CN114350577B - 一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用 - Google Patents

一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用，所述改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp.lactis BLa36菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.24029，保藏日期为2021年12月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。所述动物双歧杆菌乳亚种具有良好的耐胃酸能力，可以改善便秘。

Description

一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与 应用
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用。
背景技术
顽固性便秘是一种常见的症候群，随着社会生活习惯和饮食结构的改变,近年来便秘的发病率逐年提高。流行病学调查显示，各国便秘的发生率为2%-27%。在排除了器质性和代谢性疾病所导致的便秘后，慢性便秘可分为3个亚型：慢传输型便秘（slow transitconstipation, STC）、出口梗阻型便秘和混合型便秘，其中STC占慢性便秘的45.5%。STC的概念于1986年由Proton和Lennar-Joners最先提出，经过了三十年的研究，目前普遍认为STC是一类以肠道内粪便的传输过程缓慢为主要特点的顽固性功能性便秘，以老年人和育龄期妇女最为多见。然而由于对STC的发病机制尚未完全认清，内科保守治疗长期疗效欠佳，不能从根本上解决问题，因此外科干预是STC非手术治疗失败后的最后手段。
慢传输型便秘（slow transit constipation，STC）是临床上较为常见的一种慢性顽固性便秘，是由于多种原因导致的肠道运动功能障碍、肠内容物传输延迟，具有慢性、原发性、功能性的特点。STC病因尚未完全明了，临床主要表现为大便次数少、无肠道蠕动的感觉，无坠胀及无便意，仅有长期不排便所致腹胀和不能进食的症状。慢传输型便秘是一种较难治的慢性肠道疾病，以往对慢传输型便秘的治疗以内科保守治疗为主，但保守治疗仅能暂时缓解症状，往往难以根治，甚至可能造成症状的加重或其他并发症，远期疗效并不令人满意。
慢传输型便秘是一种常见的健康问题，通常归因于大肠运动功能异常，如结肠推进功能下降、大肠电或运动活动整体减少、直肠乙状结肠收缩活动改变和对食物摄入的异常反应。便秘在各种胃肠道疾病中的发病率较高。便秘目前采用增加大便含水量和胃肠动力因子的药物治疗。但这些药物都有副作用。研究表明，便秘与肠道微生物密切相关，肠道微生物可作为便秘干预和治疗的替代方法。例如CN111603489A公开了一种改善便秘的菌剂及其制备方法，包含凝结芽孢杆菌BC99菌粉和辅料，凝结芽孢杆菌菌株BC99安全无毒性，在改善便秘患者的排便和粪便特性方面效果显著，达到促进肠道健康的目的。CN109897795A公开了一种微生物菌剂及其在防治便秘上的应用，该菌剂为解淀粉芽孢杆菌YHSH-58，保藏编号为CGMCC NO．13664，保藏日期为2017年2月16日，其可用于防治便秘。
然而，目前现有技术中用于改善便秘的微生物制剂还十分有限，而且这些制剂改善便秘的效果仍需进一步提高。
因此，如何提供一种改善/治疗便秘效果好，且在治疗过程中不会导致患者产生不良反应的微生物制剂，已成为本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36，所述改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36命名为动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalis subsp. lactis BLa36菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24029，保藏日期为2021年12月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36的培养方法，所述培养方法包括将动物双歧杆菌乳亚种BLa36接种于MRS培养基上进行培养。
优选地，所述培养的温度为30-37℃，例如30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃等，所述培养的时间为18-24 h，例如18 h、19 h、20 h、21 h、22 h、23 h、24 h等。
第三方面，本发明提供一种改善便秘的菌剂，所述改善便秘的菌剂包括如第一方面所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36和保护剂。
优选地，所述保护剂与动物双歧杆菌乳亚种的质量比为(1.8-2.3):1。
上述(1.8-2.3)中的具体数值例如1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3等。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉。
优选地，所述保护剂包括脱脂奶粉溶液，所述脱脂奶粉溶液的质量浓度为8%-12%，例如8%、9%、10%、11%、12%等。
优选地，所述改善便秘的菌剂还包括益生元，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如菊粉和螺旋藻的组合、水苏糖和聚葡萄糖的组合、云芝多糖和水苏糖的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述改善便秘的菌剂还包括动物双歧杆菌乳亚种BLa80，所述动物双歧杆菌乳亚种BLa80命名为动物双歧杆菌乳亚种 Bifidobacterium animalis subsp. lactisBLa80菌株，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15410，保藏日期为2018年3月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
优选地，所述动物双歧杆菌乳亚种BLa36与动物双歧杆菌乳亚种BLa80的质量比为(1-3):(1-3)。
上述(1-3)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3等。
第四方面，本发明提供如第一方面所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36或如第三方面所述的改善便秘的菌剂在制备改善/治疗便秘的产品中的应用，所述产品包括食品、保健品或药物。
优选地，在所述改善/治疗便秘的产品中，动物双歧杆菌乳亚种BLa36的活菌数不低于1×108 CFU/mL。
优选地，在所述药物中，动物双歧杆菌乳亚种BLa36的活菌数不低于1×1010 CFU/mL。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明筛选到一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36菌株，其具有良好的耐胃酸能力，可以改善慢传输型便秘反应，表现为粪便含水量增加、肠道转运率提高、血清中NO、NOS和VIP减少、Cajal***（ICC）标记物c-kit在蛋白和mRNA水平增加。另外，动物双歧杆菌乳亚种BLa36可调节肠道菌群，增加肠道菌群的α多样性，提高有益菌的相对丰度。使用所述改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36进行治疗时，不会产生耐药性，治疗过程中也不会引起患者的不良反应，可用于制备改善/治疗便秘的产品，如药物、食品、保健品等，应用前景广阔。
与现有技术中已公开的动物双歧杆菌相比，本发明提供的动物双歧杆菌乳亚种BLa36的改善便秘的效果更好，优势明显。此外，本发明还意外的发现，将BLa36与BLa80复配得到的复合菌剂，相较于BLa36单独使用的改善便秘的效果有所提高。这可能是由于两种菌种对于彼此的生长能够相互促进，因此在改善便秘上具有协同增效的效果。
附图说明
图1为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对大鼠粪便含水率影响的结果图。
图2为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对大鼠肠推进率影响的结果图。
图3为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对大鼠血清中血管活性肠肽VIP干预的结果。
图4为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对血清中P物质浓度干预的结果图。
图5为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对血清中一氧化氮合酶（NOS）浓度干预的结果图。
图6为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对血清中一氧化氮（NO）浓度干预的结果图。
图7为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对便秘大鼠肠黏膜c-kit表达水平影响的结果图。
图8为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对大鼠肠道微生物群落的α多样性影响的结果图。
图9为动物双歧杆菌乳亚种BLa36对大鼠肠道微生物群落差异菌群影响的结果图。
图10为利用含动物双歧杆菌乳亚种BLa36的保健品治疗大鼠后的肠推进率变化的结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。具体实施方式中涉及的原料信息如下：
MRS固体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2 g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g、琼脂20 g和L-半胱氨酸0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后，倒入灭菌后的培养皿中备用。
MRS液体培养基：称取蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、葡萄糖20 g、乙酸钠2 g、酵母粉5g、柠檬酸氢二铵2 g、K2PO4·3H2O 2.6 g、MgSO4·7H2O 0.1 g、MnSO4 0.05 g和L-半胱氨酸0.5 g，使用去离子水溶解，再加入1 mL吐温80，定容至1 L，灭菌冷却后备用。
实施例1
本实施例提供一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36，其分离筛选方法如下：
选取母乳样本，使用质量浓度为0.9%的生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释3次，涂布在MRS固体培养基（培养基含抗生素莫匹罗星锂盐，其可抑制大部分除双歧杆菌外的其他菌种，药品购于海博生物）上，在37℃培养48 h后，挑取出不同形态的3株菌落后在MRS固体培养基表面划线纯化，挑取单菌落在37℃下使用MRS液体培养基扩大培养，再使用质量浓度为30%的甘油进行保藏。针对保藏的3株人乳来源的单菌进行体外生理特性测试，筛选出一株胃肠液耐受能力（人工模拟）、HT-29细胞粘附能力、抑菌能力和功能性低聚糖利用能力最好的单菌株。
实施例2
本实施例对实施例1中筛选到的动物双歧杆菌乳亚种BLa36进行形态鉴定以及16SrRNA分子生物学鉴定，步骤如下：
（1）形态鉴定：
将菌株接种在MRS固体培养基中，于37℃培养48 h后，在显微镜下进行观察。
观察可知，菌落为乳白色，呈半圆形凸起，表面光滑、湿润，边缘整齐。
（2）16S rRNA分子生物学鉴定：
将-80℃保藏的菌株取出，按2%比例接种于装有20 mL MRS液体培养基的离心管中，在37℃下培养18 h后进行离心分离，8000 rpm下离心10 min，去上清液，收集菌体。
提取菌株的基因组，加入细菌通用引物进行PCR扩增，并将扩增产物送交上海生工生物工程股份有限公司进行测序鉴定。
该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID No: 1所示。
将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株确实为动物双歧杆菌乳亚种。
SEQ ID No: 1：
CAAGGGTCGGGCCACCGGCTTCGGGTGCTACCCACTTTCATGACTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGCATTCACCGCGGCGTTGCTGATCCGCGATTACTAGCGACTCCGCCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGACCGGTTTTCAGCGATCCGCCCCACGTCACCGTGTCGCACCGCGTTGTACCGGCCATTGTAGCATGCGTGAAGCCCTGGACGTAAGGGGCATGATGATCTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCGGTCCCACATGAGTTCCCGGCATCACCCGCTGGCAACATGCGGCGAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTGAACCGGCCCCGAAGGGAAACCGTGTCTCCACGGCGATCCGGCACATGTCAAGCCCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCGCATGCTCCGCCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTTCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGATGCTTAACGCGTTGGCTCCGACACGGGACCCGTGGAAAGGGCCCCACATCCAGCATCCACCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTGACGGCCCAGAGACCTGCCTTCGCCATTGGTGTTCTTCCCGATATCTACACATTCCACCGTTACACCGGGAATTCCAGTCTCCCCTACCGCACTCCAGCCCGCCCGTACCCGGCGCAGATCCACCGTTAGGCGATGGACTTTCACACCGGACGCGACGAACCGCCTACGAGCCCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGTGCTTATTCGAACAATCCACTCAACACGGCCGAAACCGTGCCTTGCCCTTGAACAAAAGCGGTTTACAACCCGAAGGCCTCCATCCCGCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTATCTCAGTCCCAATGTGGCCGGTCACCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCAACGCCTTGGTGGGCCATCACCCCGCCAACAAGCTGATAGGACGCGACCCCATCCCATGCCGCAAAAGCATTTCCCACCCCACCATGCGATGGAGCGGAGCATCCGGTATTACCACCCGTTTCCAGGAGCTATTCCGGTGCACAGGGCAGGTTGGTCACGCATTACTCACCCGTTCGCCACTCTCACCCCGACAGCAAGCTGCCAGGGATCCCGTTCGACTGCATG。
实施例3
本实施例对动物双歧杆菌乳亚种BLa36的培养条件进行优化，步骤如下：
将动物双歧杆菌乳亚种BLa36接种于MRS液体培养基中，分别于10-50℃的不同温度下培养48 h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600数值。
结果显示，动物双歧杆菌乳亚种BLa36在30-37℃下生长最佳，培养18-24 h即可达到生长稳定期。
实施例4
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BLa36的耐胃酸能力，步骤如下：
（1）制备人工胃液：
以质量分数计，人工胃液中含有0.20%的NaCl以及0.30%的胃蛋白酶，使用HCl分别调节pH为2.0、2.5和3.0，过滤除菌备用。
（2）耐胃酸能力测试：
取1.0 mL动物双歧杆菌乳亚种BLa36菌悬液（浓度为1×109 CFU/mL，采用国标《GB4789.35-2016食品安全国家标准食品微生物学检测乳酸菌检测》中的方法测量菌液浓度），（动物双歧杆菌乳亚种BLa36菌悬液：将动物双歧杆菌乳亚种接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18 h，得到菌液；将菌液在8000 g下离心10 min，取上清液过0.22 μm无菌滤膜，得到动物双歧杆菌乳亚种上清液；使用PBS重悬菌体，即得），分别与9.0 mL pH为2.0、2.5和3.0的人工胃液混合，在37℃下厌氧静置培养，分别在开始（0 h）和处理3 h后取样，通过倾注培养法测定活菌数并计算其存活率，公式如下：
存活率（%）=N1/N0×100%，
其中，N1：人工胃液处理3 h后的活菌数；N0：0 h的活菌数。测试结果见表1。
表1
Figure 295544DEST_PATH_IMAGE001
由表1可以看出，本发明所述的动物双歧杆菌乳亚种BLa36具有良好的耐胃酸能力，在pH为2.0的人工胃液中孵育3 h，存活率可达77.0%以上；在pH为2.5的人工胃液中孵育3 h，存活率可达91.5%以上；在pH为3.0的人工胃液中孵育3 h，存活率可达93.7%以上。良好的耐酸能力为其制备改善/治疗便秘的产品创造了条件。
实施例5
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BLa36对肠道功能的恢复作用，步骤如下：
（1）便秘大鼠模型建立：根据现有技术常用方法，使用洛哌丁胺（loperamide）诱导大鼠便秘。将30只大鼠随机分为3组（每组10只）：正常对照组（CTL）、未经治疗的慢传输型便秘模型组（STC）和经动物双歧杆菌乳亚种BLa36治疗的慢传输型便秘大鼠组（BLa36）。CTL：生理盐水（10 mL/kg）处理；STC：洛哌丁胺（10 mg/kg）处理；BLa36：洛哌丁胺（10 mg/kg）+动物双歧杆菌乳亚种BLa36（109CFU/天）处理。除CTL大鼠外，其他组均经口给予洛哌丁胺，每日1次，连续14天，诱导便秘。将动物双歧杆菌乳亚种BLa36菌悬液悬浮于水中，BLa36组于第15天至第28天每日口服1次，而CTL组和STC组用生理盐水按1 mL/100 g灌胃。
（2）将动物双歧杆菌乳亚种BLa36接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2％（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养18 h，得到菌液；将菌液在8000 g下离心10 min，取上清液过0.22 μm无菌滤膜，得到上清液；使用PBS重悬菌体，得到动物双歧杆菌乳亚种BLa36菌悬液。
（3）粪便含水量实验：
在实验过程中收集动物粪便。采集后立即记录粪便湿重（A），在干燥箱中干燥3 h后记录粪便干重（B）。含水量计算如下：粪便含水率（%）=（A-B）/A×100%。结果如图1所示。
（4）肠动力评价：
肠道转运率（肠推进率）计算如下：肠道转运率（%）= C/D×100%（C：幽门***和活性炭染色肠末端之间的长度；D：肠全长（幽门至直肠的距离）。结果如图2所示。
结果显示：由图1可知，正常小鼠（CTL组）的粪便含水量一直稳定在65%以上，而慢传输型便秘大鼠（STC组和BLa36组）的粪便含水量在一周内急速下降，而后一直维持在57%左右，BLa36组小鼠从第二周开始，给与动物双歧杆菌乳亚种BLa36进行治疗，其粪便含水量明显得到提高，证明了动物双歧杆菌乳亚种BLa36具有恢复肠道功能的效果。由图2可知，STC组肠推进率显著低于CTL组（p < 0.01），而BLa36组肠推进率高于STC组（p < 0.01），并已接近正常组水平。进一步说明了动物双歧杆菌乳亚种BLa36的肠道功能恢复效果明显，可应用于改善/治疗便秘的产品的制备中。
实施例6
本实施例探究动物双歧杆菌乳亚种BLa36对慢传输型便秘大鼠的神经递质的影响，步骤如下：
（1）便秘大鼠模型建立方法同实施例5
（2）血液样本采集：
给药14天后，大鼠禁食12 h，但可自由饮水。每只大鼠经口给予0.2 mL标准炭餐。30 min后腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，置于温度调节台上。采集血样，3500rpm离心15 min，获得血清。
（3）血液样本分析：
采用商品化ELISA试剂盒测定血清中血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）浓度、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）浓度。VIP和P物质ELISA试剂盒购自上海抚生实业有限公司。一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。测试方法按试剂盒说明书进行。动物双歧杆菌乳亚种BLa36干预对血管活性肠肽（VIP）、P物质（SP）浓度、一氧化氮（NO）和一氧化氮合酶（NOS）的检测结果分别如图3、图4、图5和图6所示。
结果显示，与正常大鼠（CTL组）相比，STC组大鼠血清VIP水平明显升高（p <0.01）、P物质水平显著降低（p < 0.01）、一氧化氮和一氧化氮合酶水平显著升高（p <0.01）。给予动物双歧杆菌乳亚种BLa36进行治疗后，大鼠的血清VIP水平明显回降（p <0.01）、P物质水平显著回升（p < 0.01）、一氧化氮和一氧化氮合酶水平也均显著回升（p <0.01）。此结果表明：动物双歧杆菌乳亚种BLa36可使慢传输型便秘大鼠的抑制性神经递质（VIP、NO等）的含量显著降低，并使P物质水平得到提高。
实施例7
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BLa36改善ICC功能的作用，步骤如下：
（1）便秘大鼠模型建立方法同实施例5
（2）组织样本采集：
给药14天后，大鼠禁食12 h，但可自由饮水。每只大鼠经口给予0.2 mL标准炭餐。30 min后腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉大鼠，置于温度调节台上。立即取出结肠，4℃生理盐水冲洗，固定在10%***中，并在石蜡中处理用于后续的免疫组织化学研究。
（3）免疫组织化学分析：
从石蜡块切下未染色的5 μm切片，切片用兔抗c-kit（Sigma-Aldrich）4℃染色过夜（使用二抗和抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物法）。使用免疫球蛋白阴性对照消除非特异性结合。采用半定量法测定c-kit的表达。结果如图7所示。
由图7可以看出，与CTL组相比，STC组的阳性细胞面积减小，显示便秘大鼠肠黏膜c-kit表达水平降低（p < 0.01）。动物双歧杆菌乳亚种BLa36处理使便秘大鼠中降低的c-kit得到显著回升（P < 0.01）。
实施例8
本实施例验证动物双歧杆菌乳亚种BLa36调节肠道菌群功能，步骤如下：
（1）便秘大鼠模型建立方法同实施例5
（2）肠道菌群分析：
收取大鼠粪便。使用QIAamp粪便DNA提取试剂盒(Qiagen)，从200 mg粪便中提取总DNA。采用341F(SEQ ID No: 2：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和805R(SEQ ID No: 3：5’-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)引物PCR扩增16S rRNA V3-V4区。最终的16S rRNA基因扩增子文库在MiSeq平台(Illumina)上使用2 × 300 bp配对末端方案进行测序。使用Usearch11合并获得的配对末端读数并保留长度≥400 pb的读数进行以下分析。将所有质量过滤序列映射到无嵌合体的ASV，并使用具有默认设置的USEARCH11创建ASV丰度表。以RDP训练集（v18版）的16S rRNA数据库为参考数据库。基于ASVs丰度表，用Usearch计算Chao1和Shannon-Weiner（香农-威纳）多样性的指数（α多样性）通过单因素方差分析(ANOVA)确定干预效应，并通过Tukey检验显著性差异检验事后分析各组间差异。动物双歧杆菌乳亚种BLa36干预对α多样性和差异菌群的检测结果分别如图8和图9所示。
由图8可知，与正常组相比，STC组微生物群落的α多样性显著下降，包括微生物丰富度下降（以Chao1指数表示），以及微生物多样性下降（以香农-威纳多样性指数表示）。由BLa36组与STC组对比可知，动物双歧杆菌乳亚种BLa36增加了微生物群落的α多样性。如图9所示，与STC组相比，动物双歧杆菌乳亚种BLa36显著增加Parabacteroides（副拟杆菌属）、Paenalcaligenes（产碱菌属）、Facklamia（费克蓝姆氏菌属）和Atopostipes（异位线虫，肉杆菌科）的相对丰度。
实施例9
本实施例提供一种改善/治疗便秘的药物，其制备方法如下：
将动物双歧杆菌乳亚种BLa36接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24 h进行活化，连续活化2次，得到活化液；将活化液按2%（v/v）的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃下培养24 h，得到菌液；将菌液在8000 g下离心10 min，得到动物双歧杆菌乳亚种BLa36菌体；
将菌体用质量浓度为10%的脱脂奶粉重悬至浓度为1×1010 CFU/mL，得到菌悬液；将菌悬液在37℃下预培养1 h后冻干，得到所述改善/治疗便秘的药物。
实施例10
本实施例提供一种改善/治疗便秘的保健品，所述改善/治疗便秘的保健品包括：改善/治疗便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36冻干粉0.1克和菊粉1.9克，可制成小袋产品食用。
按每袋2.0克计，该产品每袋内含有20亿CFU益生菌。菊粉是一种益生元，与动物双歧杆菌乳亚种BLa36复合使用，进一步提高了治疗便秘的效果。
其中，所述改善/治疗便秘的动物双歧杆菌乳亚种冻干粉的制备方法如下：
将动物双歧杆菌乳亚种BLa36按照占培养基总质量3%的接种量接种到MRS液体培养基中，于37℃下培养18 h，得到培养液；将培养液在8000 g下离心10 min，得到菌体；将菌体与脱脂奶粉溶液混合，所述脱脂奶粉溶液的质量浓度为10%，其中脱脂奶粉与菌体的质量比为2:1，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到动物双歧杆菌乳亚种BLa36冻干粉。
便秘大鼠模型建立方法和肠推进率检测方法同实施例5。
将所述改善/治疗便秘的保健品用水配置成悬液（其中动物双歧杆菌乳亚种BLa36的密度为109 CFU/mL），灌胃大鼠，检测肠推进率。结果如图10所示。
由图10可知，STC组肠推进率显著低于CTL组（p < 0.01），而经动物双歧杆菌乳亚种BLa36和动物双歧杆菌乳亚种BLa36与菊粉复合制备的保健品治疗后肠推进率都高于STC组（p < 0.01）。肠道功能恢复效果明显，可应用于改善便秘。
实施例11
本发明的动物双歧杆菌乳亚种BLa36与其他菌种改善便秘的效果对比，以及各种菌种复配得到的复合菌剂改善便秘的效果对比
为进一步体现本发明的动物双歧杆菌乳亚种BLa36在改善便秘方面的优异效果，本实施例选取动物双歧杆菌乳亚种标准菌种（ATCC27536）以及动物双歧杆菌乳亚种BLa80，进行对比测试，测试方法参照实施例5。并且，为探究采用两种菌剂进行复配是否能进一步提高改善便秘的效果，本实施例还将上述菌剂进行复配，进行对比测试，测试方法参照实施例5。各组菌种或菌剂组合的给药量均为109CFU（总菌数）/天。
各组菌种或菌剂组合得到的粪便含水率结果（平均结果）见表2。
表2
Figure 681526DEST_PATH_IMAGE002
结果表明，与现有技术中已公开的动物双歧杆菌乳亚种标准菌种（ATCC27536）以及动物双歧杆菌乳亚种BLa80相比，本发明动物双歧杆菌乳亚种BLa36的改善便秘的效果更好，优势明显。此外，本发明还意外的发现，虽然BLa80的效果稍差于BLa36，但将BLa36与BLa80复配得到的复合菌剂的改善便秘的效果相较于BLa36单独使用竟然有所提高。这可能是由于两种菌种对于彼此的生长能够相互促进，因此在改善便秘上具有协同增效的效果。
综上所述，本发明提供了一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36，所述动物双歧杆菌乳亚种BLa36具有良好的耐胃酸能力，可以改善便秘；将其制成相应的改善便秘的产品，不会引起不良反应，也不会破坏肠道微生物的菌群平衡，同时也避免了因使用抗生素而使与便秘相关的病原菌产生耐药性，具有重要的应用价值。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 微康益生菌（苏州）股份有限公司
<120> 一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36及其培养方法与应用
<130> 2022-3-3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1394
<212> DNA
<213> 动物双歧杆菌乳亚种
<400> 1
caagggtcgg gccaccggct tcgggtgcta cccactttca tgacttgacg ggcggtgtgt 60
acaaggcccg ggaacgcatt caccgcggcg ttgctgatcc gcgattacta gcgactccgc 120
cttcacgcag tcgagttgca gactgcgatc cgaactgaga ccggttttca gcgatccgcc 180
ccacgtcacc gtgtcgcacc gcgttgtacc ggccattgta gcatgcgtga agccctggac 240
gtaaggggca tgatgatctg acgtcatccc caccttcctc cgagttgacc ccggcggtcc 300
cacatgagtt cccggcatca cccgctggca acatgcggcg agggttgcgc tcgttgcggg 360
acttaaccca acatctcacg acacgagctg acgacgacca tgcaccacct gtgaaccggc 420
cccgaaggga aaccgtgtct ccacggcgat ccggcacatg tcaagcccag gtaaggttct 480
tcgcgttgca tcgaattaat ccgcatgctc cgccgcttgt gcgggccccc gtcaatttct 540
ttgagtttta gccttgcggc cgtactcccc aggcgggatg cttaacgcgt tggctccgac 600
acgggacccg tggaaagggc cccacatcca gcatccaccg tttacggcgt ggactaccag 660
ggtatctaat cctgttcgct ccccacgctt tcgctcctca gcgtcagtga cggcccagag 720
acctgccttc gccattggtg ttcttcccga tatctacaca ttccaccgtt acaccgggaa 780
ttccagtctc ccctaccgca ctccagcccg cccgtacccg gcgcagatcc accgttaggc 840
gatggacttt cacaccggac gcgacgaacc gcctacgagc cctttacgcc caataaatcc 900
ggataacgct cgcaccctac gtattaccgc ggctgctggc acgtagttag ccggtgctta 960
ttcgaacaat ccactcaaca cggccgaaac cgtgccttgc ccttgaacaa aagcggttta 1020
caacccgaag gcctccatcc cgcacgcggc gtcgctgcat caggcttgcg cccattgtgc 1080
aatattcccc actgctgcct cccgtaggag tctgggccgt atctcagtcc caatgtggcc 1140
ggtcaccctc tcaggccggc tacccgtcaa cgccttggtg ggccatcacc ccgccaacaa 1200
gctgatagga cgcgacccca tcccatgccg caaaagcatt tcccacccca ccatgcgatg 1260
gagcggagca tccggtatta ccacccgttt ccaggagcta ttccggtgca cagggcaggt 1320
tggtcacgca ttactcaccc gttcgccact ctcaccccga cagcaagctg ccagggatcc 1380
cgttcgactg catg 1394
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 2
cctacgggng gcwgcag 17
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gactachvgg gtatctaatc c 21

Claims (10)

1.一种改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）BLa36，其特征在于，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24029，保藏日期为2021年12月2日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.如权利要求1所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括将动物双歧杆菌乳亚种BLa36接种于MRS培养基上进行培养。
3.如权利要求2所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36的培养方法，其特征在于，所述培养的温度为30-37℃，所述培养的时间为18-24 h。
4.一种改善便秘的菌剂，其特征在于，所述改善便秘的菌剂包括如权利要求1所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36和保护剂。
5.如权利要求4所述的改善便秘的菌剂，其特征在于，所述保护剂包括脱脂奶粉。
6.如权利要求4所述的改善便秘的菌剂，其特征在于，所述改善便秘的菌剂还包括益生元，所述益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖、大豆低聚糖、菊粉、螺旋藻、节旋藻、云芝多糖、水苏糖、聚葡萄糖、α-乳淸蛋白或乳铁蛋白中的任意一种或至少两种的组合。
7.如权利要求4所述的改善便秘的菌剂，其特征在于，所述改善便秘的菌剂还包括动物双歧杆菌乳亚种BLa80，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.15410，保藏日期为2018年3月5日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.如权利要求7所述的改善便秘的菌剂，其特征在于，所述动物双歧杆菌乳亚种BLa36与动物双歧杆菌乳亚种BLa80的质量比为(1-3):(1-3)。
9.如权利要求1所述的改善便秘的动物双歧杆菌乳亚种BLa36或如权利要求4-8中任一项所述的改善便秘的菌剂在制备改善/治疗便秘的产品中的应用，所述产品包括食品、保健品或药物。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，在所述改善/治疗便秘的产品中，动物双歧杆菌乳亚种BLa36的活菌数不低于1×108 CFU/mL。
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