CN104611247A - 一株粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis sp.菌(DQP3)在降解苯酚与喹啉中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株粪产碱菌(Alcaligenes faecalis sp)DQP3及其降解苯酚喹啉双基质的应用。经16sRNA鉴定，该菌株属于粪产碱菌属(Alcaligenes faecalis sp)，菌株保藏编号为CGMCC No：9200。经优化培养条件，接菌量为10％、培养基初始pH为7.0、培养温度为35℃、振荡器转速为150r/min时，DQP3降解同一基质中苯酚和喹啉的效率最高。向培养基中添加适量的葡萄糖(100mg/L)和NH4NO3(200mg/L)作为外加C源和N源时，能够促进DQP3对苯酚和喹啉的降解速率，并且以喹啉作为碳源时的降解效率比其作为氮源时的效率更高。固定化载体筛选试验研究表明用1g/dL的PAC、7g/dL的PVA和3g/dL的SA制成PVA-SA-PAC凝胶小球作为载体固定DQP3，对废水中苯酚和喹啉的去除效果最好。在9h内将300mg/L的喹啉浓度降低70％，24h内能够将500mg/L的苯酚降低80％。

Description

一株粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis sp.菌(DQP3)在降解苯酚与喹啉中的应用
发明领域
本发明涉及一株粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis sp.(DQP3)在降解同一基质中苯酚、喹啉中的应用以及其固定化的研究
背景技术
焦化废水含有芳香族化合物和杂环化合物，是在高温干馏、焦炭炼制、煤气净化、副产品加工及精产品精制的过程中产生的一类比较典型的工业废水。焦化废水的成分较多，其中有机物组分复杂且毒性较大，因此有机物的污染控制是焦化废水的处理难题，制约了处理后的水质达标，是近年来研究热点。
焦化废水的有机物组分中所占比例最高的是苯酚及其衍生物，喹啉及其衍生物的含量位居第二。苯酚和喹啉的水溶性和挥发性较好，容易造成水体和大气污染，对生物体也具有一定的致癌作用。如果将含苯酚和喹啉的废水排放到环境中，会给生态***和人类健康带来严重的危害。因此，研究焦化废水中苯酚和喹啉的降解作用是关键。
申请人从首钢焦化废水二沉池污泥中筛选到一株可高效降解苯酚、喹啉的菌株，经16SrDNA鉴定为粪产碱杆菌Alcaligenes faecalis sp.在降解条件、降解率、固定化方面还未曾有相关报道。该菌经研究对于同一基质中苯酚、喹啉都有很好的降解能力，具有很好的应用前景。
发明内容
本发明涉及一株粪产碱菌Alcaligenes faecalis sp.菌在降解含苯酚、喹啉双基质中苯酚、喹啉中的应用，命名为DQP3，该菌株有良好的降解苯酚、喹啉的能力。该菌株于2014年5月26日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No：9200。
经优化培养条件，接菌量为10％、培养基初始pH为7.0、培养温度为35℃、振荡器转速为150r/min时，DQP3降解同一基质中苯酚和喹啉污染物的效率最高。
向培养基中添加适量的葡萄糖(100mg/L)和NH4NO3(200mg/L)作为外加C源和N源时，能够促进DQP3对苯酚和喹啉的降解速率，并且以喹啉作为碳源时的降解效率比其作为氮源时的效率更高。
固定化载体筛选试验研究表明用1g/dL的PAC、7g/dL的聚乙烯醇(PVA)和3g/dL的海藻酸 钠(SA)制成PVA-SA-PAC凝胶小球作为载体固定DQP3，对废水中苯酚和喹啉的去除效果最好。在9h内将30//0mg/L的喹啉浓度降低70％，24h内能够将500mg/L的苯酚降低80％。
附图说明
图1为菌株DQP3的***发育树图
图2为接种量对DQP3降解能力的影响
图3为初始pH对DQP3单基质污染物降解率的影响
图4为pH对DQP3降解同一基质中苯酚、喹啉降解率的影响
图5为温度对DQP3苯酚和喹啉降解率的影响
图6为转速对DQP3苯酚、喹啉降解率的影响
图7为不同的底物初始浓度对DQP3降解能力的影响
图8为不同初始苯酚浓度下DQP3菌体生长和苯酚降解特性
图9为不同初始喹啉浓度下DQP3菌体生长和喹啉降解特性
图10为不同葡萄糖浓度对DQP3降解喹啉的影响
图11为不同NH4NO3浓度对DQP3降解喹啉的影响
图12为外加C源、N源对DQP3降解喹啉的影响
图13为外加C源、N源对DQP3降解苯酚的影响
图14为不同的固定化载体对苯酚和喹啉的去除效果
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 菌株的筛选 
1、菌株来源与富集
取首钢焦化厂废水处理***的二沉池污泥5mL加入50mL牛肉膏液体培养基，并在其中加入苯酚和喹啉使二者浓度分别为100mg/L和50mg/L。放入恒温振荡器中30℃，150r/min，培养3d，得到富集培养液。
2、菌株的筛选 
将富集的培养液取5mL放入10mL离心管在高速冷冻离心机中10000r/min，23℃，离心5min。取沉淀加入生理盐水混匀后离心，重复两次，以去除残留培养基及代谢产物。将离心得到的沉淀菌体接入无机盐培养基中进行驯化培养，培养基中苯酚的初始浓度为50mg/L、喹啉的初始浓度为25mg/L。驯化，逐渐提高浓度，当浓度达到至苯酚500mg/L，喹啉250mg/L。时进行 平板划线分离菌株。
无机盐培养基：NaCl 0.5g，K2HPO4 0.5g，KH2PO4 0.5g，MgSO4 0.5g，蒸馏水1000mL，pH为7.0
3、菌株的复筛 
驯化所得的若干菌株均能在以苯酚与喹啉为唯一共同碳源的培养基上生长，通过对菌落的大小及分布的多少挑选出4株形态不同的菌株编号DQP1-DQP4。将菌株DQP1-DQP4的培养液分别各取10mL菌悬液分别加入到含200mg/L苯酚和150mg/L喹啉两种污染物的90mL无机盐培养基中，确保每瓶混合液的初始OD600相同，于恒温震荡培养器中进行培养，24h后分别测定四种单菌对苯酚和喹啉的降解情况。筛选出对同一基质中的苯酚和喹啉降解能力最高的一株菌进行保存，用于后续研究。
实施例2 菌株的鉴定 
使用Solarbio细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株的基因组DNA，以此为模板，利用16SrDNA基因通用引物，进行PCR扩增。扩增16SrDNA的引物：
F-primerF27：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’
R-primerR1492：5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
PCR反应体系及条件：
PCR反应条件具体设置为：94℃预变性5 min，94℃变性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，40个循环，72℃最终延伸5 min，4℃保存。取2μL的PCR反应产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳实验。
得到的16SrDNA序列产物由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列登陆NCBI网站，通过Blast程序与Genbank中核酸数据进行比对分析。使用clustalx、MEGA3软件绘制菌株进化发育树(参见附图1)。
实施例3 菌株DQP3降解的最佳条件筛选
影响细菌生长的条件主要有温度，pH值，摇床转速，细菌接种量等。
1.接种量对DQP3降解能力的影响
将DQP3接种量分别为5％，8％，10％三组分别接入含有100mg/L苯酚、50mg/L喹啉的无机盐液体培养基，初始pH为7.0得到不同接种量对DQP3降解能力的影响。结果参见附图2
接种量对DQP3降解同一培养基中苯酚和喹啉污染物的影响如图2所示。10％的接种量24h后可以将苯酚完全降解，对喹啉的降解率也高达80％，均约为5％接种量时的降解率的2.5倍。
2.pH对DQP3降解的影响
以DQP3接种量10％接入含苯酚浓度为150mg/L的唯一碳源培养基初始pH值值分别调节为5、7、9、11。类似，研究不同pH下喹啉为唯一碳源浓度为100mg/L。得出DQP3分别降解苯酚和喹啉为唯一能源的培养基的适宜pH值范围。结果参见附图3
DQP3对苯酚的降解能力受pH影响较大，过酸或过碱都会使苯酚的降解率明显降低。24h后pH为7和9的实验组苯酚的降解率近100％，而pH为5和11的实验组中苯酚降解率低于50％，其中pH为11时降解率更低，小于20％。因此得出DQP3降解苯酚时pH范围应控制在7-9。DQP3降解喹啉过程中受pH影响较弱，在中性和弱酸、弱碱性条件下其对喹啉的降解效率均较高，并且差别不大。而pH过碱(pH＝11)会抑制DQP3对喹啉的降解能力，24h后对100mg/L喹啉的降解率仅为30％左右，远低于在pH为5-7的条件下喹啉的降解率(约为80％)。因此，DQP3在降解喹啉时，pH应控制在5-9的范围内。
由DQP3分别降解两种污染最适pH的实验研究发现，DQP3对两种污染物的单独降解能力较高时的pH范围在5-9。在无机盐培养基添加两种污染物，使溶液中苯酚的浓度为200mg/L、喹啉的浓度为100mg/L。调节溶液的初始pH分别为6、7、8、9(每个pH设三个平行实验取平均值)，得出二者的降解率。结果参见附图4。
DQP3降解同一基质中苯酚、喹啉污染物时的最佳pH范围应为7～9。但当pH＞8时，配制的培养基在灭菌前后均会呈现浑浊，出现白色沉淀，这是因为培养基成分在碱性条件下会发生反应生成不溶性的白色沉淀。此种现象会降低培养基的营养物质含量，并且提高水样的浊度，影响取样后对污染物含量的测定。另外，pH的不同还会影响DQP3降解污染物的过程中培养基的颜色。综合上述结论和分析，在以下的研究中均选择pH＝7.0为DQP3降解同一基质中苯酚、喹啉的最适pH，允许波动范围为7.0～7.5。
③温度对DQP3降解能力的影响
以300mg/L苯酚、150mg/L喹啉配置无机盐培养基，后接入DQP3，设定不同的温度(25 ℃、30℃、35℃、40℃、45℃)得温度对降解效率的影响。结果参见附图5。
温度对DQP3降解苯酚、喹啉的效率也有一定影响，但是没有pH和接种量的影响显著。在30℃～40℃范围内，苯酚的降解率较高，约为80％左右；而40℃时喹啉的降解率(＜60％)明显低于30℃～35℃的条件下的降解效果(80％)。在35℃时，苯酚和喹啉的降解率都达到最大值。而25℃时的两种污染物降解率均低于40℃，高于45℃。
④振荡器转速对DQP3降解能力的影响
以300mg/L苯酚、150mg/L喹啉配置无机盐培养基，后接入DQP3，分别设定转速为50rad/min、70 rad/min、100 rad/min、150 rad/min和200 rad/min，得转速对降解效率的影响。结果参见附图6
转速在50～150rad/min范围内，随着转速的提高，DQP3对苯酚和喹啉的降解率也相应提高，基本呈现线性关系。在转速为150rad/min下，DQP3的降解能力最大，24h后对苯酚的降解率近90％，对喹啉的降解率也高于70％。进一步提高转速，苯酚和喹啉的降解率将不再提高，反而开始大幅降低，近乎于100rad/min条件下的降解率。DQP3降解苯酚和喹啉的试验中振荡器的转速设定为150rad/min较为合适。
⑤底物浓度对DQP3降解能力的影响
以不同浓度的仅含苯酚无机盐培养基(300mg/L、500 mg/L、700 mg/L、900 mg/L)和仅含喹啉无机盐培养基(200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L)为底物的培养基分别接入DQP3。得底物对降解能力的影响。结果参见附图7
DQP3完全降解污染物所需的时间受污染物浓度的影响较大，污染物的浓度越低，则被DQP3完全降解所消耗的时间就越短。24h内DQP3可以完全降解300 mg/L浓度的苯酚，对500mg/L浓度的苯酚的降解率约为60％，但36h内可以完全降解500mg/L浓度以下的苯酚。当苯酚浓度超过700 mg/L时，DQP3的降解效率明显降低24h内对苯酚的降解率仅为30％左右。36h时浓度为700mg/L苯酚的降解率高达80％。当苯酚浓度进一步增大到900mg/L时，DQP3的活性明显受到抑制，48h内的降解率均较低，均在10％以下。DQP3在48h内能高效降解苯酚的浓度限度为700mg/L。
DQP3降解喹啉所需的时间随着喹啉浓度的增大而延长。浓度为200mg/L的喹啉在24h内的降解率迅速达到90％，但24h后到48h内其降解率的增幅较小。浓度分别为300mg/L和400mg/L的喹啉在24h时的降解率则降为50％左右，但24h后喹啉的降解率增速依旧直线上升，36h时300mg/L的喹啉降解率达到90％。当喹啉浓度为500mg/L时，前24h内几乎不被降解，36h时的降解率仅为40％，36h后降解率的增速缓慢，48h时的降解率不到45％。因此，DQP3在48h内高效降解喹啉的浓度限度为400mg/L。DQP3对苯酚单基质的利用能力明显强于喹啉。 菌体能够在短时间内降解苯酚的浓度高于喹啉的浓度。
实施例4 外接碳氮源对喹啉降解的影响
1.DQP3单独降解苯酚、喹啉与自身菌体生长的关系
设定不同的苯酚初始浓度(分别为100mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L、700 mg/L、800 mg/L和900mg/L)和不同的喹啉初始浓度(分别为50mg/L、80 mg/L、130 mg/L、200 mg/L、300 mg/L、400 mg/L、500 mg/L、600 mg/L和700mg/L)。接入对数期的DQP3在最佳降解条件下培养。测定菌体的浓度(以OD600表示)和苯酚、喹啉的降解情况，考察不同浓度的底物存在情况下底物降解与DQP3菌株自身生长的关系。实验结果参照附图8、9.
随着苯酚浓度的增大，DQP3对数生长期出现的时间越也随之延迟。当苯酚的浓度在200 mg/L以下时不会对DQP3菌株产生明显的抑制作用，在DQP3生长的延滞期内苯酚浓度几乎不降低，当进入菌体生长的对数期后苯酚浓度迅速下降，而当细菌生长进入稳定期后，苯酚浓度降低则变得非常缓慢，甚至不再降低。细菌可以迅速降解低浓度的苯酚，但完全降解苯酚所需的时间会随溶液中苯酚浓度的增加而延长，经过一段时间后最终能够完全降解，苯酚浓度越高被完全降解所需的时间也越长。但当浓度高于700mg/L时，DQP3的生长到达对数生长期前苯酚几乎不被降解，达到对数期后才开始迅速降解，但是降解速率小于低浓度苯酚的降解速率。
当喹啉的浓度在130mg/L范围内，DQP3菌体的生长延滞期很短暂，能够在短时间内进入对数生长期，在12h时DQP3达到稳定生长期，此时溶液中的生物累积量也最大，喹啉在此期间被快速降解，在12h内几乎完全降解。DQP3完全降解喹啉所需要的时间随着喹啉浓度的增加而显著延长，完全降解浓度为400mg/L的喹啉需要48h，浓度为500mg/L的喹啉在72h时仍未被完全降解，而当喹啉浓度进一步加大至600mg/L时72h内降解率仅为20％。700mg/L浓度下喹啉的毒性过大，不仅抑制DQP3的生长，甚至使DQP3菌体部分死亡，因此该浓度下的喹啉几乎没有降解。由此可以得出，低浓度范围内的喹啉随着时间的延长可以被完全降解，浓度增高喹啉的降解则不完全，浓度过高(大于700mg/L)时喹啉几乎不被降解。
综合单独降解苯酚和喹啉的实验结果可知，DQP3菌株对苯酚和喹啉这两种污染物的降解作用主要发生在菌体生长的对数期，并且底物浓度越高，达到稳定期后细菌的OD600值也越高。当底物浓度较低时，DQP3菌株的生长得到促进，底物的降解效率也较高。而底物的浓度过高则会抑制DQP3的生长和降解能力，并且底物浓度越高，对菌株的生长和降解能力的抑制作用越强，高于一定范围会使菌体丧失降解能力并且死亡。
2.外加碳源、氮源对DQP3降解能力的影响
①不同浓度的外加C、N源对DQP3降解喹啉能力的影响
设置不同浓度的葡萄糖为外接碳源，不同浓度的NH4NO3外接氮源，分别接入喹啉浓度为400mg/L的无机盐培养基，后接入菌株DQP3培养。实验结果参照附图10、11。
以不加C源为对照，当葡萄糖浓度小于100mg/L时，DQP3降解喹啉的效率随葡萄糖浓度的加大而提高。当外加葡萄糖浓度为100mg/L时，对DQP3降解喹啉的促进作用最大，24h内的降解率高于60％。当葡萄糖浓度高于100mg/L随着葡萄糖浓度的增大促进作用逐渐减弱，当葡萄糖浓度达到800mg/时，DQP3几乎不再降解喹啉。通过菌体生长曲线可知500mg/L范围内，葡萄糖浓度越高，菌体最终的生物量越大。但800mg/L以上菌体的生物量几乎不增加。综上可得，向培养基中添加100mg/L的葡萄糖作为外加C源可以较好地促进DQP3对喹啉的降解作用。
与对照组相比，外加N源可以大大促进DQP3对喹啉的降解作用。当NH4NO3浓度在0～1000mg/L范围内时，DQP3对喹啉的降解能力随N源浓度的升高而增大。当溶液中NH4NO3浓度为1000mg/L时，喹啉的降解效果最好，24h内的降解率高达90％，是对照组的3倍。但是NH4NO3浓度高于200mg/L后，外加N源对喹啉降解的促进作用差别不大。因此，选择向无机盐培养基中添加200mg/L的NH4NO3以促进DQP3对喹啉的降解。
分别为C源和N源均不加(对照组)、只加C源、只加N源及同时添加C源和N源，分别接入喹啉浓度为400mg/L的无机盐培养基，后接入菌株DQP3培养。实验结果参照附图12。
当无外接葡萄糖和硝酸铵时，DQP3在40h内能将溶液中的喹啉浓度降低至50mg/L以下；说明喹啉能够为DQP3菌株的生长、代谢提供碳源和氮源。当葡萄糖和硝酸铵同时存在时，菌株DQP3可以降解喹啉但此时的降解率是四组实验中最低的。外加的C源和N源的量过多，抑制了DQP3对喹啉的降解，细菌选择优先利用外加的C源和N源进行生长代谢，当溶液中菌体的浓度增大后喹啉才被迅速降解。当无机盐培养基中只有外加碳源或只有外加氮源存在时，菌株DQP3只能利用喹啉作为生长必需能源，因此这两组实验能够加速DQP3对喹啉的降解。并且喹啉作为碳源时的降解效率比其作为氮源时的效率更好。
②外加C源、N源对DQP3降解苯酚的影响
由苯酚的分子结构可知苯酚不含N原子，没有外接N源存在的条件下，苯酚无法为DQP3的生长提供必需的能源，所以不会被DQP3所降解。设置不同浓度的NH4NO3外接氮源，分别接入600mg/L的苯酚的无机盐培养基，后接入菌株DQP3培养。实验结果参照图13.
仅向培养基中添加硝酸铵为外加N源且以苯酚为唯一C源时，DQP3对苯酚的降解效率最高。因此得到结论：只有向培养基中添加NH4NO3作为外加氮源时，DQP3才能降解苯酚并且以 此为唯一碳源用于菌体生长。
实施例5 不同固定化载体对菌种降解能力的影响
目前固定焦化废水的优势降解菌的多数采用包埋法，本实验主要选择玉米芯、海绵、凝胶小球、凝胶活性炭小球、凝胶纱布和凝胶活性炭纱布为载体，以游离菌为对照实验，探究用不同的载体固定DQP3后对其降解同一基质中苯酚和喹啉的能力的影响。将用不同载体固定化的DQP3和游离的DQP3均分别投入到含400mg/L苯酚、250mg/喹啉的无机盐培养基中进行培养。结果参照图14
除玉米芯以外，其他载体对DQP3进行固定化后均能够提高溶液中苯酚和喹啉的去除效果。其中，PVA-SA-PAC混合载体对DQP3进行固定制成凝胶小球后对同一基质中苯酚、喹啉的去除能力得到大幅度提高。溶液中苯酚的浓度在24h内由400mg/L降至100mg/L，苯酚的去除率在36h内能够达到100％。同时，固定后的生物活性炭凝胶小球可以使溶液中喹啉的浓度在12h内由250mg/L降至70mg/L，去除率超过70％。以PVA-SA-PAC-纱布为载体对DQP3进行固定后对溶液中苯酚和喹啉的去除能力仅次于活性炭凝胶小球。二者与不加活性炭的凝胶小球和纱布载体相比，12h内对苯酚的去除效率提高超过一倍，对喹啉的去除率提高超过三倍，说明以PVA-SA-PAC为载体固定游离的DQP3用于废水污染物的去除，此过程中活性炭的吸附效果强于微生物的降解效果。当海绵作为载体时，对苯酚和喹啉的去除效率低于加入活性炭的两组载体，但是高于不加活性炭的两组凝胶载体，说明海绵由于内部空隙多也具有较强的吸附能力，可吸附溶液中的污染物。但是海绵的吸附仅为物理过程，按压海绵会使菌体连同吸附的苯酚、喹啉一起回流入溶液，溶液中的两种污染物含量又会增大，稳定性在几种载体中最差，因此不选择海绵为载体。而活性炭纱布为载体，培养一段时间后，发现溶液开始变浑浊，推测可能是纱布空隙较大，凝胶在场时间浸泡和震荡后开始外溢，这会影响载体的重复利用并且使出水混浊。因此综合载体的稳定性及去除效果，最终以PVA-SA-PAC为载体包埋DQP3菌体制成凝胶小球的方法最好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一株用于能同时降解苯酚和喹啉的革兰氏阴性菌，命名为DQP3，经鉴定为粪产碱菌，保藏号：CCTCC NO.9200。
2.权利要求1所述菌株用于同时降解苯酚和喹啉的应用，该菌株降解最佳条件：接菌量为10％、培养基初始pH为7.0、培养温度为35℃、振荡器转速为150r/min。
3.如权利要求2所述菌株在同时降解苯酚和喹啉双中的应用，其特征添加适量的葡萄糖(100mg/L)和NH4NO3(200mg/L)作为外加C源和N源时，能够促进DQP3对苯酚和喹啉的降解速率。
4.如权利要求2所述菌株在同时降解苯酚喹啉中的应用，其特征用于1g/dL的PAC、7g/dL的聚乙烯醇(PVA)和3g/dL的海藻酸钠(SA)制成PVA-SA-PAC凝胶小球作为载体固定DQP3，在9h内将300mg/L的喹啉浓度降低70％，24h内能够将500mg/L的苯酚降低80％。
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