CN108003222A - 一种普利卡那肽的固相合成方法 - Google Patents

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苏军
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周金玉
刘标
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Abstract

本发明涉及医药领域产品普利卡那肽的合成方法。该方法采用固液相相合成方法合成普利卡那肽，经过裂解直接获得普利卡那肽粗品，经过纯化得到产品。本发明先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。由于液相、固相同时开展合成，酶促合成大大提高了合成效率及合成收率，不仅极大的减少了废水、废有机溶剂、废气的产生，同时固液相合成大大降低了生产成本，提高了产品品质。

Description

一种普利卡那肽的固相合成方法
技术领域
本发明为多肽合成制备领域，特别涉及普利卡那肽的合成制备方法。
技术背景
普利卡那肽结构式如下：
H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH-cyclic (4→12),(7→15)-bis(disulfide)
普利卡那肽由美国Synergy公司研发成功，并于2017年1月19日获得FDA的批准，该药是一种口服鸟苷酸环化酶C (GC-C)受体激动剂，可以在上消化道发挥作用以刺激分泌肠液，从而维持肠道功能正常。其氨基酸肽序为H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH，其中序列的4号位与10号位，7号位与15号位分别形成两对二硫环。主要用于治疗便秘肠易激综合症(IBS-C)和慢性特发性便秘(CIC)，它是迄今第二个用于治疗便秘的口服多肽药物。当前关于该药物的合成专利不多，主要有深圳翰宇药业的CN201310209459.8和CN201310680490.X两个专利，以及南京工业大学的一个制备专利CN201510104385.0。深圳翰宇药业的两个专利分别采用不同的固液相合成策略，虽然都采用的不同的侧链保护剂，定向合成了两对二硫键，但是由于采用了最后液相环化的方法，合成反应液的浓度受到极大限制，会产生大量的废水，操作复杂麻烦，不适合产业化生产。南京工业大学采用了固相环化的方法，有所改进，但是纯固相合成，需要高倍数物料投入，产生大量原材料的浪费，原子利用率极差，反应时间相对较长。本发明收率基本与现有文献报道持平或略高于报道，但是总体时间成本，物料成本等大大降低，并且适用于工业化生产。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新的普利卡那肽的固相合成方法，该方法合成效率高，物料成本大大降低，并且适用于工业化生产。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种普利卡那肽的固相合成方法，其特点是：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
本发明所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案步骤是：
A、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：
(1)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3的合成；
（2）利用树脂的假稀释效应完成R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-
Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12)- disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(3)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
各类氨基酸保护基中：
R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；
R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；
R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；
R3为H、OMe、Oet、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；
R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；
B、普利卡那肽粗肽的合成；
H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-Leu-OH-cyclic (4→12),(7→15)-bis(disulfide)
C、普利卡那肽的纯化和冻干。
本发明中的相关名词解释如下：
本发明所述的普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：固相合成过程中用到的偶联体系为：
（1）、单一缩合剂：DIC、EDC、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、TBTU、PyBOP、HBTU、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；
（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、EDC/ HOSu；
（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O；
本发明所述的普利卡那肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-
Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：
（1）以Fmoc-Leu-OH为第一个氨基酸，与wang树脂或CTC树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8 mmol/g进行缩合形成Fmoc-Leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-R3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；
（2）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12) ，disulfide的合成
采用4号位、12号位Mmt或者ACM保护的半胱氨酸，用不同浓度的TFA进行裂解，脱除Mmt或者ACM后，用DMSO、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；
（3）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成
采用7号位、15号位TRT、Tmob、Pmbf或者ACM保护的半胱氨酸，用I2/DMF进行脱保护并同时进行氧化成二硫环，获得目标产品；
（4）H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-
Leu-OH-cyclic (4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成
采用不同比例的TFA进行裂解，质子捕获剂或保护基捕获剂选自：TIS、EDT、水、二甲硫醚、苯甲硫醚等，TFA的比例大于90%。
本发明中，木瓜蛋白酶不仅可以催化该反应，对其余各类酰胺键合成都有效果，氨基酸范围包括所有20种常规氨基酸。偶联过程中，所使用的DMF:硼酸氢氧化钠（或氢氧化钾）范围为90:10~99:1；DMF:磷酸二氢钠范围为92:8~99:1，其中，硼酸氢氧化钠（或氢氧化钾）溶液范围为0.5%~20%，磷酸二氢钠范围为1%~13%。
与现有技术相比，本发明方法由于液相、固相同时开展合成，酶促合成大大提高了合成效率及合成收率，不仅极大的减少了废水、废有机溶剂、废气的产生，同时固液相合成大大降低了生产成本，提高了产品品质。
附图说明
图1为实施例所制得普利卡那肽粗品HPLC图；
图2为实施例所制得的普利卡那肽高纯产品HPLC图；
图3为实施例所制得的普利卡那肽高纯产品质谱图。
具体实施方式
以下参照附图，以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种普利卡那肽的固相合成方法，先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
实施例2，实施例 1所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其具体步骤是：
A、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：
(1)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3的合成；
（2）利用树脂的假稀释效应完成R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-
Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12)- disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(3)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
各类氨基酸保护基中：
R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；
R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；
R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；
R3为H、OMe、Oet、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；
R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；
B、普利卡那肽粗肽的合成；
C、普利卡那肽的纯化和冻干。
固相合成过程中用到的偶联体系为：
（1）、单一缩合剂：DIC、EDC、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、TBTU、PyBOP、HBTU、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；
（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、EDC/ HOSu；
（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O；
实施例3，实施例 1或2所述的一种普利卡那肽的固相合成方法中：
R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-
Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：
（1）以Fmoc-Leu-OH为第一个氨基酸，与wang树脂或CTC树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8 mmol/g进行缩合形成Fmoc-Leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-R3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；
（2）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12) ，disulfide的合成
采用4号位、12号位Mmt或者ACM保护的半胱氨酸，用不同浓度的TFA进行裂解，脱除Mmt或者ACM后，用DMSO、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；
（3）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成
采用7号位、15号位TRT、Tmob、Pmbf或者ACM保护的半胱氨酸，用I2/DMF进行脱保护并同时进行氧化成二硫环，获得目标产品；
（4）H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-
Leu-OH-cyclic (4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成
采用不同比例的TFA进行裂解，质子捕获剂或保护基捕获剂选自：TIS、EDT、水、二甲硫醚、苯甲硫醚等，TFA的比例大于90%。
实施例4，一种普利卡那肽的固相合成方法方法实验：
一、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe的合成
(1)、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Asn(Trt)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的NH2-Asp(OtBu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.2%
(2)、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的NH2-Glu(OtBu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.1%。
(3)、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的NH2-Cys(Mmt)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：99.3%。
(4)、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-OH的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取120毫摩的NH2-Glu(OtBu)-OH，溶于100ml的10%的碳酸钠溶液中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。用稀柠檬酸调pH值到7，旋蒸除去THF，再次用稀柠檬酸调pH值到3-4之间，得到大量白色沉淀，过滤，用稀柠檬酸500ml打浆洗涤，过滤，重复洗涤3遍后获得白色固体。产品为白色固体，纯度：98.7%。
(5)、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe的合成
溶液1：称取100毫摩的Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-OH、110毫摩的HOSu，置于500ml的圆底烧瓶中，加入200mlTHF溶解，磁力搅拌下冷却至0-5℃备用。
溶液2：称取110毫摩的DCC，置于小烧杯中，用100ml的THF溶解，冷却至0-5℃备用
溶液3：称取110毫摩的NH2-Leu-OMe，溶于100ml的THF中，室温下备用
在0-5℃下，将DCC溶液（溶液2）慢慢滴加到搅拌的溶液1中，反应15分钟，25℃下反应2小时，点板确定反应结束（具体反应时间以点板时间为准）。过滤除去白色沉淀，用30mlTHF洗涤沉淀并过滤，合并滤液，旋蒸除去THF，得到大量白色固体，用饱和碳酸氢钠500ml打浆洗涤，抽滤，重复洗涤3次，获得白色固体。将白色固体溶于200mlTHF中，25℃下用恒压漏斗慢慢的滴加到溶液3中，滴加完毕后反应继续反应1小时，反应结束（以点板为准）。旋蒸除去THF溶剂，得到大量白色沉淀，用1.5升乙酸乙酯溶解，用饱和碳酸氢钠洗涤，重复洗涤500ml*3，用稀柠檬酸洗涤，重复洗涤500ml*3，用饱和食盐水洗涤500ml*3，干燥后旋蒸除去乙酸乙酯，获得大量白色固体，纯度：98.8 %。
二、Fmoc-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang树脂的合成
2.1、第一个氨基酸偶联
2.1.1向反应釜中，加入200mmol的wang树脂和6L DMF，搅拌10-15分钟，抽滤除去液体；再加入6L DCM，氮气保护下搅拌溶胀25~35分钟，抽滤除去液体。
2.1.2称取400mmol Fmoc-Leu-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。加入甲醇进行封端，封端结束后，抽滤除去反应液，洗涤树脂，检测树脂的替代度，按照替代度进行下一步投料。
2.2、第二个氨基酸偶联
2.2.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.2.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.3、第三个氨基酸偶联
2.3.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.3.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Gly-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.4、第四个氨基酸偶联
2.4.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.4.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Thr(tbu)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.5、第五个氨基酸偶联
2.5.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.5.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Cys(Mmt)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.6、第六个氨基酸偶联
2.6.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.6.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Ala-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.7、第七个氨基酸偶联
2.7.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.7.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Val-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.8、第八个氨基酸偶联
2.8.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.8.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Asn-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.9、第八个氨基酸偶联
2.9.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.9.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Val-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
2.10、第八个氨基酸偶联
2.10.1去保护
向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。
去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
2.10.2 偶联
称取400mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH，400mmol HOBT，用5L的DMF溶解，溶解完全后转移至激活灌中。开启搅拌、冷媒，控制温度在0~10℃，缓慢加入66mL的DIC，控制温度在0~10℃，活化反应10~15分钟。活化反应完成后，将活化液转入反应釜中。开启反应釜搅拌和上鼓氮气，20-35℃偶联反应2h。反应结束后抽滤除去反应液体，洗涤树脂。
三、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-
Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang树脂的合成
3.1去保护
称取Fmoc-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-
wang树脂100mmol，向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应5~7 min，抽除反应液，抽干3~5 min。
再次向计量罐中加入20%六氢吡啶/DMF溶液5L作为去保护液，加入主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应8~12 min，抽除反应液，抽干3~5min。去保护后洗涤6次
每次量取DMF 5L加入主反应釜，通氮气并搅拌洗涤3~5min，抽干3~5min。茚三酮检测阳性结束洗涤。
3.2偶联
称取100mmol的Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Leu-OMe，1mmol的木瓜蛋白酶，NH2-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang树脂100mmol，溶于DMF:硼酸氢氧化钠溶液=98.5:1.5中，反应时间为3小时。监测反应完全后结束反应，反应结束后抽滤除去反应液体，用DMF洗涤树脂，获得浅棕色多肽树脂。
四、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-
Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang-cyclic (4→12)disulfide的合成
称取Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(Mmt)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(Mmt)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang树脂100毫摩，向计量罐中加入1-5%的TFA/DCM溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应40分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤1次，再次向计量罐中加入1-5%的TFA/DCM溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应60分钟，抽除反应液，用DCM洗涤3次。向计量罐中加入DMF与H2O2溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在15~30℃，反应3小时，抽除反应液，用DCM洗涤3次，反应结束，得到Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(1)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang-cyclic (4→12)disulfide产品。
五、Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(1)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-
Val-Ala-Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang-cyclic (4→12) (7-15)bis(disulfide)的合成
称取Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(1)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang-cyclic (4→12)disulfide化合物100毫摩，向计量罐中加入I2/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃，反应30分钟，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤1次，再次向计量罐中加入I2/DMF溶液5L作为反应液，主反应釜内通氮气并搅拌控制反应温度在20~30℃，反应2小时，抽除反应液，抽干反应液，用DMF洗涤3次，反应结束，得到目标产物。
六、NH2-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-
Leu-OH-cyclic (4→12) (7-15)-bis(disulfide)的制备
将100毫摩的Boc-Asn(Trt)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Cys(1)-Glu(OtBu)-Leu-Cys(Trt)-
Val-Asn(Trt)-Val-Ala-Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(Trt)-Leu-wang-cyclic (4→12)(7-15)bis(disulfide)置于1000毫升的反应瓶中，用EDT：TIS:H2O：TFA=3:1:1:95比例的裂解液500毫升进行裂解，室温下裂解2-4小时，过滤除去树脂得到肽溶液，将其倒入到5升的冰无水***中，产生大量白色沉淀，离心分离，冰无水***洗涤3-6次，获得固体。粗品色谱图参照图1；之后，用0.1%的TFA水溶液和乙腈做纯化体系，用C18柱做纯化设备，旋蒸冻干后获得纯度为99.79%的高纯产品71.22g，总收率达到42.34%。纯品色谱图参照图2；质谱确认分子量为1681.88，做质谱之前用乙腈和水做除盐，甲醇做溶剂进行质谱确认。质普图参照图3。

Claims (4)

1.一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于：先采用液相合成法合成六肽片段，利用酶促法将六肽片段偶联至固相树脂上，利用固相树脂的假稀释效应在固相树脂上通过对Cys不同位置的保护基，直接完成两个二硫环的选择性合成，之后将其从树脂上切割下来，直接进行纯化。
2.根据权利要求1所述的一种普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于，其步骤是：
A、片段缩合成各类普利卡那肽中间体：
(1)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3的合成；
（2）利用树脂的假稀释效应完成R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-
Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12)- disulfide的合成，4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚键环；
(3)R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成；4号位和12号位的两个半胱氨酸成硫醚环基础上，7号位和15号位的两个半胱氨酸再成硫醚环；
各类氨基酸保护基中：
R为Z、Boc、Cl-Z、Fmoc、oNBS、dNBS、Troc、Dts、pNZ、oNZ、NVOC、NPPOC、HFA、 Ddz、Bpoc、Nps、Nsc、Bsmoc、α-Nsmoc、ivDde、Fmoc* 、MTT、Alloc 其中任意一个；
R1为Meb、Mob、TRT、Tmob、Mmt、Xan、Pmbf、Bn、tBu、Fm、Dnpe、Fmoc、Acm、Phacm、StBu、Npys、Alloc其中任意一个；
R2为H、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb其中任意一个；
R3为H、OMe、Oet、Otbu、Bn、cHX、Mpe、2-ph1pr、TEGbn、Damb、Al、pNB、pTMSE、Dmnb、wang树脂、CTC树脂其中任意一个；
R4为Bn、cHx、tBu、Trt、TBDMS、Dmnb、Poc其中任意一个；
B、普利卡那肽粗肽的合成；
C、普利卡那肽的纯化和冻干。
3.根据权利要求1或2所述的普利卡那肽的固相合成方法，其特征如下：固相合成过程中用到的偶联体系为：
（1）、单一缩合剂：DIC、EDC、氯乙酰氯、氯甲酸乙酯、氯甲酸叔丁酯、氯甲酸异丁酯、TBTU、PyBOP、HBTU、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶；
（2）二体系缩合剂：DIC/HOBT、EDC/HOBT、DIC/HOSu、EDC/ HOSu；
（3）环合试剂：哌啶/DMF、H2O2/DMF、I2/DMF、DMSO/DMF、H2O2/H2O、I2/ H2O、DMSO/ H2O。
4.根据权利要求1或2所述的普利卡那肽的固相合成方法，其特征在于：R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-
Val-Asn(R1)-Val-Ala-Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成具体步骤如下：
（1）以Fmoc-Leu-OH为第一个氨基酸，与wang树脂或CTC树脂，涉及的树脂替代度优选从0.2mmol/g~1.8 mmol/g进行缩合形成Fmoc-Leu-树脂，然后通过逐个偶联氨基酸的方法，偶联完成10个氨基酸树脂；之后将液相方法合成的R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-R3采用木瓜蛋白酶直接偶联到肽树脂上，完成全保护肽树脂的合成；
（2）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12) ，disulfide的合成
采用4号位、12号位Mmt或者ACM保护的半胱氨酸，用不同浓度的TFA进行裂解，脱除Mmt或者ACM后，用DMSO、空气、双氧水等氧化剂中的一种或者组合物进行氧化成环，获得目标产品；
（3）、R-Asn(R1)-Asp(R2)-Glu(R2)-Cys(R1)-Glu(R2)-Leu-Cys(R1)-Val-Asn(R1)-Val-Ala-
Cys(R1)-Thr(R4)-Gly-Cys(R1)-Leu-R3-cyclic (4→12), (7→15)-bis(disulfide)的合成
采用7号位、15号位TRT、Tmob、Pmbf或者ACM保护的半胱氨酸，用I2/DMF进行脱保护并同时进行氧化成二硫环，获得目标产品；
（4）H-Asn-Asp-Glu-Cys(1)-Glu-Leu-Cys(2)-Val-Asn-Val-Ala-Cys(1)-Thr-Gly-Cys(2)-
Leu-OH-cyclic (4→12),(7→15)-bis(disulfide)的粗肽合成
采用不同比例的TFA进行裂解，质子捕获剂或保护基捕获剂选自：TIS、EDT、水、二甲硫醚、苯甲硫醚，TFA的比例大于90%。
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