CN103880945B - 制备高纯度胸腺法新的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备高纯度胸腺法新的方法。首先分别制备多肽片段一树脂、多肽片段二树脂、多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树脂；将多肽片段二、三、四和五树脂进行裂解，得到各粗多肽片段；将得到的粗多肽片段二、三、四和五分别纯化；将纯化后的各多肽片段连接到多肽片段一树脂上；将连接后多肽片段树脂进行乙酰化反应，得到胸腺法新wang树脂；进行裂解，得到胸腺法新粗品；将所得胸腺法新粗品进行两次纯化；收集纯化过程中含胸腺法新的流动相减压蒸干，离心后得到胸腺法新，真空干燥得到胸腺法新成品。利用本发明制备胸腺法新，有效地缩短了反应时间，提高了反应收率和最终产品的质量；制备的胸腺法新纯度达到99%以上。
Description
技术领域
本发明涉及多肽固相合成技术领域，具体涉及一种制备高纯度胸腺法新的方法。
背景技术
胸腺肽是胸腺组织分泌的具有生理活性的一组多肽，能促进淋巴细胞转化，增强巨噬细胞吞噬活性，可用于治疗多种免疫缺陷病。
胸腺法新的化学结构式为：
Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH。
单用胸腺法新治疗慢性乙肝中内外有研究表明，单用胸腺法新治疗慢性乙肝，持续应答率在37%左右，与单用干扰素相近，不过没有干扰素的毒副作用。
在中国台湾应用胸腺法新治疗慢性乙肝的临床研究表明：胸腺法新具有延迟的治疗效应。当胸腺法新治疗结束后，ALT有一过性升高，同时伴有HBeAg的血清转换，HBV DNA消失。HBV DNA转阴率及血清转换优越性的研究结果表明：单用胸腺法新治疗慢性乙肝有长期疗效，而没有明显不良反应。对于晚期肝纤维化患者，高剂量的胸腺法新治疗效果较好。
目前化学合成胸腺肽主要有固相合成法，该方法虽然比较成熟，但是采用该固相合成法来合成多肽是非常困难的。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种高效制备高纯度胸腺法新的方法。利用本发明技术方案制备胸腺法新，有效地缩短了反应时间，提高了反应收率和最终产品的质量。利用本发明技术方案制备的胸腺法新纯度达到99%以上。
为了解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供一种制备高纯度胸腺法新的方法，所述制备方法包括以下步骤：
（1）、多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸和Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂；
（2）、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂、Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ile-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂；
（3）、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂、Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂；
（4）、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂、Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Val-OH氨基酸连接到多肽片段上，得到多肽片段四Thr-Asp-Val树脂；
（5）、多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Ala-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Ala-wang
resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应容器中，然后加入Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂HATU和催化剂DIPEA，所述Fmoc-Ala-wang
resin树脂、Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂和催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂；
（6）、多肽片段的裂解：
将上述制备的多肽片段二树脂加入反应容器中，按照1g多肽片段二树脂：8～12mL裂解液的比例加入裂解液进行裂解，裂解液由三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25℃条件下进行裂解2h，通过裂解将多肽片段二从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液进行减压蒸馏，然后加入***，离心得到粗多肽片段二；
重复步骤（6）依次处理上述制备的多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树脂，得到粗多肽片段三、粗多肽片段四和粗多肽片段五；
（7）多肽片段的纯化：
将步骤（6）得到的粗多肽片段二、三、四和五用流动相A分别进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相分别进行纯化；
（8）多肽片段的连接：
将步骤（1）得到的多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液中进行脱保护5～8min，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺二者之间的质量比为1:1，所述多肽片段一树脂与混合液之间的加入量比例为1g多肽片段一树脂：8～12mL混合液；脱保护后采用二甲基甲酰胺进行洗涤5～8次，将洗涤后的树脂加入反应容器中，并加入步骤（7）纯化后的多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA进行缩合反应，洗涤后的树脂、多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA四者之间加入量的摩尔比例为1:2:2:4，加入后在25℃下进行缩和反应3h，反应结束后过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次，洗涤后得到多肽片段二连接到多肽片段一树脂上的产物；
重复步骤（8），依次将步骤（7）纯化后的多肽片段三、四和五连接到多肽片段一树脂，得到连接后的多肽片段树脂；
（9）乙酰化：
将步骤（8）得到的连接后多肽片段树脂加入反应容器中，并加入乙酸酐、催化剂DIPEA和二甲基甲酰胺，所述连接后多肽片段树脂、乙酸酐、催化剂和二甲基甲酰胺四者加入比例为1g连接后多肽片段树脂：10mL乙酸酐：20mL催化剂：20mL二甲基甲酰胺；加入后在室温下搅拌30～40min进行乙酰化反应，通过茚三酮检测反应进程，检测结果为阴性反应结束；反应后进行过滤，所得产物先用二甲基甲酰胺洗涤5～8次，再用无水乙醇洗涤3～5次，洗涤后得到胸腺法新wang树脂；
（10）粗肽的裂解：
将步骤（9）得到的胸腺法新wang树脂加入反应容器中，按照1g胸腺法新wang树脂：8～12mL裂解液的比例加入裂解液，所述裂解液由三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25℃条件下裂解2h，通过裂解使得多肽片段从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液在真空度0.095MPa、40℃条件下减压蒸干，蒸干后所得产物中加入***进行离心，离心后得到胸腺法新粗品；
（11）胸腺法新粗品的纯化：
将步骤（10）得到的胸腺法新粗品采用流动相A进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相进行两次纯化；
（12）干燥：
收集步骤（11）含胸腺法新的流动相，在真空度0.095MPa、30℃下减压蒸干，然后加入***进行离心，离心后得到胸腺法新，接着在真空度0.095MPa、30℃下真空干燥24h，得到胸腺法新成品。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，所述Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂、Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂、Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂、Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂和Fmoc-Ala-wang
resin树脂均由吉尔生化（上海）有限公司提供。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，所述缩合剂HATU为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，所述催化剂DIPEA为N，N-二异丙基乙胺。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤（6）中所述所得滤液进行减压蒸馏，即在真空度为0.095MPa、温度为40℃条件下蒸干；所述加入***，其***的加入量为所得滤液质量的1/2。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤（7）中纯化时的色谱条件为：
流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱（20×250mm），线性梯度为0～60min，10～35%B，流速为14ml/min；所述乙腈溶液为质量百分浓度为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤（8）中所述反应结束后过滤，所得滤液中含有过量的各多肽片段，通过减压蒸馏回收滤液中的各多肽片段，减压蒸馏即在真空度为0.095MPa、温度为40℃的条件下蒸干。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤（10）中所述蒸干后所得产物中加入***进行离心，其***的加入量为所得滤液质量的1/2。
根据上述的制备高纯度胸腺法新的方法，步骤（11）中纯化时的色谱条件为：
流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱（20×250mm），线性梯度为0～60min，10～35%B，流速14ml/min；所述乙腈溶液为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90。
本发明涉及到的氨基酸及其试剂缩写详见表1。
本发明的积极有益效果：
1、现有胸腺法新传统工艺中，依据多肽氨基酸组成依次将氨基酸逐个连接，连接过程中，不同氨基酸的连接时间不一致，使得反应时间延长才能保证反应都能完成。本发明结合实际经验，通过合适的分段，将胸腺法新分成五段，逐个合成多肽片段，再将多肽片段连接到一起，使得反应较快的氨基酸放在一个多肽片段中进行合成，有效地缩短了反应时间。
2、本发明技术方案采用分段合成胸腺法新，多肽片段可同时进行合成，大大缩短了生产胸腺法新的时间。
3、本发明技术方案采用分段合成胸腺法新，可有效地提高胸腺法新的收率。相关数据详见表2。
4、本发明技术方案采用分段合成胸腺法新，可有效提高胸腺法新成品的质量水平。采用本发明技术方案制备的胸腺法新纯度达到99%以上。
四、附图说明：
图1 采用本发明方法制备的胸腺法新的液相图谱。
图2 采用本发明方法制备的胸腺法新的氨基酸序列分析图1。
图3 采用本发明方法制备的胸腺法新的氨基酸序列分析图2。
五、具体实施方式：
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例：
本发明制备高纯度胸腺法新的方法，该制备方法的详细步骤如下：
（1）、多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：10mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂加入10mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5次；
c、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Asn（Trt）-wang
resin树脂、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸和Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂；
（2）、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：10mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂加入10mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂、Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ile-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂；
（3）、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：10mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂加入10mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂、Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂；
（4）、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：10mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂加入10mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂、Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Val-OH氨基酸连接到多肽片段上，得到多肽片段四Thr-Asp-Val树脂；
（5）、多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Ala-wang
resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：10mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Ala-wang
resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应容器中，然后加入Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂HATU和催化剂DIPEA，所述Fmoc-Ala-wang
resin树脂、Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂和催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂；
（6）、多肽片段的裂解：
将上述制备的多肽片段二树脂加入反应容器中，按照1g多肽片段二树脂：8～12mL裂解液的比例加入裂解液进行裂解，裂解液由三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25℃条件下进行裂解2h，通过裂解将多肽片段二从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液进行减压蒸馏（在真空度为0.095MPa、温度为40℃条件下蒸干），然后加入***（***的加入量为所得滤液质量的1/2），离心得到粗多肽片段二；
重复步骤（6）依次处理上述制备的多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树脂，得到粗多肽片段三、粗多肽片段四和粗多肽片段五；
（7）多肽片段的纯化：
将步骤（6）得到的粗多肽片段二、三、四和五用流动相A分别进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相分别进行纯化；
纯化时的色谱条件为：
流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱（20×250mm），线性梯度为0～60min，10～35%B，流速为14ml/min；所述乙腈溶液为质量百分浓度为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90；
（8）多肽片段的连接：
将步骤（1）得到的多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液中进行脱保护5min，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺二者之间的质量比为1:1，所述多肽片段一树脂与混合液之间的加入量比例为1g多肽片段一树脂：10mL混合液；脱保护后采用二甲基甲酰胺进行洗涤5次，将洗涤后的树脂加入反应容器中，并加入步骤（7）纯化后的多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA进行缩合反应，洗涤后的树脂、多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA四者之间加入量的摩尔比例为1:2:2:4，加入后在25℃下进行缩和反应3h，反应结束后过滤（所得滤液中含有过量的各多肽片段，通过减压蒸馏回收滤液中的各多肽片段，减压蒸馏即在真空度为0.095MPa、温度为40℃的条件下蒸干），过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5次，洗涤后得到多肽片段二连接到多肽片段一树脂上的产物；
重复步骤（8），依次将步骤（7）纯化后的多肽片段三、四和五连接到多肽片段一树脂，得到连接后的多肽片段树脂；
（9）乙酰化：
将步骤（8）得到的连接后多肽片段树脂加入反应容器中，并加入乙酸酐、催化剂DIPEA和二甲基甲酰胺，所述连接后多肽片段树脂、乙酸酐、催化剂和二甲基甲酰胺四者加入比例为1g连接后多肽片段树脂：10mL乙酸酐：20mL催化剂：20mL二甲基甲酰胺；加入后在室温下搅拌30min进行乙酰化反应，通过茚三酮检测反应进程，检测结果为阴性反应结束；反应后进行过滤，所得产物先用二甲基甲酰胺洗涤5次，再用无水乙醇洗涤3次，洗涤后得到胸腺法新wang树脂；
（10）粗肽的裂解：
将步骤（9）得到的胸腺法新wang树脂加入反应容器中，按照1g胸腺法新wang树脂：10mL裂解液的比例加入裂解液，所述裂解液由三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25℃条件下裂解2h，通过裂解使得多肽片段从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液在真空度0.095MPa、40℃条件下减压蒸干，蒸干后所得产物中加入***进行离心（***的加入量为所得滤液质量的1/2），离心后得到胸腺法新粗品；
（11）胸腺法新粗品的纯化：
将步骤（10）得到的胸腺法新粗品采用流动相A进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相进行两次纯化；
纯化时的色谱条件为：
流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱（20×250mm），线性梯度为0～60min，10～35%B，流速14ml/min；所述乙腈溶液为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90；
（12）干燥：
收集步骤（11）含胸腺法新的流动相，在真空度0.095MPa、30℃下减压蒸干，然后加入***进行离心，离心后得到胸腺法新，接着在真空度0.095MPa、30℃下真空干燥24h，得到胸腺法新成品。
本实施例采用的Fmoc- Asn（Trt）-wang
resin树脂、Fmoc-Lys（Boc）-wang
resin树脂、Fmoc-Glu-（OtBu）-wang
resin树脂、Fmoc-Thr（tBu）-wang
resin树脂和Fmoc-Ala-wang
resin树脂均由吉尔生化（上海）有限公司提供；
采用的缩合剂HATU为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，催化剂DIPEA为N，N-二异丙基乙胺。
本实施例所制备的胸腺法新的液相色谱图详见附图1，氨基酸序列分析详见附图2、3。
Claims (5)
1.一种制备胸腺法新的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）、多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Asn（Trt）-wang resin树脂、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Ala-OH 氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Val-OH氨基酸、Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸和Fmoc-Glu（OtBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂；
（2）、多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将步骤a溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Lys（Boc）-wang resin树脂、Fmoc-Leu-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、Fmoc-Lys（Boc）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸、Fmoc-Thr（tBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ile-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段二Lys-Leu-Asp-Lys-Thr-Thr-Ile树脂；
（3）、多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Glu-（OtBu）-wang resin树脂、Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段三Glu-Ser-Ser树脂；
（4）、多肽片段四Thr-Asp-Val树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应器中，然后加入Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA，所述Fmoc-Thr（tBu）-wang resin树脂、Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸、缩合剂和缩合催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法将Fmoc-Val-OH氨基酸连接到多肽片段上，得到多肽片段四Thr-Asp-Val树脂；
（5）、多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂的制备：
a、首先将Fmoc-Ala-wang resin树脂加入容器中，然后加入二甲基甲酰胺进行溶胀，溶胀时间为30～60min；所述树脂与二甲基甲酰胺二者之间加入量的比例为1g树脂：8～12mL二甲基甲酰胺；
b、将溶胀后的树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合液中进行脱保护，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺之间的质量比为1:1，每克Fmoc-Ala-wang resin树脂加入8～12mL混合液，脱保护后采用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
c、将步骤b脱保护、洗涤后的树脂加入反应容器中，然后加入Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂HATU和催化剂DIPEA，所述Fmoc-Ala-wang resin树脂、Fmoc-Ala-OH氨基酸、缩合剂和催化剂四者之间加入的摩尔比为1:2:2:4，各种原料加入后在25℃条件下进行缩合反应，通过茚三酮检测为阴性，反应结束；结束后将所得反应物进行过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次；
然后将洗涤后所得产物按照步骤b同样方法进行脱保护、洗涤，依步骤c同样方法依次将Fmoc-Asp（OtBu）-OH氨基酸和Fmoc-Ser（tBu）-OH氨基酸连接到多肽片段上；得到多肽片段五Ala-Ala-Asp-Ser树脂；
（6）、多肽片段的裂解：
将上述制备的多肽片段二树脂加入反应容器中，按照1g多肽片段二树脂：8～12mL裂解液的比例加入裂解液进行裂解，裂解液由三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25℃条件下进行裂解2h，通过裂解将多肽片段二从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液进行减压蒸馏，然后加入***，离心得到粗多肽片段二；
重复步骤（6）依次处理上述制备的多肽片段三树脂、多肽片段四树脂和多肽片段五树脂，得到粗多肽片段三、粗多肽片段四和粗多肽片段五；
（7）多肽片段的纯化：
将步骤（6）得到的粗多肽片段二、三、四和五用流动相A分别进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相分别进行纯化；
纯化时的色谱条件为：流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱、20×250mm，线性梯度为0～60min，10～35%B，流速为14ml/min；所述乙腈溶液为质量百分浓度为0.1%三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90；
（8）多肽片段的连接：
将步骤（1）得到的多肽片段一Asn-Glu-Ala-Glu-Glu-Val-Val-Glu-Lys-Lys-Glu树脂加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液中进行脱保护5～8min，混合液中哌啶与二甲基甲酰胺二者之间的质量比为1:1，所述多肽片段一树脂与混合液之间的加入量比例为1g多肽片段一树脂：8～12mL混合液；脱保护后采用二甲基甲酰胺进行洗涤5～8次，将洗涤后的树脂加入反应容器中，并加入步骤（7）纯化后的多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA进行缩合反应，洗涤后的树脂、多肽片段二、缩合剂HATU和缩合催化剂DIPEA四者之间加入量的摩尔比例为1:2:2:4，加入后在25℃下进行缩和反应3h，反应结束后过滤，过滤所得树脂用二甲基甲酰胺洗涤5～8次，洗涤后得到多肽片段二连接到多肽片段一树脂上的产物；
重复步骤（8），依次将步骤（7）纯化后的多肽片段三、四和五连接到多肽片段一树脂，得到连接后的多肽片段树脂；
（9）乙酰化：
将步骤（8）得到的连接后多肽片段树脂加入反应容器中，并加入乙酸酐、催化剂DIPEA和二甲基甲酰胺，所述连接后多肽片段树脂、乙酸酐、催化剂和二甲基甲酰胺四者加入比例为1g连接后多肽片段树脂：10mL乙酸酐：20mL催化剂：20mL二甲基甲酰胺；加入后在室温下搅拌30～40min进行乙酰化反应，通过茚三酮检测反应进程，检测结果为阴性反应结束；反应后进行过滤，所得产物先用二甲基甲酰胺洗涤5～8次，再用无水乙醇洗涤3～5次，洗涤后得到胸腺法新wang树脂；
（10）粗肽的裂解：
将步骤（9）得到的胸腺法新wang树脂加入反应容器中，按照1g胸腺法新wang树脂：8～12mL裂解液的比例加入裂解液，所述裂解液由三氟乙酸、水和1,2-乙二硫醇按照质量比为18:1:1的比例混合而成；加入裂解液后在25℃条件下裂解2h，通过裂解使得多肽片段从树脂上裂解下来；裂解后进行过滤，所得滤液在真空度0.095MPa、40℃条件下减压蒸干，蒸干后所得产物中加入***进行离心，离心后得到胸腺法新粗品；
（11）胸腺法新粗品的纯化：
将步骤（10）得到的胸腺法新粗品采用流动相A进行溶解，制成10mg/ml的溶液，通过制备液相进行两次纯化；
纯化时的色谱条件为：流动相A为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液，流动相B为乙腈溶液；色谱柱为C18反向柱、20×250mm，线性梯度为0～60min，10～35%B，流速14ml/min；所述乙腈溶液为质量百分浓度0.1%的三氟乙酸水溶液与乙腈的混合液，其混合质量比为10:90；
（12）干燥：
收集步骤（11）含胸腺法新的流动相，在真空度0.095MPa、30℃下减压蒸干，然后加入***进行离心，离心后得到胸腺法新，接着在真空度0.095MPa、30℃下真空干燥24h，得到胸腺法新成品。
2.根据权利要求1所述的制备胸腺法新的方法，其特征在于：所述缩合剂HATU为2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，所述催化剂DIPEA为N，N-二异丙基乙胺。
3.根据权利要求1所述的制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤（6）中所述所得滤液进行减压蒸馏，即在真空度为0.095MPa、温度为40℃条件下蒸干；所述加入***，其***的加入量为所得滤液质量的1/2。
4.根据权利要求1所述的制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤（8）中所述反应结束后过滤，所得滤液中含有过量的各多肽片段，通过减压蒸馏回收滤液中的各多肽片段，减压蒸馏即在真空度为0.095MPa、温度为40℃的条件下蒸干。
5.根据权利要求1所述的制备胸腺法新的方法，其特征在于，步骤（10）中所述蒸干后所得产物中加入***进行离心，其***的加入量为所得滤液质量的1/2。
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