CN109762755A - 降解莠去津的克雷白杆菌fh-1及含有该菌株的土壤生物修复菌剂 - Google Patents

Abstract

一种降解莠去津的克雷白杆菌FH‑1及含有该菌株的土壤生物修复菌剂，属于微生物技术领域。本发明所述菌株为革兰氏染色阴性菌，在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)的保藏号为CCTCC NO：M 2018334。本发明所述的克雷白杆菌FH‑1可以用于制备土壤生物修复菌剂。该莠去津降解菌为从多年施用莠去津的农田中通过富集培养分离得到的一株对莠去津具有较强降解能力的菌株，该菌株以莠去津为唯一氮源生长，在液体培养基中通过莠去津诱导增加菌体活性，提高对莠去津的降解能力。该菌剂的制备方法简单，成本较低，施用方便，可以撒施在土壤上，在土壤中的降解效果可达到73.2％，有很好的应用前景。

Description

降解莠去津的克雷白杆菌FH-1及含有该菌株的土壤生物修复 菌剂

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种降解莠去津的克雷白杆菌(Klebsiella SP.)FH-1及含有该菌株的土壤生物修复菌剂。

背景技术

莠去津(atrazine)化学名称为2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1，3，5-三嗪，又名阿特拉津，是世界产量最大的除草剂。具有内吸选择性，根吸收为主，茎叶吸收很少。莠去津杀草谱较广，可防除多种一年生禾本科和阔叶杂草。适用于玉米、高粱、甘蔗、果树、苗圃、林地等旱田作物防除马唐、稗草、狗尾草、莎草、看麦娘、蓼、藜等杂草，对玉米有较好的选择性，对某些多年生杂草也有一定抑制作用。

莠去津易被雨水淋洗至土壤较深层，对某些深根草亦有效，但对敏感作物容易产生药害，持效期也较长。该药对人、畜毒性较强，在不少地方曾发生过中毒死亡事故。如果长期食入农药超标的水果和蔬菜，不但引起相应中毒症状，同时也影响免疫***。当莠去津进入生物体内残留、富集到一定程度时就会产毒性。因此，研究解决莠去津残留毒害问题对扩大它在生产上应用，减少对后茬作物及环境造成的污染具有重要意义。

近年来，生物修复(Bioremediation)理论渐渐成为大家关注的焦点，生物修复技术因其操作简便、经济实用、环境友好等优点已成为处理环境中有机污染物的有效措施。目前大量研究证明利用微生物的代谢途径可以消除农药残留，其中投加高效降解菌株是生物修复中最常见最有效的一种方法。微生物降解农药残留依靠自然力量，不产生二次污染。通过筛选高效莠去津降解菌株，将其经过发酵加工成菌剂，应用于农药残留降解，从而达到消除土壤、水体、农产品中莠去津残留。

发明内容

本发明的目的是提供一种降解莠去津的克雷白杆菌(Klebsiella SP.)FH-1 及含有该菌株的土壤生物修复菌剂。

本发明所述的高效降解莠去津的克雷白杆菌(Klebsiella SP.)FH-1，于2018 年6月1日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为中国武汉武汉大学(430072)，保藏编号为CCTCC NO：M 2018334，分类命名：克雷白杆菌属(Klebsiella sp.)FH-1。该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

含有该克雷白杆菌(Klebsiella SP.)FH-1的土壤生物修复菌剂，是将克雷白杆菌FH-1的菌株作为活体成分制备获得，其步骤如下：

1)将克雷白杆菌FH-1的菌株于LB液体培养基中，30℃、150rpm下振荡培养至对数生长期，以pH为7.0的缓冲溶液清洗，获得菌种；所述LB培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和10g胰蛋白胨，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0；

2)将步骤1)获得的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶培养基， 25～30℃、150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；

3)将15～20mL步骤2)制备得到的种子液加入到1000g由豆粕、麦麸、木屑、稳定剂(硅藻土)组成的发酵培养基中，同时把15～20mL的营养液加入到上述1000g发酵培养基中，在25～30℃下进行通风发酵36～60h，并将发酵物在25～30℃下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到本发明所述的降解菌 FH-1菌株的土壤生物修复菌剂；

所述LB液体培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和10g胰蛋白胨，加入到 1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0；

每100mL种子瓶培养基组成按重量百分比是：蔗糖0.3～0.5％、 MgSO₄·7H₂O 0.04～0.08％、K₂HPO₄ 0.15～0.2％、NaCl 0.08～0.1％、KH₂PO₄ 0.05～0.07％、酵母膏0.15～0.2％，余量由水补足，调pH为7.0；

每1000g发酵培养基的组成按重量百分比是：豆粕55～60％、麦麸15～20％、木屑10～15％、稳定剂硅藻土5～10％；

每100mL营养液组成按重量百分比是：蔗糖0.5～0.7％，KH₂PO₄ 0.08～0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.08～0.1％，K₂HPO₄ 0.18～0.2％，NaCl 0.1～1.2％，酵母粉0.8～1.0％，余量由水水补足，pH自然。

本发明的这种菌株经形态学特征、生理生化特性、16S rDNA序列分析鉴定为克雷白杆菌(Klebsiella SP.)，该菌株在在LB固体平板培养基上生长很快，菌落高出表面，光滑而黏湿，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的乳白色菌落。扫描电镜下观察无鞭毛，表面粗糙，不具有运动性，菌体短粗，不活动，有荚膜，成对或呈短链，通过生理生化特性测定，显示该菌株革兰氏阴性，能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不液化明胶，不产生吲哚，不形成H₂S，能分解利用柠檬酸，分解尿素，赖氨酸鸟氨酸呈阳性，ONPG、精氨酸、氧化酶呈阳性，在普通无机盐培养基上易生长。

本发明筛选获得一株克雷白杆菌(Klebsiella SP.)FH-1，该菌株可在短时间内有效降解莠去津残留，保护生态环境和人类健康，且使用方便，成本低，溶液中莠去津去除率达到85.1％，使用克雷白杆菌FH-1生产制备得到的菌剂，具有生产成本低，使用方便，去除效果好等优点，适合治理水体和土壤等环境中莠去津造成的污染，具有非常重要的理论和应用价值。

附图说明

图1：莠去津标准品色谱图；

图2：不同温度条件下FH-1对莠去津的降解曲线；

图3：不同pH条件下FH-1对莠去津的降解曲线；

图4：不同莠去津浓度条件下FH-1对莠去津的降解曲线；

图5：FH-1菌剂处理对大豆的修复作用柱形图；(a)FH-1菌剂处理对大豆株高影响柱形图；(b)FH-1菌剂处理对大豆根长影响柱形图；(c)FH-1 菌剂处理对大豆出芽率影响柱形图；(d)FH-1菌剂处理对大豆地上部分鲜重影响柱形图；

图6：FH-1菌剂处理对黄瓜的修复作用柱形图。(a)FH-1菌剂处理对黄瓜株高影响柱形图；(b)FH-1菌剂处理对黄瓜根长差异影响柱形图；(c)FH-1 菌剂处理对黄瓜出芽率影响柱形图；(d)FH-1菌剂处理对黄瓜地上部分鲜重影响柱形图；

具体实施方式

实施例1：莠去津降解菌FH-1的分离与鉴定

1、降解菌FH-1的分离与筛选

称取长期受莠去津污染的土壤(来自吉林省长春市吉林农业大学农业科学试验站)10.0g于250mL三角锥形瓶中，加入100mL无机盐培养基，三角锥形瓶置于摇床(30℃，150rpm)上培养7d，取5mL培养液，加入100mL分离培养基(向分离培养基中添加莠去津，使莠去津浓度为100mg/L)，三角锥形瓶置于摇床(30℃，150rpm)上培养7d，取10mL培养液接种至新鲜分离培养基(向分离培养基中添加莠去津，使莠去津浓度为200mg/L)中，然后在 30℃摇瓶培养7d，依次类推5次接种，按莠去津100mg/L的浓度梯度增长，使最终富集培养液莠去津的浓度达到500mg/L。

每次接种前将浑浊的分离培养基菌悬液逐级稀释成10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6 5个系列稀释液，每个稀释液都用涂布法分别在固体分离纯化培养基上进行分离，30℃培养两天，根据其不同的外观形态和特征挑取单菌落，反复划线纯化，并根据菌落外观形态特征和显微形态观察的菌体形态特征合并相同的菌株，并将所得的菌株接种于固体分离纯化培养基斜面，保存、备用。

最终分离到能够在含莠去津浓度为500mg/L的分离培养基上生长的菌株8 株，并使用高效液相色谱法(HPLC)验证其降解效果。根据降解效果的，最终获得一个编号为FH-1的菌株，命名为降解菌FH-1，该菌株能够在纯培养条件下，将初始浓度50.0mg/L的莠去津在11d降解81.5％。

HPLC测定条件：Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent)；检测器： Agilent1260紫外检测器(美国Agilent)；色谱柱：C18反相柱(Waters, 150mm×4.60mm,5μm)；流动相为甲醇∶水60∶40，V/V)，流速1.0mL/min；柱温30℃；检测波长：222nm；进样量：10μL。在上述条件下，莠去津保留时间为7.847min(见图1)。

降解率计算方法如下：

上述实施例中使用的培养基如下：

无机盐培养基(MSM)：NaCl 1.0g、K₂HPO₄ 1.5g、KH₂PO₄ 0.5g、 MgSO₄·7H₂O 0.2g、蔗糖1g，溶解于1000mL蒸馏水，pH＝7.0，高压蒸汽灭菌121℃，30min；

分离培养基：NaCl 1.0g、K₂HPO₄ 1.5g、KH₂PO₄ 0.5g、MgSO₄·7H₂O 0.2g、蔗糖1g，按实验设计要求添加不同浓度莠去津作为唯一氮源，以蒸馏水补足 1000mL，调节pH为7.0(固体分离纯化培养基(AMSM)添加20g琼脂)。

以上培养基均在高压锅中121℃灭菌30min。培养基中，30℃，150rpm 下振荡培养至对数生长期，获得菌种。

2、降解菌FH-1的鉴定

(1)降解菌FH-1的形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述分离并纯化得到的降解菌FH-1 进行单菌落状态描述，上述分离并纯化得到的降解菌FH-1在LB固体平板培养基上生长很快，呈圆形或近似圆形、质地软、稍有光泽的乳白色菌落，粘稠易挑取，电镜观察为表面不光滑，杆状细菌。

(2)生理生化特征分析

参考《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京：高等教育出版社，1999.)和《常见细菌***鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌***鉴定手册.北京：科学出版社，2011.)测定降解菌FH-1的生理生化特征。

测定结果显示，该菌株革兰氏阴性，能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇，不液化明胶，不产生吲哚，不形成H₂S，能分解利用柠檬酸，分解尿素，赖氨酸鸟氨酸呈阳性，ONPG、精氨酸、氧化酶呈阳性。

(3)降解菌16S rDNA的同源性分析

采用通用引物聚合酶链反应(PCR)扩增16S rDNA基因，引物为 27F(5‘-AGAGTTGATCCTGCTCAG-3’)， 1492R(5‘-GTTACCTTTACGACTT-3’)。50μL扩增体系：Premix taq25μL，模版(克雷白氏菌DNA)500ng，1492R、27F各10μL，用无菌水补足50μL。 PCR循环参数为：95℃预加热5min，95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，72℃下延伸10min，用1％琼脂糖凝胶电泳和EasyPure凝胶进行纯化。提取试剂盒(转基因生物技术有限公司，北京，中国)，然后由生工生物技术有限公司进行测序。(中国上海)。PCR产物用V-gene核酸纯化试剂盒 (TIANGEN)纯化回收16S rDNA片段，将DNA洗脱至收集管中，4℃冷藏。将测序结果委托上海生工工程有限公司完成。测序结果用Blast软件Genbank 中的16S rDNA序列进行同源性比较。获得FH-1的16S rDNA序列如 SEQ ID NO.1所示，该菌株的16S rDNA序列已经提交到GenBank数据库 (GenBank登录号：MH250202)，发现该序列与Klebsiella variicolastrain kms0422等菌株的基因序列同源性达99％。

3、生长特性分析,

进行了菌株最适最适温度最适pH和底物浓度生长实验。

温度实验中，在100mL无机盐培养基中加入莠去津使其浓度达到50mg/L，调节pH为7，接入5％的FH-1菌悬液，调节培养温度分别为20℃、25℃、30℃、 35℃、40℃，于150rmp摇床培养。

pH值实验中，在100mL无机盐培养基中调节pH值分别为5、7、9，加入莠去津使其浓度达到50mg/L，接入体积百分数5％的FH-1菌悬液，于30℃、 150rmp摇床培养。

底物浓度实验是在无机盐培养基中加入莠去津溶液，使其终浓度分别为 10mg/L、20mg/L、50mg/L、80mg/L、100mg/L，以体积百分比为5％的接菌量接入FH-1菌悬液，30℃、150rpm摇床震荡培养，

上述处理分别在3d、5d、7d、9d和11d时取样，测定莠去津降解菌FH-1 的生长情况和莠去津含量。每次处理重复三次，用未接菌的作为对照，培养、观察、记录菌株生长情况。

结果表明，所述降解菌FH-1的最适生长温度为25～30℃，最适生长pH为碱性7～9。(见图2～3)

莠去津的初始浓度对菌株FH-1降解莠去津的影响结果见图4和表1。

表1：FH-1菌株降解莠去津一级动力学方程数据

实验结果表明，莠去津初始浓度10～100mg/L时，莠去津降解符合农药降解动力学方程。从表1中可以看出，当莠去津浓度为50mg/L时降解速率常数是 0.948，半衰期是4.2天，50mg/L莠去津11天降解率85.1％。

鉴于上述菌株FH-1的形态、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，将降解菌FH-1鉴定为克雷白杆菌(Klebsiella SP.)。

实施例2：降解莠去津土壤生物修复菌剂的制备,

1)将克雷白杆菌FH-1的菌株于LB液体培养基中，30℃，150rpm下振荡培养至对数生长期，获得菌种；所述LB培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和5g胰蛋白胨，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调pH为7.0；

2)将上述培养好的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶，30℃， 150rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；每1000mL种子瓶培养基组成是：NaCl 1.0g，K₂HPO₄1.5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.4g，蔗糖3.0g、酵母膏0.2，以水补足至1000mL，调pH为7.0；

3)将获得的种子液20mL(OD₆₀₀＝2)加入1000g发酵培养基，同时把 20mL的营养液加入到1000g发酵培养基中，在28℃下进行通风发酵48h，并将发酵物在30℃下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到降解菌FH-1菌株的土壤生物修复菌剂；

每1000g发酵培养基的组成按重量百分比是：豆粕600g、麦麸200g、木屑150g、稳定剂硅藻土50g；

每1000mL营养液组成按重量百分比是：蔗糖5g，KH₂PO₄ 0.8g， MgSO₄·7H₂O 0.8g，K₂HPO₄ 2g，NaCl 1g，酵母粉10g，余量为水，pH自然；

实施例3：FH-1菌剂对土壤修复作用

首先称取土壤1000g，加入由莠去津原药制成的水溶液，使土壤中莠去津的浓度为1mg/kg(即配制成被莠去津污染的土壤)，将含有FH-1菌株的土壤生物修复菌剂(由实施例2得到的)按重量百分比为10％施于该土壤中，充分混匀，放于30℃的黑暗培养箱中恒温培养，定时取样测定莠去津在土壤中的残留。

结果表明，使用含有FH-1菌株的土壤生物修复菌剂，莠去津降解率明显提高，土壤中加入FH-1菌剂30天莠去津降解率达到73.2％，而没加菌剂30天莠去津降解率仅为49.1％。

实施例4：FH-1菌剂对土壤修复作用对敏感作物修复的影响，

黄瓜、大豆作为供试作物，选取经清水浸种催芽萌发一致的种子备用；配制莠去津溶液备用。

处理一：取风干土(过20目筛)1.0kg，加入适量的水，使含水量为20％。

处理二：分别取风干土(过20目筛)1.0kg，加入莠去津溶液，充分拌匀使土壤莠去津浓度为1mg/kg，再加入重量百分比为10％的基于上述FH-1菌株的生物修复菌剂，混匀。

处理三：取风干土(过20目筛)1.0kg，加入莠去津溶液，充分拌匀后制成莠去津浓度为1mg/kg的含药土壤。

从已经浸种催芽的种子中选取萌发度一致的黄瓜和大豆种子，播种于不同处理土壤中，在温室中培养7d。同时观察记录不同处理土壤株高、根长、出苗情况、鲜重。

实验结果表明含药土壤施用菌剂后可以明显提高黄瓜，大豆株高、根长。当土壤中浓度1mg/kg时，加入质量分数为10％的菌剂后，黄瓜和大豆的株高和根长明显高于未施用菌剂处理培养的黄瓜和大豆，株高分别提高3％、60％，根长分别提高8％、15.6％，出苗率分别提高56.4％、64.2％，鲜重分别提高23.8％、 90％，表明FH-1菌剂对土壤中莠去津有较好的降解作用，提高黄瓜、大豆的株高、根长、出苗率、鲜重。没加菌剂土壤中对黄瓜、大豆的生长有明显的抑制作用，在施用FH-1菌剂后黄瓜和玉米的药害作用明显减轻。(见图5～6)。

<110> 吉林农业大学

<120> 降解莠去津的克雷白杆菌FH-1及含有该菌株的土壤生物修复菌剂

<130> nm:

<160> 1

<170> PatentIn version

<210> SEQ ID NO：1

<211> 1443

<212> DNA

<213> 克雷白杆菌FH-1

<220>

<221> rDNA

<400> 1

GGCAATGGCG CAGCTACACA TGCAGTCGAG CGGTAGCACA GAGAGCTTGC TCTCGGGTGA 61

CGAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGTCTGGG AAACTGCCTG ATGGAGGGGG ATAACTACTG 121

GAAACGGTAG CTAATACCGC ATAACGTCGC AAGACCAAAG TGGGGGACCT TCGGGCCTCA 181

TGCCATCAGA TGTGCCCAGA TGGGATTAGC TGGTAGGTGG GGTAACGGCT CACCTAGGCG 241

ACGATCCCTA GCTGGTCTGA GAGGATGACC AGCCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA 301

CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GCACAATGGG CGCAAGCCTG ATGCAGCCAT 361

GCCGCGTGTG TGAAGAAGGC CTTCGGGTTG TAAAGCACTT TCAGCGGGGA GGAAGGCGGT 421

GAGGTTAATA ACCTTACCGA TTGACGTTAC CCGCAGAAGA AGCACCGGCT AACTCCGTGC 481

CAGCAGCCGC GGTAATACGG AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AATTACTGGG CGTAAAGCGC 541

ACGCAGGCGG TCTGTCAAGT CGGATGTGAA ATCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATTC 601

GAAACTGGCA GGCTAGAGTC TTGTAGAGGG GGGTAGAATT CCAGGTGTAG CGGTGAAATG 661

CGTAGAGATC TGGAGGAATA CCGGTGGCGA AGGCGGCCCC CTGGACAAAG ACTGACGCTC 721

AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCTGTAAACG 781

ATGTCGATTT GGAGGTTGTG CCCTTGAGGC GTGGCTTCCG GAGCTAACGC GTTAAATCGA 841

CCGCCTGGGG AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA 901

GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGATGCA ACGCGAAGAA CCTTACCTGG TCTTGACATC 961

CACAGAACTT TCCAGAGATG GATTGGTGCC TTCGGGAACT GTGAGACAGG TGCTGCATGG 1021

CTGTCGTCAG CTCGTGTTGT GAAATGTTGG GTTAAGTCCC GCAACGAGCG CAACCCTTAT 1081

CCTTTGTTGC CAGCGGTTAG GCCGGGAACT CAAAGGAGAC TGCCAGTGAT AAACTGGAGG 1141

AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGGC CCTTACGACC AGGGCTACAC ACGTGCTACA 1201

ATGGCATATA CAAAGAGAAG CGACCTCGCG AGAGCAAGCG GACCTCATAA AGTATGTCGT 1261

AGTCCGGATT GGAGTCTGCA ACTCGACTCC ATGAAGTCGG AATCGCTAGT AATCGTAGAT 1321

CAGAATGCTA CGGTGAATAC GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCATGGGA 1381

GTGGGTTGCA AAAGAAGTAG GTAGCTTAAC CTTCGGGAGG GCGCTACCAC TTGATCATTG 1441

CG 1443

Claims (6)

1.一种降解莠去津的克雷白杆菌FH-1，其特征在于：其保藏编号为CCTCC NO：M2018334，分类命名为克雷白杆菌属FH-1，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年6月1日，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种土壤生物修复菌剂，其特征在于：是将权利要求1所述的克雷白杆菌FH-1的菌株作为活体成分制备获得。

3.权利要求2所述的一种土壤生物修复菌剂的制备方法，其步骤如下：

1)将权利要求1所述的克雷白杆菌FH-1的菌株于LB液体培养基中，30℃、150rpm下振荡培养至对数生长期，以pH为7.0的缓冲溶液清洗，获得菌种；所述LB培养基是将10g NaCl、5g酵母浸粉和10g胰蛋白胨，加入到1000mL蒸馏水配制而成，调节pH为7.0；

2)将步骤1)获得的菌种按体积比10％的接种量接种入种子瓶培养基，25～30℃、150～200rpm下振荡培养至对数生长期，获得种子液；

3)将15～20mL步骤2)制备得到的种子液加入到1000g由豆粕、麦麸、木屑、稳定剂硅藻土组成的发酵培养基中，同时把15～20mL的营养液加入到上述1000g发酵培养基中，在25～30℃下进行通风发酵36～60h，并将发酵物在25～30℃下进行通风干燥，粉碎后进行包装，即得到含有降解菌FH-1菌株的土壤生物修复菌剂。

4.如权利要求3所述的一种土壤生物修复菌剂的制备方法，其特征在于：每100mL种子瓶培养基组成按重量百分比是：蔗糖0.3～0.5％、MgSO₄·7H₂O 0.04～0.08％、K₂HPO₄ 0.15～0.2％、NaCl 0.08～0.1％、KH₂PO₄ 0.05～0.07％、酵母膏0.15～0.2％，余量由水补足，调pH为7.0。

5.如权利要求3所述的一种土壤生物修复菌剂的制备方法，其特征在于：每1000g发酵培养基的组成按重量百分比是：豆粕55～60％、麦麸15～20％、木屑10～15％、稳定剂硅藻土5～10％。

6.如权利要求3所述的一种土壤生物修复菌剂的制备方法，其特征在于：每100mL营养液组成按重量百分比是：蔗糖0.5～0.7％，KH₂PO₄ 0.08～0.1％，MgSO₄·7H₂O 0.08～0.1％，K₂HPO₄ 0.18～0.2％，NaCl 0.1～1.2％，酵母粉0.8～1.0％，余量由水水补足，pH自然。