KR101574252B1

KR101574252B1 - 고체상 펩타이드 합성법을 이용한 신규한 탈티렐린의 제조 방법

Info

Publication number: KR101574252B1
Application number: KR1020100117259A
Authority: KR
Inventors: 김석인; 김도영; 임채영; 정기훈; 김주성; 주소경; 김완주
Original assignee: 주식회사 씨트리
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2015-12-04
Also published as: KR20120055840A

Abstract

본 발명에서는 고체상 펩타이드 합성법을 이용하여 각 단계 마다의 정제와 동결건조 없이 단시간 내에 용이하게 탈티렐린을 합성할 수 있는 방법이 제공된다. 본 발명의 제조방법에 의한 탈티렐린을 합성은, 하나의 반응기 안에서 모든 단계의 반응이 이루어져 대단히 빠른 속도로 화합물의 합성을 종결시킬 수 있고, HPLC 순도가 97% 이상으로 최종 화합물을 확보하여 단 한번의 레진 통과 또는 HPLC 정제법을 통하여 원하는 최종 화합물을 고 수율/순도로 확보할 수 있는 장점을 가지고 있다.

Description

고체상 펩타이드 합성법을 이용한 신규한 탈티렐린의 제조 방법 {Novel Preparation for Taltirelin by Solid Phase Peptide Synthetic Method}

본 발명은 화학식 하기 (I)로 표기되는 탈티렐린의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 본 발명은 고체상 펩타이드 합성법을 사용하여 손쉽고 빠르게 매우 온화한 합성조건 하에서 고효율로 고순도의 탈티렐린 제조 방법에 관한 것이다.

탈티렐린은 글루탐산의 유도체인 1-메틸-4,5-디히드로오로트산(II), 히스티딘 그리고 프롤린 아미드의 3개 아미노산으로 구성된 펩타이드성 화합물이다. 탈티렐린은 TRH(L-피로글루타밀-L-히스티딜-L-프롤린아미드; 티로트로핀 방출 호르몬)의 일종으로써 중추신경계 질환의 치료 또는 예방용 약제로서 유용한 것으로 알려진 디히드로오로트산 유도체의 일종이다. 탈티렐린은 디히드로오로트산 유도체 중에서 약제학적으로 가장 유용한 형태이다. 탈티렐린은 소뇌병변증 등의 의식질환 관련 치료 물질로 알려져 있다.

탈티렐린의 합성은 주로 하기 화학식 Ⅲ의 화합물 또는 이것의 염을 1-메틸-4,5-디히드로오로트산(II)을 축합 반응하여 탈티렐린을 얻는 것으로 이루어진다. 화학식 III의 화합물은 프롤린 아미드와 히스티딘 또는 N^im-보호된 히스티딘과 축합 반응을 통해 얻어질 수 있다 [J. Med . Chem ., 1990, 33, 2130 -2137 특허공개 1989-002085호]. 위와 같이 합성된 탈티렐린은 약제학적으로 허용된 부가 염으로 전환될 수 있다.

그러나 이와 같은 용액상 합성법은 반응 중 용매 DMF (Dimethylformamide)를 사용함으로써 반응 후 DMF 제거의 문제는 물론 액체상 반응이므로 각 단계의 모든 중간체 화합물이 수용성이기 때문에 일반적인 방법에 의하여 회수가 어려워 각 단계 마다 레진(예를 들면, CPH-20P)을 사용한 정제와 동결건조를 해야 하는 불편함과 합성 및 정제에 있어서 많은 시간이 소요되고 각 단계의 반응 수율이 낮은 단점을 가지고 있었다.

상기와 같은 종래 기술의 문제점을 극복하기 위하여, 본 발명자들의 꾸준한 연구 결과, 고체상 펩타이드 합성법을 이용할 경우, 각 단계 마다의 정제와 동결건조 없이 단시간 내에 용이하게 탈티렐린을 제조할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 고체상 펩타이드 합성법을 이용하여 각 단계 마다의 정제와 동결건조 없이 단시간 내에 용이하게 탈티렐린을 합성할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하고자, 본 발명은 다음과 같은 단계로 이루어지는 고체상 코어-셀 타입 레진을 사용하는 펩타이드 합성법을 이용한 탈티렐린의 제조 방법을 제공한다:

a) Fmoc(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl) 보호기를 제거한 레진을 제공하는 단계;

b) Fmoc-프롤린을 상기 레진에 커플링하는 단계;

c) 상기 커플링된 프롤린에서 Fmoc 보호기를 제거하는 단계;

d) Fmoc-히스티딘을 상기 커플링된 프롤린에 커플링하는 단계;

e) 상기 커플링된 히스티딘에서 Fmoc 보호기를 제거하는 단계;

f) 1-메틸-4,5-디히드로오로트산을 상기 커플링된 히스티딘에 커플링하는 단계; 및

g) 레진으로부터 제조된 펩타이드을 분리하는 단계.

본 발명의 제조방법은, 필요에 따라, 추가로

h) 제조된 펩타이드를 정제하는 단계;

i) 정제된 펩타이드를 동결 건조하는 단계; 및/또는

j) 탈티렐린 결정형을 β-형에서 α-형으로 전환하는 단계

를 포함할 수 있다.

상기 언급된 모든 단계는 미국 PTI사에서 제조한 펩타이드 전자동 합성기 SONATA XT를 사용하여 진행될 수 있다.

본 발명의 제조방법에서 상기 각 단계는 구체적으로 다음과 같이 수행될 수 있다.

a) 단계: Fmoc 보호기 제거

본 발명에서 사용되는 레진은 산에 약하고 염기에 강하여 Fmoc 보호기를 제거하는 단계에서 깨지지 않는 특성을 가지고 있는 2-Cl-트리틸아민(Tritylamine), Rink Amide AM(aminomethyl), Rink Amide MBHA (4-methylbenzhydrylamine), MBHA (4-methylbenzhydrylamine)과 같은 같은 아민 기능기를 C-말단에 가지는 레진 (아민 기능기 레진); 및 트리틸아민(Tritylamine), 2-Cl-트리틸(Trityl), Rink-Acid, Sasrin (2-methyl-4-alkoxybenzylalchol)와 같은 OH 기능기를 가지는 레진 (OH 기능기 레진)이다. 특히, 코어-셀(CS) 타입의 레진을 사용할 경우 (90% 수율), 일반적인 레진을 사용하여 생산된 레진(70% 수율)을 사용했을 때보다 좋은 효율을 나타낸다. (도 5) [Org. Lett. 2004, 6, 3273-3276, Tetrahedron Letters 50 (2009) 4272-4275].

아민 기능기 레진의 경우는 Fmoc 정량법을 사용하여 측정하여 0.5 ~ 0.8 mmol/g 로딩된 것을 사용한다. 더 바람직하게는 0.8 mmol/g 로딩된 레진을 사용한다. OH 기능기 레진은 0.8 ~ 1.4 mmol/g 로딩된 것을 사용한다. 더 바람직하게는 1.1 mmol/g 로딩된 레진을 사용한다.

레진에서 Fmoc 보호기 제거는 레진을 용매(NMP(N-methylpyrrolidone) 또는 DMF(Dimethylformamide)) 상에서 10 ~ 30분 동안 팽창(swelling)시킨 후, 여과하여 용매를 제거한 후, 20% 피페리딘 (용매 중에)을 넣고 10 ~ 30분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (용매 중에)를 넣고 5 ~10분 동안 반응시킨 후 여과함에 의해 행한다. 여과 후 반응 용기에 남아 있는 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과한다. NMP x 2 (5분), DCM (dichloromethane) x 1 (5분), NMP x 1 (5분)

b), d) 및 f) 단계: 아미노산 커플링

Fmoc-아미노산 3~10 당량을 NMP에 용해한 후, 아미노산의 당량에 맞추어 DIC (N,N'-Diisopropylcarbodiimide)와 Cl-HOBt (1-Hydroxy-6-Chlorobenzotriazole)를 넣어 약 5분간 활성화한 후, a) 단계에서 준비된 레진이 들어있는 용기에 넣은 후 3 ~ 5 시간 동안 반응시킨다.

히스티딘의 경우는, 트리틸(trtyl) 기가 있는 Fmoc-히스티딘을 사용하면 수율을 높일 수 있다.

반응 종결 후 반응액을 여과한 다음 반응 용기에 남아있는 레진을 다음과 같은 순서로 세척한다: NMP 또는 DMF x 2 (5분), DCM x 1 (5분), NMP 또는 DMF x 1 (5분)

반응의 종결 확인은 발색반응(Kaiser Test)을 통하여 확인한다.

발색반응은 고체상 펩타이드 합성에서 닌히드린 (Ninhydrin; 2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)을 사용하여 보호기 제거를 확인하는 방법이다 (Analytical Biochemistry 1970, 34, 595-598).

c) 및 e) 단계: 중간체의 Fmoc 보호기 제거

b) 및 d) 단계에 형성된 펩타이드 (중간체)에서 Fmoc 보호기의 제거는 a) 단계에서의 보호기 제거와 동일하게 수행된다. 즉, 20% 피페리딘 (용매 중에)을 넣고 10 분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (용매 중에)를 넣고 5분 동안 반응시킨 후 여과함에 의해 행한다. 여과 후 반응 용기에 남아 있는 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과한다: NMP x 2 (3분), DCM x 1 (3분), NMP x 1 (3분).

g) 단계: 레진으로부터 펩타이드의 분리

레진 부피의 10배량의 절단 용액 (TFA(trifuloroacetic acid) : TIS (triisopropylsilane): H₂O = 95 : 2.5 : 2.5)을 넣은 후, 3 ~ 5 시간 동안 반응시킨다. 반응 종결 후, 반응 여과액의 10배 부피의 에탄올(Et₂O)을 부어 넣어 펩타이드를 추출한다. 추출된 펩타이드 (탈티렐린)를 원심 분리기를 사용하여 침전시킨 후 에탄올을 제거한 다음 두 번 더 에탄올을 사용하여 펩타이드에 섞여있는 TFA 잔존물과 아미노산의 곁사슬 부위의 보호기들로부터 제거된 화학물질들을 제거 한 다음 건조시킨다.

h) 단계: 펩타이드의 정제

펩타이드 정제는 다음의 2가지 방법이 있다.

1) 얻어진 펩타이드를 0.1% TFA (H₂O 중에)에 녹인다. 만일 이때 잘 녹지 않을 경우는 아세토니트릴 또는 메탄올을 적당량 첨가하여 녹인 다음 MILLEX GV Filter Unit 0.22 ㎛를 사용하여 여과한다. 여과한 펩타이드 수용액을 (분석용 또는 정제용) HPLC를 사용하여 분석/정제한다. HPLC 조건은 다음과 같다:

아세토니트릴 또는 메탄올 그리고 물의 농도 구배 조건 사용하며, 용매는 각각 0.1 % TFA 가 첨가되어 있는 상태이어야 하며 분석 및 정제 조건은 초기 농도 및 분당 아세토니트릴 또는 메탄올의 증가 속도를 적절하게 조절하여 사용한다.

2) 확보한 펩타이드 화합물을 중탄산나트륨 수용액을 사용하여 pH 8로 맞춘 다음, 컬럼에 충진된 CPH-20P 수지를 물로 세척한 후 준비된 화합물을 CPH-20P 수지가 충진된 컬럼을 통과시킨 다음 목적한 화합물을 물을 사용하여 용출시킨다. 이때 용출된 물 분획은 파울리(Pauly) 반응에 양성인 분획을 모은다.

i) 단계: 정제된 펩타이드의 동결 건조

상기 언급된 두 가지 방법으로 정제된 펩타이드는 동결건조기를 사용하여 건조시킨 후 분말 상태로 보관할 수 있다.

j) 단계: 탈티렐린 결정형 전환 (β→α)

얻어진 펩타이드 즉, 탈티렐린을 주로 β-형의 결정형이므로, 필요에 따라서, 의약품 제제화를 위해 메타스테이블한 α-형의 결정형으로 전환할 수 있다.

결정형 전환은 탈티렐린을 물에 녹인 다음 막 필터를 사용하여 여과한 후, 35℃에서 1 시간 동안 방치 후, 저온 반응조 (10℃)에서 교반기를 사용하여 5cm 페들러 (paddler)의 회전 속도를 300rpm으로 맞추고 10분 동안 교반 후, 생성된 결정을 여과하여 진공 건조(35℃)한다. XRD 분석을 통해 α-형임을 확인한다. 만일 β-형이 섞여있으면 상기 절차를 반복한다.

XRD data에서 16.2^o 에서 보여지는 특징적인 피크가 β-형의 전형이다. 만약 16.2^o 에서 특징적인 피크가 보이지 않으면 탈티렐린의 결정형은 α-형으로 변환된 것이다. 이렇게 얻어진 α-형 탈티렐린은 다음 α-형 결정형을 만들 때 씨드로 사용하면 α-형 결정형의 회수율을 50% 이상으로 높일 수 있다.

본 발명의 제조방법에 의한 탈티렐린(I)의 합성은 다음 반응식으로 요약할 수 있다:

<반응식: 고체상 합성법을 이용한 탈티렐린 제조 모식도>

본 발명의 제조방법에 의한 탈티렐린을 합성은, 하나의 반응기 안에서 모든 단계의 반응이 이루어져 대단히 빠른 속도로 화합물의 합성을 종결시킬 수 있고, HPLC 순도가 98% 이상으로 최종 화합물을 확보하여 단 한번의 레진 통과 또는 HPLC 정제법을 통하여 원하는 최종 화합물을 고 수율/순도로 확보할 수 있는 장점을 가지고 있다.

도 1은 실시예 1에 따라 생성된 탈티렐린의 HPLC한 결과를 나타낸다.
도 2는 실시예 1에 따라 생성된 탈티렐린을 정제한 후 HPLC한 결과를 나타낸다.
도 3은 실시예 2에 따라 생성된 탈티렐린 (α-결정형)의 HPLC한 결과를 나타낸다.
도 4는 탈티렐린의 α- 및 β-결정형을 분석한 XRD 데이터이다.
도 5는 코어-셀 타입의 레진의 일례를 나타내는 사진이다.

이하 실시예들에서 본 발명을 더 구체적으로 설명하나, 본 발명은 이에 한정되지는 않는다.

실시예 1: 아민 기능기를 가진 레진을 이용한 탈티렐린 합성

C-말단에 아민 기능기를 제공할 수 있는 코아-셀(CS) 기술을 사용하여 생산된 CS-Rink Amide MBHA 레진을 사용하여 탈티렐린을 합성하였다. 이때 Fmoc 정량법을 사용하여 측정하여 0.8 mmol/g 로딩된 레진을 사용하였다. 합성은 0.1M 스케일로 진행을 하였다. 합성은 PTI사에서 제조한 펩타이드 전자동 합성기 SONATA XT를 사용하였다.

레진의 Fmoc 보호기 제거

Fmoc 보호된 코어-셀(CS) 타입 Rink Amide MBHA 레진 (100mmol, 125g, 0.8 mmol/g, ㈜비드테크)를 전자동 펩타이드 합성기 SONATA XT의 3.2L 반응용기에 넣은 다음 디메틸포름아미드(DMF)를 첨가한 후, 여과반응기에 넣고 30분 동안 팽창시켰다. 여과하여 DMF를 제거한 후 여과반응기에 20% 피페리딘 (DMF 중에)을 넣고 10분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (DMF 중에) 를 넣고 5분 동안 반응시킨 후 여과하여 Fmoc가 제거된 Rink Amide MBHA 레진을 제조하였다. 여과하여 여액을 버리고 반응기에 남아 있는 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과했다: DMF x 2회 (각 5분), Dichloromethane x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분)

Fmoc - Pro - OH 커플링

Fmoc-Pro-OH 3 당량을 DMF에 녹인 후, 아미노산의 당량에 맞추어 DIC(N,N'-Diisopropylcarbodiimide) 와 Cl-HOBt(1-Hydroxy-6-Chlorobenzotriazole)를 넣어 약 5분간 활성화한 다음, Fmoc 보호기가 제거된 CS-Rink Amide MBHA 레진이 들어있는 여과반응기에 넣은 후, 3 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 반응액을 여과한 다음 여과반응기에 남아있는 Fmoc-Pro-CS-Rink Amide MBHA 레진을 다음과 같은 순서로 세척한다: DMF x 2회 (각 5분), 디클로로메탄 x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분). 반응의 종결 확인은 발색반응(Kaiser Test)을 통하여 확인했다.

Fmoc - Pro - CS - Rink Amide 레진의 Fmoc 보호기 제거

세척된 Fmoc-Pro-Rink Amide MBHA 레진이 들어있는 반응기에 20% 피페리딘 (DMF 중에)을 넣고 20분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (DMF 중에) 를 넣고 10분 동안 반응시킨 후 여과하여 Fmoc가 제거된 H-Pro-CS-Rink Amide MBHA 레진을 제조하였다. 여과 후 반응기에 남아 있는 H-Pro-CS-Rink Amide MBHA 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과했다: DMF x 2회 (각 5분), Dichloromethane x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분)

Fmoc - His ( Trt )- OH 커플링

Fmoc-His(Trt)-OH 3 당량을 DMF에 녹인 후, 아미노산의 당량에 맞추어 DIC 와 Cl-HOBt를 넣어 약 5분간 활성화한 다음, H-Pro-Rink Amide 레진이 들어있는 여과반응기에 넣은 후 3 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 반응액을 여과한 다음 여과반응기에 남아있는 Fmoc-His(Trt)-Pro-CS-Rink Amide MBHA 레진을 다음과 같은 순서로 세척한다: DMF x 2회 (각 5분), 디클로로메탄 x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분). 반응의 종결 확인은 발색반응(Kaiser Test)을 통하여 확인했다.

Fmoc - His ( Trt )- Pro - CS - Rink Amide 레진의 Fmoc 보호기 제거

세척된 Fmoc-His(Trt)-CS-Pro-Rink Amide 레진이 들어있는 반응기에 20% 피페리딘 (DMF 중에)을 넣고 20분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (DMF 중에)를 넣고 10분 동안 반응시킨 후 여과하여 Fmoc가 제거된 H-His(Trt)-Pro-CS-Rink Amide 레진을 제조하였다. 여과 후 반응기에 남아 있는 H-Pro-CS-Rink Amide 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과했다: DMF x 2회 (각 5분), Dichloromethane x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분)

1-메틸-4,5-디히드로오로트산의 커플링

1-메틸-4,5-디히드로오로트산 2 당량을 DMF 녹인 후, 아미노산의 당량에 맞추어 DIC와 Cl-HOBt를 넣어 약 5분간 활성화한 다음, H-His(Trt)-Pro-Rink Amide 레진이 들어있는 여과반응기에 넣은 후 3 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 반응액을 여과한 다음 여과반응기에 남아있는 1-메틸-4,5-디히드로오로트산-His(Trt)-Pro-CS-Rink Amide 레진을 다음과 같은 순서로 세척한다: DMF x 3회 (각 5분), 디클로로메탄 x 3회 (각 5분). 그리고 나서 10분간 여과하여 건조한다.

반응의 종결 확인은 발색반응(Kaiser Test)을 통하여 확인했다.

레진으로부터 펩타이드의 분리

잘 건조 된 1-메틸-4,5-디히드로오로트산-His(Trt)-Pro-CS-Rink Amide 레진 이 들어있는 여과반응기에 레진 부피의 10 배량의 절단용액 (95% TFA, 2.5% TIS, 2.5% H₂O)를 조심스럽게 넣은 후 3시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 반응 여과액의 10배 부피의 에탄올을 부어 넣어 펩타이드를 추출한다. 추출된 펩타이드를 원심 분리기를 사용하여 침전시킨 후 에탄올을 제거 한 다음 두 번 더 에탄올을 사용하여 펩타이드에 섞여있는 TFA 잔존물과 아미노산의 곁 사슬 부위의 보호기들로부터 이탈된 물질들을 제거한 다음 건조시켜 36.5g (90%)을 얻었다.

얻어진 펩타이드(탈티렐린)을 HLPC 하여 그 결과를 도 1에 나타냈다 (97.93%).

펩타이드(탈티렐린)의 정제

얻어진 펩타이드를 필요량의 0.1% TFA 가 포함된 물에 녹인 후, 펩타이드 수용액을 분석용 및 정제용 HPLC를 사용하여 분석한 후 정제했다. HPLC 분석 및 정제 조건은 다음과 같았다: (일반적으로 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴과 물을 사용하여 농도구배조건으로 분석 및 정제를 한다) 분석은 아세토니트릴 5% 으로 설정하였으며, 분석용 C₁₈ 컬럼, 210nm UV 파장, 1ml/min유량으로 실시하였으며, 정제는 아세토니트릴 5%에서 20% 농도가 증가하는 구배로 설정하였으며, 정제는 C₁₈ 컬럼, 210nm UV 파장, 14ml/min유량으로 실시하였다.

정제 후의 탈티렐린의 HPLC 하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.

정제된 펩타이드의 동결건조

정제된 펩타이드는 동결건조기를 사용하여 건조시킨 후 분말 상태로 보관하였다.

실시예 2: 카르복시산 기능기를 가진 레진을 사용한 탈티렐린 합성

C-말단에 카르복시산 기능기를 제공할 수 있는 CS-2-Cl-트리틸 레진(이하 'CS-2-CTC 레진')을 사용하여 탈티렐린을 합성하였다. 이때 CS-2-CTC 레진은 1.1 mmol/g 로딩된 레진을 사용하였다. 합성은 0.1M 스케일로 진행을 하였다. 합성은 PTI사에서 제조한 펩타이드 전자동 합성기 SONATA XT를 사용하였다.

Fmoc - Pro - OH 로딩

CS-2-CTC 레진(165mmol, 150g, 1.1 mmol/g)이 준비된 전자동 합성기 SONATA XT의 3.2L 반응용기에 DCM에 녹인 0.2 M 농도의 Fmoc-Pro-OH 3 당량과 아미노산 당량의 3.5배 당량의 DIEA(diisopropylamine)를 가하여 약 1시간 동안 반응시킨다. 반응 종결 후 여전히 반응하지 않고 레진 상에 남아있는 염소기의 반응성을 없애기 위하여 상기 반응 용액에 150 mL의 MeOH/DIEA(1:9)을 가하여 30분 동안 반응시킨다. 이렇게 얻어진 레진은 1L의 DCM을 사용하여 10분씩 3회 세척한 후 질소 기류 하에서 건조시킨 다음 Fmoc 정량법을 사용하여 정량한 결과 0.67 mmol/g 로딩률을 확인하였다.

Fmoc - Pro - CS -2- CTC 레진의 Fmoc 보호기 제거

세척된 Fmoc-Pro-CS-2-CTC 레진이 들어있는 반응기에 20% 피페리딘 (DMF 중에)을 넣고 20분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (DMF 중에) 를 넣고 10분 동안 반응시킨 후 여과하여 Fmoc가 제거된 H-Pro-CS-2-CTC 레진을 제조하였다. 여과 후 반응기에 남아 있는 H-Pro-CS-2-CTC 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과했다: DMF x 2회 (각 5분), 디클로로메탄 x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분)

Fmoc - His ( Trt )- OH 커플링

Fmoc-His(Trt)-OH 3 당량을 DMF 녹인 후, 아미노산의 당량에 맞추어 DIC와 Cl-HOBt를 넣어 약 5분간 활성화한 후, H-Pro-CS-2-CTC 레진이 들어있는 여과반응기에 넣은 후 3 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 반응액을 여과한 다음 여과반응기에 남아있는 Fmoc-His(Trt)-Pro-CS-2-CTC 레진을 다음과 같은 순서로 세척한다: DMF x 2회 (각 5분), 디클로로메탄 x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분). 반응의 종결 확인은 발색반응(Kaiser Test)을 통하여 확인했다.

Fmoc - His ( Trt )- Pro - CS -2- CTC 레진의 Fmoc 보호기 제거

세척된 Fmoc-His(Trt)-Pro-Rink Amide 레진이 들어있는 반응기에 20% 피페리딘 (DMF 중에)을 넣고 20분 동안 반응시킨 후 여과하고 다시 20% 피페리딘 (DMF 중에) 를 넣고 10분 동안 반응시킨 후 여과하여 Fmoc가 제거된 H-His(Trt)-Pro-CS-2-CTC 레진을 제조하였다. 여과 후 반응기에 남아 있는 H-His(Trt)-Pro-CS-2-CTC 레진을 다음과 같은 순서로 세척 후 여과했다: DMF x 2회 (각 5분), 디클로로메탄 x 2회 (각 5분), DMF x 2회 (각 5분)

1-메틸-4,5-디히드로오로트산의 커플링

1-메틸-4,5-디히드로오로트산 2 당량을 DMF 녹인 후, 아미노산의 당량에 맞추어 DIC와 Cl-HOBt를 넣어 약 5분간 활성화한 후, H-His(Trt)-Pro-CS-2-CTC 레진 이 들어있는 여과반응기에 넣은 후 3 시간 동안 반응시켰다. 반응 종결 후 반응액을 여과한 다음 여과반응기에 남아있는 1-메틸-4,5-디히드로오로트산-His(Trt)-Pro- CS-2-CTC 레진을 다음과 같은 순서로 세척한다: DMF x 3회 (각 5분), 디클로로메탄 x 3회 (각 5분). 그리고 나서 10분간 여과하여 건조한다.

반응의 종결 확인은 발색반응(Kaiser Test)을 통하여 확인했다.

레진으로부터 펩타이드의 분리

잘 건조된 1-메틸-4,5-디히드로오로트산-His(Trt)-Pro- CS-2-CTC 레진에 무수암모니아 기체를 포화시킨 MeOH 수용액에서 하루 동안 반응시킨 다음 여과 장치를 사용하여 분리 후 여액을 회전식 증류기를 사용하여 농축한 다음 진공 건조 시켜 26.4g (65%)을 얻었다.

펩타이드의 정제는 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였다.

결정형 전환

정제 후 얻어진 30g의 β-형의 탈티렐린을 물에 70mL의 녹인 다음 0.45 mm의 막 필터를 사용하여 여과한 다음, 35 ^oC에서 1 시간 동안 방치한 후, 10 ^oC 저온 반응조에서 교반기를 사용하여 5cm 패들러의 회전 속도를 300rpm으로 맞추고 10분 동안 교반한 다음 생성된 결정을 여과하여 35 ^oC에서 진공 건조하여 α-형 탈티렐린을 얻었다. 얻어진 α-형 탈티렐린은 XRD 분석을 통해 확인하였고, HPLC 하여 그 결과를 도 3에 나타내었다 (최종 회수율 50%).

Claims

프롤린 아미드, 히스티틴 및 1-메틸-4,5-디히드로오로트산을 축합반응시키되
a) Fmoc(9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl) 보호기를 제거한 레진을 제공하는 단계;
b) Fmoc-프롤린을 상기 레진에 커플링하는 단계;
c) 상기 커플링된 프롤린에서 Fmoc 보호기를 제거하는 단계;
d) Fmoc-히스티딘을 상기 커플링된 프롤린에 커플링하는 단계;
e) 상기 커플링된 히스티딘에서 Fmoc 보호기를 제거하는 단계;
f) 1-메틸-4,5-디히드로오로트산을 상기 커플링된 히스티딘에 커플링하는 단계를 포함하는 고체상 펩타이드 합성법을 이용하여 탈티렐린을 제조하는 방법에 있어서,
상기 레진은 고체상 코어-셀 타입으로서, 2-Cl-트리틸아민(Tritylamine), Rink Amide AM(Aminomethyle) 및 MBHA(4-methylbenzhydrylamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아민 기능기 레진이거나, 또는 트리틸아민(Tritylamine), 2-Cl-트리틸(Trityl), Rink-Acid 및 Sasrin(2-methyl-4-alkoxybenzylalchol)로 이루어진 군으로부터 선택되는 OH 기능기 레진인 것을 특징으로 하는 탈티레린의 제조방법.
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제 1항에 있어서, 상기 아민 기능기 레진은 Fmoc 정량법을 사용하여 측정하여 0.5 ~ 0.8 mmol/g 로딩된 것을 특징으로 하는 탈티렐린의 제조 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 OH 기능기 레진은 Fmoc 정량법을 사용하여 측정하여 0.8 ~ 1.4 mmol/g 로딩된 것을 특징으로 하는 탈티렐린의 제조 방법.
제 1항에 있어서, 상기 히스티딘은 트리틸기가 있는 것을 특징으로 하는 탈티렐린의 제조 방법.