CN108004169A - 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌zl-1及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108004169A
CN108004169A CN201711364361.4A CN201711364361A CN108004169A CN 108004169 A CN108004169 A CN 108004169A CN 201711364361 A CN201711364361 A CN 201711364361A CN 108004169 A CN108004169 A CN 108004169A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus licheniformis
feather
culture
temperature
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201711364361.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108004169B (zh
Inventor
朱红惠
谢小林
周莲
陈美标
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangzhou Wangdao Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Guangzhou Wangdao Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangzhou Wangdao Biological Technology Co ltd filed Critical Guangzhou Wangdao Biological Technology Co ltd
Priority to CN201711364361.4A priority Critical patent/CN108004169B/zh
Publication of CN108004169A publication Critical patent/CN108004169A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108004169B publication Critical patent/CN108004169B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C12R2001/10—Bacillus licheniformis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F1/00—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof
    • C05F1/005—Fertilisers made from animal corpses, or parts thereof from meat-wastes or from other wastes of animal origin, e.g. skins, hair, hoofs, feathers, blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Environmental & Geological Engineering (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fertilizers (AREA)

Abstract

本发明公开了地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZL‑1及其应用。本发明地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZL‑1从羽毛联合食用菌渣的高温堆体中分离筛选得到，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60284，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年11月24日。经实验测定，本发明地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZL‑1能够在纯羽毛的液体培养基中培养3天，其角蛋白酶活达到52.14U/mL，对羽毛的降解率达到90.15％。此外，本发明地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisZL‑1对高温和盐度均有很好的耐受性，能在55℃下良好生长，并耐受14％的盐度，因此可用于降解羽毛、生产复合氨基酸溶液、利用羽毛为原料进行高温堆肥发酵、生产复合氨基酸肥料和生产角蛋白酶，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

地衣芽孢杆菌ZL-1及其应用
技术领域
本发明属微生物及其应用技术领域，更具体地说，本发明涉及地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ZL-1及其应用。
背景技术
羽毛是家禽处理后剩余的废弃物，在全世界的范围内，每年有数百万吨羽毛废弃物产生，而我国每年产生的废弃羽毛将近70万t，固体废弃物的管理问题成了家禽屠宰企业亟待解决的问题。然而羽毛废弃物是一种丰富的天然蛋白质资源，其粗蛋白含量高达85％-90％，也含有维生素B12和一些未知的生长因子。羽毛蛋白中除赖氨酸、蛋氨酸的含量明显较低外，其它动物必需氨基酸的组成略高于鱼粉，这意味着利用羽毛蛋白质水解生产复合氨基酸具有潜在的经济效益。但禽类羽毛中的蛋白质主要由角质蛋白构成，角蛋白中含有较多的胱氨酸，他们之间形成大量的二硫键，再加上氢键和分子间作用力很难被普通蛋白酶(如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等)水解。利用高温高压蒸煮、酶解法、膨化、酸碱水解和利用氧化剂或者还原等传统方法加工处理废弃羽毛，氨基酸破坏严重、酶制剂成本高、能耗高、污染大等问题，而利用微生物对角蛋白进行降解可以提高水解产物的营养价值，降低能耗、成本以及对环境的污染问题，是一种环境友好型的废弃物资源化利用方式。
自然界中有多种微生物可以降解羽毛角蛋白，自1899年Ward报道了真菌马爪甲团囊菌能分解角蛋白以来，迄今为止已发现30多种，主要包括细菌类的芽孢杆菌属、真菌类的曲霉属和放线菌的链霉菌属。
我国在羽毛角蛋白分解菌的筛选及应用方面的研究落后于国外，分离筛选出的高效菌株并不多，并多是真菌和放线菌，且这些报道的角蛋白降解菌大多生长于常温环境下(25～35℃)，关于高温条件下(45℃以上)的角蛋白降解菌报道极少。由于角蛋白酶的最适反应温度一般在40℃～60℃，以羽毛为原料堆肥发酵中堆体温度一般在50℃以上，从而给常规的生物处理技术带来较大困难。因此，筛选在高温条件下具有稳定性和高效性的角蛋白降解菌也是一个研究热点。
发明内容
本发明的目的在于：克服现有技术中缺乏高温条件下的角蛋白降解菌等不足，提供一种在高温条件下稳定且高效的角蛋白降解菌地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformisZL-1及其应用。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌Bacilluslicheniformis ZL-1，其是从羽毛联合食用菌渣的高温堆体中分离筛选得到，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60284，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年11月24日。
本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1分离后经菌落形态鉴定，结果如下：在NA培养基上培养24h后，菌落粗糙，不透明，边缘不整齐呈树根状，易挑取，菌落直径为15mm，杆菌，菌体单个，成对或链状排列；革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生偏端生，有荚膜。
本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1经生理生化测定，结果如下：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1的接触酶、V-P实验，厌氧生长、硝酸盐还原、淀粉水解、酪蛋白水解、明胶水解、纤维素分解等实验均为阳性，吲哚、卵磷脂酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氢酶等实验均为阴性；生长温度范围25～60℃，对NaCl的最大耐受性为14％。
本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，片段长度为1455bp，与NCBI数据库比对表明，该菌株与地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ATCC 14580的同源性最高，达99％。应用MEGA 7.0软件采用Neighbor-Joining法绘制16S rDNA***发育树，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征，该菌株最可能是地衣芽孢杆菌属，并命名为Bacillus licheniformis ZL-1。
本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1的种子液的培养温度为45～55℃。
经实验证实，本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1在高温条件下可稳定且高效的降解角蛋白，因此，本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1可用于发酵降解羽毛、生产复合氨基酸溶液、高温堆肥发酵废弃羽毛和食用菌渣、生产复合氨基酸肥料和生产角蛋白酶。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种降解羽毛、生产复合氨基酸溶液的方法，其包括如下步骤：
将羽毛与无机盐溶液按照1:100的质量比混合，加入5wt％地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1种子液，在45～55℃、200rpm下培养3天，完成羽毛降解，并得到复合氨基酸溶液；所述无机盐溶液成分包括：NaCl 0.5g/L、NaH2PO4 0.1035g/L、Na2HPO4 1.3277g/L；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1种子液的制备方法是：将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1接种到NA固体平板培养基上，45℃培养24h使其活化，活化后转接到NB液体种子培养基中培养至对数生长期；所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.60284，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年11月24日。
所得复合氨基酸溶液经测定，发酵液中角蛋白酶活达到52.14U/ml，发酵液中复合氨基酸种类齐全，氨基酸含量达到3.4278g/kg，对羽毛的降解率达到90.15％。
优选地，所述羽毛还经过预处理，预处理方法包括：将羽毛破碎成蓬松絮状，然后与水按照1:40的质量比混合，调节pH至10，在微波能量为700W的条件下加热180s。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种高温堆肥发酵废弃羽毛和食用菌渣、生产复合氨基酸肥料的方法，其包括如下步骤：
将羽毛和食用菌渣按照碳氮比为20:1～25:1的比例混合得到混合物，加入混合物质量1～2％的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1菌剂和混合物质量0.1～0.2％的黑曲霉菌剂，得到总混合物，调节总混合物的含水量至70～75％后放入固体发酵罐中，调节温度为50～55℃，每天通气30～60min，连续堆肥7天后，将温度降至自然温度，使其自然堆肥发酵14天，得到复合氨基酸肥料；
所述地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1菌剂的制备方法为：将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1接种到发酵培养液中进行发酵，在45～50℃，搅拌速度为180～200rpm，通气量为0.5～2vvm的条件下培养36～48h，得到地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1菌剂；所述发酵培养液配方为：葡萄糖1.5g/L、玉米粉1.5g/L、豆粕2.0g/L、氯化钠0.5g/L；
所述黑曲霉菌剂的制备方法为：将黑曲霉菌种(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.3.576)接种到麸皮培养基中进行发酵，在37℃下浅盘静止培养3～5天，得到黑曲霉菌剂；所述麸皮培养基的配方为：麸皮：磷酸二氢钾：水的质量比＝1000:5:1000。
相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1相比国内已报道的角蛋白降解菌，对温度耐受程度强，在20～60℃温度条件内均可以生长，生长温度能达到角蛋白酶的最适反应温度40～60℃，在45～55℃条件下具有高角蛋白酶活(角蛋白酶活为52.14U/ml)，对羽毛的降解率高(降解率为90.15％)，能在羽毛和菇渣的高温快速堆肥发酵中生长良好。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1抗逆性强，能耐受14％的高盐度，且能分泌纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等多种酶。
本发明利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1生产的复合氨基酸溶液，能以羽毛为唯一的碳氮源，生产成本低，工艺简单，且复合氨基酸溶液中氨基酸种类齐全。
本发明利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1生产复合氨基酸肥料能大大缩短羽毛和食用菌渣的发酵时间，节约成本。
菌种保藏信息：
Bacillus licheniformis ZL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60284，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年11月24日。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1***发育树图。
图2为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1降解羽毛的效果图，其中锥形瓶ZL-1为加入地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1的实验组，锥形瓶CK为空白对照组。
图3为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1降解羽毛得到复合氨基酸溶液中氨基酸谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
实施例1地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1的分离
鸡羽毛取自广东温氏食品集团股份有限公司下养鸡场，食用菌渣取自广州王道生物科技有限公司，混合放入敞开的固体发酵罐中，保持罐内温度为45℃，待羽毛分解后收集发酵残渣，自然阴干，4℃保存备用。
取10g上述样品放入装有90mL无菌水的三角瓶中(带玻璃珠)，在180rpm转速下震荡30min，静置10min后，取上层液稀释10倍后，一次制成10-4、10-5、10-6稀释液，取0.1mL均匀涂布在NA培养基平板上，倒扣平板置于45℃培养箱中培养2天。对每个菌落形态不同的菌株做3个平行纯化平板。挑选初筛单菌落于基础盐羽毛培养基中，置于45℃摇床，180rpm培养，以未接种的培养基作对照，观察羽毛降解情况。
NA培养基配方：蛋白胨10.0g/L，牛肉膏3.0g/L，氯化钠5.0g/L，琼脂15.0g/L。
基础盐羽毛培养基配方：天然羽毛1g/L，氯化钠0.5g/L，磷酸二氢钠0.1035g/L，磷酸氢二钠1.3277g/L。
经过基础盐羽毛培养基的进一步培养，筛选出分解羽毛效率最高的高温菌株，经过形态学及生理生化和DNA鉴定后，命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1。
实施例2地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1的生物学性状及生理生化和分子鉴定
S1.形态特征
地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1在NA培养基上培养24h后，菌落粗糙，不透明，边缘不整齐呈树根状，易挑取，菌落直径为15mm，杆菌，菌体单个，成对或链状排列；革兰氏染色阳性；芽孢椭圆形，中生偏端生，有荚膜。
S2.生理生化特征：经生理生化测定，本发明的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZL-1的接触酶、V-P实验，厌氧生长、硝酸盐还原、淀粉水解、酪蛋白水解、明胶水解、纤维素分解等实验均为阳性，吲哚、卵磷脂酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脱氢酶等实验均为阴性；生长温度范围25～60℃，对NaCl的最大耐受性为14％。具体结果如表1所示.
表1
注：+，阳性；-，阴性。
S3.地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1的16S rDNA的序列测定与分析：
(1)DNA提取：将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1划线接种在NA培养基的平板上，45℃培养过夜。挑取单菌落与1.5mL EP管中，采用CTAB法提取细菌DNA。
(2)16S rDNA基因PCR扩展：
PCR引物由上海生工公司合成。
Primer A(27F)的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；Primer B(1492R)的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
PCR反应体系如表2。
表2
PCR扩增条件：95℃5min；95℃50s，56℃50s，72℃90s，30个循环；72℃10min；4℃保藏。采用1％的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)回收纯化PCR产物。
(3)序列测定：PCR产物纯化后，送上海美吉公司进行测序，其序列如SEQ ID NO:1所示。该序列与NCBI数据库已知标准菌株比对表明，该菌株与地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ATCC 14580的同源性最高，达99％。应用MEGA7.0软件采用Neighbor-Joining法绘制16S rDNA***发育树(见于图1)，确定其进化地位，结合其形态特征和生理生化特征，该菌株最可能是地衣芽孢杆菌属，并命名为Bacillus licheniformis ZL-1。
实施例3地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1发酵降解纯羽毛生产复合氨基酸溶液及其相关指标测定
(1)羽毛原料的预处理：将羽毛用粉碎机破碎，成蓬松的絮状。然后将絮状羽毛与水按照1:40的质量比混合，调节pH到10，在微波能量为700W的条件下加热180s。
(2)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1种子液制备：将实施例1筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1接种到NA固体培养基平板上，45℃培养24h，使其活化；将上述活化的种子转接到NB液体种子培养基中，培养24h至对数生长期。
(3)将预处理后的羽毛与无机盐溶液按照1:100的质量比混合，加入5wt％地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1种子液，在45℃下，200rpm下培养3天，得到复合氨基酸溶液，观察羽毛的降解情况(见图2)，测定羽毛降解率，角蛋白酶活以及复合氨基酸溶液中氨基酸种类及含量。所述无机盐溶液成分如下：NaCl 0.5g/L，NaH2PO4 0.1035g/L，Na2HPO4 1.3277g/L。
(4)羽毛降解率测定：将复合氨基酸溶液用滤纸过滤，收集滤渣于105℃烘干至恒重，计算降解率。
羽毛降解率(％)＝(对照样品干重-实验样品干重)/对照样品干重×100。
(5)角蛋白酶活性的测定按照文献“Gradisar H,Kern S,FriedrichJ.Keratinase of Doratomyces microsporus.Appl Microbiol Biotechnol[J].2000,53(2):196-200.”所描述的方法为基础，并加以修改。具体方法为：将复合氨基酸溶液用2层纱布过滤，去滤液，12,000×g，4℃离心10min，取上清液1.0mL加入2.0mL 0.05mol/L Tris/HCl缓冲液(pH7.5)与10mg羽毛粉底物，37℃恒温水浴锅反应，100rpm保温处理1h。反应结束时添加2.0mL 10％三氯乙酸终止反应，10,000×g离心15min。上清液于595nm下测定其吸光值，采用保温前添加TCA的反应管作为对照。酶活单位定义：实验条件下，单位mL分解角蛋白产生的酶量是ΔOD595值升高0.001个单位所需的酶量为一个活力单位(U)。
(6)复合氨基酸溶液中水溶性游离氨基酸测定：取5mL复合氨基酸溶液至10mL比色管中，加ddH2O定容至10mL，静置过夜。取2mL上清液至10mL离心管中，加入2mL磺基水杨酸，混匀，静置1h使蛋白沉淀。加入1mL EDTA和1mL盐酸后4℃、6,000×g离心15min(或用0.22μm微孔滤膜过滤)。取上清液1mL至培养皿中，蒸干。加入1mL 20mmol/L HCl溶液，用0.22μm微孔滤膜过滤。至少取500μL至进样瓶。用L-8900全自动氨基酸分析仪测定。
测试结果发现，培养基中羽毛被降解(见图2)，发酵3天后对羽毛的降解率达到90.15％，同时发酵液中角蛋白酶活性达到52.14U/mL，表明本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1具有快速降解羽毛的能力，经测定，发酵3天获得的氨基酸溶液中复合氨基酸种类齐全，氨基酸含量达到3.4278g/kg，氨基酸谱图见图3。因此可将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1用于羽毛的降解和资源化利用，以及角蛋白酶的生产。
实施例4地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1高温堆肥发酵废弃羽毛和菇渣，生产复合氨基酸肥料
(1)地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1菌剂制备：将实施例1筛选出的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1接种到NA固体培养基平板上，45℃培养24h，使其活化，将活化好菌株接种到发酵培养液中进行发酵，在45℃，搅拌速度为200rpm，通气量为1vvm的条件下培养48h，得到地衣芽孢杆菌ZL-1菌剂，液体发酵所获得的菌剂的总活菌数可达到1×1010cfu。所述发酵培养液配方为：葡萄糖1.5g/L、玉米粉1.5g/L、豆粕2.0g/L、氯化钠0.5g/L。
(2)黑曲霉菌剂制备：将黑曲霉菌种(购自广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.3.576)接种到麸皮培养基中进行发酵，在37℃下浅盘静止培养，培养3-5天，得到黑曲霉菌剂。所述麸皮培养基的配方为：麸皮：磷酸二氢钾：水的质量比＝1000:5:1000。
将废弃家禽羽毛和食用菌渣按照C/N比为25:1的比例均匀混合，向原料混合物中加入原料混合物质量2％的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)ZL-1菌剂和0.2％的黑曲霉菌剂，然后调节原料混合物的含水量至70％，放入固体发酵罐中，调节温度至50℃，每天通气30min，并撒适量水，连续堆肥7天后，关闭温度控制器，让其自然堆肥发酵14天，完成物料的腐熟，得到复合氨基酸肥料。
根据上述说明书的揭示和指导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。
序列表
<110> 广州王道生物科技有限公司
<120> 地衣芽孢杆菌ZL-1及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1446
<212> DNA
<213> 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformisZL-1 16S rDNABacilluslicheniformis)
<400> 1
acgtgcggca tgctatacat gcagtcgagc ggaccgacgg gagcttgctc ccttaggtca 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt tcaatcataa aaggtggctt 180
ttagctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag 420
aacaagtacc gttcgaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600
gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagagg gtttccgccc tttagtgctg cagcaaacgc 840
attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900
gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960
tcttgacatc ctctgacaac cctagagata gggcttcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020
tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080
caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140
aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200
cgtgctacaa tgggcagaac aaagggcagc gaagccgcga ggctaagcca atcccacaaa 1260
tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320
atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380
accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc tttggagcca gccgccgaag 1440
tgggac 1446
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Primer A(Artificial Sequence)
<400> 2
agagtttgat cctggctcta g 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Primer B(Artificial Sequence)
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (9)

1.Bacillus licheniformis ZL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60284，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年11月24日。
2.权利要求1所述的Bacillus licheniformis ZL-1，其特征在于，其16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.权利要求1所述的Bacillus licheniformis ZL-1，其特征在于，其种子液的培养温度为45～55℃。
4.权利要求1所述Bacillus licheniformis ZL-1在发酵降解羽毛、生产复合氨基酸溶液中的应用。
5.一种降解羽毛、生产复合氨基酸溶液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将羽毛与无机盐溶液按照1:100的质量比混合，加入5wt％地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZL-1种子液，在45～55℃、200rpm下培养3天，完成羽毛降解，并得到复合氨基酸溶液；
所述无机盐溶液成分包括：NaCl 0.5g/L、NaH2PO4 0.1035g/L、Na2HPO4 1.3277g/L；
所述Bacillus licheniformis ZL-1种子液的制备方法是：将地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZL-1接种到NA固体平板培养基上，45℃培养24h使其活化，活化后转接到NB液体种子培养基中培养至对数生长期；
所述Bacillus licheniformis ZL-1，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60284，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期为2017年11月24日。
6.根据权利要求5所述降解羽毛、生产复合氨基酸溶液的方法，其特征在于，所述羽毛还经过预处理，预处理方法包括：将羽毛破碎成蓬松絮状，然后与水按照1:40的质量比混合，调节pH至10，在微波能量为700W的条件下加热180s。
7.权利要求1所述Bacillus licheniformis ZL-1在高温堆肥发酵废弃羽毛和食用菌渣、生产复合氨基酸肥料中的应用。
8.一种高温堆肥发酵废弃羽毛和食用菌渣、生产复合氨基酸肥料的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将羽毛和食用菌渣按照碳氮比为20:1～25:1的比例混合得到混合物，加入混合物质量1～2％的Bacillus licheniformis ZL-1菌剂和混合物质量0.1～0.2％的黑曲霉菌剂，得到总混合物，调节总混合物的含水量至70～75％后放入固体发酵罐中，调节温度为50～55℃，每天通气30～60min，连续堆肥7天后，将温度降至自然温度，使其自然堆肥发酵14天，得到复合氨基酸肥料；
所述Bacillus licheniformis ZL-1菌剂的制备方法为：将Bacillus licheniformisZL-1接种到发酵培养液中进行发酵，在45～50℃，搅拌速度为180～200rpm，通气量为0.5～2vvm的条件下培养36～48h，得到Bacillus licheniformis ZL-1菌剂；所述发酵培养液配方为：葡萄糖1.5g/L、玉米粉1.5g/L、豆粕2.0g/L、氯化钠0.5g/L；
所述黑曲霉菌剂的制备方法为：将黑曲霉菌种接种到麸皮培养基中进行发酵，在37℃下浅盘静止培养3～5天，得到黑曲霉菌剂；所述麸皮培养基的配方为：麸皮：磷酸二氢钾：水的质量比＝1000:5:1000。
9.权利要求1所述Bacillus licheniformis ZL-1在生产角蛋白酶中的应用。
CN201711364361.4A 2017-12-18 2017-12-18 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用 Active CN108004169B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711364361.4A CN108004169B (zh) 2017-12-18 2017-12-18 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201711364361.4A CN108004169B (zh) 2017-12-18 2017-12-18 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108004169A true CN108004169A (zh) 2018-05-08
CN108004169B CN108004169B (zh) 2019-06-07

Family

ID=62059471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201711364361.4A Active CN108004169B (zh) 2017-12-18 2017-12-18 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108004169B (zh)

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109370944A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 江南大学 一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN110183252A (zh) * 2019-06-05 2019-08-30 江苏丘陵地区南京农业科学研究所 利用生物降解羽毛制备复合氨基酸液肥的方法及应用
CN110747128A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用
CN110862950A (zh) * 2019-12-24 2020-03-06 烟台富康生物科技有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其应用
CN110923175A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 江苏大道生物环境科技有限公司 芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用
CN112044584A (zh) * 2020-08-27 2020-12-08 程亮 一种益生菌提取原料处理装置
CN112831540A (zh) * 2021-03-23 2021-05-25 贝因美（杭州）食品研究院有限公司 一种奶粉加工中耐热地衣芽孢杆菌的特异培养基及其应用
CN114395516A (zh) * 2022-03-21 2022-04-26 河北科技大学 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用
CN114958668A (zh) * 2022-05-24 2022-08-30 武汉轻工大学 一种液体培养基以及微生物发酵制备纳米硒的方法
CN116606755A (zh) * 2023-03-15 2023-08-18 中国国际海运集装箱(集团)股份有限公司 地衣芽孢杆菌及其在降解聚烯烃中的应用
CN116656565A (zh) * 2023-06-16 2023-08-29 天典(广东)生物科技有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154144A (zh) * 2010-12-06 2011-08-17 天津科技大学 高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法
CN103804038A (zh) * 2014-01-23 2014-05-21 广东省微生物研究所 一种利用微生物发酵食用菌渣和家禽羽毛生产有机肥的方法
CN103834603A (zh) * 2014-03-31 2014-06-04 金陵科技学院 一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102154144A (zh) * 2010-12-06 2011-08-17 天津科技大学 高效降解羽毛角蛋白的菌株及其筛选方法
CN103804038A (zh) * 2014-01-23 2014-05-21 广东省微生物研究所 一种利用微生物发酵食用菌渣和家禽羽毛生产有机肥的方法
CN103834603A (zh) * 2014-03-31 2014-06-04 金陵科技学院 一种分解鸽子羽毛的地衣芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BO XU ET AL.: "Isolation and characterization of a new keratinolytic bacterium that exhibits significant feather-degrading capability", 《AFRICAN JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY》 *
C. M. WILLIAMS ET AL.: "Isolation, identification, and characterization of a featherdegrading bacterium", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
M. ROZS ET AL.: "Fermentation characteristics and secretion of proteases of a new keratinolytic strain of Bacillus licheniformis", 《BIOTECHNOLOGY LETTERS》 *
周莲 等: "解淀粉芽孢杆菌3-2发酵羽毛产氨基酸", 《微生物学通报》 *

Cited By (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109370944B (zh) * 2018-11-20 2020-09-04 江南大学 一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN109370944A (zh) * 2018-11-20 2019-02-22 江南大学 一株产蛋白酶的芽孢杆菌及其在堆肥中的应用
CN110183252A (zh) * 2019-06-05 2019-08-30 江苏丘陵地区南京农业科学研究所 利用生物降解羽毛制备复合氨基酸液肥的方法及应用
CN110183252B (zh) * 2019-06-05 2021-11-19 江苏丘陵地区南京农业科学研究所 利用生物降解羽毛制备复合氨基酸液肥的方法及应用
CN110747128A (zh) * 2019-11-18 2020-02-04 山东隆科特酶制剂有限公司 一株高产角蛋白酶的地衣芽孢杆菌菌株及其应用
CN110862950A (zh) * 2019-12-24 2020-03-06 烟台富康生物科技有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其应用
CN110923175A (zh) * 2019-12-26 2020-03-27 江苏大道生物环境科技有限公司 芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用
CN110923175B (zh) * 2019-12-26 2021-05-07 江苏大道生物环境科技有限公司 芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用
CN112044584B (zh) * 2020-08-27 2022-05-17 安徽中微微元生物科技有限公司 一种益生菌提取原料处理装置
CN112044584A (zh) * 2020-08-27 2020-12-08 程亮 一种益生菌提取原料处理装置
CN112831540A (zh) * 2021-03-23 2021-05-25 贝因美（杭州）食品研究院有限公司 一种奶粉加工中耐热地衣芽孢杆菌的特异培养基及其应用
CN114395516A (zh) * 2022-03-21 2022-04-26 河北科技大学 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用
CN114395516B (zh) * 2022-03-21 2024-01-26 河北科技大学 一种地衣芽孢杆菌td-4及其生产蛋白酶的方法和应用
CN114958668A (zh) * 2022-05-24 2022-08-30 武汉轻工大学 一种液体培养基以及微生物发酵制备纳米硒的方法
CN116606755A (zh) * 2023-03-15 2023-08-18 中国国际海运集装箱(集团)股份有限公司 地衣芽孢杆菌及其在降解聚烯烃中的应用
CN116606755B (zh) * 2023-03-15 2024-05-14 中国国际海运集装箱(集团)股份有限公司 地衣芽孢杆菌及其在降解聚烯烃中的应用
CN116656565A (zh) * 2023-06-16 2023-08-29 天典(广东)生物科技有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其应用
CN116656565B (zh) * 2023-06-16 2023-11-28 天典(广东)生物科技有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108004169B (zh) 2019-06-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108004169B (zh) 地衣芽孢杆菌zl-1及其应用
Jeong et al. Keratinolytic enzyme-mediated biodegradation of recalcitrant feather by a newly isolated Xanthomonas sp. P5
CN107868762A (zh) 产角蛋白酶的蜡样芽孢杆菌及其应用
AU2021103470A4 (en) Bacillus subtilis bs40-4 strain and method for composting organic wastes by using the same
CN105647832B (zh) 一株耐高温园林废弃物分解菌fhm1及其应用
CN105695367B (zh) 一种降解秸秆的复配菌剂fx及其应用
CN103255077B (zh) 枯草芽孢杆菌yb-04、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用
CN104498407B (zh) 一株产耐高温角蛋白酶的地衣芽孢杆菌utm107 及其应用
CN103667155B (zh) 一株枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 3-2及其应用
CN1769424A (zh) 一种芽孢杆菌菌株及其用途
CN103695354B (zh) 一株蜡状芽孢杆菌Bacillus cereus J2及其应用
CN107285815A (zh) 一种复合氨基酸肥料及其生产方法
CN110183252A (zh) 利用生物降解羽毛制备复合氨基酸液肥的方法及应用
CN105567609B (zh) 一株耐高温园林废弃物分解菌st2及其应用
CN107760623B (zh) 一株产中性生淀粉酶的阿氏芽孢杆菌
CN110317748A (zh) 一株链霉菌菌株及其在降解羽毛中的应用
CN110106090A (zh) 一种粗糙脉孢菌株及其应用
CN102399726B (zh) 一种芽孢八叠球菌及其应用
CN105670966B (zh) 一株耐高温园林废弃物分解菌st4及其应用
CN108070540A (zh) 一株产表面活性剂微生物及其在堆肥中的应用
CN102127515B (zh) 一株高产l-脯氨酸短波单胞杆菌(jnpp-1)的筛选及应用
CN104560817B (zh) 一株产植酸酶的嗜热地衣芽孢杆菌utm102及其应用
CN111154661B (zh) 复合菌剂及其应用
CN106222107B (zh) 一株来自猪场废弃物的极端嗜热细菌
CN102417890A (zh) 一株草木樨中华根瘤菌及应用其发酵产锰过氧化物酶的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant