CN1923849B - 固相多肽合成奥曲肽的制备方法 - Google Patents

固相多肽合成奥曲肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种固相多肽合成奥曲肽的制备方法。本发明的方法包括如下步骤：以2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂作起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型奥曲肽，并在pH7-11的条件下用空气氧化，获得奥曲肽粗品，再经C18(或C8)柱分离纯化，制得奥曲肽精品。本发明的方法，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，收率高，质量稳定，生产成本低，接肽收率高，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，采用C18(或C8)柱进行分离纯化。

Description

固相多肽合成奥曲肽的制备方法
技术领域
本发明涉及一种奥曲肽的制备方法，具体涉及固相多肽合成奥曲肽的制备方法。
背景技术
奥曲肽，中文名：醋酸奥曲肽；英文名：Octreotide Acetate
结构式：
Figure G05129221220050913D000011
               分子式：C49H66N10O10S2·XC2H4O2
奥曲肽是人工合成的生长抑素8肽，是90年代临床应用最具成效的激素类药物之一。与天然生长抑素的药理作用相同，但半衰期延长了30倍，因此具有应用价值。奥曲肽能抑制多种胃肠道激素的分泌及其它多种内分泌功能，目前已广泛用于临床治疗各型胰腺炎、胰腺瘘管、肠瘘、肝硬化食道-胃底曲张静脉出血、消化道溃疡出血、严重腹泻及肢端肥大症，并有望用于消化***内分泌肿瘤的治疗。
奥曲肽是一种安全有效的治疗上消化道出血、急性胰腺炎的首选药物。但目前本品尚无国产品，全部依赖进口，进口品(商品名：善得定、善宁，生产商为瑞士山道士公司)在国内的零售价为801元/盒(5支)，规格为2ml:0.1mg。
在国内，肝硬化发病率超过1％，每年发生食管曲张静脉破裂引起的大出血的患者，加上消化性溃疡引起的上消化道大出血患者，总数超过300万，因此奥曲肽的市场巨大。我们研制的生长抑素八肽(醋酸奥曲肽)成本将大大低于进口品，将大大降低患者的治疗成本。
目前文献报导的制备方法均存在着一定的缺陷，每一轮脱帽须用三氟醋酸，故接肽收率低，导致生产成本较高；三废污染多，并使用氟化氢切肽、三氟醋酸进行纯化，污染环境，收率较低。因此目前的方法限制了奥曲肽的大规模生产和使用。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是公开一种固相多肽合成奥曲肽的制备方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。
本发明的方法包括如下步骤：
以2-氯-三苯甲基树脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)、三苯甲基树脂作树脂(TritylChloride Resin)、4-甲基三苯甲基树脂(4-Methyltrityl Chloride Resin)或4-甲氧基三苯甲基树脂(4-Methoxytrityl Chloride Resin)为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型八肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型奥曲肽，并在pH7-11的条件下用空气氧化，获得奥曲肽粗品，再经C18(或C8)柱分离纯化，冷冻干燥后，制得奥曲肽精品。
按照本发明，依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Thr(tBu)-树脂：
将2-氯-三苯甲基树脂、三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂，用DMF浸泡10～60分钟，使树脂充分溶胀，加DIPEA或DMPA和Fmoc-Thr(tBu)-ol10～50℃反应1～24小时；
再加甲醇10～50℃反应1～20小时，氮气吹干，树脂用DMF洗涤，获得Fmoc-Thr(tBu)-树脂；
所说的树脂取代量为：0.3-1.5mmol/g；粒径为100-400目；
Fmoc-Thr(tBu)-ol的摩尔数为树脂的2～5倍；
DIPEA或DMPA的摩尔数为树脂的2～20倍；
脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5～20ml/g，下同；
甲醇的摩尔数为树脂的2～20倍；
(2)制备Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，10～50℃反应10～60分钟，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10～50℃反应1～5小时，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比，下同；
脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5～20ml/g，下同；
混合物中：
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
TBTU/HBTU和HOBT的摩尔数为树脂的2～5倍；
所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同；
接肽试剂中，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
“TBTU/HBTU和HOBT”指的是：TBTU与HOBT的混合物，或者是HBTU与HOBT的混合物，下同；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(5)制备Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-D-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(6)制备Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(5)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干。加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(7)制备Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍。
其余操作以及工艺条件同上；
(8)制备Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)树脂：
在步骤(7)的Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Boc-D-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)树脂；
混合物中：
Boc-D-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(9)制备D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol：
在步骤(8)Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)树脂中，加入预冷至-10℃～20℃的切肽试剂，10℃～50℃反应1～5小时，减压蒸除溶剂，加入***沉淀，收集沉淀物，用***洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的还原型奥曲肽；
所说的切肽试剂的组分为：TFA/EDT/H2O/TIS＝90-95/2-5/2-5/1-5，体积比；
(10)制备
Figure A20051002922100101
在步骤(9)的D-Phe-Cys(SH)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(SH)-Thr-ol中，用氢氧化钠或氨水调节pH至7-12，在10℃～50℃下，通入空气或氧气氧化反应8～30小时，获得奥曲肽粗品。
按照本发明，粗品经C18(或C8)柱分离纯化分离纯化的方法包括如下步骤：
将奥曲肽粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18或C8柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为100-650ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品，总收率为30-40％(以树脂的mmol计)。
乙酸的重量浓度为0.5～10％，乙酸中奥曲肽粗品的重量浓度为1～50％。
本发明的奥曲肽工艺路线有下列特点，具备规模化生产能力，工艺稳定，原辅材料来源方便，生产周期短，生产成本低，三废少，收率高，质量稳定，生产成本低，极具市场竞争力，接肽收率高(每步接肽收率为≥99％)，降低了成本，采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS)进行切肽，加入***沉淀粗品的方法，避免使用氟化氢等剧毒试剂，三废污染少，且提高收率，采用C18(或C8)柱进行分离纯化，避免使用TFA(三氟醋酸)进行纯化，减少三废，每步接肽收率均在98％以上；总收率为30-40％。
具体实施方式
                              实施例1
实施例和前述过程中所采用的原料列表如下：
Figure G05129221220050913D000051
一、合成肽链
(1)制备Fmoc-Thr(tBu)-树脂：
取2-氯-三苯甲基树脂50克(100-200目，1.0mmol/g，50mmol)，用DMF浸泡30分钟，使树脂充分溶胀，加44ml DIPEA，39.7g Fmoc-Thr(tBu)-ol，反应3小时，再加50ml甲醇继续反应3小时。氮气吹干，树脂用DMF洗三次。获得Fmoc-Thr(tBu)-树脂；
(2)Fmoc-Cys(Trt)-Thr-树脂的制备：
加入800毫升体积浓度为20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹滤去六氢吡啶，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入Fmoc-Cys(Trt)-OH(MW：585.7，200mmol)117.1g、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
(3)Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-树脂的制备
在上述脱帽反应后的树脂中，加79.5g(397.5，200mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
(4)Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-树脂的制备
在上述脱帽反应后的树脂中，加93.7g(468.5，200mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
(5)Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-树脂的制备
在上述脱帽反应后的树脂中，加85.3g(426.5，200mmol)Fmoc-D-Trp-OH、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
(6)Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-脂的制备
在上述脱帽反应后的树脂中，加77.5g(FW：387.4，200mmol)Fmoc-Phe-OH、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
(7)Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-树脂的制备
在上述脱帽反应后的树脂中，加117.1g(585.7，200mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次，氮气吹干。
(8)Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-树脂的制备
在上述脱帽反应后的树脂中，加53g(FW：265.3，200mmol)Boc-D-Phe-OH、TBTU(MW：321，200mmol)64.2g，HOBT(MW：153，200mmol)30.6g，NMM 44.4ml(MW＝101.2)，400mlDMF，将混合物25℃反应1小时。氮气吹干，DMF、无水甲醇、DMF各洗涤三次，氮气吹干。
加入500毫升20％的六氢吡啶的DMF溶液，25℃反应30分钟。氮气吹干，分别用DMF、无水甲醇DMF各洗涤三次，氮气吹干。
再用无水甲醇洗涤三次。抽干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得八肽树脂约90g(MW＝931，43mmol)，接肽总收率约为86％。
二、切肽
取90.2g八肽树脂转移到茄形瓶中，冷却下加入切肽试剂：(TFA/水/乙二硫醇/苯甲硫醚＝650ml/17ml/17ml/34ml)，25℃搅拌2小时。过滤，抽干，滤液加无水***沉淀，过滤收集沉淀得约30g还原型奥曲肽粗品。
三、氧化(二硫键的形成)
将30g还原型奥曲肽粗品溶于30L水，在搅拌下慢慢滴加2M NH4OH至pH7.8，室温通空气氧化约24小时，用冰醋酸调至pH5.5，加活性碳搅拌30分钟，过滤。
四、纯化
滤液分批经C18柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶乙腈(7.5∶2.5)；流速为：380ml/min；检测波长为：280nm；样品峰合并后冻干，约得15.6g白色疏松块状物成品(MW：1019，15.3mmol)；收率30.6％(以Fmoc-Thr-树脂的mmol计)。用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液。
                            实施例2～3
采用与实施例1相同的方法和工艺条件，其中：
分别以4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂作起始原料，同前法接上Fmoc-Thr-ol后，再加入脱帽试剂，25℃反应0.5小时，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-氨基酸、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，25℃反应2小时，再经切肽、氧化等反应，得到16.3g和14.9g白色疏松块状物成品，收率分别为32.0％和29.2％(以Fmoc-Thr-树脂的mmol计)。

Claims (3)

1.一种固相多肽合成奥曲肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：以2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂为起始原料，按照固相合成的方法依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团，用TBTU或HBTU及HOBT为缩合剂进行接肽反应，得保护的还原型八肽树脂后，同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型奥曲肽，并在pH7-11的条件下用空气氧化，获得奥曲肽粗品，再经C18或C8柱分离纯化，冷冻干燥后，制得奥曲肽精品；
依次连接具有保护基团的氨基酸，获得保护八肽树脂，其间依次脱去Fmoc-保护基团的方法包括如下步骤：
(1)制备Fmoc-Thr(tBu)-树脂：
将2-氯-三苯甲基树脂、4-甲基三苯甲基树脂或4-甲氧基三苯甲基树脂，100-400目，0.3-1.5mmol/g，用DMF浸泡5～60分钟，加入DIPEA或DMPA和Fmoc-Thr(tBu)-ol，10～50℃反应1～24小时；
再加甲醇10～50℃反应1～24小时，氮气吹干，树脂用DMF洗涤，获得Fmoc-Thr(tBu)-树脂；
Fmoc-Thr(tBu)-ol的摩尔数为树脂的2～5倍；
DIPEA或DMPA的摩尔数为树脂的2～20倍；
甲醇的摩尔数为树脂的2～20倍；
(2)制备Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(1)的Fmoc-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
所说的脱帽试剂为：PIP∶DMF＝1∶2～5，体积比，下同；
脱帽试剂的加入量以树脂的重量为基准为5～20ml/g，下同；
混合物中：
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
TBTU/HBTU和HOBT的摩尔数为树脂的2～5倍；
所说的接肽试剂为：NMM∶DMF＝1∶5～15，体积比，下同；
接肽试剂中，Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
(3)制备Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂
在步骤(2)的Fmoc-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Thr(tBu)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(4)制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(3)的Fmoc-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Lys(Boc)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(5)制备Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(4)的Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-D-Trp-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-D-Trp-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(6)制备Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(5)的Fmoc-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(7)制备Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(6)的Fmoc-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂；
混合物中：
Fmoc-Cys(Trt)-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
(8)制备Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂：
在步骤(7)的Fmoc-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-树脂中，加入脱帽试剂，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，加入用接肽试剂溶解的Boc-D-Phe-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，反应，吹干，分别用DMF和乙醇洗涤，吹干，获得Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)树脂；
混合物中：
Boc-D-Phe-OH的摩尔数为树脂的2～5倍；
其余操作以及工艺条件同上；
同步进行脱侧链保护基团及切肽，获得还原型奥曲肽的方法包括如下步骤：
在步骤(8)Boc-D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)树脂中，加入预冷至-10℃～20℃的切肽试剂，10℃～50℃反应1～5小时，减压蒸除溶剂，加入***沉淀，收集沉淀物，用***洗，P2O5真空干燥，获得切肽后的还原型奥曲肽；
所说的切肽试剂的组分为：TFA/EDT/H2O/TIS＝90-95/2-5/2-5/1-5，体积比；
所述的氧化过程包括如下步骤：
将上述还原型奥曲肽用氢氧化钠或氨水调节pH至7-12，在10℃～50℃下，通入空气或氧气氧化反应8～30小时，获得奥曲肽粗品；
粗品经C18或C8柱分离纯化的方法包括如下步骤：
将奥曲肽粗品溶于乙酸中，过滤，滤液经C18或C8柱纯化，流动相：0.1MNH4Ac：
乙腈＝7.5∶2.5；流速为100-650ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后去盐，冻干，获得成品；乙酸的重量浓度为0.5～10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入脱帽试剂，10～50℃反应10～60分钟。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入用接肽试剂溶解的Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU/HBTU和HOBT的混合物，10～50℃反应1～5小时。
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