CN116656565B - 一种地衣芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种地衣芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明的地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)phb01，已于2023年5月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.63466。本发明的地衣芽孢杆菌phb01发酵产生的蛋白酶能够有效降解发酵原料中残留蛋白质，提高氨基酸态氮和全氮的含量；本发明的地衣芽孢杆菌phb01在20％高盐条件下的蛋白酶酶活性高；本发明的地衣芽孢杆菌phb01遗传稳定性较好，可以作为工业生产备用菌株。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌及其应用。
背景技术
酱油、豆酱等传统发酵调味品通常由大豆等主要原料经米曲霉发酵而成，米曲霉在生长过程中产生丰富的蛋白酶能够将原料中的蛋白类物质水解形成具有优质风味的肽类或氨基酸。然而酱油在发酵结束后的废渣中仍含有大约20％的粗蛋白，这表明原料中含有一部分难降解的蛋白，在发酵过程中米曲霉所产生的蛋白酶仍不能将其完全水解。
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，可以根据水解方式分为内肽酶和外肽酶，也可以根据其适合的作用条件分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。蛋白酶的来源广泛，可以从动、植物中提取或通过微生物发酵制得，食品工业中常用的蛋白酶大多以微生物来源为主，主要来源菌种包括黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌等。由于蛋白质的分子量大，结构复杂，种类丰富，同时蛋白酶也属于一大类物质，不同来源的蛋白酶其作用方式、切割位点可能不同，从而产生完全不同的水解效果。近年来，对于耐盐性的蛋白酶也有一些研究，其中大多侧重于在高盐条件下储存后的酶活下降情况，直接在高盐条件下反应测得的酶活研究较少。在这类研究中，有一类嗜盐古生菌的部分研究结果显示其产蛋白酶在高盐条件下的酶活保留率较高，但这类菌株不属于食品国家安全标准范围内的食品可用蛋白酶生产菌株，产蛋白酶也不具有针对酿造难水解蛋白的强降解能力。
为了提高发酵原料中蛋白质的利用率，研究者们采用了多种方法，尤其是通过对米曲霉菌株进行改良，提高其制曲的蛋白酶活力，这种方法虽然在生产操作上简单但并没有改变米曲霉蛋白酶的类型或作用机制，但无法被米曲霉水解的蛋白类物质仍然没有被触及。也有部分研究者通过优化发酵的温度、时间等因素以提高蛋白水解率，这类工艺优化对于传统发酵行业而言已经基本趋于饱和，难以再在现有基础上大幅度改善。近年来，一些厂家开始尝试在发酵过程中补充蛋白酶以达到酶、菌共酵的效果，然而现阶段国内、外的酶制剂厂家都有食品级蛋白酶产品，但其性质比较趋于同质化，针对酿造食品专用的蛋白酶品类较少，对发酵原料中的难降解蛋白水解能力有限，并且耐盐性差，在10％以上的高渗透压条件下只能发挥其作用的20％以下，使用效率极低。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种地衣芽孢杆菌及其应用，本发明的地衣芽孢杆菌产生的蛋白酶能够异性酶解发酵难水解蛋白，并且在高盐条件下依然具有较高活性。
为实现上述目的，本发明提供一种地衣芽孢杆菌，所述地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)phb01，已于2023年5月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.63466。本申请发明人针对豆类发酵调味品剩余的难水解蛋白，经过大量的实验筛选能够有效降解难水解蛋白的蛋白酶发酵菌株，再通过ARTP诱变法提高其产蛋白酶在高盐条件下的作用效果，最终获得了一株蛋白酶发酵菌株，该菌株产生的蛋白酶能够异性酶解发酵难水解蛋白，并且在高盐条件下依然具有较高活性。
作为本发明所述地衣芽孢杆菌的优选实施方式，所述地衣芽孢杆菌phb01的序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供所述的地衣芽孢杆菌phb01在生产蛋白酶中的应用。
本发明还提供所述的地衣芽孢杆菌phb01在制备豆类调味品中的应用。
本发明还提供一种蛋白酶，采用所述的地衣芽孢杆菌发酵制备得到。本申请发明人经过大量的实验筛选得到地衣芽孢杆菌phb01，该菌株能够发酵产生phb01蛋白酶，phb01蛋白酶能够特异性降解酱油或发酵酱原料中难以被米曲霉水解的蛋白质，并且在高盐条件下作用效果良好，是一种专门用于酿造食品生产的蛋白酶。
本发明还提供所述蛋白酶在制备豆类调味品中的应用。本申请发明人使用ARTP法对蛋白酶发酵菌株进行诱变，提高了phb01蛋白酶在高盐体系下的酶活，比其他蛋白酶在高盐条件下的酶活保留率显著提高，更适应高盐的发酵体系。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述豆类调味品包括酱油、豆酱。
本发明还提供一种提高豆类调味品中氨基酸态氮的方法，所述方法为将所述蛋白酶加入酱醪中进行发酵。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明提供一种地衣芽孢杆菌及其应用，本发明从天然发酵酱醪中分离出产蛋白酶的菌株，再以酱油发酵渣中残留的蛋白质作为酶解底物，筛选出一株蛋白酶发酵菌株(地衣芽孢杆菌phb01)，该菌株培养液中的蛋白酶能够有效降解发酵原料中残留蛋白质，经酶解的酱油渣滤液中氨基酸态氮提高16.36％，全氮提高20.29％；本发明的地衣芽孢杆菌phb01在20％高盐条件下的蛋白酶酶活性高；本发明的地衣芽孢杆菌phb01遗传稳定性较好，可以作为工业生产备用菌株。
附图说明
图1为地衣芽孢杆菌phb01菌落形态图。
图2为实施例4中不加酶组酱油氨基酸分析图。
图3为实施例4中地衣芽孢杆菌phb01蛋白酶组酱油氨基酸分析图。
图4为实施例4中商品化碱性蛋白酶组酱油氨基酸分析图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，本发明通过下列实施例进一步说明。显然，下列实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。应理解，本发明实施例仅用于说明本发明的技术效果，而非用于限制本发明的保护范围。除非特别说明，否则本发明实施例中采用的方法和试验条件均为本领域常规使用的方法和试验条件，使用的试剂、设备和培养基均为本领域常规使用的试剂、设备和培养基，均可通过现有方法制备获得或通过市售购买获得。
实施例1菌株的分离与筛选
1、原材料的处理：
取传统高盐稀态工艺发酵10天、30天、50天、90天的酱醪，分别将10g酱醪加入至100mL含NaCl 0.85％的无菌生理盐水中，使用均质袋均质后，再用无菌生理盐水将酱醪均质液稀释至10-3～10-6的梯度稀释液，分别从各稀释液中取0.1mL，在含盐10％的LB固态培养基平板上均匀涂布，将平板倒置放于38℃培养箱中培养24～48h，选取菌落数少于300个的平板，将其全部菌落挑取并分别接种至LB肉汤培养基试管中，在37℃转速200r/min的摇床中培养12h。
2、菌种的初筛
将培养好的菌液在10000r/min条件下离心去除菌体保留菌液，根据GB1886.174中的方法检测各个菌液中的酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶的酶活力，分别选取产酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶最高的10个菌株。
3、菌种的复筛
(1)将初筛选取的菌株分别接种至LB培养基中，在37℃转速200r/min的摇床中培养12h，离心去除菌体后在50℃条件下浓缩10倍，检测各浓缩液的蛋白酶酶活；
(2)取酱油发酵渣，低温烘干后打成均一细致的粉末，再将粉末分装至试管中，每组1g酱油渣，加入10mL纯水，121℃灭菌15min，冷却后分别加入各菌株的蛋白酶浓缩液500U，对照组不加入；混合均匀后，在30℃条件下摇床酶解72h；
(3)酱渣酶解液用滤纸过滤后检测氨基酸态氮和全氮的含量。
结果如表1所示，其中氨基酸态氮及全氮较对照组有显著提升的菌种有7株，选择氨基酸态氮及全氮含量相对于对照组提高最多的作为目标菌株P-7，该菌株主要产生的蛋白酶为碱性蛋白酶，经该菌株产生的蛋白酶酶解后酱渣滤液中的氨基酸态氮含量提高16.36％，全氮含量提高20.29％。
表1初筛菌株酶解酱渣后酶解液中氨基酸态氮、全氮含量
4、菌种的诱变
调味品发酵通常是高盐体系，蛋白酶即使能够对发酵原料中的难水解蛋白起作用，也需要耐盐性好才能充分发挥作用。对经过筛选获得的优质菌株P-7进行诱变，提高其产蛋白酶在高盐条件下反应的保留率，具体诱变方法如下：
(1)用LB培养基活化P-7菌株至对数生长期，将菌液进行ARTP诱变处理后，用0.85％的无菌生理盐水梯度稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6的稀释液。将各浓度的稀释液分别取0.1mL均匀涂布于LB琼脂培养基表面，37℃培养48h；
(2)挑取菌落较大的单一菌落，接种至LB肉汤培养基中37℃摇床培养12h，离心去除菌体，检测上清液中的蛋白酶酶活，剔除酶活显著低于初始菌株酶活的菌株，余下的菌株培养液再在20％盐的条件下检测其耐盐性蛋白酶酶活。其中，高盐条件下的酶活检测方法在GB1886.174中规定的碱性蛋白酶检测方法基础上进行调整，在酪蛋白溶液及相应缓冲液中分别加入20％的NaCl，从而使酶解反应体系中的含盐量达到20％，反应温度、时间及检测波长等条件不改变。
在所有诱变选育获得的菌株中，高盐酶活保留率高于初始菌株P-7的共有9株，具体酶活情况如表2所示。
表2诱变菌株培养液的碱性蛋白酶活力及高盐条件下酶活保留情况
| 菌种名称 | 蛋白酶活力U/mL | 20％盐蛋白酶活力U/mL | 高盐酶活保留率％ |
| P-7(初始) | 106.2 | 16.6 | 15.6 |
| P7-2 | 123.6 | 23.3 | 18.8 |
| P7-7 | 133.8 | 29.8 | 22.3 |
| P7-15 | 118.1 | 21.5 | 18.2 |
| P7-18 | 140.0 | 22.8 | 16.3 |
| P7-31 | 128.2 | 32.4 | 25.3 |
| P7-36 | 152.4 | 72.2 | 47.4 |
| P7-39 | 141.0 | 47.9 | 34.0 |
| P7-44 | 109.5 | 29.5 | 26.9 |
| P7-50 | 144.9 | 60.6 | 41.8 |
根据研究目的选择高盐酶活保留率提高最大的P7-36菌株作为优选菌株，本发明将上述P7-36菌株送至华大基因进行测序鉴定，其基因序列如SEQ ID NO:1所示，结果为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。
所述SEQ ID NO:1为：
经上述筛选分离以及鉴定，将P7-36菌株进行保藏。发明人已于2023年5月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，并命名为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)phb01，获得的保藏号为GDMCC NO:63466。
本实施例所得的地衣芽孢杆菌phb01的菌落形态如图1所示。
实施例2地衣芽孢杆菌phb01的传代稳定性
本实施例将实施例1中获得的优选菌株地衣芽孢杆菌phb01在LB肉汤培养基中连续传代10代，将第2代、第5代、第10代的菌株培养至12h时取出，检测其在600nm条件下的OD值，以及其菌液中的蛋白酶活力和20％盐蛋白酶的活力，将以上几代之间的检测结果进行比较以判断其遗传稳定性。具体数据如表3。
表3地衣芽孢杆菌phb01的传代稳定性
| 检测项目 | 第2代 | 第5代 | 第10代 |
| 12hOD600 | 1.21 | 1.22 | 1.21 |
| 差异 | 0.00％ | 0.83％ | 0.00％ |
| 蛋白酶活力U/mL | 150.4 | 153 | 152.8 |
| 差异 | -1.31％ | 0.39％ | 0.26％ |
| 20％盐蛋白酶活力U/mL | 70.8 | 82.5 | 71.7 |
| 差异 | -1.94％ | 0.42％ | -0.69％ |
从上述各代菌株的OD值、蛋白酶活力以及20％盐蛋白酶活力来看，各代菌株的差异较小，差异率的绝对值小于5％，且均显著高于出发菌株P-7，这表明地衣芽孢杆菌phb01的遗传稳定性较好，可以作为工业生产备用菌株。
实施例3地衣芽孢杆菌phb01蛋白酶的制备及性质
1、本实施例提供采用实施例1的地衣芽孢杆菌phb01发酵产蛋白酶的方法，包括以下步骤：
(1)菌种活化：从保藏的地衣芽孢杆菌phb01甘油管中吸取0.1mL菌液，接种至具有100mL LB培养基的锥形瓶中，37℃摇床220r/min培养10～12h。
(2)种子液培养：将活化好的菌种接种至种子培养基中，接种量为2-3％，37℃摇床220r/min培养8-10h；所述种子培养基：1％蛋白胨，1％葡萄糖，0.5％氯化钠，其余成分为水，115℃灭20min。
(3)发酵培养：配制发酵培养基大豆粉200g，玉米浆150kg，葡萄糖100g，磷酸二氢钾40g，磷酸氢二钾20g，加水定容至10L后装入20L发酵罐，用氨水调节初始pH至7.5，121℃灭菌20min，冷却后接种活化好的phb01菌液800mL。37℃保温发酵，控制转速起始25HZ，通气量600m3/h；发酵2h后转速调整至50HZ，空气流量调整至900m3/h，发酵过程中控制葡萄糖含量在1-2g/L。发酵35h后放出发酵液。
(4)蛋白酶制备：在发酵液中加入4％硅藻土搅拌30min后过滤，将滤液用10000Da分子量中空纤维膜浓缩至初始体积的1/10，加入20％甘油，0.1％山梨酸钾后备用。
(5)检测发酵液及最终蛋白酶的酶活，并根据实施例1中的方法检测蛋白酶在20％盐条件下的酶活。
表4蛋白酶酶活
| 发酵液酶活 | 浓缩液酶活 | 蛋白酶酶活 | 蛋白酶20％盐酶活 |
| 8120U/mL | 66000U/mL | 52000U/mL | 24600U/mL |
由表4可知，制备得到的phb01蛋白酶液，其最终酶活为52000U/mL，20％盐条件下酶活为24600U/mL，高盐酶活保留率为47.3％，与原始菌种培养液的高盐酶活保留率相当。
2、根据实施例1菌种复筛中酶解酱油渣的方法验证phb01蛋白酶的作用效果，具体实验方法如下：取酱油发酵渣，低温烘干后打成均一细致的粉末，再将粉末分装至试管中，每组1g酱油渣，加入10mL纯水，121℃灭菌15min，冷却后加入phb01蛋白酶500U，以不加蛋白酶组作为空白组、商品化碱性蛋白酶作为对照组。混合均匀后，在30℃条件下摇床酶解72h。酶解结束后检测酶解液中的氨基氮及全氮含量。
结果如表5所示，phb01蛋白酶能够有效作用于酱油渣中难水解蛋白，酶解液中的氨基酸态氮提高20.37％，全氮含量显著提高31.82％，表明酱渣中蛋白水解率显著提高。
表5phb01蛋白酶酶解酱渣后酶解液中氨基氮、全氮含量
| 氨基酸态氮g/100mL | 全氮g/100mL | |
| 空白组 | 0.054 | 0.066 |
| phb01蛋白酶酶解 | 0.065 | 0.087 |
| 商品化碱性蛋白酶酶解 | 0.056 | 0.073 |
实施例4phb01蛋白酶在酱油发酵中的应用
本实施例采用高盐稀态工艺发酵酱油，在酱醪发酵的0～1天内加入酱醪体积0.05％的phb01蛋白酶，同时以加入0.05％商品化碱性蛋白酶作为对照组，然后继续按照常规生产工艺进行发酵，发酵结束后，检测酱油的氨基氮、全氮含量，以及氨基酸种类分析。
结果如表6～表7，图2～4所示。由表6可知，在发酵过程中使用phb01蛋白酶后发酵酱油的氨基酸态氮和全氮含量都有显著提高，其中氨基酸态氮提高12.6％，全氮提高14.4％，并且相对于商品化碱性蛋白酶效果更佳。由表7可知，如表7所示，使用phb01菌株生产的phb01蛋白酶进行发酵的酱油中各类氨基酸的含量均有不同程度的提高。
表6酱油指标检测结果
| 氨基酸态氮g/100mL | 全氮g/100mL | |
| 不加酶组 | 0.95 | 1.18 |
| phb01蛋白酶组 | 1.07 | 1.35 |
| 商品化碱性蛋白酶组 | 0.98 | 1.21 |
表7酱油氨基酸分析
实施例5phb01蛋白酶在豆酱发酵中的应用
将大豆高压蒸煮后与面粉混合搅拌，加入总质量0.3％的米曲霉沪酿3.042种曲，同时在实验组中加入0.05％的phb01蛋白酶再次搅拌混合均匀，对照组不加入，30～32℃通风制曲42h后，加入12～14％的盐水至刚好末过曲料，30℃继续发酵80天后成为豆酱，对豆酱进行理化指标检测及味道感官评价；感官评价的评分标准：选取15名鉴评人员从鲜味、香气、浓厚感和综合风味4个维度进行打分，从1-5分依次为不接受、可接受、较好、好、很好，最后统计平均分，鲜味评分越高，表示鲜味越足；香气评分越高，表示香气越好；浓厚感评分越高，表示浓厚感越足；综合风味评分越高，表示综合风味越好。
结果如表8、9所示。由表8可知，在豆酱生产过程中使用phb01蛋白酶对发酵豆酱的氨基酸态氮含量能起到显著的提升作用，总酸同步提高，而对pH影响不大；由表9可知，通过感官评价，使用phb01蛋白酶后豆酱的鲜味、香气、浓厚感都有一定程度的提升，并且对综合风味起到改善作用。
表8豆酱指标检测结果
表9豆酱感官评价结果
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)phb01，已于2023年5月14日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，保藏编号为GDMCC No.63466。
2.根据权利要求1所述的地衣芽孢杆菌，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌phb01的序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1～2任一项所述的地衣芽孢杆菌phb01在生产蛋白酶中的应用。
4.权利要求1～2任一项所述的地衣芽孢杆菌phb01在制备豆类调味品中的应用。
5.一种蛋白酶，其特征在于，采用权利要求1～2任一项所述的地衣芽孢杆菌发酵制备得到。
6.权利要求5所述蛋白酶在制备豆类调味品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述豆类调味品包括酱油、豆酱。
8.一种提高豆类调味品中氨基酸态氮的方法，其特征在于，所述方法为将权利要求5所述蛋白酶加入酱醪中进行发酵。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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