CN110923175B - 芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用，属于生物菌肥技术领域。本发明筛选获得了一株对镰刀菌有明显拮抗作用的芽孢杆菌并将其用于餐厨垃圾的堆肥，可以实现餐厨垃圾的快速减量化、资源化。通过本发明的方法制备获得的菌肥能够改善土壤理化与生物特性，抑制植物病害发生，具有重要的工业应用前景。

Description

芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用
技术领域
本发明涉及芽孢杆菌及其餐厨垃圾减量化资源化生产有机肥中的应用，属于生物菌肥技术领域。
背景技术
餐厨垃圾营养丰富全面、含水量高、易腐败产生刺激性气味，对环境卫生造成恶劣影响，且容易滋长各类病原微生物、与蚊虫等害虫。由于中国的饮食习惯。餐桌浪费惊人，每天产生巨量的餐厨垃圾。产生巨大的环境污染，急需对餐厨垃圾进行快速高效的减量化处理方法。
我国农业生产中，有机肥的缺口巨大、有机肥具有养分全面、有机质含量高、长期施用可提高土壤有机质,改善土壤团粒结构,促进土壤微生物繁殖,使土壤疏松、通气,可增强土壤的保肥性能和缓冲力、增强保水、保肥、供肥能力.有机肥能进使种子发芽、根系生长和养分吸收.改善农产品品质。
芽孢杆菌作为一种具有生防应用前景的细菌引起了极大的关注。芽孢杆菌通过营养和空间位点的竞争抑制病原菌的生长。芽孢杆菌产生细菌素对病原菌中的霉菌、酵母、细菌都有一定的抑制作用。芽孢杆菌分泌的几丁质酶分解病原菌的细胞壁生防作用显著、分泌抗菌蛋白抑制病原菌孢子产生和萌发，使得菌丝畸形，细胞壁溶解和原生质泄露。芽孢杆菌产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号蛋白，对植物生长的促进作用、诱导植物抗性。
由于餐厨垃圾营养丰富、具有经过发酵生产有机肥的可能。
本发明通过筛选获得一株可高效发酵餐厨垃圾生产有机肥的芽孢杆菌JSDD3012、开发了JSDD3012发酵餐厨垃圾生产有机肥的工艺方法，实现了餐厨垃圾的减量化与资源化，生产的有机肥符合国家有机肥标准NY525-2012与生物有机肥标准NY884-2012。并且生产的有机肥中每克干物质芽孢杆菌含量超过109个。
发明内容
本发明的第一个目的是保护一株高效发酵餐厨垃圾生产有机肥的芽孢杆菌，分类命名为Bacillus licheniformis，已于2019年7月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：60726，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
本发明的第二个目的是提供含有所述芽孢杆菌的微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂中含有细胞或芽孢形态的所述芽孢杆菌。
本发明的第三个目的提供应用所述芽孢杆菌发酵餐厨垃圾生产有机肥的工艺方法
本发明的第四个目的是提供含有大量所述芽孢杆菌的有机肥。
在本一种实施方式中，所述肥料是以餐厨垃圾为原料，接种所述芽孢杆菌，堆肥后制得。
本发明的第五个目的是提供一种餐厨垃圾的处理方法，以所述芽孢杆菌为发酵微生物，在25～30℃固态发酵20～72h。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是分阶段发酵，包括第一阶段和第二阶段；
所述第一阶段将餐厨垃圾与麸皮以2:1的质量比混合的比例混合，接种菌浓为(1-8)×106CFU/g发酵基质的芽孢杆菌3kg，在30分钟内升温到80℃，保持8～10分钟，通风降温20～30分钟后，再次在30分钟内升温到80℃，保持8～10分钟，后通风降温，保持28-30℃，发酵过程持续70～75h，每小时搅拌120转；
所述第二阶段排出第一阶段发酵后的占发酵体系总质量不超过15％的菌肥，加入与第一阶段相同质量的粉碎后的餐厨垃圾，于30分钟内升温到80℃，保持10分钟，通风降温，30min后再重复一遍升温到80℃，保持10分钟，后通风降温，保持28-30℃，发酵过程持续22h，罐内每小时搅拌120转。
在本发明的一种实施方式中，将发酵后的菌肥通风干燥至含水率低于10％。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是接种菌浓大于1×109CFU/ml的种子液。
在本发明的一种实施方式中，所述种子液按如下方式制备：将芽孢杆菌单菌落接种至LB液态培养基中，于28℃、140rpm摇床培养2天。
在本发明的一种实施方式中，所述发酵是质量比为(2～3):1的餐厨垃圾和麸皮为原料，并调节含水量至45～50％。
在本发明的一种实施方式中，所述餐厨垃圾粉碎至20目。
在本发明的一种实施方式中，所述方法重复第二阶段的发酵过程。
本发明还要求保护所述方法制备的菌肥在农作物培育方面的应用。
有益效果：本发明具有如下优点：
1、本发明筛选获得了一株对高效发酵餐厨垃圾生产有机肥的芽孢杆菌；
2、本发明菌种与工艺使餐厨垃圾的脱水率达到了85-90％。实现了餐厨垃圾的高效减量化。
3、本发明生产的有机肥达到国家有机肥标准NY525-2012与生物有机肥标准NY884-2012，实现了餐厨垃圾的快速资源化。
4、本发明发酵工艺方法操作容易、设备简单、适合产业化应用。
5、本发明制备的有机肥中芽孢杆菌的含量超过109CFU/克。
生物材料保藏
一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，分类命名为Bacilluslicheniformis，已于2019年7月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：60726，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
具体实施方式
测定方法：
蛋白质含量：凯氏定氮法(GB/T5009.5－2003)；
脂肪含量：酸水解法(GB/T5009.6－2003)；
有机质含量：采用灼烧法测定有机质含量；
含水率：采用减重法测定；
降解率定义为：可降解成分中，已降解部分的质量占可降解成分初始质量的百分比。
培养基配方：
LB固态培养基：蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，琼脂20g。
LB液态培养基：蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL。
实施例1菌株的筛选及鉴定
(1)将采集的企业食堂附近的土壤样品10g，放入带有玻璃珠90ml无菌水的三角瓶中，30℃下200r/min振荡培养30min后，将其80℃水浴10min，然后按梯度逐级稀释，涂布于LB平板。将涂布后的LB平板于28℃下培养3天，挑取不同单菌落，在LB平板上重复划线分离、纯化3次后镜检，选择具有芽孢的菌株。
(2)将步骤(1)分离的芽孢杆菌分别接种于LB培养基中，培养16h，获得种子液；
(3)以企业食堂收集的餐厨垃圾为培养基质，接种10％的步骤(2)的种子液，于55℃发酵48h，对发酵体系的脂肪含量变化进行检测，共筛选到16株降解效果相对较优的芽孢杆菌，如表1所示：
表1芽孢杆菌对脂肪的降解率
Figure BDA0002339225200000031
Figure BDA0002339225200000041
(3)选择餐厨垃圾降解率超过70％的菌株进行16S rDNA鉴定，其中编号3、8为地衣芽孢杆菌，编号4为解淀粉芽孢杆菌，编号12为短小芽孢杆菌。
(4)具有生物防治功能的芽孢杆菌接种于100mL的LB液态培养基中，于37℃、140rpm摇床培养2天，两天后分装，分装后置于25％甘油中，-80℃冰箱长期保藏。
实施例2
(1)将鼠伤寒沙门氏菌SL1344在LB培养基中进行活化培养后，37℃225rpm震荡培养12h。
(2)将实施例1筛选获得的4株芽孢杆菌活化、传代之后，用LB培养基于37℃培养14h后离心，收集培养物上请，以未接种的LB培养基作为对照组。培养物上清及对照组用孔径为0.22微米的无菌滤膜过滤待用。
(3)分别向5mL上述4株芽孢杆菌的培养物上清中加入50μL菌浓为1×109CFU/mL的沙门氏菌SL1344菌液，37℃静置培养24h，在测定共培养物的OD600。
表2芽孢杆菌对沙门氏菌的生长抑制效果
Figure BDA0002339225200000042
结果显示，地衣芽孢杆菌3对于沙门氏菌有很好的抑制效果，对其进行专利菌种保藏。
实施例3生物防治菌株用于餐厨垃圾堆肥
(1)将实施例2筛选获得的具有生物防治功能的地衣芽孢杆菌接种至1L的LB液态培养基中，于28℃、140rpm摇床培养2天，获得菌浓为109CFU/mL的菌液作为下一步的发酵种子液。
(2)取餐厨垃圾300公斤，粉碎后过20目筛子，过筛后与约150公斤麸皮混合，混合后含水量在45-50％之间。
(3)将步骤(2)的餐厨垃圾与麸皮的混合物装置至江苏大道生物环境技术有限公司研发固态发酵罐中，按每一百公斤餐厨垃圾接种1公斤步骤(1)的地衣芽孢杆菌菌液。
(4)餐厨垃圾与麸皮以及菌种混合物在发酵罐中升温到80℃，保持10分钟，通风降温，半小时后再重复一遍升温到80℃，保持10分钟，后通风降温，保持28-30℃，罐内每小时搅拌120次，整个发酵过程持续72h。
(5)发酵培养72h后，发酵罐内通风干燥2h，使芽孢杆菌菌肥含水率低于10％，获得有机肥。
(6)将餐厨垃圾总投加量10-15％的有机肥排放，余下的富含芽孢杆菌的有机肥作为菌种与粉碎后的餐厨垃圾混合，发酵罐中升温到80℃，保持10分钟，通风降温，30min后再重复一遍升温到80℃，保持10分钟，后通风降温，保持28-30℃，共发酵22h，罐内每小时搅拌120次。发酵结束后，对罐内通风干燥2h，使有机肥含水率低于10％。
(7)重复步骤(5)～(6)，可实现餐厨垃圾的每日投放，有机肥每日排出，实现餐厨垃圾的连续处理，与有机肥肥的连续产出。
需特别说明，芽孢杆菌的首次培养需72h，其余仅需要22h，并且仅第一次需要大量混合麸皮，其余并不需要混合大量麸皮，仅当含水率无法达到要求时(40-50％)根据餐厨垃圾的情况，适量补充。
对本实施例制备的有机肥进行检测，检测方法参照NY525-2012、NY884-2012标准，结果显示，每g有机肥中芽孢杆菌含量超过1×109CFU；发酵22h，蛋白降解率为62.3％，脂肪降解率为65.37％，有机质(蛋白质、脂肪及总糖)67.5％、总养分12.8％，水分7.3％，肥料中粪大肠菌群个数为3个/g，蛔虫卵死亡率为99.99％。符合国家有机肥标准NY525-2012与生物有机肥标准NY884-2012。
对比例1：
按实施例2的方式进行堆肥，区别在于，调节含水量为30％，结果显示，每g有机肥中芽孢杆菌含量为1×106CFU；蛋白降解率为22.8％，脂肪降解率为16.59％，有机质32.45％、总养分5.3％，水分9.2％，不符合国家生物有机肥NY884-2012x标准。
对比例2
按实施例2的方式进行堆肥，区别在于，第一阶段发酵时间缩短至24h，结果显示，每g有机肥中芽孢杆菌含量为1×107CFU；蛋白降解率为31.5％，脂肪降解率为25.07％，有机质37.45％、总养分7.1％，水分8.3％，不符合国家生物有机肥NY884-2012x标准。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种餐厨垃圾的处理方法，其特征在于，以芽孢杆菌为发酵微生物，接种至含有餐厨垃圾的基质，固态发酵；
所述的芽孢杆菌，分类命名为Bacillus licheniformis，已于2019年7月11日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：60726，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼；
所述发酵是分阶段发酵，包括第一阶段和第二阶段；
所述第一阶段将餐厨垃圾与麸皮以（2〜3）：1的质量比混合，接种菌浓为（1〜8）×106CFU/g发酵基质的芽孢杆菌，升温至70〜80℃，保持8〜10分钟，通风降温20〜30分钟后，再重复升温至70〜80℃，保持8〜10分钟，后通风降温，于28〜30℃发酵70〜75h；
所述第二阶段排出第一阶段发酵后的占发酵体系总质量不超过15%的菌肥，加入与第一阶段相同质量的粉碎后的餐厨垃圾，升温至70〜80℃，保持5〜15分钟，通风降温，再重复升温到70〜80℃，保持5〜15分钟，后通风降温，于28-30℃持续发酵22h。
2.根据权利要求1所述的一种餐厨垃圾的处理方法，其特征在于，重复第二阶段若干次。
3.根据权利要求1所述的一种餐厨垃圾的处理方法，其特征在于，接种前将餐厨垃圾和麸皮的混合物的含水量调节至45〜50%。
4.根据权利要求1所述的一种餐厨垃圾的处理方法，其特征在于，将发酵后的菌肥通风干燥至含水率低于10%。
5.含有权利要求1所述芽孢杆菌的微生物制剂。
6.权利要求1所述的芽孢杆菌，或权利要求5所述的微生物制剂在发酵餐厨垃圾生产有机肥中的应用。
7.应用权利要求1〜4任一所述方法制备获得的含有大量权利要求1所述芽孢杆菌的有机肥。
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