CN117050922B - 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 - Google Patents
一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117050922B CN117050922B CN202311311036.7A CN202311311036A CN117050922B CN 117050922 B CN117050922 B CN 117050922B CN 202311311036 A CN202311311036 A CN 202311311036A CN 117050922 B CN117050922 B CN 117050922B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fluorine
- strain
- difluorobenzonitrile
- benzonitrile
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N benzenecarbonitrile Natural products N#CC1=CC=CC=C1 JFDZBHWFFUWGJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 123
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 47
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 47
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 33
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- -1 benzonitrile compound Chemical class 0.000 title claims abstract description 11
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 title abstract description 9
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- BTBFCBQZFMQBNT-UHFFFAOYSA-N 3,4-difluorobenzonitrile Chemical compound FC1=CC=C(C#N)C=C1F BTBFCBQZFMQBNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 239000002689 soil Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 claims abstract description 21
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 14
- BNBRIFIJRKJGEI-UHFFFAOYSA-N 2,6-difluorobenzonitrile Chemical compound FC1=CC=CC(F)=C1C#N BNBRIFIJRKJGEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- REIVHYDACHXPNH-UHFFFAOYSA-N 2-fluoro-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=CC=C(C#N)C(F)=C1 REIVHYDACHXPNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- BJBXUIUJKPOZLV-UHFFFAOYSA-N 4-fluoro-2-methylbenzonitrile Chemical compound CC1=CC(F)=CC=C1C#N BJBXUIUJKPOZLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 claims abstract description 9
- 241000588986 Alcaligenes Species 0.000 claims abstract description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 19
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 13
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 10
- GDHXJNRAJRCGMX-UHFFFAOYSA-N 2-fluorobenzonitrile Chemical compound FC1=CC=CC=C1C#N GDHXJNRAJRCGMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000000306 component Substances 0.000 claims description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 5
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 claims description 4
- 239000003415 peat Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 3
- 150000008359 benzonitriles Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 3
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 3
- 238000005067 remediation Methods 0.000 claims description 3
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 11
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 9
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 5
- 238000003900 soil pollution Methods 0.000 description 4
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 4
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 3
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940005347 alcaligenes faecalis Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 2
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 3,5-dibromo-4-hydroxybenzonitrile Chemical compound OC1=C(Br)C=C(C#N)C=C1Br UPMXNNIRAGDFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588813 Alcaligenes faecalis Species 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- TYIYMOAHACZAMQ-CQSZACIVSA-N Cyhalofop-butyl Chemical group C1=CC(O[C@H](C)C(=O)OCCCC)=CC=C1OC1=CC=C(C#N)C=C1F TYIYMOAHACZAMQ-CQSZACIVSA-N 0.000 description 1
- 239000005502 Cyhalofop-butyl Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000005562 fading Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000004973 liquid crystal related substance Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000004381 surface treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000033772 system development Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000004065 wastewater treatment Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B09—DISPOSAL OF SOLID WASTE; RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C—RECLAMATION OF CONTAMINATED SOIL
- B09C1/00—Reclamation of contaminated soil
- B09C1/10—Reclamation of contaminated soil microbiologically, biologically or by using enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F3/00—Biological treatment of water, waste water, or sewage
- C02F3/34—Biological treatment of water, waste water, or sewage characterised by the microorganisms used
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F2101/00—Nature of the contaminant
- C02F2101/30—Organic compounds
- C02F2101/36—Organic compounds containing halogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C02—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F—TREATMENT OF WATER, WASTE WATER, SEWAGE, OR SLUDGE
- C02F2101/00—Nature of the contaminant
- C02F2101/30—Organic compounds
- C02F2101/38—Organic compounds containing nitrogen
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/05—Alcaligenes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Environmental & Geological Engineering (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Soil Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Hydrology & Water Resources (AREA)
- Water Supply & Treatment (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用。所述含氟苯腈降解菌为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌株名为GHL4，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26074。应用所述粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)GHL4制备得到的降解菌剂生产成本低，使用方便，降解效果好，可使废水和土壤中的3,4‑二氟苯腈、2,6‑二氟苯腈、2‑氟‑4‑羟基苯腈、4‑氟‑2‑甲基苯腈的浓度降低95%以上，解决了含氟苯腈对水体和土壤环境的污染问题。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物领域，具体涉及一种含氟苯腈类化合物高效降解菌及其在环境治理中的应用。
背景技术
含氟芳香族化合物是目前增长较为迅速的精细化学品，广泛应用于医药、农药、染料等领域，具有广阔的发展前景。与不含氟芳香族化合物相比，含氟芳香族化合物不但具有更强的稳定性和生物活性，还具有较高的脂溶性和疏水性，其在药物应用领域具有毒性低、用量少、药效高、代谢能力强等特点。在染料方面，引入氟原子后，使染物色泽鲜艳、不易褪色等优点。
腈类物质是一类含有氰基基团的有机化合物，天然存在于在土壤、植物和微生物中，也可以通过人工合成应用于工业生产。苯腈因其在工业生产中的广泛应用被认为是最重要的腈类物质之一，它可以作为溶剂和中间体广泛应用于药物、香水、染料、橡胶、铂织品、树脂等，但大多数腈类化合物具有高毒性，一旦经由工业生产进入环境后将对人体健康和环境保护带来严重的危害。含氟苯腈具有广泛的应用前景，但是，由于卤素元素的电负性极强，易于生命细胞中的酶***结合，导致这类化合物稳定性高、毒性强，易在环境中迁移，造成土壤和水体严重的面源污染，一旦排入环境会环境造成危害。3,4-二氟苯腈是合成多种医药、染料、液晶材料的有机合成原料，也是选择性除草剂氰氟草酯的重要中间体。3,4-二氟苯腈还可以用作有机溶剂，它在化学分析、有机合成和表面处理等领域有广泛的应用。它还可以用于制备高分子材料，是一种重要的有机化合物，具有广泛的应用前景。随着科技的不断发展，它的应用领域还将不断扩大。但是，由于其毒性较强，使用时必须注意安全，避免对人体和环境造成危害。目前对于腈类化合物的降解报道主要集中在苯甲腈和溴苯腈，还未见对于含氟苯腈化合物降解情况的报道。相比于化学降解法，生物降解法具有高效性、高选择性、反应条件温和、环境污染小等优点，因此筛选含氟苯腈降解菌对被含氟苯腈污染的环境修复具有重要作用。
发明内容
发明目的：本发明针对环境中的由含氟苯腈造成的水污染与土壤污染的问题，对现有含氟苯腈生物降解技术的空白提供一株含氟苯腈污染修复菌，使用本菌株可以高效降解土壤和水体中3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈，快速修复含氟苯腈导致的水污染和土壤污染问题，生产成本较低。本发明还提供一种污染修复菌剂，即应用所述含氟苯腈污染修复菌制备得到一种新的菌剂。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一株含氟苯腈降解菌，菌株分类号为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌株名为GHL4，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.26074，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明进一步提出了一种菌剂，其包含上述含氟苯腈降解菌。
本发明还公开了上述菌剂的制备方法，包括如下步骤：
（1）将含氟苯腈降解菌GHL4的平板菌种接种于LB液体培养基摇瓶中，置于恒温摇床中，30~35℃、160~180r/min振荡培养至对数期；
（2）将步骤（1）培养好的菌液按种子罐培养基的体积比的8%～10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
（3）将达到对数期的种子液按照体积比8%～10%的接种量接种入生产罐培养，发酵完成后培养液出罐得到液体剂型的菌剂，或采用泥炭吸附得到固体剂型的菌剂。在一种实施方式中，可以直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
其中，步骤（1）中，LB液体培养基组份为：酵母膏4~6g/L、蛋白胨8~10g/L、NaCl 8~10g/L，所有培养基均在121℃高压蒸汽灭菌20 min，待冷却后使用。
种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖7~9g/L，酵母膏4~6g/L，K2HPO40.8~1.2g/L，NaCl 4~6g/L，CaCO31.5~2.5g/L，MgSO4 0.1~0.3g/L，大豆油0.1~0.12% (v/v)，pH值7.2~7.5，生产罐的培养基成分与种子罐相同。
其中，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h，发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上。
本发明进一步提出了上述含氟苯腈降解菌或者菌剂在降解含氟苯腈废水中的应用，其中，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种。
优选地，所述废水中含氟苯腈含量为100~1600mg/L；所述废水的盐浓度为0g/L~30g/L。
本发明进一步提出了上述含氟苯腈降解菌或者权菌剂在含氟苯腈污染土壤修复中的应用，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种，含氟苯腈在土壤中的含量为50~200mg/kg。
具体应用时，将含氟苯腈降解菌GHL4菌株接种于LB 液体培养基中，振荡培养至对数期，得到降解菌悬液；将上述降解菌悬液按土壤5~8%wt的接种量接入含氟苯腈污染土壤中。
有益效果：本发明的粪产碱菌(Alcaligenes faecalis) GHL4能够高效、快速降解含氟苯腈，该菌能够降解土壤和废水中的3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈，污染物降解率在95%以上。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低、使用方便、修复效果好的优点，适合在全国受含氟苯腈污染的化工园区、农业生产区等地推广使用。
附图说明
图1是本发明菌株GHL4的菌落形态图；
图2是本发明菌株GHL4的***发育树；
图3是本发明菌株GHL4对3,4-二氟苯腈的生长利用和降解情况；
图4是温度对本发明菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响效果图；
图5是pH对本发明菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响效果图；
图6是NaCl浓度对本发明菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响效果图；
图7是本发明菌株GHL4对不同含氟苯腈的降解效果图；
图8是本发明菌株GHL4对土壤中含氟苯腈的降解效果图。
实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
实施例1 降解菌株的分离、筛选与鉴定。
本发明提供一种能高效降解含氟苯腈的菌株GHL4及其生产的菌剂，分离自某化工园区污水处理厂的活性污泥。
具体的菌株分离筛选方法为：取污水处理厂生化池的活性污泥5mL加入到95mL含有200mg/L 3,4-二氟苯腈的无机盐培养基中，30℃、160r/min摇床培养5天；5天后，以5%（V/V）的接种量转接到新鲜同一无机盐培养基中，连续富集转接培养4次，获得富集液。
将第五代富集液在含有200mg/L 3,4-二氟苯腈的无机盐固体培养基上，稀释涂布，30℃培养4d。用接种环挑选其中长势较好、数量较多、且呈单个分布的菌落，采用梯度平板划线法划线分离纯化。将分离纯化后的菌株转接至LB固体培养基上于4℃冰箱内保存备用。
无机盐培养基成分：NaCl 1.0g/L、(NH4)2SO41.0g/L、K2HPO41.5 g/L、KH2PO4 0.5g/L、MgSO4•7H2O 0.2g/L和水1L，pH 7.0，固体培养基中加入1.5%的琼脂，培养基121℃灭菌30min。
LB固体培养基组分为：酵母膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，加入1.5% 的琼脂，pH 7.0，培养基121℃灭菌30min。
该菌株经活化之后，在固体营养培养基制成的平板上生长24h后，能形成直径为0.3~0.5cm淡黄色、边缘光滑、表面光滑、中间凸起、透明度低的菌落。对菌株进行革兰氏染色，染色的菌体颜色变为红色，表明菌株GHL4为革兰氏阴性菌。
将菌株GHL4的16S rRNA基因序列在GenBank数据库的NCBI核酸数据进行比对分析，结合16S rRNA基因***发育分析（图2），菌株GHL4鉴定为粪产碱菌 (Alcaligenes faecalis)，并于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.26074，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
实施例2 降解菌剂的制备。
将本发明的含氟苯腈降解菌GHL4的菌种在LB固体平板培养基上活化，平板菌种接种于含有100mL LB液体培养基的250mL摇瓶中，置于恒温摇床中，30℃、160r/min振荡培养至对数期，准备接种种子罐。种子罐100L，投料量80L，所用培养基配方为：葡萄糖8g/L，酵母膏5g/L，K2HPO41g/L，NaCl 5g/L，CaCO32g/L，MgSO4 0.2g/L，大豆油0.1% (v/v)，pH值7.2~7.5。投料完成后在1.1Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的菌液按种子罐培养基的体积比的10%的接种量接种入种子罐，无菌空气的通气量为0.5m3/min，搅拌速度为200r/min，培养温度为30℃，培养至对数生长期备用。达到对数期的种子液按照体积比10%的接种量接种入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量1吨，投料量为0.08～0.1吨。投料后的生产罐，在1.1 Kg/cm3的压力下、121℃条件下高压湿热灭菌，冷却至30℃后，通无菌空气，通气量为0.5m3/min，搅拌速度为200r/min，培养温度控制在30℃，整个工艺培养流程时间为96h，发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL左右。
发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
实施例3 菌株GHL4对3,4-二氟苯腈的生长利用和降解。
将实施例1筛选获得的菌株GHL4单菌落接种至LB液体培养基中，在30℃、160 r/min条件下培养至对数生长期，所得菌液于6000r/min离心5min收集菌体，用灭菌的纯水洗涤菌体3次，制成OD600约为1.0的菌悬液作为种子液。将种子液按体积5%（V/V）的接种量接种到的3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，调节培养基pH为7。在30℃、160r/min的摇床中培养，定时取样检测菌体浓度（OD600值）和3,4-二氟苯腈浓度，绘制菌株生长曲线和污染物降解曲线（如图3所示）。
由图3可知，当3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L时，菌株可较快适应生长环境，在8h开始快速生长，菌株的生长曲线与3,4-二氟苯腈的降解规律基本一致，随着菌株的生长，3,4-二氟苯腈的浓度逐渐降低，说明菌株GHL4可以利用废水中的3,4-二氟苯腈进行生长代谢，从而降解废水中的3,4-二氟苯腈，24h时菌株GHL4对污染物的降解率达97.8%，菌株浓度为初始浓度的16倍。
实施例4 环境因素对菌株GHL4降解3,4-二氟苯腈的影响。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，然后分别置于不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃ 和40℃)的摇床中，160r/min培养24h，取样测定3,4-二氟苯腈浓度，计算其降解率。结果如图4所示，菌株GHL4在15~40℃对3,4-二氟苯腈的降解率均在90%以上，最适降解温度为30℃。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，调节无机盐培养基的pH分别为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，在30℃、160r/min的摇床中培养24h，取样测定3,4-二氟苯腈浓度，计算其降解率。结果如图5所示，菌株GHL4对碱性环境的耐受性优于对酸性环境的耐受性，当环境pH<6时，菌株GHL4对3,4-二氟苯腈的降解效果明显降低，菌株GHL4在pH为7.0时对3,4-二氟苯腈的降解效果最好。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到3,4-二氟苯腈浓度为200mg/L的无机盐培养基中，调节无机盐培养基中NaCl浓度分别为0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L和30g/L，在30℃、160r/min的摇床中培养24h，取样测定3,4-二氟苯腈浓度，计算其降解率。结果如图6所示，菌株GHL4对盐度有较好的耐受性，在NaCl浓度为0~30g/L时菌株对3,4-二氟苯腈的降解率均在90%以上。
实施例5 菌株GHL4对不同含氟苯腈的降解。
按体积5%（V/V）的接种量将菌株GHL4的种子液接种到含不同浓度污染物（3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈）的无机盐培养基中，培养基中污染物的初始浓度分别为100mg/L、400mg/L、700mg/L、1000mg/L、1300mg/L、1600mg/L，在30℃、160r/min的摇床中培养48h，取样测定各污染物浓度并计算降解率，如图7所示。
由图7可知，在各污染物浓度为100~1600mg/L的范围内，菌株GHL4对其的降解率随着污染物的浓度增大呈现先增大后减小的趋势，当污染物浓度为400mg/L时降解率最高，随着污染物的浓度提高菌株GHL4活性略受抑制，但各污染物降解率仍均在90%以上。这一结果表明菌株GHL4可以高效的降解3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈等含氟苯腈，为难降解腈类物质的污染治理提供了一种优良的微生物种质资源。
实施例6 菌株GHL4在土壤修复中的应用。
在田间选取未经污染的表层土壤（0～20cm），准确称取每份200g土壤，在每一份中分别加入3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈，使其质量终浓度分别为50、100、150和200mg/kg，按土壤5wt%的接种量将菌株GHL4的菌悬液接种到各待降解土壤中，并设不接菌的土壤为对照，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，7天后测定其在土壤中的残留量，结果见表1所示。结果表明，菌株GHL4可以有效去除土壤中的含氟苯腈，可以有效治理土壤污染问题。
表1 菌株GHL4去除土壤中含氟苯腈效果
实施例7 不同剂量菌株GHL4对土壤中含氟苯腈的降解。
在田间选取未经污染的表层土壤（0～20cm），准确称取每份200g土壤，在每一份中分别加入100mg/kg的3,4-二氟苯腈，分别按土壤5wt%、6wt%、7wt%和8wt%的接种量将菌株GHL4的菌悬液接种到各待降解土壤中，置于30℃培养箱中黑暗条件下恒温培养，7天后测定其在土壤中的残留量，结果如图8所示。结果表明，当菌悬液质量浓度在5%~8%范围内时，菌株GHL4可以快速高效去除土壤中的含氟苯腈，随着菌悬液质量浓度增加，菌株对含氟苯腈的降解率不断增大。
本发明提供了一种含氟苯腈降解菌及其在废水治理与土壤修复中的应用，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。
Claims (10)
1.一种含氟苯腈类化合物降解菌，其特征在于，所述降解菌分类号为粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)，菌株名为GHL4，于2022年11月07日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌种保藏编号为CGMCC No.26074。
2.一种菌剂，其特征在于，包含权利要求1所述的含氟苯腈类化合物降解菌。
3.权利要求2所述的菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将含氟苯腈类化合物降解菌GHL4的平板菌种接种于LB液体培养基摇瓶中，置于恒温摇床中，30~35℃、160~180r/min振荡培养至对数期；
（2）将步骤（1）培养好的菌液按种子罐培养基体积比的8%～10%的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，获得种子液；
（3）将达到对数期的种子液按照体积比8%～10%的接种量接种入生产罐培养，发酵完成后培养液出罐得到液体剂型的菌剂，或采用泥炭吸附得到固体剂型的菌剂。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，LB液体培养基组份为：酵母膏4~6g/L、蛋白胨8~10g/L、NaCl 8~10g/L。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖7~9g/L，酵母膏4~6g/L，K2HPO4 0.8~1.2g/L，NaCl 4~6g/L，CaCO3 1.5~2.5g/L，MgSO4 0.1~0.3g/L，大豆油0.1~0.12% (v/v)，pH值7.2~7.5，生产罐的培养基成分与种子罐相同。
6.根据权利要求3所述的菌剂的制备方法，其特征在于，在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为0.45～0.60m3/min，搅拌速度为180~240r/min，培养温度为30~35℃，全流程培养时间为96~108h，发酵结束后发酵液中有效活菌数为109个/mL以上。
7.权利要求1所述的含氟苯腈类化合物降解菌或者权利要求2所述的菌剂在降解含氟苯腈废水中的应用，其中，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述废水中含氟苯腈含量为100~1600mg/L；所述废水的盐浓度不高于30g/L。
9.权利要求1所述的含氟苯腈类化合物降解菌或者权利要求2所述的菌剂在含氟苯腈污染土壤修复中的应用，所述含氟苯腈为3,4-二氟苯腈、2,6-二氟苯腈、2-氟-4-羟基苯腈、4-氟-2-甲基苯腈中的任意一种或多种，含氟苯腈在土壤中的含量为50~200mg/kg。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将含氟苯腈类化合物降解菌GHL4菌株接种于LB 液体培养基中，振荡培养至对数期，得到降解菌悬液；将上述降解菌悬液按土壤5~8wt%的接种量接入含氟苯腈污染土壤中。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311311036.7A CN117050922B (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311311036.7A CN117050922B (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117050922A CN117050922A (zh) | 2023-11-14 |
| CN117050922B true CN117050922B (zh) | 2023-12-08 |
Family
ID=88657535
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311311036.7A Active CN117050922B (zh) | 2023-10-11 | 2023-10-11 | 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117050922B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0348901A2 (en) * | 1988-06-27 | 1990-01-03 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing optically active alfa-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor |
| CN102791855A (zh) * | 2009-11-16 | 2012-11-21 | 希鲁士股份有限公司与帕滕特有限合资公司 | 全细胞生物催化剂 |
| WO2014145883A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Spogen Biotech Inc. | Plant growth-promoting bacteria and methods of use |
| WO2015046664A1 (ko) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 주식회사 두산에코비즈넷 | 질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스 이비엔-엔에스13(케이씨티씨 12471비피) |
| CN108500059A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-07 | 青岛农业大学 | 粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌wz-2及其制备的降解剂和用途 |
| CN108977399A (zh) * | 2018-09-13 | 2018-12-11 | 陕西理工大学 | 一株粪产碱杆菌及其应用 |
| CN113862199A (zh) * | 2021-11-11 | 2021-12-31 | 南京农业大学 | 一种苯腈类除草剂的降解菌株及其生产的菌剂 |
| CN116042493A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-05-02 | 江苏聚庚科技股份有限公司 | 蜡样芽胞杆菌、菌剂、其在处理化工废水中的应用和处理装置 |
| CN117025490A (zh) * | 2023-10-09 | 2023-11-10 | 江苏聚庚科技股份有限公司 | 一株用于土壤修复的菌株、菌剂及其应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9573980B2 (en) * | 2013-03-15 | 2017-02-21 | Spogen Biotech Inc. | Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots |
| MX2018011243A (es) * | 2016-03-16 | 2018-11-22 | Spogen Biotech Inc | Metodos para promover la salud de las plantas usando enzimas libres y microorganismos que sobreexpresan enzimas. |
| US11124438B2 (en) * | 2020-01-20 | 2021-09-21 | Chio Kang Medical, Inc. | Alcaligenes faecalis for degrading ethylene oxide |
-
2023
- 2023-10-11 CN CN202311311036.7A patent/CN117050922B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0348901A2 (en) * | 1988-06-27 | 1990-01-03 | Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha | Process for producing optically active alfa-substituted organic acid and microorganism and enzyme used therefor |
| CN102791855A (zh) * | 2009-11-16 | 2012-11-21 | 希鲁士股份有限公司与帕滕特有限合资公司 | 全细胞生物催化剂 |
| WO2014145883A1 (en) * | 2013-03-15 | 2014-09-18 | Spogen Biotech Inc. | Plant growth-promoting bacteria and methods of use |
| WO2015046664A1 (ko) * | 2013-09-27 | 2015-04-02 | 주식회사 두산에코비즈넷 | 질산화능 및 탈질능이 우수한 알칼리지너스 패칼리스 이비엔-엔에스13(케이씨티씨 12471비피) |
| CN108500059A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-07 | 青岛农业大学 | 粪产碱杆菌的用途、粪产碱杆菌wz-2及其制备的降解剂和用途 |
| CN108977399A (zh) * | 2018-09-13 | 2018-12-11 | 陕西理工大学 | 一株粪产碱杆菌及其应用 |
| CN113862199A (zh) * | 2021-11-11 | 2021-12-31 | 南京农业大学 | 一种苯腈类除草剂的降解菌株及其生产的菌剂 |
| CN116042493A (zh) * | 2023-03-10 | 2023-05-02 | 江苏聚庚科技股份有限公司 | 蜡样芽胞杆菌、菌剂、其在处理化工废水中的应用和处理装置 |
| CN117025490A (zh) * | 2023-10-09 | 2023-11-10 | 江苏聚庚科技股份有限公司 | 一株用于土壤修复的菌株、菌剂及其应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Optimization of nitrilase production from Alcaligenes faecalis MTCC 10757 (IICT-A3): effect of inducers on substrate specificity;Y V D Nageshwar等;Bioprocess and Biosystems Engineering;第515-523页 * |
| 一株高效废水除臭粪产碱菌的筛选及除臭特性研究;贺琨等;安全与环境学报;第223-227页 * |
| 粪产碱菌对阿魏酸厌氧降解的影响;谢婷等;中国酿造;第66-70页 * |
| 苯酚降解菌JS-1的筛选及降解特性的初步研究;高雁辉;黄晶心;张辉;李琳;肖明;;上海师范大学学报(自然科学版)(第01期);第74-79页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN117050922A (zh) | 2023-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2020103347A4 (en) | Preparation Method of Sodium Alginate Composite Immobilized Microbial Inoculum Capable of Remarkably Improving Degradation Efficiency of Quinclorac | |
| US9404163B2 (en) | Pseudomonas putida strain as well as its microbial inoculum and application | |
| CN110643548B (zh) | 一株降解苯胺的浅黄微杆菌及其应用 | |
| CN101857846B (zh) | 一种红球菌及其菌剂与应用 | |
| CN103627653B (zh) | 一种赤红球菌菌株及其在含有机污染物的废水处理中的应用 | |
| CN103243060B (zh) | 一种二氯喹啉酸降解菌及其应用 | |
| CN109182178B (zh) | 一株具有铬耐受和Cr(VI)去除能力的菌株及其在原位修复中轻度铬污染土壤中的应用 | |
| CN106754578B (zh) | 一株氯霉素降解菌株lms-cy及其生产的菌剂和应用 | |
| WO2021077453A1 (zh) | 一种施氏假单胞菌、采用该施氏假单胞菌制得的复合菌剂及该复合菌剂的应用 | |
| CN117603888B (zh) | 一株蜡样芽孢杆菌及其在养殖尾水处理中的应用 | |
| CN109929777B (zh) | 一种盐单胞菌株h6、组合物及其在耐盐促生中的应用 | |
| CN101811779B (zh) | 耐盐净污菌剂的制备方法及其菌剂 | |
| CN106591169B (zh) | 一种n-甲基吡咯烷酮降解芽孢杆菌nmp-2及其应用 | |
| CN110846250A (zh) | 一株高产γ-PGA的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN101935626B (zh) | 一种二甲基甲酰胺降解菌及其生产的菌剂 | |
| CN115786191B (zh) | 一株弗氏柠檬酸杆菌及其在农药生产废水处理中的应用 | |
| CN117050922B (zh) | 一种含氟苯腈类化合物降解菌及其在环境治理中的应用 | |
| CN101935625A (zh) | 一种三乙胺降解菌及其生产的菌剂 | |
| CN115491338B (zh) | 一种化工中间体降解菌株及其在废水处理中的应用 | |
| CN115386520B (zh) | 一株嗜吡啶红球菌rl-gz01菌株及其应用 | |
| CN114164156B (zh) | 恶臭假单胞菌株及微生物菌剂、去除降解环境中苯的方法 | |
| CN107523515B (zh) | 基于细菌胞外多糖的饮用水重金属吸附剂 | |
| CN114854620A (zh) | 一种n-甲基吡咯烷酮的降解菌株及其应用 | |
| CN108102943A (zh) | 一种高效脱氮微生物及其应用 | |
| CN104195066B (zh) | 一种偶氮染料金橙ii降解菌及其生产的菌剂 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |