唑醇浓度至500mg/L。最后取0.1mL基础培养基发酵液均匀涂抹到含戊唑醇的固体平板中反复进行划线分离，直至得到单菌落，并使用超高效液相色谱质谱法(UPLC-MS/MS)验证其降解效果。
UPLC测定条件如下：
UPLC型号：Agilent 1290Infinity/6460；色谱柱：Agilent Poroshell 120EC-C18反相柱(75mm×2.1mm×2.7μm)；流动相：甲醇：水＝60:40(含0.1％甲酸)；进样量：5μL；柱温：35℃；离子源：电喷雾电离源ESI；扫描方式：正离子源；检测方式：多重反应监测MRM；碎裂电压：75V；碰撞能量19eV；检测离子(m/z):308，70.2。在上述条件下，戊唑醇的保留时间为2.85min，色谱图如图1所示。
降解率计算方法如下：
采用上述方法从土壤样品中成功分离获得一株戊唑醇降解菌，编号为WZ-2，该菌可以利用戊唑醇为唯一碳源生长，7d内对50mg/L的戊唑醇降解率达到90％以上，菌株在含戊唑醇50mg/L的固定培养基中生长很快，菌落光滑粘稠，呈黄色，不透明。通过生理生化特性测定，显示该菌株属于格兰氏阴性菌，接触氧化酶酶、硝酸盐还原酶呈阳性，甲基红、吲哚、明胶液化、淀粉水解试验均呈阴性，不产生H2S气体。进一步设计PCR引物通过16S rDNA鉴定，该菌株基因序列与BLAST在线数据中的Alcaligenes faecalis strain NBRC 13111(GenBank登录号为：NR113606)相似性达到100％。通过与相关菌株的16S rDNA***进化分析(见图2)，将菌株鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)。粪产碱杆菌WZ-2在2018年1月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.15301。
实施例2
降解菌WZ-2对戊唑醇的降解效果
1)菌悬液的制备：将纯化后的菌种WZ-2接入到含100mL的LB液体培养基(胰蛋白胨，10g；酵母提取物，5g；NaCl，10g；蒸馏水1000mL，pH7.0)中，于35℃，150r/min振荡培养至对数期，经5000rpm离心10min收集菌体，用磷酸缓冲液(pH7.0)洗菌3次后重悬，调节吸光度值OD600＝1.0作为菌种悬液。
2)降解性能的测定：分别向100mL含有不同浓度戊唑醇(50、100、200、400、600mg/L)的基础培养液中接菌3mL，以不接菌作为对照，并调节pH为7.0，每个处理三个重复。在30℃，150rpm恒温摇床培养10d，定期取样，经UPLC-MS/MS测定戊唑醇的降解情况。
色谱条件与质量控制：色谱条件如实施例1中所述，质量控制采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。戊唑醇的加标回收率为88.5％～102.3％，相对标准偏差低于8.5％，仪器检测限为0.003μg/g。该方法满足戊唑醇培养液中戊唑醇残留分析方法要求。
结果如图3所示，菌株WZ-2在培养初期对戊唑醇的降解速率较慢，随着培养时间的延长，其降解作用也逐渐增大；当戊唑醇浓度低于100mg/L时，7d内戊唑醇降解达90％以上；随着戊唑醇浓度的增高，其降解速率受到抑制，但当戊唑醇高至600mg/L时，10d内其降解率也可达40％以上。
本实施例说明分离所得到的Alcaligenes faecalis WZ-2可利用戊唑醇为唯一碳源和能源进行生长繁殖，在戊唑醇浓度较低时，该菌具有高效降解戊唑醇的能力。
实施例3
温度、pH对菌株WZ-2降解戊唑醇的影响
温度对菌WZ-2降解戊唑醇的影响：向100mL含有戊唑醇(100mg/L)的基础培养液中接菌3mL，以不接菌作为对照，每组三个重复，分别在20℃、25℃、28℃、30℃、35℃和40℃的恒温摇床中经150r/min培养3d后，经经UPLC-MS/MS测定戊唑醇的降解情况。
pH对菌株WZ-2降解戊唑醇的影响：分别向100mL不同pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)的含100mg/L的培养液中接菌3mL，以不接菌作为对照，每组三个重复。在30℃，150rpm恒温摇床培养3d后，经UPLC-MS/MS测定戊唑醇的降解情况。
实验结果如图4和图5所示，菌WZ-2在不同温度条件下对戊唑醇的降解效果可以看出，当温度在28～40℃范围内，该菌对戊唑醇的降解率均达到80％以上，其中在35℃时，降解率最大，达到92.3％。菌WZ-2在不同pH条件下对戊唑醇的降解效果图可以看出，Alcaligenes faecalis WZ-2菌在不同pH条件下对戊唑醇的降解能力不同。在pH为6～8范围内，该菌对戊唑醇的降解率均达到80％以上，在pH为5和9时降解率受到较大抑制。
本实施例说明，菌株Alcaligenes faecalis WZ-2可在在较宽的温度和pH范围内较好的降解戊唑醇，为其在不同复杂环境中的应用提供了保证。
实施例4
菌株Alcaligenes faecalis WZ-2对土壤中戊唑醇的降解效果
土壤取自青岛农业大学胶州农业示范园，土壤为棕壤土，理化性质为：pH，6.32；总有机碳，17.5g/kg；总氮，1.35g/kg；总磷，1.04g/kg。本实验共设置二个处理：自然土+戊唑醇(SW)、自然土+戊唑醇+降解菌WZ-2(SWJ)。每个处理设置3次重复，土壤中戊唑醇含量为50mg/kg，加菌土壤中加入菌WZ-2的量为107cfu/g土壤。所有土壤均调节土壤含水量至最大持水量的60％左右，置于30℃恒温生化培养箱中黑暗培养，培养过程中损失的水分每天通过称重法进行补充。处理后分别于0、3、7、14、21、28、45、60d取样检测土壤中戊唑醇的残留量。
土壤中戊唑醇的提取与净化：称取2g土壤，将其放入10mL离心管中，加入5mL乙腈，涡旋2min，然后加入1g无水MgSO4，再涡旋2min，4000r/min离心10min；移取上清液3mL至另一个10mL离心管中，添加N-丙基乙二胺30mg(PSA)，20mg石墨化碳黑(GCB)，1000mg MgSO4、200mg NaCl，涡旋2min，4000r/min离心10min；上清液过0.22μm滤膜后供UPLC-MS/MS测定。
戊唑醇在不同处理土壤中的降解结果如图6所示。随着时间的延长，戊唑醇在土壤中降解率逐渐升高，残留浓度逐渐降低。接种戊唑醇降解菌WZ-2的土壤中，戊唑醇的降解半衰期从72.6d降低至15.3d。由此可见，添加戊唑醇降解菌WZ-2能够明显加快土壤中戊唑醇的降解，对戊唑醇污染土壤起到良好的修复效果。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌WZ-2及其制备的降解剂和用途
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1442
<212> DNA
<213> 粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalisWZ-2)
<400> 1
tccatcgggg atgctttaca catgcagtcg aacggcagcg cgagagagct tgctctcttg 60
gcggcgagtg gcggacgggt gagtaatata tcggaacgtg cccagtagcg ggggataact 120
actcgaaaga gtggctaata ccgcatacgc cctacggggg aaaggggggg atcgcaagac 180
ctctcactat tggagcggcc gatatcggat tagctagttg gtggggtaaa ggctcaccaa 240
ggcaacgatc cgtagctggt ttgagaggac gaccagccac actgggactg agacacggcc 300
cagactccta cgggaggcag cagtggggaa ttttggacaa tgggggrarc cctgatccag 360
ccatcccgcg tgtatgatga aggccttcgg gttgtaaagt acttttggca gagaagaaaa 420
ggtatctcct aatacgagrt actgctgacg gtatctgcag aataagcacs ggctaactac 480
gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtg caagcgttaa tcggaattac tgggcgtaaa 540
gcgtgtgtag gcggttcgga aagaaagatg tgaaatccca gggctcaacc ttggaactgc 600
atttttaact gccgagctag agtatgtcag aggggggtag aattccacgt gtagcagtga 660
aatgcgtaga tatgtggagg aataccgatg gcgaaggcag ccccctggga taatactgac 720
gctcagacac gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgcccta 780
aacgatgtca actagctgtt ggggccgtta ggccttagta gcgcagctaa cgcgtgaagt 840
tgaccgcctg gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca 900
caagcggtgg atgatgtgga ttaattcgat gcaacgcgaa aaaccttacc tacccttgac 960
atgtctggaa agccgaagag atttggccgt gctcgcaaga gaaccggaac acaggtgctg 1020
catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc 1080
cttgtcatta gttgctacgc aagagcactc taatgagact gccggtgaca aaccggagga 1140
aggtggggat gacgtcaagt cctcatggcc cttatgggta gggcttcaca cgtcatacaa 1200
tggtcgggac agagggtcgc caacccgcga gggggagcca atctcagaaa cccgatcgta 1260
gtccggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc 1320
agaatgtcgc ggtgaatacg ttcccgggtc ttgtacacac cgcccgtcac accatgggag 1380
tgggtttcac cagaagtagg tagcctaacc gtaaggaggg cgctaccacg gtggattccg 1440
cg 1442
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (7)

1.粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)的用途，用于降解戊唑醇。
2.一株粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC NO.15301。
3.粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2的用途，用于降解戊唑醇。
4.权利要求3所述的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2的用途，用于降解土壤中的戊唑醇。
5.一种降解戊唑醇的降解剂，有效成分为粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2。
6.权利要求5所述的降解戊唑醇的降解剂，制备方法如下：将纯化后的粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2接入到pH7.0的LB液体培养基中，于35℃，150r/min振荡培养。
7.一种去除戊唑醇的方法，使用粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)WZ-2进行降解。
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