CN103255077B - 枯草芽孢杆菌yb-04、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种枯草芽孢杆菌菌株YB-04及其菌剂制备方法，该菌株保藏编号为CGMCCNO.6497。该菌株对秸秆具有明显的降解效果，且对小麦根部全蚀病、纹枯病等抑菌效果明显，发现其表现出较为广谱的抑菌效果。单独作用于秸秆时，降解率可达49%，当与真菌混合作用于秸秆时，使秸秆表面较湿润腐败，降解率达到了最大值59%，实验组合的降解作用远远优于市售菌剂的降解作用。本发明中YB-04菌剂还表现出较为广谱的抑菌效果，其中对棉花黄萎病菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病等根际病害抑菌效果较好。不仅能够降解秸秆，还能够抑制根际病原菌，调节根际微生物群落，具有很好开发利用前景。

Description

枯草芽孢杆菌YB-04、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌YB-04、其微生物制剂及其在秸秆降解中的应用。

背景技术

近年来秸秆还田越来越受到重视，一方面大规模的农业生产使秸秆需要就近处理，以节约劳力；另一方面，长期单纯施用化肥不利于土壤肥力的发育。农作物秸秆中含有丰富的氮﹑磷﹑钾等有机养分，秸秆还田后将增加土壤有机质的含量，改善土壤结构﹑培肥地力，有大量研究表明秸秆还田后对土壤养分及有机质含量都有提高。但在自然条件下，秸秆腐解速度慢，如果大量还田则秸秆不能充分的腐解，会影响播种质量﹑出苗和苗期生长。秸秆覆盖后还会为病虫害提供越冬的场所对下茬作物产生影响。随着机械化的发展，秸秆还田已成为先进农业生产的重要部分，由于秸秆自然腐解速度过慢，秸秆还田带来了一系列的问题，深入研究秸秆降解，将从根本上解决土壤病害，秸秆焚烧，农产品污染等问题。秸秆快速降解是一种实现资源循环利用技术，在农业的可持续发展中有开发利用的潜力。微生物秸秆催腐剂是秸秆快速降解技术研究较多的方向，秸秆催腐剂主要是由强烈分泌秸秆降解酶的菌株组成。在微生物秸秆催腐剂的综合作用下使纤维素分子彻底解体，有机物矿质化分解后，继而腐质化形成有机质。随着不断的研究发展，人们所复配的降解菌株不仅能够促进秸秆的快速降解，同时还向抑制病虫害的方向发展。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），具有生长繁殖快、营养简单，能产生耐热抗逆的芽孢，对人畜无害、环境兼容性好、能够抑制多种植物病害、不易使农作物产生抗药性。而且批量生产工艺简单，成本也较低，施用方便，储存期长等优点，有些菌株在降解秸秆中起到很好的作用，因此，是一种理想的降解制剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有拮抗小麦全蚀病作用的枯草芽孢杆菌YB-04，并给出了具体的培养应用方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：

分离出了一种枯草芽孢杆菌YB-04，其保藏编号为CGMCC NO.6497。

一种微生物制剂，其特征在于，所含活性成分为上述枯草芽孢杆菌YB-04或/和其代谢产物。

所述枯草芽孢杆菌YB-04以液态剂型应用于秸秆降解，液态菌剂制备方法：将保存的枯草芽孢杆菌YB-04移入TSA试管斜面培养基上，28～35℃下培养24～36小时获得菌体；将试管中菌种接入LB液体培养液内，在28～32℃下震荡培养12～16小时制成种子液；液体发酵培养基为：取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加水配制成含葡萄糖1.2%、玉米粉1.8%、黄豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.2%的培养液；对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按5%的接种量接种于以上配好的培养液，在27～34℃，转速180rpm，PH8.0条件下发酵培养至少36～48小时后，收集发酵液，即得液体菌剂。

所述基质培养基由取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉加水配制成，含葡萄糖9～12g/L、玉米粉11～16g/L、黄豆饼粉12～16g/L的的质量比混匀后经高压湿热灭菌而制成。

本发明具有积极有益的效果：

所分离出的枯草芽孢杆菌YB-04 CGMCC NO. 6497，对秸秆具有明显的降解效果，且对小麦根部全蚀病、纹枯病等抑菌效果明显，发现其表现出较为广谱的抑菌效果。单独作用于秸秆时，降解率可达49%，当与真菌混合作用于秸秆时，使秸秆表面较湿润腐败，降解率达到了最大值59%，实验组合的降解作用远远优于市售菌剂的降解作用。将将解后的秸秆进行纤维素含量测定，发现各试验组的纤维素含量均有所下降，与3种真菌组合降解后的秸秆中纤维素含量变为44.7%，可见秸秆中的纤维素被大量降解，秸秆的整体结构被打乱，从而秸秆得到良好的降解。

本发明所述枯草芽孢杆菌YB-04，已于2012年9月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，该枯草芽孢杆菌YB-04的保藏编号为CGMCC NO.6497。

附图说明

图1为菌株YB-04的菌落特征图；

图2为菌株YB-04 的分子进化树图；

图3为P3、P4、P5单独降解秸秆的效果图；

图4为P3、P4、P5分别于YB-04、L8联合降解秸秆的效果图；

图5为P3、P4、P5 混合降解秸秆的效果图；

图6为P3、P4、P5与YB-04、L8混合降解秸秆的效果图；

图7为市售菌剂1降解秸秆的效果图；

图8为市售菌剂2降解秸秆的效果图。

具体实施方式

为了使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限止本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按常规实验方法进行。

实施例1  枯草芽孢杆菌YB-04的分离、筛选

样品采集：样品采集自河南省农科院原阳基地多个田间正在腐烂的玉米和小麦秸秆（采集时间：2010年6-2010年10月；具体采集地点：河南省农科院原阳基地，采集人：谢茂芳），用保鲜袋带回。

枯草芽孢杆菌的分离与纯化：取采回来的腐烂秸秆，秤取1g放入含有100mL无菌水的三角瓶中，在28℃恒温振荡器上充分振荡2h。以稀释涂布平板法将10^-1-10^-7的样液涂布于LB 平板中，37℃培养一天，依据菌落形态分别在LB平板上进行纯化。并将培养基倒置于37℃恒温培养过夜, 最后挑取形态、色泽、大小与枯草芽孢杆菌类似的单菌落转接到LB平板培养基上，于37℃培养2d后，记录其编号，再挑选单菌落接种到LB斜面培养基上保存。

表1 具有较大透明圈菌株

经过土壤样品微生物分离，共分离出20株类似细菌菌株，经过反复筛选比较共得效果较好的细3株，分别命名为YB-04、L4和L8。该3株菌均可在其相应筛选培养基上旺盛生长，如表1所示，在淀粉降解筛选培养基和蛋白降解筛选培养基上产生大于20mm的透明质圈，表明YB-04富含降解淀粉和蛋白质的酶类，具有很好的降解秸秆的潜力。

实施例2 枯草芽孢杆菌YB-04的鉴定

（1）形态和生理生化分类鉴定  采用菌落形态观察及显微观测法鉴定YB-04菌株，并检索文献确定其种类。个体的形态学特征，包括革兰氏染色反应﹑芽孢观察﹑菌体大小等；群体形态观察，观察菌落形状﹑菌落表面特征﹑菌落边缘﹑菌落的颜色和是否分泌可溶性色素等；生理生化试验﹑过氧化物酶测定﹑V.P试验﹑糖发酵试验﹑淀粉水解试验﹑明胶液化﹑柠檬酸盐利用﹑吲哚试验﹑耐盐性试验等。

（2）分子鉴定：基因组DNA提取参考以下步骤：①培养5mL的细菌培养物至饱和状态，取1.2mL的培养物12000rpm离心1min。②沉淀物加入500μL的无菌水，用吸管反复吹打使之重悬。加入30μL的10%SDS和10μL的20mg/μL的蛋白酶K，混匀，于37℃保温1h。③加入100μL5mol/L的NaCL，充分混匀，再加入80μLCTAB/NaCL溶液，混匀，于60℃温浴10min。④加入750μL的氯仿：异戊醇（24:1），混匀，静置5min，12000rpm离心5min，取上清。⑤在上清中加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），重新抽提一次。⑥吸取上清加入0.6倍体积的冰冻过得异丙醇。轻轻混合直到DNA沉淀下来，4℃静置2-4h。⑦离心弃上清，沉淀用1mL75%酒精洗涤，离心5min，弃上清，使酒精挥发完全，重悬于30μL去离子水中。用于扩增16Sr DNA序列的上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，分别为16SF：5‵-AGAGTTTGATCATGGCICAG-3‵，16SR：‵-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3‵。以基因组DNA为模板，利用引物16SF及16SR进行PCR扩增。PCR反应体系为25 μl：10×PCR Buffer 2.5 μl，模板1μl，dNTP (10 mM each) 0.5 μl，引物16SF (10 mM)1μl，16SR (10 mM)1μl，DNA聚合酶(5 U/μl) 0.25 μl，加入去离子水至25μl。PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 1 min；55℃ 30 sec；72℃ 1 min；33个循环；72℃10 min。PCR反应产物采用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。1400bp大小目的条带采用DNA回收试剂盒（AXYGEN公司）回收纯化后，与T-载体（Takara PMD-19T）连接，转化感受态细胞，然后在含有Amp、IPTG、X-Gal的平板上进行蓝白斑筛选，并进行菌落PCR筛选出重组质粒。经验证为目的片段的阳性克隆送至上海生工生物有限公司进行测序。测序结果通过检索Genbank (http://www.nebi.nlm.nih.gov/Blast/)，采用BLAST进行序列一致性比较。同时，下载芽孢杆菌属菌株16SrDNA序列，并运用CLUSTAL X (Version 1.8)软件进行对位排列，辅以人工校对，得到的序列使用MEGA3.1分子进化遗传分析软件分析。在Kimura 2-parameter法计算遗传距离基础上，采用邻接法构建NJ***发生树，***树各分支的置信度用自举检验法（bootstrap）检验，共进行1000次循环。

（3）菌株YB-04形态特征：将复筛效果较好YB-04的菌株在LB培养平板中于28℃下培养1d，观察其菌落形态和颜色。YB-04在LB培养基上生长良好，菌落呈乳白色，未见有色素产生，菌落形态不规则、表面有***，且形成不规则的褶皱，（见图2）。培养24d后产生轻微腥臭气味，挑起时菌落成一团且有黏液。革兰氏染色呈阳性（G⁺）。

（4）菌株YB-04的生理生化鉴定：参照《伯杰细菌鉴定手册(第八版》和《常见细菌鉴定手册》的方法，测定和观察其部分生理生化指标。

由表2可见，菌株YB-04能使明胶液化，淀粉水解，硝酸盐还原；能使牛奶胨化，可产生过氧化氢酶。不能使纤维素水解，葡萄糖产气。可利用葡萄糖，果糖，半乳糖，木糖，麦芽糖，棉籽糖和甘露醇。菌株YB-04耐受NaCl浓度为7%，当pH<5或pH>9时菌株不能生长,柠檬酸盐利用阳性，明胶液化阳性。根据《伯杰细菌鉴定手册》(第八版)和《常见细菌鉴定手册》，YB-04的形态特征和生理生化特征均符合枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的分类标准。

表2 菌株YB-04的生理生化特征

注：“+”：阳性结果 Positive results；“–”：阴性结果 Negative results

（5）菌株YB-04 的分子鉴定结果：将YB-04序列与GenBank 数据库中相关序列进行BLAST分析, 结果显示有130个与该序列匹配的同源序列,选取同源性较高且具有代表性菌株的16S rDNA 序列构建***发育树, 如图 3 所示, 菌株YB-04与Bacillus subtilis（OYKN9W5701S）处于进化树中的同一分支，同源性为100%。 综合上述形态学、生理生化特征以及YB-04和相关菌株16SrDNA 序列同源性分析结果，将YB-04 菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。

实施例3  YB-04微生物菌剂制备方法

（1）菌株培养与制备  将枯草芽孢杆菌YB-04接种到TSA试管斜面培养基上，28～35℃下培养24～36小时获得菌体；

（2）种子液制备  将步骤（1）制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28～32℃下震荡培养12～16小时制成种子液；

（3）发酵培养基制备  分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加水配制成含葡萄糖1.2%、玉米粉1.8%、黄豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.2%培养液；

（4）液体发酵生产  对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按5%的接种量接种于步骤（3）配好的培养液，在27～34℃，转速180rpm，PH8.0条件下发酵培养至少36～48小时后，收集发酵液，即得液体菌剂。

实施例4: YB-04菌株的酶活测定

种子液的制备：真菌分别接种于PDA试管斜面上，28℃恒温培养至试管斜面长满孢子。加入10mL无菌水充分震荡，所得菌悬液即为种子液。细菌接种于装有8mL LB培养液的试管中，37℃恒温培养24h所得菌悬液即为细菌种子液。

将种子液接种于液体产酶培养基中,37℃，180r/min进行发酵。发酵完成后将发酵液5000r/min离心10min，所得上清即为粗酶液。

淀粉酶活测定方法：根据文献（彭花园，卢红梅，曾祥钦.高产木聚糖酶菌株的诱变筛选及其产酶性质[J] .酿酒科技，2006,10:34-36.）向试管中加入1mL粗酶液，70℃水浴15min再加入1mL pH5.06的柠檬酸盐缓冲液，对照中加入4mL 0.4moL/L的NaOH。将试管在40℃水浴中保温10min,加入2mL淀粉溶液摇匀，立即放入40℃水浴中反应5min,取出后迅速加入4mL 0.4moL/L的NaOH以终止反应。取反应液2 mL加入2 mL3，5-二硝基水杨酸40℃水浴5min，冷却后定容至25mL。在520nm处测定其吸光值，对照标准曲线计算酶活。

表3 各菌株的酶活性

 蛋白酶活测定方法：根据文献（徐莹，何国庆，陈启和等.缓冲体系对产弹性蛋白酶芽孢杆菌EL31410发酵的影响[J].农业生物技术学报，2004，1（6）：709-713.）向试管中加入1mL的粗酶液，空白作为对照，置于40℃水浴中预热5min,然后加入1mL的2%酪蛋白溶液，准确保温10min。立即加入2mL 0.4M的三氯乙酸溶液15min后吸取上清1mL,加入5mL0.4M的碳酸钠溶液和1mL斐林试剂，40℃水浴中显色20min。680nm下测定吸光值，对照标准曲线计算酶活。

将具有较大透明圈的菌株进行发酵产酶，酶活测定结果见表3。可见YB-04淀粉酶和蛋白酶活性在发酵第二天达到最高分别为113.47 u/mL和134.95 u/mL，高于同发酵批次的L4和L8菌株，可以预测YB-04富含秸秆降解酶类，具有开发降解制剂的前景。

实施例5：YB-04降解菌液体发酵秸秆产酶条件优化

秸秆降解过程主要是各种菌所产生的酶对秸秆的消化利用过程，因此常用产酶能力来衡量降解菌株对秸秆的利用能力，产酶能力的大小一般用发酵液中的单位酶活大小来衡量。本发明研究了菌株YB-04在液体条件下的发酵秸秆产酶能力，指明了影响这些菌株产酶的因素。

（1）发酵时间对降解菌株产酶能力的影响：发酵时间是影响菌株产酶的因素之一，发酵初期随着时间的延长发酵液的酶活一般呈上升趋势；随着营养物质的耗尽以及酶蛋白的降解作用，发酵液的酶活将出现下降。按1%的接种量，pH自然，摇床转速180r/min，37℃进行发酵培养。 每24h小时取样一次，连续测定5d，研究降解菌株所产酶活随时间的变化关系。

（2）pH对降解菌株产酶能力的影响：不同微生物对pH有不同的耐受性，因此其产酶过程受pH的影响较大。细菌一般适应在碱性环境下生长和产酶。将YB-04菌株产酶培养基的pH值设定5个水平（7﹑7.5﹑8﹑8.5﹑9）。按照1%的接种量，摇床37℃ 180r/min进行发酵培养。取发酵48h的发酵液进行酶活测定，研究发酵液的酶活与pH的变化关系。

（3）温度对降解菌株产酶能力的影响：温度也是影响自然界中微生物产酶的指标之一，大多说真菌的产酶温度一般在30℃左右，细菌的产酶温度一般在37℃左右。真菌产酶培养基分别设定为（24﹑26﹑28﹑32﹑34 ）5个温度水平，细菌产酶培养基分别设定为（30﹑35﹑37﹑42﹑47）5个温度水平。按照1%的接种量，pH自然，180r/min进行发酵培养。发酵48h后测定酶活，研究发酵液的酶活与发酵温度的关系。

（4）接种量对降解菌株产酶能力的影响：接种量的大小影响菌种群体的多少，从而影响酶产量，但并非接种量越大越好。受到溶氧及营养物质的影响，研究合适的接种量才能使发酵液具有最高的酶活。在pH自然，真菌28℃细菌37℃，180r/min条件下，将接种量设定（0.5%﹑1%﹑1.5%﹑2%﹑2.5%）5个水平，测定发酵48h后的酶活，研究发酵液酶活与接种量的关系。

（5）氮源对降解菌株产酶能力的影响：氮源是微生物生长所必须的，秸秆的C/N为50:1远远大于微生物生长的最适C/N，因此发酵培养液中要有一定的氮源，不同的氮源物质对产酶能力也有不同的影响。本研究细菌发酵液中的氮源为酵母浸粉，分别用酵母膏，蛋白胨，胰蛋白胨，进行替代。按1%的接种量，在pH自然，真菌28℃细菌37℃，180r/min条件下进行发酵，测定发酵48h后的酶活，研究发酵液酶活与碳源添加量的关系。

（6）结果分析：对YB-04菌株的发酵液进行酶活、pH、温度、接种量、氮源利用等方面的单因素优化实验，可以看出：①YB-04、L1﹑L8菌发酵2天后即达到了产酶最大值，单因素方差分析发现菌株YB-04、L1﹑L8发酵2d后的酶活与其它天有明显差异，因此发酵两天即为YB-04两株菌的最佳发酵时间；②随着pH的变化，发酵液的单位酶活不断改变，可见pH值会影响到菌株的产酶过程。结果显示YB-04、在pH 7.5时所产蛋白酶酶活最高分别为135.01U/mL，经过单因素方差分析发现YB-04在pH 7.5时所产淀粉酶与其它水平有显著差异，发酵产蛋白酶的最适pH为7.5，发酵产淀粉酶的最适pH为8；③不同温度条件下，发酵液的酶活有明显的变化。因此最适温度的确定也是发酵条件优化的重要因素。YB-04在37℃时淀粉酶﹑蛋白酶均有最高酶活，淀粉酶活分别为： 142.59U/mL，蛋白酶活分别为：133.14 U/mL，经过方差分析得出在YB-0437℃与40℃时的差异不显著。基于经济条件考虑，发酵条件确定为37℃；④随着接种量的增加发酵液的酶活呈上升趋势，但是当接种量达到一定量时酶活又开始下降。YB-04的接种量为1%时酶活最高，淀粉酶活分别为137.81 U/mL，蛋白酶活分别为154.09 U/mL。经过方差分析得出YB-04在1%接种量条件下与其它水平有明显差异，所以的最适接种量为1%；⑤当以酵母浸粉为氮源时YB-04淀粉酶活最高为151.36U/mL，当以胰蛋白酶为氮源时蛋白酶活为121.16U/mL。经过方差分析可知以酵母浸粉为氮源时YB-04发酵液的酶活与其它水平有显著差异，因此YB-04的最适氮源为酵母浸粉。

实施例6: YB-04的抑菌普测定

以10种病原菌为靶标菌，采用平板对峙的方法测定YB-04菌株对这10种病原菌的拮抗作用，测定其抑菌谱。

表4 YB-04菌株抑菌谱

注：“＋＋＋”：抑菌带10mm以上；“＋＋”：抑菌带5～10mm；

“＋”：抑菌带＜5mm；“—”：抑菌带＜3mm

测定出YB-04对10种病原菌的抑菌带，结果如表4所示，发现其表现出较为广谱的抑菌效果，其中对棉花黄萎病菌、小麦全蚀病菌、小麦纹枯病等根际病害抑菌效果较好。表明YB-04不仅能够降解秸秆，还能够抑制根际病原菌，调节根际微生物群落，具有很好开发利用前景。

实施例7: 菌种组合降解小麦秸秆试验

（1）降解菌的共培养实验：生态***的微生物之间关系十分复杂，相互依存又相互竞争。通过将两种或两种以上菌株接种于同一平板上，观察它们之间是否存在拮抗作用，才能确定多个菌株是否能共同培养。本实验将筛选得到的菌株两两接种于PDA平板上，通过菌落直径的观察，分析两种菌之间是否会产生拮抗作用。

（2）所用菌株：YB-04为本发明专利中保护菌株枯草芽孢杆菌(BaciLLus  stbtiLis)，P4为黑曲霉菌（Aspergillus niger），P3为米曲霉（AspergiLLus oryzae）菌株，P5为黄青霉(Penicillium chrysogenum)菌株，L8为解淀粉芽孢杆菌（B. amyLaLiquefaiens）菌株，均由本实验室分离自腐烂秸秆中。菌剂1和菌剂2分别购自鹤壁百惠生物科技有限公司。

（3）降解秸秆试验：准确称取2g在60℃干燥至恒重的新鲜小麦秸秆放入培养皿内，进行菌种降解小麦秸秆的效果研究，菌悬液的制作参照前述种子液制作方法。单一菌种降解为：向放有2g秸秆的培养皿内加入1mL菌悬液并补水至10mL；联合降解为：放有秸秆的平皿中加入菌液，每种菌液为1mL，补水至10mL。

（4）降解效果分析：降解试验完后，通过表观特征，及秸秆的重量变化情况来评价秸秆的降解效果。正在腐烂的秸秆，可根据颜色（黄﹑微黄﹑褐黄﹑黑黄）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，根据秸秆的气味（霉味﹑氨味﹑酒味﹑腐烂味）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，根据手感软化程度（硬﹑微软﹑软﹑腐烂）分为（1﹑2﹑3﹑4）四级，将三种特征的级数进行加和即为秸秆的腐烂程度，级说越大，腐烂程度越大^[80]。每5天观察一次秸秆降解情况，记录秸秆降解的级数。

将秸秆表面的菌丝体用蒸馏水冲洗干净，60℃干燥至恒重称量剩余秸秆的重量，计算秸秆降解率，并将剩余秸秆进行纤维素含量测定。纤维素含量测定方法：称取0.1g秸秆于试管中，加入醋酸和硝酸混合液（体积比为1/1）5mL，盖上盖子于沸水浴中加热30min，转移至大离心管中加蒸馏水稀释至45 mL，冷却后离心去上清，60℃烘干。取烘干后的样品加入混合液中(质量分数为10%的硫酸，浓度为0.1mol/L的重铬酸钾)10 mL，摇匀后沸水浴15min，全部转移至干净的三角瓶中滴定，加入质量分数为20%的KI溶液5 mL，用0.2mol/L的硫代硫酸钠滴定至溶液刚显蓝色2且半分钟内不变色，另作一未加秸秆的空白。

纤维素含量计算公式：X=k(a-b)/(n×24)

式中：k为硫代硫酸钠的浓度，a为空白滴定所用硫酸钠的体积，b为溶液滴定所耗硫代硫酸钠的体积，n为稻壳的质量。

（5）共培养试验结果

表5 共培养试验菌株生长速率

将两种不同的菌株接种于平板上，以单一菌种培养为对照，菌株在平板上的菌落大小见表5。将菌株共同培养时的生长速率与单独培养时的速率进行差异性分析，分析结果表明P值均大于0.05，因此共同培养与单独培养的生长速率不存在差异性，因此表明菌株之间不存在拮抗作用，可以共同培养。

（6）秸秆降解结果分析

表6 菌株组合降解秸秆方案

注：菌剂1/菌剂2购自鹤壁百惠生物科技有限公司；每种组合中菌液均加1ml.

前面方法中介绍是5株菌组合进行秸秆的降解研究，组合方案见表6,秸秆降解过程中的降解级数如表7所示。由上表可知，试验结束时，菌种两两组合降解的秸秆与单一降解的秸秆达到了相同的腐烂级数，但是菌种组合时秸秆的降解速度大于单一菌种是的速度。并且当有芽孢杆菌加入时，秸秆的降解速度比没有加入芽孢杆菌的实验组降解速度快，腐烂程度深。试验中3株真菌与2株芽孢组合使秸秆的腐烂级数达到12级，两种市售菌剂的腐烂级数分别达到8﹑9级，可见P3+P4+P5+（YB-04+L8）对秸秆降解效果良好。由图3-8可知，当只有真菌作用与秸秆时，秸秆表面虽然附着大量的菌丝体，但是秸秆表面较干燥，当加入细菌后秸秆表面较湿润腐败现象较明显。真菌（P3+P4+P5）混合作用于秸秆后秸秆的利用明显大于单一真菌作用于秸秆，加入细菌的试验批次秸秆也出现了明显的变黑等腐败现象。可以观察到该两种菌剂对秸秆的降解效果不如研究中混合复配的效果好。

表7秸秆降解级数

注：级数越大说明腐烂程度越明显

表8秸秆降解率

表9纤维素含量的变化                                                                     

秸秆降解率和降解后秸秆中纤维素含量见表8和表9。可知，真菌与细菌混合作用于秸秆后，秸秆的降解率明显高于真菌单独作用于秸秆的降解率，当5种菌混合作用于秸秆时，秸秆的降解率达到了最大值，但并非远远大于单一真菌与细菌的组合作用，可见菌株混合降解秸秆时并非是单纯的加和作用。由实验组合与市售菌剂的降解率比较可知，实验组合的降解作用远远优于市售菌剂的降解作用。

实施例8 秸秆降解模拟大田试验

（1）试验方法：在花盆中（15cm×12cm）中加入8cm厚的菜园土，上面均匀铺撒小麦秸秆100g。用不同处理的菌液喷洒秸秆， 菌液及处理方法见实施例3，用量为10mL。然后后在秸秆上覆盖土层使花盆正好装满为止，放入25℃温室中降解30d后，测定秸秆的降解率，及各处理土壤中氮磷钾及有机物含量。以不加菌液处理的秸秆为对照。

（2）结果分析    

盆栽试验中，秸秆的降解率见表10，秸秆降解后土壤中的氮磷钾及有机物含量见表11。由表10可见，自然条件下秸秆30d内的降解率为55.55%，加入菌液的各种处理的降解率均高于自然条件下的降解率，其中5种菌组合处理的秸秆降解率为79.61%，达到了最大值，显著高于自然条件下的降解率。

表10模拟大田试验秸秆降解率

            注：小写字母为在0.05水平上显著性分析

由表11可见，秸秆在土壤中降解后会使土壤中的氮磷钾及有机物含量增加，秸秆降解率越大土壤中的氮磷钾及有机物增加值越大，没有添加秸秆的土壤中氮磷钾及有机物含量分别为31mg/mL﹑42mg/mL﹑240 mg/mL﹑0.1%，5种菌组合降解秸秆后的土壤中氮磷钾含量达到了58 mg/mL﹑52 mg/mL﹑674 mg/mL、1.3%，土壤中氮磷钾的含量显著高于对照，也说明5种菌组合降解盆栽秸秆效果最好，为进一步开发利用组合降解菌提供了科学依据。

表11 土壤中氮磷钾及有机物含量

Claims (4)

1.一种枯草芽孢杆菌YB-04，其保藏编号为CGMCC NO.6497。

2.一种微生物菌制剂的制备方法，包括如下步骤：

（1）菌株培养与制备：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌YB-04接种到TSA试管斜面培养基上，28～35℃下培养24～36小时获得菌体；

（2）种子液制备：将步骤（1）制备的试管菌种接入TSB培养液内，在28～32℃下震荡培养12～16小时制成种子液；

（3）发酵培养基制备：分别取葡萄糖、玉米粉、黄豆饼粉、磷酸氢二钾加水配制成含葡萄糖1.2%、玉米粉1.8%、黄豆饼粉3%、磷酸氢二钾0.2%的培养液；

（4）液体发酵生产：对发酵设备及培养基灭菌后，将种子液按5%的接种量接种于步骤（3）配好的培养液，在27～34℃下发酵培养36～48小时后，收集发酵液即得菌剂。

3.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株YB-04在作物秸秆降解中的应用。

4.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株YB-04在防治小麦根际纹枯病和全蚀病中的应用。