CN109762766B - 一株具有吸附重金属、解磷及植物益生的细菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株益生细菌(Edaphovirga sp.)及其应用，具体涉及一株益生细菌及其吸附重金属、解磷及益生的作用，属于微生物资源的开发与利用领域。该菌已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15748。所述的菌株具有较强的重金属吸附作用、解磷作用和促进植物生长、促进植物种子萌发作用。本发明使用该菌株的菌株悬液或菌株发酵液或菌株发酵液提取液或含有该菌株的固体菌剂对植物进行灌根或撒施处理。可单独使用，也可与有机肥混合制成菌肥使用，这将为种植业的高产、稳产、优质打下坚实基础，对发展绿色无公害农业的生产具有非常重要的意义。

Description

一株具有吸附重金属、解磷及植物益生的细菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物资源的开发与利用领域，涉及一株具有吸附重金属、解磷及植物益生的细菌(Edaphovirga sp.)及其应用，具体涉及一株益生细菌及其吸附重金属、解磷及益生的作用。

背景技术

随着社会经济的发展及人类活动逐渐加强，矿产资源开发、电镀、钢铁制造、制革、化学加工和化肥的应用等将高含量的重金属释放到自然环境，造成土壤、水污染问题越来越严重。据统计，到2016年为止，我国受到重金属污染的土壤面积已经达到上万公顷，占全国总耕地面积的1/6。目前我国重金属污染的土壤中含量超标的重金属元素主要包括铬(Cr)、镉(Cd)、铅(Pb)和汞(Hg)等，其通过食物链累积危害人类健康。当人体摄入过量的Cd，可引发骨密度降低和骨折。而当Pb进入人体之后，将引发机体免疫力下降，当累积到一定量之后，就会引起头疼、记忆力衰退和腹疼等症状，严重威胁人类健康。因此，修复土壤重金属污染势在必行。重金属污染物在土壤中移动性极差，滞留时间长，具有生物学上的不破坏性，因此，寻找生态友好的方法修复重金属污染显得尤为重要。目前，重金属污染土壤修复的主要技术手段包括物理、化学和生物修复。前两种方法在短时间内的修复效果较好，但存在工程量大、费用较高等问题，并且容易造成土壤的二次污染。近年来，重金属生物修复技术逐渐成为国内外的研究热点，以绿色、对环境友好和廉价为特点的植物和微生物联合修复技术备受关注。而微生物修复法利用微生物对重金属的吸附、转化和代谢，不但可以降低土壤中重金属的毒性，而且可以改善植物作物根系的微环境，从而降低修复成本，且不容易造成二次污染，还可同时处理地下水及土壤，所受时间、空间上的局限小，是修复重金属污染土壤的重要手段。熊芬等研究发现烟曲霉胞外聚合物(EPS)中的羟基、羧基和C-O-C等基团是与Pb²⁺结合的主要基团。Manasi等利用一株盐单胞菌处理电子工业中富含Cd²⁺废水。

磷是高等植物生长所必需的三大营养元素之一，是植物生长发育过程中各种代谢活动的参与者及形成细胞核蛋白、卵磷脂等不可或缺的元素。而土壤中95％的磷以有机或无机磷化物状态存在，水溶性低，难以被植物直接吸收利用，只有很少比例的速效态磷能被植物直接利用，从而造成了世界范围内磷素的缺乏。农业生产上采用施加大量磷肥来增加土壤磷素的供应，然而磷肥极易与土壤中的Ca²⁺、Al³⁺、Fe²⁺和Fe³⁺螯合形成难溶性磷酸盐，磷肥利用效率仅为5％-25％，且过度使用化肥会破坏土壤结构，污染环境。因此，研究土壤中被固定的无效态磷的分解和释放，对提高土壤中的可溶性磷含量、调节土壤肥力具有重要意义。而解磷微生物能够将植物难以吸收的磷转化为可利用状态，在提高土壤有效磷含量、磷肥利用率及促进作物生长等方面具有显著作用。史发超等筛选了1株可溶解难溶性磷的菌株P83斜卧青霉菌，能显著提高土壤有效磷水平，对玉米生长及增产具有显著作用。因此，解磷微生物资源在未来可持续农林业的发展过程中，必将具有更加广阔的应用前景。

现代农业对植物病害的防治过度依赖于化学农药的使用，不仅对生态环境具有长期的破坏作用,也引起农产品质量下降、农药残留超标、病原菌的耐药性等问题。植物对病害及其他逆境的抗性与苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)等多种酶活性变化有关，而生防菌可诱导这些植物抗病相关防御酶活力产生变化，增强抗病能力。超氧化物歧化酶(SOD)在活性氧代谢中处于重要地位，可防止超氧自由基对生物膜***的氧化，其活性高低是植物细胞自身抗衰老能力强弱的重要标志。过氧化物酶(POD)不仅参与木质素的聚合反应，也是细胞内重要的内源活性氧清除剂，能催化H₂O₂分解成H₂O和O₂。林陈强等发现，枯草芽胞杆菌CS16发酵液及上清液处理香蕉苗均能诱导香蕉叶片中SOD、PAL和POD等防御酶活性变化。因此，通过生物方法提高植物防御酶系的活性来提高植物的抗逆性，减少化学农药的施用对发展绿色无公害农业的生产具有非常重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于：提供一株从中国土壤中分离、筛选到的益生细菌(Edaphovirga sp.)菌株，该细菌具有吸附重金属作用、解磷作用和对植物种子及植株的益生作用。可作为生物肥料使用，达到提高产量和品质的目的，具有成本低、对环境无污染、对人畜安全的特点。

本发明所述的益生细菌通过如下方法获得：

取新疆党参根际土壤，将土样除去石块后称取5g，放入盛有45mL无菌水的三角瓶中，振荡20min，此即10^-1的土壤悬液；逐级稀释至10^-2、10^-3、10^-4、10^-5后，分别取各稀释液涂布于分离平板，倒置，26℃培养1～5d。培养观察，单菌落长出后转接到LB培养基上培养，即获得了菌株(Edaphovirga sp.)。

本发明还提供了所述益生细菌在吸附重金属、解磷和对植物种子及植株的益生中的作用。

本发明可以用益生细菌(Edaphovirga sp.)的菌株悬液或菌株发酵液或菌株发酵液提取液或含有该菌株的固体菌剂对植物进行灌根或撒施处理。

一、所述的菌株悬液制备方法：取岀所述的菌株菌种保藏管,用LB固体培养基进行复苏,20-37℃培养24-48小时，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8。LB固体培养基的配方为：蛋白胨1-5％，酵母浸粉0.1-5％，NaCl 0.1-3％，琼脂1.5-2％，水1000ml。

二、所述的菌株发酵液或菌株发酵液提取液的制备方法：取岀所述的菌株菌种保藏管,用LB固体培养基进行复苏,20-37℃培养24-48小时。在平板上挑取单个菌落接种至50ml LB培养基中,在培养箱中20-37℃震荡培养24-72小时。种子采用1-10％的接种量,接种至LB培养基中扩大培养24-72小时。菌液浓度大于OD₆₀₀＝1即可结束发酵，无菌灌装得到液体成品，或通过冷冻干燥得到粉状成品。将前述所得的菌株发酵液使用等体积乙酸乙酯萃取，收集浓缩萃取液，得菌株发酵液提取液，备用。

三、所述的固体菌剂通过如下方法制备：将上述所得的菌株发酵液接种到固体菌剂培养基中，20-40℃培养，培养1-3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1-3d，得到固体发酵菌剂。固体菌剂培养基的配方，以g/ml计如下，麦麸20-50％，玉米粉10-30％，豆粉1-10％，硝酸钾0.1-1％，磷酸氢二钾0.1-1％，氯化钠0.4-0.7％，碳酸钙1-10％，蒸馏水200ml。

本发明可以将步骤一和步骤二制得的菌剂稀释10-10000倍使用，或将步骤三制得的菌剂直接撒施，或与其他有机肥混合使用。

本发明的益生细菌(Edaphovirga sp.)，已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号：CGMCC No.15748，保藏日期为2018年05月09日。

附图说明

图1为菌株Edaphovirga sp.No.15748对Pb、Cd的吸附率；

图2为700nm波长下采用钼锑抗比色法绘制的磷含量标准曲线；

图3为菌株Edaphovirga sp.No.15748在液体培养基上的溶磷能力。

具体实施方式

下面结合具体实施方式进行详细描述,但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

实施例1菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748重金属吸附作用

重金属耐受能力测试：将菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748在重金属(铅，镉)浓度达到固体LB中终浓度为200mg/L，400mg/L，800mg/L的浓度梯度进行平板耐受实验。

重金属吸附能力测试：将种液按照2％的比例接入重金属浓度为60mg/L的发酵液中，26-35℃条件下120-200r/min发酵48h，对照为不接菌的培养基，三组平行，取24h，48h的发酵液离心后上清3ml，加入3ml的浓硝酸，再加水稀释至45ml，即待测样品。利用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱)来测定发酵液中残留的总的金属离子浓度。

结果如图1所示，菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748在24h对Pb吸附率达到40±1.63％,对Cd吸附率达到37.5±1.2％,48h对Pb吸附率达到70±1.22％,对Cd吸附率达到67.5±2.04％，显示出很强的吸附重金属的能力。

实施例2菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748解磷作用

PKO培养基的制备：磷酸三钙0.5％，蔗糖1-5％，硫酸铵0.1-1％，酵母粉0.01-0.1％，氯化钠0.01-0.1％，无水硫酸镁0.01％g，氯化钾0.02％g，3ml 1％硫酸锰，3ml 1％硫酸亚铁，琼脂18g，蒸馏水1000ml,pH值为7，121℃灭菌30min。

溶磷圈法：将菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748点接种于PKO培养基上，置于26-35℃培养箱中培养3-4d，观察到透明圈，初步确定该菌具有解磷能力。

钼锑抗比色法：将菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748用50ml的液体LB培养基在26-35℃条件下120-200r/min发酵24h作为种液,然后按照1％的接种量接入PKO培养基中相同条件下发酵7天，对照组(CK)按照1％接种量接入无菌水，发酵完毕后离心收集上清液，待测。分别准确吸取5mg/L磷(K₂HPO ₄)标准溶液0、2、4、6、8、10ml于50ml容量瓶中，同时加入与显色测定所用的样品溶液等体积的空白溶液，加入二硝基酚指示剂2-3滴，并用100g/L碳酸钠溶液调节至溶液刚呈微黄色，准确加入5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，即得含磷(P)量分别为0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/L的标准溶液。摇匀，室温放置30min。在波长700nm处，测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg/L)为横坐标，绘制标准曲线，结果如图2所示。将待测液体适量移至50ml容量瓶中，用适量水稀释后，加入二硝基酚指示剂1～2滴，并用100g/L碳酸钠溶液或50ml/L硫酸溶液调节至溶液刚呈微黄色，准确加5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，室温放置30min。紫外分光光度计，波长700nm处，以不接菌体的空白培养基为参比液调零后，测定其吸光度，依据标准曲线计算得相应的含磷量。

结果如图3所示，菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748接种处理培养液中的有效磷含量达525.33±12.26mg/L，显著高于CK，显示出很强的解磷作用。

实施例3菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748对三七种子萌发的促进作用

将三七种子洗净，在无菌条件下，无菌水漂洗3次，无菌吸水纸吸干表面后备用。使用无菌水将所述菌株制备成10⁷、10⁵、10³、10¹cfu/ml的菌悬液，以蒸馏水作为对照组(CK)，备用。每组三个重复，每个重复30粒种子，每组使用菌悬液稀释液或蒸馏水10ml浸泡3-5h。筛网过滤得到种子，20-25℃保湿培养16天，统计三七种子萌发率、测根系活力、芽长、直径及鲜质量，结果见表1、表3。根系活力测定方法为氯化三苯基四氮唑(TTC)法，参照张志良《植物生理学实验指导第三版》。

将菌株(Edaphovirga sp.)No.15748用50ml的液体LB培养基在26-35℃条件下120-200r/min发酵24h作为种液,然后按照1％的接种量接入LB培养基中相同条件下发酵2天，获得OD₆₀₀＝0.3的发酵液，将其离心后取上清液，稀释10²、10⁴和10⁶倍同上述试验步骤处理三七种子，结果见表2、表4。

通过以上测量指标，运用Graphpad软件进行显著性差异分析，结果如表1、表2所示，使用Edaphovirga sp.No.15748菌株处理过的三七种子萌发率均高于对照组，并有显著性差异，说明该菌株对三七种子萌发有促进作用。并且如表3，表4所示，该菌株的菌悬液和发酵液可以显著提高三七种子的生物量及根系活力，对三七的营养吸收起到促进作用，对三七种子有促生作用。

表1.菌株Edaphovirga sp.No.15748菌悬液对三七种子萌发率(％)影响

注：**，P<0.01；***，P<0.001.

表2.菌株Edaphovirga sp.No.15748发酵液对三七种子萌发率(％)影响

注：*，P<0.05；**，P<0.01；

表3.菌株Edaphovirga sp.No.15748菌悬液对三七种子萌发促进作用

注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001.

表4.菌株Edaphovirga sp.No.15748发酵液对三七种子萌发促进作用

注：*，P<0.05；***，P<0.001.

实施例4菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748提高三七植株根系酶活性

菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748固体菌剂处理三七植株，以未加菌株的灭菌固体菌剂培养基为对照组(CK)，分别在菌剂处理后第3、6、9、12、18和30天取样，每组处理选择具有代表性的完整植株，各3组重复。反复冲洗根部，洗净后及时进行各项根指标的测定。根系活力采用TTC法测定；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮蓝四唑(NBT)法测定，以抑制NBT光化还原50％为一个酶活性单位；过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法测定，以每min内变化0.01为1个过氧化物酶活性单位。

结果如表5、6、7所示，以该菌株固体菌剂处理后，与对照组相比，可明显提高三七植株根系活力，有助于植物吸收营养进行代谢；可明显提高防御酶SOD活性和POD活性，可明显提高植物体自身的防御能力。

表5.Edaphovirga sp.CGMCC No.15748菌剂对三七植株根活力[μg/(g·h)]增强作用

注：*，P<0.05；***，P<0.001.

表6.Edaphovirga sp.No.15748菌剂对三七植株SOD活性(U/g)增强作用

注：*，P<0.05；***，P<0.001.

表7.Edaphovirga sp.No.15748菌剂对三七植株POD活性(U/g)增强作用

注：***，P<0.001.

实施例5菌株(Edaphovirga sp.)CGMCC No.15748对植物种子的益生作用

试验方法同实施例3Edaphovirga sp.No.15748菌株菌悬液对三七种子萌发的的影响试验，20-25℃保湿培养1-5天，测定黄瓜、玉米及生菜种子的根系活力、根系SOD及POD活性。

结果如表8、9、10所示，使用Edaphovirga sp.No.15748菌悬液处理过的种子的根系活力、SOD活性和POD活性，均高于对照组，说明菌悬液对植物种子萌发有促进作用。

表8.Edaphovirga sp.No.15748菌悬液对植物种子根活力[μg/(g·h)]增强作用

注：***，P<0.001.

表9.Edaphovirga sp.No.15748菌悬液对植物种子SOD活性(U/g)增强作用

注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001.

表10.Edaphovirga sp.No.15748菌悬液对植物种子POD活性(U/g)增强作用

注：*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001.

序列表

<110> 沈阳药科大学

<120> 一株具有吸附重金属、解磷及植物益生的细菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1564

<212> DNA

<213> Edaphovirga sp.

<400> 1

gctgccttag agtttgatcc tggctcagat tgaacgctgg cggcaggcct aacacatgca 60

agtcgggcgg tagcacgggg gagcttgctc cctgggtgac gagcggcgga cgggtgagta 120

atgtctggga aactgcctga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca 180

tgacctcgca agagcaaagt gggggacctt agggcctcac gccatcggat gtgcccagat 240

gggattagct agtaggtggg gtaatggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag 300

aggatgacca gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg 360

gggaatattg cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc 420

ttcgggttgt aaagcacttt cagcgaggag gaaggcactg ttcctaatag ggatggtgat 480

tgacgttact cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga 540

gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt caattaagtt 600

ggatgtgaaa tccccgggct taacctggga actgcattca aaactgattg gctagagtct 660

tgtagagggg ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtagagatct ggaggaatac 720

cggtggcgaa ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc 780

aaacaggatt agataccctg gtagtccacg ctgtaaacga tgtcgacttg gaggttgtgg 840

ccttgagccg tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc 900

aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa 960

ttcgatgcaa cgcgaagaac cttacctact cttgacatcc acgggatttg gcagagatgc 1020

cttagtgcct tcgggaaccg tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg 1080

aaatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc ctttgttgcc agcgcgtaat 1140

ggcgggaact caaaggagac tgccggtgat aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag 1200

tcatcatggc ccttacgagt agggctacac acgtgctaca atggcatata caaagagaag 1260

caaactcgcg agagccagcg gacctcataa agtatgtcgt agtccggatt ggagtctgca 1320

actcgactcc atgaagtcgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca cggtgaatac 1380

gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatggga gtgggttgca aaagaagtag 1440

gtagcttaac cttcgggagg gcgcttacca ctttgtgatt catgactggg gtgaagtcgt 1500

aacaaggtaa ccgtagggga acctgcggct ggatcacctc ctaagggcag ctcaatcgcc 1560

ctat 1564

Claims (10)

1.一株细菌(Edaphovirga sp.)，其特征在于，保藏编号为：CGMCC No.15748。

2.权利要求1所述的细菌(Edaphovirga sp.)在吸附重金属、解磷中的应用。

3.权利要求1所述的细菌(Edaphovirga sp.)在促进植物生长、促进植物种子萌发中的应用。

4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于，使用细菌(Edaphovirga sp.)的菌株悬液或菌株发酵液或菌株发酵液提取液或含有该菌株的固体菌剂对植物进行灌根或撒施处理。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌株悬液的制备：取岀所述的细菌(Edaphovirga sp.)菌种保藏管,用LB固体培养基进行复苏,20-37℃培养24-48小时，使用蒸馏水将活化好的菌株制备成菌悬液，使用紫外分光光度计在波长600nm下测定菌悬液浓度，所述的菌悬液的浓度为：0.1-0.8。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的菌株发酵液或菌株发酵液提取液的制备：取岀所述的细菌(Edaphovirga sp.)菌种保藏管,用LB固体培养基进行复苏,20-37℃培养24-48小时，在平板上挑取单个菌落接种至50ml LB培养基中,在培养箱中20-37℃震荡培养24-72小时，种子采用1-10％的接种量,接种至LB培养基中扩大培养24-72小时，菌液浓度大于OD₆₀₀＝1即可结束发酵，无菌灌装得到液体成品，或通过冷冻干燥得到粉状成品；将前述所得的菌株发酵液使用等体积乙酸乙酯萃取，收集浓缩萃取液，得菌株发酵液提取液。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的固体菌剂的制备：将权利要求6所述的菌株发酵液接种到固体菌剂培养基中，20-40℃培养，培养1-3d后在无菌条件下进行搅拌，搅拌后继续培养1-3d，得到固体发酵菌剂。

8.根据权利要求5或6或7所述的应用，其特征在于，所述的LB培养基的配方为：蛋白胨1-5％，酵母浸粉0.1-5％，NaCl 0.1-3％，水1000ml；LB固体培养基的配方为：蛋白胨1-5％，酵母浸粉0.1-5％，NaCl 0.1-3％，琼脂1.5-2％，水1000ml。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述固体菌剂培养基的配方为，以g/ml计如下，麦麸20-50％，玉米粉10-30％，豆粉1-10％，硝酸钾0.1-1％，磷酸氢二钾0.1-1％，氯化钠0.4-0.7％，碳酸钙1-10％，蒸馏水200ml。

10.如权利要求2-9任何一项所述的应用，其特征在于，所述的细菌(Edaphovirga sp.)单独作用或与其它有机肥混合使用。

Images