CN114933994B - 具有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用，属于微生物技术领域。所述组合物为复合菌剂，所述复合菌剂中含有长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003、屎肠球菌NSP004；通过实验发现，本发明提供的组合物能够改善溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数，同时维持结肠组织结构完整，增强肠道屏障，降低氧化应激水平，缓解结肠组织炎症。不仅如此，所述组合物还能够恢复溃疡性结肠炎小鼠肠道短链脂肪酸水平，进而调节肠道微生态平衡。本发明所述的组合物用于制备缓解溃疡性结肠炎的食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂，具有非常广泛的应用前景。

Description

具有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用
技术领域
本发明涉及具有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
炎症性肠病(IBD)是一种主要累及消化***的慢性炎症性肠道疾病，可分为克罗恩病和溃疡性结肠炎两种主要类型，具有隐匿性、症状多样和非特异性，至今为止病因不清，发病机制复杂，缺乏明确清晰的机制，给临床治疗带来极大的挑战。IBD最早发现于西方国家，然而在过去20余年中，西方发达国家IBD发病率和患病率趋于平稳，南美和东亚国家的却呈明显增长趋势。据统计，中国IBD患者2025年预计将达到150万例，伤残调整生命年已远超理论值，造成巨大的疾病经济负担。
肠道菌群与肠道炎症的发生发展息息相关，是近年来科学研究的热点之一。临床研究表明结肠炎患者普遍存在着肠道粘膜菌群失调的情况。免疫缺陷型小鼠在肠道无菌环境下无法诱导形成IBD，当其肠道回复正常菌群状态，表现出肠道炎症，由此可见肠道菌群是IBD形成的必须条件。因此调控肠道菌群以缓解炎症反应是寻求IBD有效治疗方案的重要研究方向。例如，公开号为CN111424003A的中国发明专利申请文本中公开了一株干酪乳杆菌zhang及其在防治慢性胃肠炎中的应用；公开号为CN105343133B的中国发明专利文本中公开了一种含有嗜酸乳杆菌CGMCC10436和植物乳杆菌CGMCC9961的组合物及其在治疗溃疡性结肠炎中的应用；公开号为CN105434476A的中国发明专利申请文本中公开了一株脆弱拟杆菌 ZY312及其在缓解溃疡性结肠炎中的应用。
同时，膳食纤维如果胶、菊粉、β-葡聚糖等能够通过缓解结肠萎缩、增强肠道屏障、调节炎症因子、降低氧化应激水平、维持肠道微生态平衡等方面缓解肠道炎症(Fan L,etal. Preventive effects of pectin with various degrees of esterification onulcerative colitis in mice[J]. Food&Function,2020,11,2886-2897)。
然而，研究表明，使用种类单一的益生元、益生菌或合生元虽然能够调节部分肠道菌种的丰度，但很难引起整个肠道菌群的显著改变，因而对宿主生理健康的调节作用是有限的，多样化的肠道菌和/益生元复配作为一个稳定的微生态群落，能够更全面的促进微生物生态***的健康和稳健性(Tran TTT,et al.Prebiotic supplementation in frailolder people affects specific gut microbiota taxa but not global diversity[J].Microbiome.2019；7:19-654)。因而通过挖掘肠道菌及其与膳食纤维的组合物，能够为缓解溃疡性结肠炎药物组合物或保健品的开发提供新思路。
发明内容
本发明第一个目的是提供了一种组合物，所述组合物包含复合菌剂或复合菌剂及益生元。所述复合菌剂包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004；所述益生元为果胶。
本发明提供了一种组合物，所述组合物包含复合菌剂；
所述复合菌剂中包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌 (Bacteroides xylanisolvens)NSP003、屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004；
所述长双歧杆菌NSP002，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61440；
所述解木聚糖拟杆菌NSP003，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61441；
所述一株屎肠球菌NSP004，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:61442。
所述长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004是从来源于江西南昌地区的健康人体粪便样本中分离得到的，该菌株经测序分析，并将测序得到的序列在NCBI中进行核酸序列比对，结果显示三株菌分别为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)。
所述的长双歧杆菌NSP002具有下列性质：
菌体特征：革兰氏染色阳性杆状细菌，有时呈Y型或V型，无孢子，无鞭毛，菌体约0.5-1.5μm宽，1.3-8μm长。菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.3-2mm之间，正面形态圆形，中间凸起，边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑。生长特性：该菌株为专性厌氧菌，最适生长温度是36℃-38℃，最适生长pH值为6.6-7.0，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，16-24h可进入对数后期或稳定前期。
所述的解木聚糖拟杆菌NSP003具有下列性质：
菌体特征：革兰氏阴性杆状细菌，无孢子，无鞭毛，宽约0.9-1.2μm，长约3-8μm。菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.3-2mm之间，正面形态圆形，中间凸起，边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑。生长特性：该菌株为严格厌氧菌，对氧气敏感，在温度35-38℃生长最佳，最适生长pH值为6.6-7.0，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，16-24 h可进入对数后期或稳定前期。
所述的屎肠球菌NSP004具有下列性质：
菌体特征：革兰氏阳性球状细菌，无孢子，无鞭毛，直径0.8～1.0μm。菌落特征：在培养基上形成明显地菌落，直径在0.3-2mm之间，正面形态圆形，中间凸起，边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑。生长特性：该菌株为兼性厌氧菌，最适生长温度是36℃-38℃，最适生长pH值为6.6-7.0，在含有葡萄糖的培养基中生长良好，16～24h可进入对数后期或稳定前期。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物中，所述组合物中还含有益生元，复合菌剂与益生元按照质量比为：(0.02～20)：(0～1)，不为0的比例进行添加。
在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中的活菌数至少为：1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中，长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌 NSP003、屎肠球菌NSP004按照活菌数比为：(0.01～100)：(0.01～100)：(0.01～100)的比例进行添加。
在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌 NSP003及屎肠球菌NSP004的活菌数均不低于1×106CFU/mL或1×106CFU/g，添加比例，按照体积比为1:1:1。
在本发明的一种实施方式中，所述益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％。
本发明第二个目的是提供了含有上述组合物的产品。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003、屎肠球菌NSP004按照活菌数比为：(0.01～100)：(0.01～100)：(0.01～100)的比例进行添加。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中还含有益生元，复合菌剂与益生元按照质量比为(0.02～20)：(0～1)的比例进行添加。
在本发明的一种实施方式中，长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003、屎肠球菌 NSP004的总活菌数至少为：1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述的益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中包含长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum) NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003、屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004，还含有可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述产品包含长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003、屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004 以及果胶，还含有可接受的载体和/或辅料。
本发明第三个目的是提供了上述组合物在制备具有预防、辅助治疗、和/或修复改善溃疡性结肠炎症状的产品中的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物为复合菌剂，所述复合菌剂中含有长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)NSP003、屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004；所述复合菌剂中，长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003、屎肠球菌NSP004按照活菌数比为：(0.01～100)：(0.01～100)：(0.01～100) 的比例进行添加。
在本发明的一种实施方式中，所述组合物中还含有益生元，复合菌剂与益生元按照质量比为(0.02～20)：(0～1)的比例进行添加。
在本发明的一种实施方式中，所述复合菌剂中的活菌数至少为：1×106CFU/mL或1×106CFU/g。
在本发明的一种实施方式中，所述的益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50％。
在本发明的一种实施方式中，产品为食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)NSP003、屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004，还含有可接受的载体和/ 或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂包含长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroidesxylanisolvens)NSP003、屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004以及果胶，还含有可接受的载体和/或辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述可接受的辅料包括增稠剂、抗氧化剂、酸碱调节剂、乳化剂、防腐剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂及矫味剂中的一种或多种。
本发明的一种实施方式中，所述填充剂为淀粉、蔗糖、乳糖、硫酸钙和/或微晶纤维素。
在本发明的一种实施方式中，所述粘合剂为纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮。
在本发明的一种实施方式中，所述润湿剂为水、乙醇、淀粉和/或糖浆。
在本发明的一种实施方式中，所述崩解剂为羧甲基淀粉钠、羧丙纤维素、交联羧甲基纤维素、琼脂、碳酸钙和/或碳酸氢钠。
在本发明的一种实施方式中，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁、微粉硅胶和/ 或聚乙二醇。
在本发明的一种实施方式中，所述矫味剂为单糖浆、蔗糖、卵磷脂、橙皮糖浆、樱桃糖浆、柠檬、茴香、薄荷油、海藻酸钠、***胶、明胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、柠檬酸、酒石酸和/或碳酸氢钠。
本发明的第四个目的是提供了上述组合物及含有上述组合物的制剂在制备预防、辅助治疗、修复改善溃疡性结肠炎症状的食品、营养补充剂、保健品、药物组合物、饲料添加剂中的应用。
有益效果
本发明的组合物具有缓解溃疡性结肠炎的作用，具体体现在：
1)能够改善溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数；
2)能够降低溃疡性结肠炎小鼠肠道通透性，增加结肠组织中紧密连接蛋白的水平，维持肠道屏障完整；
3)能够避免溃疡性结肠炎小鼠结肠组织结构损伤；
4)能够降低溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中髓过氧化物酶(MPO)的水平，缓解结肠组织氧化损伤。
5)能够增加溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中肿瘤抑制因子TGF-β的水平，缓解炎症。
能够增加溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群产短链脂肪酸的总体水平。
生物材料保藏
一株长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，分类学命名为：Bifidobacterium longum，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61440，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
一株解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003，分类学命名为：Bacteroides xylanisolvens，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61441，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004，分类学命名为：Enterococcusfaecium，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:61442，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所。
附图说明
图1：组合物干预溃疡性结肠炎小鼠后的疾病活动指数的变化，A为不同时间的疾病活动指数的变化，B为实验结束后疾病活动指数的变化。
图2：组合物干预溃疡性结肠炎小鼠后的肠道通透性(A)及结肠中紧密连接蛋白Occludin 水平(B)的变化。
图3：组合物干预溃疡性结肠炎小鼠后的结肠组织形态的变化。
图4：组合物干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠中髓过氧化物酶MPO(B)的水平变化。
图5：组合物干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠中TGF-β的水平变化。
图6：组合物干预溃疡性结肠炎小鼠后结肠内容物中总短链脂肪酸的水平变化。
其中，模型组为DSS结肠炎小鼠组，NSP002为DSS+长双歧杆菌NSP002组，NSP003 为DSS+解木聚糖拟杆菌NSP003组，NSP004为DSS+屎肠球菌NSP004组，复合菌剂为DSS+ 长双歧杆菌NSP002+解木聚糖拟杆菌NSP003+屎肠球菌NSP004组，复合菌剂+益生元为 DSS+长双歧杆菌NSP002+解木聚糖拟杆菌NSP003+屎肠球菌NSP004组+果胶组，果胶为 DSS+果胶组，美沙拉嗪为DSS+阳性药物美沙拉嗪组。
“*”表示与模型组具有显著性差异(*：p<0.05；**：p<0.01；***：p<0.001)；“#”表示与正常组具有显著性差异(#：p<0.05；##：p<0.01；###：p<0.001)。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的Dextran-FITC购自Sigma-Aldrich公司，葡聚糖硫酸钠(DSS)购自MPBio公司，美沙拉嗪颗粒购自法国爱的发制药有限公司。
下述实施例中所涉及的果胶为酯化度低于50％的果胶，购自CPKelco公司。
下述实施示例中涉及的培养基：
双歧杆菌液体培养基的制备：配制MRS培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)，溶解于蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0， 115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述双歧杆菌液体培养基。
双歧杆菌固体培养基的制备：按照双歧杆菌液体培养基的配方，再加入1.5-2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为6.6-7.0，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述双歧杆菌固体培养基。
拟杆菌液体培养基的制备：配制脑心浸液BHI液体培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)，溶解于蒸馏水中，并加入半胱氨酸盐酸盐1g/L，维生素K1 0.002g/L，氯化血红素0.01g/L，混合均匀，然后调整其pH为6.8-7.4，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述拟杆菌液体培养基。
拟杆菌固体培养基的制备：按照拟杆菌液体培养基的配方，再加入1.5-2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为6.8-7.4，115-121℃灭菌15-20min。待冷却至50-60℃时，向培养基中加入终浓度为0.0075‰的无菌万古霉素及0.1‰的卡那霉素，即得到所述拟杆菌固体培养基。
肠球菌液体培养基的制备：配制脑心浸液BHI液体培养基(例如青岛海博生物技术有限公司的产品)，溶解于蒸馏水中，混合均匀，然后调整其pH为6.8-7.2，115-121℃灭菌15-20 min后，即得到所述肠球菌液体培养基。
肠球菌固体培养基的制备：按照肠球菌液体培养基的配方，再加入1.5-2％的琼脂，混合均匀，然后调整其pH为6.8-7.2，115-121℃灭菌15-20min后，即得到所述肠球菌固体培养基。
下述实施例中所涉及的溶液的配制方法如下：
3％DSS的灭菌蒸馏水的配制方法为：称取30g的DSS，溶于蒸馏水中，采用高压蒸汽灭菌锅，121℃灭菌15min后，即得到所述3％DSS的灭菌蒸馏水。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
疾病活动指数(DAI)的判断标准如表1所示：
表1疾病活动指数(DAI)评分
注：正常粪便：成形粪便；松散粪便：不黏附于***的糊状、半成形粪便；稀便：黏附于***的稀水样粪便。
实施例1：长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002、解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003以及屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004的分离筛选
1、样品采集
采集江西南昌地区的健康人体粪便样本，样本置于保藏管中，保存于装有冰袋的保温盒中，带回实验室后迅速置于-80℃冰箱待分离筛选。
2、长双歧杆菌、解木聚糖拟杆菌、屎肠球菌的分离纯化
(1)粪便样品梯度稀释：在无菌厌氧环境中，取约1g步骤1采集到的粪便样本，加入到9mL生理盐水，得到第一梯度稀释液，吸取1mL第一梯度稀释液于9mL生理盐水，得到第二梯度稀释液，以此类推，共配制9个梯度稀释液；
(2)涂布培养：
分别吸取100μL上述所有梯度稀释液分别置于双歧杆菌固体培养基上，涂布后至于37℃厌氧条件下培养48h，得到双歧杆菌稀释涂布平板；
分别吸取100μL上述所有梯度稀释液分别置于拟杆菌固体培养基上，涂布后至于37℃厌氧条件下培养48h，得到拟杆菌稀释涂布平板；
分别吸取100μL上述所有梯度稀释液分别置于肠球菌固体培养基上，涂布后至于37℃厌氧条件下培养48h，得到肠球菌稀释涂布平板；
(3)纯化培养：
挑取各个固体培养基上不同形态的菌落进行划线分离，直至得到边缘整齐，微白，不透明，表面湿润光滑，且形态一致的纯的单菌落；分别挑取双歧杆菌固体培养基、拟杆菌固体培养基、肠球菌固体培养基上的纯菌落接种于5mL相应的液体培养基(双歧杆菌液体培养基、拟杆菌液体培养基、肠球菌液体培养基)中，至于37℃厌氧条件下培养24h，分别得到双歧杆菌纯化培养液、拟杆菌纯化培养液、肠球菌纯化培养液。
3、菌种保藏与鉴定
将步骤2获得的双歧杆菌纯化培养液、拟杆菌纯化培养液、肠球菌纯化培养液于8000rpm 分别离心10min，弃上清，分别得双歧杆菌菌体、拟杆菌菌体、肠球菌菌体，分别命名为 NSP002、NSP003及NSP004。用细菌16S rDNA引物(见表2)进行PCR。
表2引物名称
PCR产物经核酸电泳分析确认后，扩增产物送至公司进行测序，NSP002、NSP003及NSP004的16S rDNA序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，测序结果与NCBI数据库中序列进行比对分析；比对结果发现编号NSP002的菌株为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，命名为长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)NSP002，编号NSP003 的菌株为解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)，命名为解木聚糖拟杆菌(Bacteroides xylanisolvens)NSP003，编号NSP004的菌株为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，命名为屎肠球菌(Enterococcus faecium)NSP004。
实施例2：组合物对溃疡性结肠炎小鼠病理表征指标的影响
具体步骤如下：
1、复合菌剂冻存剂的制备：
(1)菌株培养：
将实施例1得到的长双歧杆菌NSP002在双歧杆菌固体培养基上划线，长出单菌落后，挑取单菌落并接种至双歧杆菌液体培养基，在37℃下厌氧培养18～24h，制备得到长双歧杆菌NSP002种子液；
将实施例1得到的解木聚糖拟杆菌NSP003在拟杆菌固体培养基上划线，长出单菌落后，挑取单菌落并拟杆菌液体培养基，在37℃下厌氧培养18～24h，制备得到解木聚糖拟杆菌 NSP003种子液；
将实施例1得到的屎肠球菌NSP004在肠球菌固体培养基上划线，长出单菌落后，挑取单菌落并接种至肠球菌液体培养基，在37℃下厌氧培养18～24h，制备得到屎肠球菌NSP004 种子液。
(2)保护剂制备：
用蒸馏水配制体积分数为20％～25％的甘油溶液，并加入质量分数为0.1％的半胱氨酸盐酸盐，121℃灭菌15min后，即得到所述保护剂。
(3)冻存剂的制备：
将步骤(1)制备得到的长双歧杆菌NSP002种子液、解木聚糖拟杆菌NSP003种子液以及屎肠球菌NSP004种子液分别在4℃下5000rpm离心10min后，取沉淀为长双歧杆菌NSP002菌体、解木聚糖拟杆菌NSP003菌体以及屎肠球菌NSP004菌体；
分别将上述长双歧杆菌NSP002菌体、解木聚糖拟杆菌NSP003菌体、屎肠球菌NSP004 菌体用无菌PBS溶液(pH 7.2)清洗1～2次后，用步骤(2)制备的保护剂分别重悬，使菌液浓度均为5.0×108CFU/mL，于-80℃保存备用，即分别得到菌浓为5.0×108CFU/mL的长双歧杆菌NSP002冻存剂、菌浓为5.0×108CFU/mL的解木聚糖拟杆菌NSP003冻存剂、菌浓为5.0×108CFU/mL的屎肠球菌NSP004冻存剂。
复合菌剂组冻存剂的制备：
分别将上述长双歧杆菌NSP002菌体、解木聚糖拟杆菌NSP003菌体、屎肠球菌NSP004 菌体用无菌PBS溶液(pH 7.2)清洗1～2次后，用步骤(2)制备的保护剂分别重悬，使菌液浓度均为5.0×108CFU/mL，并按照体积比为1:1:1的比例进行混合，于-80℃保存备用；混合菌液中，长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003以及屎肠球菌NSP004的浓度均达到 5.0×108CFU/mL，即得所述复合菌剂冻存剂。
2、果胶溶液的制备
根据小鼠体重称取酯化度低于50％的果胶(如CPKelco产品)，溶于水后即为果胶溶液。灌胃剂量为每千克小鼠体重300mg果胶，灌胃体积为0.2mL，现配现用。
3、美沙拉嗪溶液的制备
根据小鼠体重称取美沙拉嗪颗粒，溶于质量分数为5％的羧甲基纤维素钠水溶液后即为美沙拉嗪溶液。灌胃剂量为每千克小鼠体重300mg美沙拉嗪，灌胃体积为0.2mL。
4、动物实验方法
取5周龄健康雄性C57BL/6小鼠90只，随机分为九组：正常组、溃疡性结肠炎组(模型组)、DSS+长双歧杆菌NSP002组(NSP002组)，DSS+解木聚糖拟杆菌NSP003组(NSP003 组)，DSS+屎肠球菌NSP004组(NSP004组)，DSS+长双歧杆菌NSP002+解木聚糖拟杆菌 NSP003+屎肠球菌NSP004组(复合菌剂组)，DSS+长双歧杆菌NSP002+解木聚糖拟杆菌 NSP003+屎肠球菌NSP004组+果胶组(复合菌剂+益生元组)，DSS+果胶组(果胶组)，DSS+ 阳性药物美沙拉嗪组(美沙拉嗪组)。每组含小鼠10只。
小鼠饲养于25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照12h黑暗的标准化实验室中，适应性正常喂养7天后开始为期14天的实验，实验全程给予小鼠自由取用标准饲料。
具体过程如下：
正常组：第1～14天，自由饮用灭菌蒸馏水；
干预治疗实验过程：
溃疡性结肠炎组(模型组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14天，自由饮用含 3％DSS的灭菌蒸馏水；
DSS+长双歧杆菌NSP002(NSP002组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14天，自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水；并且，第1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤1制备的长双歧杆菌NSP002冻存剂(5.0×108CFU/mL)；
DSS+解木聚糖拟杆菌NSP003(NSP003组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14 天，自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水；并且，第1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤1制备的解木聚糖拟杆菌NSP003冻存剂(5.0×108CFU/mL)；
DSS+屎肠球菌NSP004(NSP004组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14天，自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水；并且，第1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤1制备的屎肠球菌NSP004冻存剂(5.0×108CFU/mL)；
DSS+长双歧杆菌NSP002+解木聚糖拟杆菌NSP003+屎肠球菌NSP004组(复合菌剂组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14天，自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水，并且，第 1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤1制备的复合菌剂冻存剂(5.0×108CFU/mL长双歧杆菌NSP002、5.0×108CFU/mL解木聚糖拟杆菌NSP003以及5.0×108CFU/mL屎肠球菌NSP004)；
DSS+长双歧杆菌NSP002+解木聚糖拟杆菌NSP003+屎肠球菌NSP004组+果胶组(复合菌剂+益生元组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14天，自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水，并且，第1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤1制备的复合菌剂冻存剂(5.0×108CFU/mL 长双歧杆菌NSP002、5.0×108CFU/mL解木聚糖拟杆菌NSP003以及5.0×108CFU/mL屎肠球菌NSP004)和0.2mL步骤2制备的果胶溶液(300mg/kg bw)；
DSS+果胶组(果胶组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14天，自由饮用含3％DSS 的灭菌蒸馏水，并且，第1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤2制备的果胶溶液(300mg/kg bw)；
DSS+美沙拉嗪(阳性药物对照，美沙拉嗪组)：第1～7天，自由饮用灭菌蒸馏水，第8～14 天，自由饮用含3％DSS的灭菌蒸馏水，并且，第1～14天每天灌胃一次0.2mL步骤3制备的美沙拉嗪溶液(300mg/kg bw)。
实验结束后处死小鼠，实验期间每日监测记录各组小鼠的状态，记录小鼠体重，并按表 1中评判标准计算疾病活动指数(DAI)。
4、实验结果
如图1A～图1B所示，连续7天饮用含有3％DSS的灭菌蒸馏水后，模型组小鼠的DAI值从0(正常组)升至2.76(p<0.001)。经复合菌剂干预后，DAI值下降为2.30(p<0.05)。经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，DAI值显著下降为2.10(p<0.001)，低于单独菌株干预组NSP002组(2.39)、NSP003组(2.40)、NSP004组(2.44)、单独果胶干预组(2.21)及阳性药物美沙拉嗪组(2.38)。以上结果表明，本发明的组合物能够降低疾病活动指数，改善溃疡性结肠炎病理表征指标，并且效果优于灌胃益生元、肠道菌及临床药物组。
实施例3：组合物对溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障的影响
实验方法同实施例2，将所有分组的小鼠在处死前6h开始禁食，处死前4h灌胃600mg/kg 小鼠体重的Dextran-FITC，之后处死所有小鼠，收集血清及结肠组织样本。用荧光分光光度计测定血清中的FITC含量，激发光485nm，发射光535nm。采用ELISA试剂盒(南京森贝伽生物科技有限公司的产品)测定结肠组织中紧密连接蛋白(Occludin)的含量。
实验结果如图2A所示，连续饮用7天含3％DSS的灭菌蒸馏水使得小鼠血清中的Dextran-FITC含量从0.06mg/L(正常组)显著升高至1.09mg/L(模型组，p<0.001)。经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，血清中Dextran-FITC的含量显著下降为0.53mg/L(p<0.05)，经复合菌剂干预后，血清中Dextran-FITC的含量下降为0.35mg/L(p<0.01)，低于单独菌株干预组NSP002组(0.49mg/L)、NSP003组(0.63mg/L)、NSP004组(0.57mg/L)、单独果胶干预组(0.48mg/L)及阳性药物美沙拉嗪组(0.78mg/L)。
同时，如图2B所示，模型组小鼠结肠中的紧密连接蛋白(Occludin)含量从110.64pg/mL (正常组)显著降至75.14pg/mL(p<0.001)。经复合菌剂干预后，结肠中Occludin含量上升为90.14pg/mL(p<0.05)，经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，结肠中Occludin含量显著上升为103.75pg/mL(p<0.001)，高于单独菌株干预组NSP002组(102.25pg/mL)、NSP003组 (93.80pg/mL)、NSP004组(87.16pg/mL)、单独果胶干预组(101.11pg/mL)及阳性药物美沙拉嗪组(87.38pg/mL)。
以上结果表明，本发明的组合物能够降低溃疡性结肠炎小鼠的肠道通透性，上调紧密连接蛋白的水平，维持肠道屏障完整，并且效果优于灌胃益生元、肠道菌及临床药物组。
实施例4：组合物对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理学的影响。
具体实施方式同实施例2，在实验后处死全部小鼠，分别收集结肠组织样本，通过苏木精-伊红染色法结合显微镜观测小鼠结肠组织病理结构的变化，实验结果如图3所示。
结果显示，正常组小鼠结肠黏膜上皮细胞结构完好，结肠绒毛及隐窝结构完整，无溃疡或损伤。模型组小鼠，可见明显的肠黏膜破坏，胞质疏松，出现大量炎症细胞浸润，结肠绒毛破坏，肠隐窝消失。复合菌剂的干预能够有效减少的炎症细胞浸润，维持肠黏膜上皮细胞完整。经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，不仅能够有效减少的炎症细胞浸润，结肠组织细胞排列也更为致密，结肠组织形态接近正常组，改善效果明显优于单独菌株干预组NSP002 组、NSP003组、NSP004组、单独果胶干预组及阳性药物美沙拉嗪组。
实施例5：组合物对溃疡性结肠炎小鼠氧化应激水平的影响。
实验方法同实验例2，在实验后处死全部小鼠，收集结肠组织样本。采用ELISA试剂盒 (南京森贝伽生物科技有限公司的产品)测定结肠中髓过氧化物酶MPO的含量。
实验结果如图4所示，模型组小鼠结肠中MPO的含量从8.91ng/L(正常组)显著上升至13.82ng/L(p<0.001)。经复合菌剂干预后，结肠中MPO的含量下降为10.03ng/L(p<0.05)。经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，结肠中MPO的含量显著下降为7.62ng/L(p<0.001)，低于单独菌株干预组NSP002组(8.64ng/L)、NSP003组(9.12ng/L)、NSP004组(12.39ng/L)、单独果胶干预组(8.09ng/L)及阳性药物美沙拉嗪组(9.74ng/L)。
以上结果表明，本发明的组合物能够降低溃疡性结肠炎小鼠的氧化应激水平，从而缓解结肠炎相关的全身性及组织器官氧化损伤，并且效果优于灌胃益生元、肠道菌及临床药物组。
实施例6：组合物对溃疡性结肠炎小鼠炎症因子水平的影响。
实验方法同实验例2，在实验后处死全部小鼠，收集结肠组织样本。采用ELISA试剂盒 (南京森贝伽生物科技有限公司的产品)测定结肠中TGF-β的含量。
实验结果如图5所示，模型组小鼠结肠中TGF-β含量从47.81ng/L(正常组)显著下降为21.79ng/L(p<0.001)。经复合菌剂干预后，结肠中TGF-β含量上升为44.11ng/L(p<0.001)，经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，结肠中TGF-β含量显著上升为38.40ng/L(p<0.01)，高于单独菌株干预组NSP002组(30.29ng/L)、NSP003组(29.72ng/L)、NSP004组(31.78ng/L)。并且复合菌剂组TGF-β含量还高于单独果胶干预组(40.29ng/L)及阳性药物美沙拉嗪组(40.58 ng/L)。
以上结果表明，本发明的组合物能够显著增加溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中肿瘤抑制因子的水平，从而缓解结肠炎症，并且效果优于灌胃益生元、肠道菌及临床药物组。
实施例7：组合物对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群产短链脂肪酸的影响。
实验方法同实验例2，在实验后处死全部小鼠。收集100mg结肠内容物样本，加入0.8mL 饱和生理盐水匀浆后，于4℃下14000rpm离心15min，取上清过0.22μm水系滤头。取200 μL过膜后的上清，加入0.1mL 50％(v/v)硫酸和400μL无水***，涡旋后静置2min，于 4℃下14000rpm离心1min，取上清采用Agilent 7890B气相色谱仪检测包括乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、异丁酸、异戊酸在内的总短链脂肪酸含量。
实验结果如图6所示，模型组小鼠结肠内容物的总短链脂肪酸含量从0.5944mmol/g(正常组)显著下降为0.3992mmol/g(p<0.01)。经复合菌剂干预后，总短链脂肪酸含量上升为 0.5176mmol/g。经复合菌剂与果胶益生元联合干预后，总短链脂肪酸含量显著上升为0.5692 mmol/g(p<0.05)，高于单独菌株干预组NSP002组(0.5429mmol/g)、NSP003组(0.4746 mmol/g)、NSP004组(0.5406mmol/g)、单独果胶干预组(0.5588mmol/g)及阳性药物美沙拉嗪组(0.5390mmol/g)。
以上结果表明，本发明的组合物能够显著上调溃疡性结肠炎小鼠肠道内容物中短链脂肪酸的含量，从而调节肠道微生态健康，并且效果优于灌胃益生元、肠道菌及临床药物组。
实施例8：组合物的应用
组合物可用于制备胶囊制品，胶囊制品的具体制备过程如下：
(1)将实施例1获得的长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003以及屎肠球菌NSP004纯化后的培养液以3％(v/v)的接种量分别接种到相应培养基中，37℃培养36h，6000rpm离心20min，收集菌泥；使用无菌水对菌泥进行清洗后，用脱脂乳重悬并混合三种菌液至长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003以及屎肠球菌NSP004的浓度均为2×1010CFU/mL，得到悬浮液；
(2)将步骤(1)制得的悬浮液添加至浓度为3％的海藻酸钠溶液中至浓度为2×109CFU/mL后，充分搅拌，使得长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003以及屎肠球菌NSP004的细胞均匀地分散于海藻酸钠溶液中，得到混合液；将混合液挤压到浓度为2％的氯化钙溶液中形成胶粒；待形成的胶粒静止固化30min后，过滤收集胶粒；将收集得到的胶粒进行冷冻干燥48h，得到粉剂；
(3)将步骤(2)制得的粉剂与果胶粉末一起装入到药用胶囊中，得到胶囊制品。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌大学
<120> 具有缓解溃疡性结肠炎功能的组合物及其应用
<130> BAA220394A
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 人工序列
<400> 2
cgatggcttt accctaggac gctccttgcg gttacgtact tcaggtaccc ccggctttca 60
tggcttgacg ggcggtgtgt acaaggcccg ggaacgtatt caccgcgcca tggctgatgc 120
gcgattacta gcgaatccag cttcacgaag tcgggttgca gacttcgatc cgaactgaga 180
gaggtttttg ggattagcat cctgtcgcca ggtagctgcc ttctgtaccc cccattgtaa 240
cacgtgtgta gccccggacg taagggccgt gctgatttga cgtcatcccc accttcctca 300
catcttacga cggcagtctc tctagagtcc tcagcatgac ctgttagtaa ctaaagataa 360
gggttgcgct cgttatggca cttaagccga cacctcacgg cacgagctga cgacaaccat 420
gcagcacctt cacatttgcc ttgcggctat actgtttcca atatattcaa atgcaattta 480
agcccgggta aggttcctcg cgtatcatcg aattaaacca catgttcctc cgcttgtgcg 540
ggcccccgtc aattcctttg agtttcaccg ttgccggcgt actccccagg tggaatactt 600
aatgctttcg cttggccgct tactgtatat cgcaaacagc gagtattcat cgtttactgt 660
gtggactacc agggtatcta atcctgtttg atacccacac tttcgagcat cagtgtcagt 720
tgcagtctag tgagctgcct tcgcaatcgg agttcttcgt gatatctaag catttcaccg 780
ctacaccacg aattccgccc acctctactg tactcaagac tgccagtttc aactgcaatt 840
ttacggttga gccgcaaact ttcacaactg acttaacaat ccacctacgc tccctttaaa 900
cccaataaat cccggataac gctcggatcc tccgtattac cgcggctgct ggcacggagt 960
tagccgatcc ttattcatat ggtacataca aatcccacac gtggatactt tattcccata 1020
taaagagttt acacccatag ggcagtcatc ttcacgctac ttggctgatc agactctcgt 1080
cattgaccat attcctcact gctgcctccc gtagagtttg accgtgttct cagtcatgtg 1140
ggactcctct cagaacccct atcatcgtag tctggtggcc gta 1183
<210> 3
<211> 681
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atgggggcgg ggcctaatac atgcaaagtc gaacgcttct ttttccaccg gagcttgctc 60
caccggaaaa agaggagtgg cgaacgggtg agtaacacgt gggtaacctg cccatcagaa 120
ggggataaca cttggaaaca ggtgctaata ccgtataaca atcaaaaccg catggttttg 180
atttgaaagg cgctttcggg tgtcgctgat ggatggaccc gcggtgcatt agctagttgg 240
tgaggtaacg gctcaccaag gccacgatgc atagccgacc tgagagggtg atcggccaca 300
ttgggactga gacacggccc aaactcctac gggaggcagc agtagggaat cttcggcaat 360
ggacgaaagt ctgaccgagc aacgccgcgt gagtgaagaa ggttttcgga tcgtaaaact 420
ctgttgttag agaagaacaa ggatgagagt aactgttcat cccttgacgg tatctaacca 480
gaaagccacg gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtaggtggc aagcgttgtc 540
cggatttatt gggcgtaaag cgagcgcatg cggtttctta agtctgatgt gaaagccccc 600
ggctcaaccg gggagggtca ttggaaactg ggagacttga gtgcagatta tgagagtgga 660
atttcttgtg tagtgtgcga c 681

Claims (9)

1.一种组合物，其特征在于，所述组合物为复合菌剂，所述复合菌剂中含有长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）NSP002、解木聚糖拟杆菌（Bacteroides xylanisolvens）NSP003、屎肠球菌（Enterococcus faecium）NSP004；所述复合菌剂中，长双歧杆菌NSP002、解木聚糖拟杆菌NSP003、屎肠球菌NSP004按照活菌数比为：（0.01~100）：（0.01~100）：（0.01~100）的比例进行添加；
所述长双歧杆菌NSP002，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No: 61440；
所述解木聚糖拟杆菌NSP003，已于2021年1月19日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No: 61441；
所述一株屎肠球菌NSP004，已于2021年1月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No: 61442。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还含有益生元，所述的益生元为果胶，所述果胶的酯化度低于50%。
3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述复合菌剂中的活菌数至少为：1×106CFU/mL或1×106 CFU/g。
4.一种包含权利要求 1-3 任一项所述的组合物的产品。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品为药物组合物、饲料添加剂中的任一种。
6.权利要求1~3任一所述的组合物在制备具有预防、辅助治疗、和/或修复改善溃疡性结肠炎症状的产品中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述产品为药物组合物、饲料添加剂中的任一种。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物组合物的剂型包括但不限于颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂、口服液。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述产品包含权利要求1~3任一所述的组合物，还含有可接受的载体和/或辅料。
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