CN104371956B - 对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌及用途 - Google Patents

对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌及用途 Download PDF

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Abstract

本发明为对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌，解决镉进入食物链的问题。其拉丁文名Bacillus sp，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCC NO.9541。本发明菌株对镉的活性效应可以阻止重金属镉进入植株体内，从而减少镉污染进入食物链，特别适合在已污染土壤上边种植边修复的我国实际种植国情。

Description

对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌及用途
技术领域：
本发明涉及对土壤重金属镉污染具有阻隔效应，可减少镉进入食物链的细菌微生物。
技术背景：
镉（Cd）是生物毒性极强的一种重金属元素，在环境中的化学活性强、移动性大、毒性持久，易通过食物链的富集作用危及人类健康，能诱发肝、肾、骨骼病变，还有致癌作用。我国镉污染耕地面积已达1.3×104 hm2，每年约有5.0×107 kg的稻米镉含量超标。2003年农业部稻米及制品质量监督检验测试中心对我国各地稻米质量安全普查结果表明，按照我国稻米Cd含量0.2 mg·kg-1的限量标准（GB15201—1994），镉的超标率超过10%，一些镉污染地区的稻米Cd含量高达0.4–1.0 mg·kg-1，远远超过我国谷物中镉的最高许可量标准。
目前，镉等重金属污染土壤主要的修复方法有物理修复、化学修复和生物修复等方法。物理修复主要包括客土、土壤淋洗和电动修复；该法修复彻底，但修复成本高，难以大面积应用。化学修复主要指化学固定，即加入改良剂（如石灰、磷矿石、硫化物、有机物等）改变土壤的理化性质，通过重金属的吸附或(共)沉淀作用来降低其生物有效性达到固化失活的目的。但，长期施用石灰等物质易造成土壤板结，磷灰石等矿物质本身含有重金属Cd，金属硫化物释放到环境中产生硫化氢会造成二次环境污染。生物修复主要包括植物提取和微生物修复。植物提取是通过超积累植物进行富集，通过收集植物达到去除重金属的目的，但效率低，且占用粮食作物种植面积。微生物修复主要是利用某些微生物对重金属的吸收、沉淀、固定、氧化还原等作用降低重金属毒性、减少重金属移动和阻止重金属进入植株体内。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种对镉具有吸附、固定效应和高抗镉毒性的对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌。
本发明的另一目的在于提供上述芽孢杆菌在减少镉进入农作物的应用。
发明是这样实现的：
对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌，其拉丁文名Bacillus sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCCNO.9541。
本发明芽孢杆菌Bacillus sp. ，自编号LY152，详细分离筛选步骤如下：
（1）样品采集：2012年10月采取四川省什邡市镉污染土壤0-20cm土层样品。
（2）富集培养：称取10g土样于灭菌的液体培养基中，28℃培养箱振荡培养48h后吸取10ml培养液进行传代培养，传代5次
（3）菌株芽孢杆菌分离：吸取10ml富集培养液至装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，于28℃摇床振荡30min，再一次吸取1ml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至不同梯度，分别取0.1ml涂布在不同梯度含200mg·L-1的固体培养基平板上，于28℃培养箱培养3天，长出的菌株为镉抗性菌株芽孢杆菌。
（4）划线分离：将步骤（3）中得到的芽孢杆菌挑取不同的菌落进行平板划线培养，并进行复筛验证直到分离到纯菌落为止，将菌株接种到斜面培养基上，菌长出后放4℃冰箱中备用，并用甘油冷冻管保存一份于-80℃。
（5）芽孢杆菌筛选：菌株芽孢杆菌培养至对数期，按1%接种量接种至镉浓度为100mg·L-1的液体培养基，置28℃培养箱振荡培养48h后离心，用石墨炉原子吸收分光光度计测定上清液中Cd2+含量，上清液中Cd2+含量越低，固定效率越高。
对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌，该菌株具有如下特征：
1）菌落形态特征：菌落粗糙、不透明、乳白色
2）菌体形态特征：利用电镜形态鉴定和革兰氏染色分析。特征如下：杆状，直径0.6μm～1.0μm，长1.5μm～2.0μm，产芽孢，革兰氏阳性。
3）生理生化特征：过氧化氢酶（+）、氧化酶（+）、明胶水解（+）、淀粉水解（+）、酪素水解（+）、酪氨酸水解（-）、卵磷脂水解（-）、V.P反应（+）、丙酸盐利用（-）
4）对镉的活性效应：
本发明在实验室条件下验证结果表明该芽孢杆菌对重金属镉具有显著的吸附、固定和高抗镉毒性的特征，可用于重金属镉污染土壤的生物修复。
5）分子生物学鉴定：利用16S rDNA鉴定，采用通用引物27F和1492R扩增其16SrDNA并测序，再与NCBI GenBank核酸数据库比对，同源性为99%，鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.。
6）将上述分离得到的菌株命名为LY152，经形态学特征观察和分子生物学鉴定，确认该菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。该菌株于2014年8月25日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。其保藏号为CGMCC NO.9541。分类命名为：芽孢杆菌（Bacillus sp.）
本发明通过大棚条件下用重金属镉污染的土壤接种该菌株进行盆栽放大种植试验，结果表明该菌对镉具有显著吸附和固定效应，能高效阻止镉进入植物体内，阻隔效应明显。对重金属镉污染的土壤、水体生物修复方面有着良好的应用前景。
以下节具体实施方式来进一步说明本发明提供的芽孢杆菌的用途。
具体实施方式：
实施例1
芽孢杆菌（Bacillus sp.）LY152的制备方法，具体操作如下：
（1）样品采集：2012年10月采取四川省什邡市镉污染土壤0-20cm土层样品。
（2）富集培养：称取10g土样于灭菌的液体培养基中，28℃培养箱振荡培养48h后吸取10ml培养液进行传代培养，传代5次。液体培养基成分为：蔗糖10 g·L-1，K2HPO42 g·L-1，(NH4)SO4 1 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CaCO3 0.5 g·L-1，酵母膏0.5 g·L-1，NaCl0.1 g·L-1，CdCl2·2.5H2O 0.2 g·L-1，pH 7.0。
（3）镉抗性菌株分离：吸取10ml富集培养液至装有90ml无菌生理盐水的三角瓶中，于28℃摇床振荡30min，再一次吸取1ml到9ml无菌生理盐水中逐步稀释至10-4，10-5，10-6，分别取0.1ml涂布在含200mg·L-1的固体培养基平板，每个稀释度涂布3个平板，于28℃培养箱培养3d，长出的菌株为镉抗性菌株。
（4）划线分离：将步骤（3）中得到的镉抗性菌挑取不同的菌落进行平板划线培养，并进行复筛验证直到分离到纯菌落为止，将菌株接种到斜面培养基上，菌长出后放4℃冰箱中备用，并用甘油冷冻管保存一份于-80℃。
（5）高抗镉菌株筛选：镉抗性菌株培养至对数期，按1%接种量接种至镉浓度为100mg·L-1的液体培养基，置28℃培养箱振荡培养48h后离心，用石墨炉原子吸收分光光度计测定上清液中Cd2+含量，上清液中Cd2+含量越低，固定效率越高。液体培养基成分为：蔗糖10g·L-1，K2HPO4 2 g·L-1，(NH4)SO4 1 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，CaCO3 0.5 g·L-1，酵母膏0.5 g·L-1，NaCl 0.1 g·L-1，CdCl2·2.5H2O 0.1 g·L-1，pH 7.0。
（6）菌株的形态学和生物学鉴定
形态学特征观察：利用电镜形态鉴定和革兰氏染色分析。特征如下：杆状，直径0.6μm～1.0μm，长1.5μm～2.0μm，产芽孢，革兰氏阳性。
分子生物学鉴定：利用16S rDNA鉴定，采用通用引物27F和1492R扩增其16S rDNA并测序，再与NCBI GenBank核酸数据库比对，同源性为99%，鉴定为芽孢杆菌Bacillus sp.。
（7）将上述分离得到的菌株命名为LY152，经形态学特征观察和分子生物学鉴定，确认该菌为芽孢杆菌（Bacillus sp.）。该菌株于2014年8月25日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，其保藏号为CGMCC NO.9541。分类命名为：芽孢杆菌（Bacillus sp.）。
实施例2
芽孢杆菌在减少重金属镉进入水稻的应用，具体操作如下：
1、材料
菌株：芽孢杆菌（Bacillus sp.）LY152，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏号为CGMCC NO.9541
种植介质：重金属镉污染土壤，镉污染浓度1 mg·L-1和40 mg·L-1
种植容器：容积为50升的栽培盆
植物种子：水稻种子，品种分别为：辐优838、糯香61
2、操作方法及步骤
（1）育苗：将水稻种子在温室育秧，叶龄约3叶1心即可移栽；
（2）菌液制备：将有效芽孢杆菌（Bacillus sp.）LY152为1×109个/毫升接种于2升液体培养基，37℃ 150 rpm振荡培养24h，制成含菌株LY152的菌液，菌液含菌株LY152有效活菌数不低于1×106个/毫升，备用；所述的液体培养基：牛肉膏3g·L-1，蛋白胨10g·L-1，NaCl 5g·L-1，pH 7.0～7.2；
（3）种植介质准备：以每盆30公斤镉污染土壤加水至淹过土面2-4cm，备用；
（4）秧苗移栽：将步骤（1）中所育秧苗用步骤（2）所制备的菌液蘸根后按照每盆4株移栽至步骤（3）所准备的介质中，同时设置不蘸根处理作对照；
（5）水稻种植日常管理，至收获期取植株根、茎、叶和稻米测定镉含量，结果如下表：
*注：阻隔率=(处理的生长器官中镉的含量-对照的生长器官中隔的含量)÷对照的各生长器官中隔的含量×100%
实施例3
芽孢杆菌在减少重金属镉进入蔬菜的应用，具体操作如下：
1、材料
菌株：芽孢杆菌（Bacillus sp.）LY152，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏号为CGMCC NO.9541
种植介质：重金属镉污染土壤，镉污染浓度40 mg·L-1
种植容器：容积为2升的栽培盆
蔬菜幼苗：小白菜幼苗
2、操作方法及步骤
（1）菌液制备：同实施例1；
（2）种植介质准备：以每盆2公斤镉污染土壤；
（3）秧苗移栽：移栽小白菜幼苗至步骤（2）所准备的介质中，采用方式，每株幼苗根施4mL菌液，同时设置不施菌液移栽作对照；
（4）小白菜种植日常管理，至收获期取植株根、叶测定镉含量，结果如下表：
*注：阻隔率=(处理的生长器官中镉的含量-对照的生长器官中隔的含量)÷对照的各生长器官中隔的含量×100%
实施例4
芽孢杆菌在减少重金属镉进入水果的应用，具体操作如下：
1、材料
菌株：芽孢杆菌（Bacillus sp.）LY152，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏号为CGMCC NO.9541
种植介质：重金属镉污染土壤，镉污染浓度40 mg·L-1
种植容器：容积为80升的栽培盆
水果树幼苗：嫁接成活的柑桔移栽苗（第一年栽植，第二年可结果）
2、操作方法及步骤
（1）菌液制备：同实施例1；
（2）种植介质准备：以每盆80公斤镉污染土壤；
（3）幼苗移栽：移栽柑桔嫁接苗至步骤（2）所准备的介质中，采用穴施方式，每穴施用20mL菌液，同时设置不施菌液移栽作对照；
（4）柑桔种植日常管理，至次年果实收获期取植株根、茎、叶、果皮、果肉测定镉含量，结果如下表：
*注：阻隔率=(处理的生长器官中镉的含量-对照的生长器官中隔的含量)÷对照的各生长器官中隔的含量×100%
根据上述试验效果表明，本发明提供的芽孢杆菌（Bacillus sp.）LY152对重金属镉进入植株体内具有显著的阻隔效应，阻隔率达到17.89-81.83%，有效地减少了农作物中有害物质累积，特别适合在已污染土壤上边种植边修复的我国实际种植国情。因此，在不同镉污染程度土壤生物修复方面具有良好的应用前景。
上述实施例是对本发明的上述内容作进一步的说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上述实施例。凡基于上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

Claims (4)

1.对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌，其特征在于其拉丁文名Bacillus sp.，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2014年8月25日，保藏编号：CGMCC NO.9541。
2.如权利要求1所述的芽孢杆菌在减少镉进入农作物的应用。
3.根据权利要求2所述的芽孢杆菌在减少镉进入农作物的应用，其特征在于所述农作物为水稻、小麦、玉米、油菜、蔬菜、水果，在农作物种植过程中施用对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌，可有效减少重金属镉进入植株体内，进而阻止镉通过植株可食器官污染食物。
4.根据权利要求3所述的芽孢杆菌在减少镉进入农作物的应用，其特征在于农作物种植过程中施用对镉具有阻隔效应的芽孢杆菌采用蘸根或穴施或土壤撒施或根施或沟施。
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