CN104628827A - 一种普利卡那肽的制备方法 - Google Patents
一种普利卡那肽的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种普利卡那肽的制备方法，包括以下步骤：1)由Fmoc-Leu-树脂载体采用Fmoc固相合成方法按普利卡那肽的多肽序列顺序由碳端向氮端逐一偶联得到侧链基团保护的肽树脂；2）肽树脂依次按Cys4-Cys12、Cys7-Cys15分别脱保护后定向成环，获得全保护的普利卡那肽肽树脂；3）采用裂解试剂裂解侧链基团保护的肽树脂，4）脱盐后纯化、冻干得到普利卡那肽。本发明采用的普利卡那肽制备工艺方法具有实际的工业化应用前景和可观的经济实用价值。
Description
技术领域
本发明属于制药技术领域，尤其是涉及一种通过树脂上定向成环反应制备普利卡那肽的方法。
背景技术
C型鸟苷酸环化酶(GC-C)受体主要在小肠上皮细胞腔侧表达。GC-C是一种多中心酶，包括细胞外配体结合域、单通道过膜域、类似于酪氨酸激酶蛋白的活性中心以及配体介导活化生成cGMP的C-末端GC-C催化域。肠毒素(ST)通过过度活化肠道受体GC-C(已确认的人体内仅有的ST靶点)的信号通道引起受感人群分泌性腹泻。相应的，敲除小鼠GC-C编码基因导致ST诱导的肠道分泌和腹泻被抑制。产ST细菌引起的传染性腹泻是卫生条件落后和拥挤情况下的主要病因，也是发展中国家旅行者腹泻和婴儿死亡的主要因素。尽管机理认知不断深入，这些腹泻疾病的发病率在过去的数十年中未见变化。旅行者腹泻与结肠癌发病相关。
总之，GC-C受体在体液平衡、pH控制和电解质平衡方面扮演了一个关键角色。这样，提出内源性配体鸟苷蛋白和尿鸟苷素作为cGMP相关的第二信使调节肠道流质和电解质稳态，是维持肠道生理环境的基本现象。而且，许多研究建议，服用STs刺激小肠平滑肌，从而改善肠动力和通过STs减少痛觉传入纤维放电的GC-C活性。可能通过释放特定的介质刺激在十二指肠周围的神经末端从而调节神经放电频率。
GC-C受体参与维持小肠内体液和离子平衡、其所谓的小肠动力和传入疼痛衰减作用、以及基于分子靶向治疗途径，使这一受体成为慢性特发性便秘(CIC)和便秘肠易激综合征(IBS-C)等慢性便秘症的潜在治疗靶点。这些研究与ST多肽分子、内源性激素(鸟苷蛋白、尿鸟苷素)作用机理的发现推动了包括利那洛肽、普利卡那肽在内的创新性促分泌药物开发。
普利卡那肽由美国Synergy制药有限公司研制的针对GC-C受体的在研药物，口服给药。目前正在进行包括慢性特发性便秘(CIC)和便秘肠易激综合征(IBS-C)在内的III期临床试验。有望在近年内获得美国FDA批准上市。普利卡那肽的CAS号：467426-54-6，英文名plecanatide，结构式如下：
普利卡那肽的制备方法由深圳翰宇药业首先报道(CN103694320A)，采用了固相合成线性多肽，继而在溶液中两步法分别成环得到。由于该方法成环在溶液中分两次进行，溶液中成分复杂，分离纯化难度大，方法有待改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一条新型的Fmoc固相合成路线，在树脂上定向氧化形成两对二硫键，切割纯化后直接获得具有完整空间结构的普利卡那肽。有利于工业化生产，成本低、操作方便、对环境影响小、收率高。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种制备普利卡那肽的方法，包括以下步骤：
1)按普利卡那肽的序列，在Fmoc-Leu-树脂载体上由碳端向氮端逐一偶联Cys、Gly、Thr、Cys、Ala、Val、Asn、Val、Cys、Leu、Glu、Cys、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂，其中，Cys侧链保护基分别是StBu、Mmt和Acm，Thr、Glu、Asp、Asn侧链保护基分别是tBu、OtBu、OtBu和Trt；
2)肽树脂在巯基乙醇的DMF溶液中反应，洗涤，然后加入过量的2,2’-二硫双(5-硝基吡啶)的DCM溶液反应，洗涤后加入TFA的含TIS的DCM溶液反应，进行第一次环化；
3)经过一次环化的肽树脂在I2溶液中脱除7位、15位的Acm保护基，第二次环化；
4)肽树脂采用切割试剂将普利卡那肽从树脂上分离，得到粗肽，经过分离纯化获得普利卡那肽纯品。
其中，所述步骤1)中，所述Fmoc-Leu-树脂为市售的羟甲苯基树脂与Fmoc-Leu-OH的反应产物。羟甲苯基树脂包括但不限于王树脂、HMP树脂；所述Fmoc-Leu-树脂载体的取代度为0.1mmol/g-1.6mmol/g，优选Fmoc-Leu-树脂的取代度为0.2mmol/g-0.6mmol/g；优选的保护氨基酸依次为Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys-(Mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH等，保护氨基酸用量优选为树脂担载量的1.5-5倍。采用HOBt/DIC偶联试剂、20％哌啶的DMF溶液制备得到N端Boc保护的含侧链保护基团的线性普利卡那肽的肽树脂；
所述步骤2)中，肽树脂在体积百分数10-50％巯基乙醇的DMF溶液中反应1-10h；巯基乙醇含量优选15-30％，反应时间优选2-4h；然后加入5-20倍量DTNP的DCM溶液1h；洗涤后加入体积百分数0.5-5％TFA的含体积百分数1-10％TIS的DCM溶液反应20min，进行一次环化；
所述步骤3)中，5-100倍当量I2的DMF溶液中反应0.5-5h，优选10-20倍当量I2的DMF溶液，反应时间优选1-2h；
本技术过程中，采用定向成环反应，分别脱去StBu和Mmt环化4位Cys和12位Cys，形成第一个二硫键；在此基础上进一步脱除7位Cys和15位Cys的Acm，并同时完成环化反应，形成第二个二硫键；树脂上成环反应完成后，肽树脂经过切割直接得到目标多肽，与溶液成环反应产生的复杂体系相比，简化了样品体系的复杂程度，大大降低了产品分离纯化难度。
所述步骤4)中，向含侧链保护基团的普利卡那肽树脂中加入体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H2O，或体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT，或体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT的裂解试剂，冰浴反应0.1-1h后，室温下继续搅拌反应1-10h，然后抽滤。抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发和/或N2气吹至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的普利卡那肽粗肽。优选裂解试剂体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H2O。
该步骤中，对含侧链保护基团的普利卡那肽树脂进行裂解、沉淀得到粗肽，其沉淀试剂包括:***、环己烷、甲基叔丁基醚、石油醚、体积比为1:10-10:1的***/石油醚、体积比为1:10-10:1的***/环己烷，优选***或体积比为1:1的***/石油醚，更优选***。
普利卡那肽粗肽经过高效液相色谱纯化、冻干得普利卡那肽纯品。
此外，本发明中，未注明构型的氨基酸均为天然/左旋结构；缩略语的解释如下：
DIC：N,N'-二异丙基碳二酰亚胺
HOBt：1-羟基苯并三氮唑
DMF：二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷，
Thioanisole：甲基苯基硫醚
Anisole：苯甲醚
EDT：1，2-乙二硫醇
Phenol：苯酚
DTNP：2,2’-二硫双(5-硝基吡啶)
Acm：乙酰胺甲基；
StBu：叔丁巯基；
Mmt：4-甲氧基三苯甲基；
Trt：三苯甲基；
OtBu：叔丁氧基；
tBu：叔丁基；
h为时间单位:小时。
采用上述技术方案制备普利卡那肽的有益效果在于，采用Fmoc固相合成路线，在树脂上定向氧化形成两对二硫键，切割纯化后直接获得具有完整空间结构的普利卡那肽。报道的方法采用了固相合成线性多肽，继而在溶液中两步法分别成环得到普利卡那肽，而溶液中成分复杂，分离纯化难度大，增加了生产成本。与报道的方法相比，本方法更有利于工业化生产，成本低、操作方便、对环境影响小、收率高，具有广泛的应用前景和可观的经济实用价值，适宜工业化推广应用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，由于篇幅所限，此处只列举了最具代表性的实施方式，虽然本发明所涉及的各反应条件及其具体参数未一一体现在具体实施方式中，但本领域技术人员依然可以预见，说明书中给出的各反应条件均能够实现本发明。
实施例1
称取取代度为0.51mmol/g的Fmoc-Leu-王树脂10g(5.1mmol)，加入固相反应器中，DMF洗涤3次后，溶胀3h。将体积比1:4的哌啶：DMF溶液加至反应器中反应，反应后用DCM洗涤2次，DMF进行洗涤4次。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH 6.34g、HOBt 2.07g、DIC 2.37mL溶于DMF溶液中，混合均匀后加入反应器中，室温反应2h。茚三酮显色反应控制终点，树脂显透明无色表示反应结束，如果显色则继续反应至无色。结束反应后，DCM洗涤2次，DMF进行洗涤4次。
重复上述步骤，按照序列顺序，依次脱保护、偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys-(Mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH。
向制备得到的肽树脂反应器中加入体积百分数15％巯基乙醇的DMF溶液，反应2h；然后加入20倍量DTNP的DCM溶液反应1h；洗涤后加入1％TFA的含TIS 5％的DCM溶液反应20min。
制备得到的肽树脂经过DMF充分洗涤后，加入10倍量I2的DMF溶液中反应1h。充分洗涤。
制备得到的肽树脂中加入体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H2O的裂解试剂，加入量20mL/g，冰浴反应1h后，室温下继续搅拌反应5h，然后抽滤。抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的普利卡那肽粗肽，得到8.67g。
将制备得到的普利卡那肽粗肽采用制备型HPLC***，波长214nm，C18填料的反相色谱柱用于分离，流动相分别采用水和乙腈，以梯度洗脱法收集目标多肽的吸收峰。采用旋转蒸发法在30℃除去大部分乙腈，进行冻干处理，获得纯化的普利卡那肽精制品。
实施例2
称取取代度为0.2mmol/g的Fmoc-Leu-王树脂10g(2mmol)，加入固相反应器中。DMF洗涤3次后，溶胀3h。将体积比1:4的哌啶：DMF溶液加至反应器中反应，反应后用DCM洗涤2次，DMF进行洗涤4次。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH1.24g、HOBt0.406g、DIC 0.465mL溶于DMF溶液中，混合均匀后加入反应器中，室温反应2h。茚三酮显色反应控制终点，树脂显透明无色表示反应结束，如果显色则继续反应至无色。结束反应后，DCM洗涤2次，DMF进行洗涤4次。
重复上述步骤，按照序列顺序，依次脱保护、偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys-(Mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH。
向本实施例制备得到的肽树脂反应器中加入体积百分数30％巯基乙醇的DMF溶液，反应4h；然后加入5倍量DTNP的DCM溶液反应1h；洗涤后加入1％TFA的含TIS 5％的DCM溶液反应20min。
制备得到的肽树脂经过DMF充分洗涤后，加入20倍量I2的DMF溶液中反应1h。充分洗涤。
制备得到的肽树脂中加入体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT的裂解试剂，加入量10mL/g，冰浴反应0.5h后，室温下继续搅拌反应1h，然后抽滤。抽滤后将裂解试剂滤液利用N2气吹至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的普利卡那肽粗肽，得到1.52g。
将制备得到的普利卡那肽粗肽采用制备型HPLC***，波长214nm，C18填料的反相色谱柱用于分离，流动相分别采用水和乙腈，以梯度洗脱法收集目标多肽的吸收峰。采用旋转蒸发法在30℃除去大部分乙腈，进行冻干处理，获得纯化的普利卡那肽精制品。
实施例3
称取取代度为0.6mmol/g的Fmoc-Leu-王树脂10g(6mmol)，加入固相反应器中，DMF洗涤3次后，溶胀3h。将体积比1:4的哌啶：DMF溶液加至反应器中反应，反应后用DCM洗涤2次，DMF进行洗涤4次。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH 7.46g、HOBt2.44g、DIC 2.79mL溶于DMF溶液中，混合均匀后加入反应器中，室温反应2h。茚三酮显色反应控制终点，树脂显透明无色表示反应结束，如果显色则继续反应至无色。结束反应后，DCM洗涤2次，DMF进行洗涤4次。
重复上述步骤，按照序列顺序，依次脱保护、偶联Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Cys-(Mmt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(StBu)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Boc-Asn(Trt)-OH。
向制备得到的肽树脂反应器中加入体积百分数25％巯基乙醇的DMF溶液，反应3h；然后加入10倍量DTNP的DCM溶液反应1h；洗涤后加入1％TFA的含TIS5％DCM溶液反应20min。
制备得到的肽树脂经过DMF充分洗涤后，加入15倍量I2的DMF溶液中反应1h。充分洗涤。
制备得到的肽树脂中加入体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT的裂解试剂，加入量20mL/g，冰浴反应0.1h后，室温下继续搅拌反应10h，然后抽滤。抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的普利卡那肽粗肽，得到8.46g。
将制备得到的普利卡那肽粗肽采用制备型HPLC***，波长214nm，C18填料的反相色谱柱用于分离，流动相分别采用水和乙腈，以梯度洗脱法收集目标多肽的吸收峰。采用旋转蒸发法在30℃除去大部分乙腈，进行冻干处理，获得纯化的普利卡那肽精制品。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种普利卡那肽的制备方法，包括以下步骤:
1）按普利卡那肽的序列，在Fmoc-Leu-树脂载体上由碳端向氮端逐一偶联Cys、Gly、Thr、Cys、Ala、Val、Asn、Val、Cys、Leu、Glu、Cys、Glu、Asp、Asn，制备得到线性普利卡那肽的肽树脂，其中，Cys侧链保护基分别是StBu、Mmt和Acm，Thr、Glu、Asp、Asn侧链保护基分别是tBu、OtBu、OtBu和Trt；
2）肽树脂在巯基乙醇的DMF溶液中反应，洗涤，然后加入过量的2,2’-二硫双（5-硝基吡啶）的DCM溶液反应，洗涤后加入TFA的含TIS的DCM溶液反应，进行第一次环化；
3）经过一次环化的肽树脂在I2溶液中脱除7位、15位的Acm保护基，第二次环化；
4）肽树脂采用切割试剂将普利卡那肽从树脂上分离，得到粗肽，经过分离纯化获得普利卡那肽纯品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂载体的取代度为0.1 mmol/g-1.6 mmol/g。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂载体的取代度为0.2 mmol/g-0.6 mmol/g。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Fmoc-Leu-树脂为市售的羟甲苯基树脂与Fmoc-Leu-OH的反应产物。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述Cys侧链保护基分别是4位StBu、12位的Mmt和7位、15位的Acm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述线性普利卡那肽的肽树脂在树脂上直接成环，环化方法为：肽树脂在体积百分数10-50%巯基乙醇的DMF溶液中反应1-10h；巯基乙醇含量优选15-30%，反应时间优选2-4h；然后加入5-20倍量DTNP的DCM溶液1h；洗涤后加入体积百分数0.5-5%TFA的含体积百分数1-10%TIS的DCM溶液反应20min，优选1%TFA的含TIS 5%的DCM溶液，进行一次环化；树脂经过洗涤后，加入5-100倍当量I2的DMF溶液反应0.5-5h，优选10-20倍当量I2的DMF溶液，反应时间优选1-2h，进行二次环化。
7.根据权利要求1的制备方法，其特征在于，在步骤4）中，向含侧链保护基团的普利卡那肽树脂中加入体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H2O，或体积比为90/5/3/2的TFA/thioanisole/anisole/EDT，或体积比为82.5/5/5/5/2.5的TFA/thioanisole/H2O/phenol/EDT的裂解试剂，冰浴反应0.1-1h后，室温下继续搅拌反应1-10h，然后抽滤；抽滤后将裂解试剂滤液利用旋转蒸发和/或N2气吹至无TFA溢出，加入沉淀试剂静置；离心分离沉淀的普利卡那肽粗肽，其中所述沉淀试剂包括:***、环己烷、甲基叔丁基醚、石油醚、体积比为1:10-10:1的***/石油醚、体积比为1:10-10:1的***/环己烷。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述裂解试剂是体积比为95/2/2/1的TFA/TIS/EDT/H2O，所述沉淀试剂为***。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用HPLC方法分离得到普利卡那肽纯品。
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