CN107847571A - 用于改善多糖‑蛋白质缀合物及其获得的多价疫苗配制剂的吸附的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于制备稳定多价肺炎球菌多糖‑蛋白质缀合物疫苗配制剂的方法。本稳定配制剂显示了每种缀合物的最佳百分比吸收，其中，可以通过采用下列各项防止聚集：i)缀合物的个别或分开吸收，所述缀合物在其它情况下通过组合吸收显示较低的百分比吸收，ii)组氨酸‑琥珀酸缓冲液***以及中性pH至酸性pH的pH转变，iii)0.5至约1.4之间的多糖比蛋白质比率iv)配制容器中的六叶片Rushton型涡轮叶轮。

Description

用于改善多糖-蛋白质缀合物及其获得的多价疫苗配制剂的 吸附的方法
发明背景
肺炎链球菌是儿童的细菌性肺炎、脑膜炎和败血症的主要原因。由肺炎链球菌(Spneumoniae)引起的儿童死亡的最近估值范围为全球每年70-100万。在2000年，估计发生约145万例严重肺炎球菌疾病(不确定性范围111–180万)事件。肺炎球菌疾病在年龄为1–59个月的儿童中引起约82.6万例死亡(0.58–0.926M)，其中9.1万(6.3–10万)为HIV阳性儿童，并且73.5万(51–82万)为HIV阴性儿童。
已经许多多年的多价肺炎球菌多糖疫苗已经证明在成年人，特别是老年人和高风险者中预防肺炎球菌疾病是有价值的。然而，婴儿和幼童较差响应未缀合的肺炎球菌多糖。2000年2月在美国第一次许可了肺炎球菌缀合物疫苗其含有7种最经常分离的血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，所述血清型在当时在幼童和婴儿中引起侵入性肺炎球菌疾病。
此外，PrevnarTM 13(Wyeth)是一种得到批准的疫苗，其在1、3、4、5、7F、9V、14、18C和23F外含有来自血清型6A、6B、19A、19F的多糖缀合物。SynflorixTM(GSK)是另一种得到批准的疫苗，其提供了针对1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F、和23F的保护以及针对19A &6A的交叉保护。
疫苗配制剂一般必须是稳定且一致稠度的，以适应长货架期的需要和多剂量容器的使用。基于蛋白质(包括多糖-蛋白质缀合物)的疫苗经受蛋白质聚集和沉淀，这可以由于沉淀的蛋白质产物的不可用性而导致疫苗的较低的有效总浓度。特别地，多糖-蛋白质缀合物疫苗似乎具有比单独的载体蛋白更强大的聚集趋势(参见Berti et al,2004,Biophys J86:3-9)。多糖-蛋白质缀合物疫苗的配制剂的选择可以大大影响蛋白质聚集。参见Ho etal.,2001,Vaccine 19:716-725。
尽管全球范围开发了几种现有的多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗组合物，本领域中不断需要疫苗配制剂，其提供了个别缀合物的高吸收并且免于具有多糖-蛋白质缀合物的免疫原性组合物的聚集/沉淀。
此类多价肺炎球菌疫苗中传统使用的佐剂是铝盐，如氢氧化铝和磷酸铝。许多其它实验佐剂是已知的，然而对铝盐的吸附仍然是最常见的疫苗佐剂配制剂。虽然其用途广泛，但是铝盐不可能总是与特定的抗原相容，从而就明矾上多糖-蛋白质缀合物的百分比吸附或抗原性而言导致相当大的变化。
铝佐剂上吸附的缀合物疫苗候选物的免疫学特性和稳定性取决于各种参数，如i)每种抗原的抗原性，ii)用于缀合的载体蛋白类型，和iii)使用的佐剂类型。最重要地，先前已经报告了佐剂上抗原吸附的程度是表明配制过程的批次间一致性和其对疫苗产品的效力的可能影响的关键参数之一。此外，多糖-蛋白质缀合物的百分比吸附可以在贮存配制剂后或在不利的情况，如温度偏移下进一步下降。参见WHO Expert Committee onBiological Standardization,Recommendations for the production&control ofPneumococcal conjugate vaccines的第54次会议,2003年11月17-21日；Carl E.Frasch,Session IV:Conjugate Vaccines；Vaccine Technology II；Portugal.2008。
按照欧洲管理局(European regulatory agency，EMEA)肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物指南，应当认为吸收的完整性(％未结合的缀合物)与明矾含量、无菌度、同一性和游离多糖含量一起是重要的质量控制参数。参见Assessment Report for Synflorix 2009,Procedure No.EMEA/H/C/000973。WHO推荐最大化明矾沉淀的抗原(例如白喉和破伤风类毒素)的吸附，其中这些疫苗中的至少80％抗原是吸附的。
在制造多糖-蛋白质缀合物期间，配制剂可以包含多糖-多糖类型、蛋白质-蛋白质类型或多糖-蛋白质类型的聚集体。在成品中也观察到此类聚集，导致多糖-蛋白质缀合物疫苗的填充小瓶的4％-10％拒绝率，从而影响缀合物疫苗的稳定性和效力。
鉴于上文就多糖及其缀合物的聚集和稳定性而言讨论的局限性，对在下游加工到肺炎球菌缀合物疫苗制造的最终配制剂贮存间降低聚集和稳定化所述多糖仍然有独特的需要。
发明概述
本发明提供了包含铝盐的疫苗的稳定性的改善，以及特别地用于多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗中使聚集最小化并且改善个别缀合物的百分比吸附的方法。本发明的发明人已经观察到多糖-蛋白质缀合物的组合吸附和使用大于1:1的多糖比蛋白质比率导致i)血清型6A、9V和23F的肺炎链球菌缀合物的小于55％的百分比吸附和ii)剩余血清型缀合物的约80％-90％的百分比吸附，从而未能实现给定多价肺炎球菌缀合物配制剂的个别血清型缀合物的完全吸附。还观察到通过使用6.8-7.0的pH制备的疫苗配制剂导致约4-10％的聚集和较低的吸附。
本发明涉及制备稳定多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗配制剂的方法，所述配制剂显示每种缀合物的75％至99％之间的最佳吸附，其中在所述方法中，通过采用下列至少一项防止聚集：
a.个别或分开吸附缀合物，所述缀合物在其它情况下通过组合吸附显示相对较低的吸附；
b.组氨酸-琥珀酸缓冲液***以及从中性pH至酸性pH的pH转变；
c.0.6至约1.4之间的多糖比蛋白质比率；和/或
d.在配制容器中使用六叶片Rushton型涡轮叶轮。
本发明还公开了用于制备多糖-蛋白质缀合物的方法，所述缀合物具有含有磷酸二酯连接的肺炎链球菌多糖，特别是19A、19F、6A和6B的改善的免疫原性和较小的游离多糖含量。所述缀合方法使氰基化剂副产物介导的分筛多糖降解最小化，并防止随后的多糖-多糖聚集，从而稳定化不稳定的多糖。降低聚集的关键可归因于使用100-200Da范围内的分筛多糖和(1):(0.8-1)范围内的多糖比CDAP(氰基化剂)比率。
根据本发明制备的免疫原性组合物提供了多糖-多糖和多糖-蛋白质缀合物之间的降低的聚集以及改善的稳定性和免疫原性。
附图简述
图1：DMAP处理前分筛的19A PnPs(178KDa)的SEC-HP-RI概况
图2：DMAP处理24小时后分筛的19A PnPs(70KDa)(A)和72小时后14.5KDa(B)的SEC-HP-RI概况-降解概况
图3：分筛的19A PnPs(178KDa；A)的SEC-HP-RI概况和不使用10KDa渗滤步骤的CDAP介导的活化多糖(5B,5C&5D)、5E(没有10KDa DF的缀合物)、5F(具有10KDa DF的缀合物)、5G分筛的19A/5H-活化的19A(对于19A，经修饰的Ps:CDAP比率1:1)缀合方法的时间依赖性聚集
图4：分筛的19F PnPs(157KDa；A)的SEC-HP-RI概况和不使用10KDa渗滤步骤的CDAP介导的活化多糖(B)，6C/6D(对于19F，经修饰的Ps:CDAP比率1:1)缀合方法的时间依赖性聚集
图5：六叶片Rushton型涡轮平叶片叶轮
图6：吸附方案
发明详述
本发明的目的提供了包含铝盐的疫苗的稳定性的改善，以及特别地用于多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗中使聚集最小化并且改善个别缀合物的百分比吸附的方法。本发明的发明人已经观察到多糖-蛋白质缀合物的组合吸附和大于1:1的多糖比蛋白质比率的使用导致：i)血清型6A、9V和23F的肺炎链球菌缀合物的吸附百分比小于55％和ii)对于剩余的血清型缀合物，约80％至90％的吸附百分比，因此对于给定的多价肺炎球菌缀合物配制剂，未能实现个别血清型缀合物的完全吸附。还观察到通过使用6.8至7.0的pH制备的疫苗配制剂导致约4至10％的聚集和较低的吸附。
使用专利WO2013088448A1中所述的方法培养多糖，其中所述方法包括(a)提供表达CP的细菌菌株的接种物；(b)通过于pH7.2的发酵培养菌株，其中补料培养基添加的速率等于添加碱混合物以维持预设pH的速率；c)于35-38℃以0.1-0.5vvm的空气流速在以50-150RPM搅拌下发酵培养基。
通过专利WO2012127485中描述的方法纯化多糖。通过本方法制备的Pn-Ps显示约60至70％的回收率，其中与疏水相互作用层析(HIC)后或离子交换层析(IEC)前的C-Ps含量相比，C多糖污染减少为1至5倍，蛋白质污染小于1％，并且核酸污染小于1％。已经在研究、试验性和商业规模进行所述方法。
与基于CTAB/醇的方法相比，此方法可以以少80-90％的时间消耗和少90％的成本纯化多糖。
根据本发明的一个重要实施方案，可以通过如下对肺炎链球菌缀合物获得75％-95％的改善的百分比吸附：i)采用约0.8至1.4的多糖比蛋白质比率；ii)利用吸附较差的肺炎链球菌缀合物的个别或分开吸附，iii)在配制期间保持较低的pH。
根据第一个实施方案的一方面，优选的多糖比蛋白质比率是1:1。
根据第一个实施方案的第二方面，所述组合物包含至少2种多糖蛋白质缀合物，其具有选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9F、9N、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和45的多糖。
根据第一个实施方案的第三方面，可以对选自2、3、4、6A、8、9V、9F、9N、12F、15B、17F、18C、20、22F、23F、33F和45的任何肺炎链球菌血清型，优选对于肺炎链球菌血清型6A、9V和23F利用吸附的个别模式。
根据第一个实施方案的优选方面，多价肺炎球菌缀合物疫苗是10价的，其中肺炎链球菌血清型6A、9V和23F个别作为分开的混合物吸附，然后加入到另一种混合物，其包含已经以组合模式吸附的肺炎链球菌血清型1、5、6B、7F、14、19A和19F的混合物。
根据第一个实施方案的另一个优选方面，多价肺炎球菌缀合物疫苗是11、13、15、16或更多价的，其中选自2、3、4、6A、8、9V、9F、9N、12F、15B、17F、18C、20、22F、23F、33F和45的至少一种肺炎链球菌血清型个别吸附或者在较小的组中作为分开的混合物吸附，然后加入到另一种混合物，其包含已经以组合模式吸附的肺炎链球菌血清型1、5、6B、7F、14、19A和19F的混合物。
根据第一个实施方案的又一个优选方面，多价肺炎球菌缀合物疫苗是16价的，其中选自2、3、4、6A、9V、12F、15B、18C、和23F的至少一种肺炎链球菌血清型个别吸附或者在较小的组中作为分开的混合物吸附，然后加入到另一种混合物，其包含已经以组合模式吸附的肺炎链球菌血清型1、5、6B、7F、14、19A和19F的混合物。
本发明的第二个实施方案是可以如下完全防止多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物配制剂中的聚集：i)利用中性pH至酸性pH的pH转变和ii)使用组氨酸-琥珀酸缓冲液组合。
根据第二个实施方案的一方面，可以发生从6.8至选自但不限于5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8和5.9的pH的所述pH转变。更优选地，从6.8至选自5.4、5.5、5.6、5.7和5.8的pH。
根据第二个实施方案的另一方面，所述组氨酸-琥珀酸缓冲液***可以具有1mM至200M的浓度。浓度优选为至少1mM(例如至多200mM、150mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM等)。更优选地，组合物中组氨酸-琥珀酸缓冲液的浓度在10mM和40mM之间。
本发明的第三个实施方案是可以通过在配制容器中利用rushton涡轮平叶片叶轮替换磁力搅拌的轴向和径向型叶轮来防止肺炎球菌本体缀合物中的絮状物或聚集体形成。
使用本领域技术人员公知且常规的标准技术容易测定本发明的免疫原性组合物的稳定性。例如，通过方法对免疫原性组合物测定缀合物的百分比吸附、稳定性、聚集、免疫原性、颗粒形成、蛋白质(浓度)损失等，所述方法包括但不限于ELISA、光散射、光密度、沉降速度离心、沉降平衡离心、圆二色性(CD)、Lowry测定法、双金鸡宁酸(BCA)测定法。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了新的ELISA，其可以直接定量缀合的/结合的多糖而不影响多价肺炎球菌缀合物疫苗中缀合物的抗原性。其可用于定量配制剂基质中未吸附的缀合物含量作为百分比吸附的指示参数，其中缀合物显示超过70％的吸附。优选地，所述ELISA可以采用预测定步骤，其牵涉从明矾佐剂中解吸缀合物而不影响载体蛋白以及缀合多糖的抗原性。更具体地，使用氢氧化钠和柠檬酸来实现明矾吸附的缀合物样品的溶解。
载体蛋白可以选自但不限于CRM197、P4、白喉类毒素、破伤风类毒素、破伤风类毒素的片段C、百日咳类毒素、流感嗜血菌的蛋白D、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)和脱毒水肿因子(EF)和炭疽芽孢杆菌的致死因子(LF)、卵清蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)、人血清清蛋白、牛血清清蛋白(BSA)和结核菌素(PPD)的纯化的蛋白质衍生物，特别是CRM197或P4。
根据优选的实施方案，所述多价组合物可以包含：
i)至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有TT作为载体蛋白的多糖蛋白；或
ii)至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有DT作为载体蛋白的多糖蛋白；或
iii)至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)作为载体蛋白的多糖蛋白；或
iv)至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有TT作为载体蛋白的多糖蛋白，至少一种具有DT作为载体蛋白的多糖蛋白；或
v)至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有TT作为载体蛋白的多糖蛋白，至少一种具有肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)作为载体蛋白的多糖蛋白；或
vi)至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有DT作为载体蛋白的多糖蛋白，至少一种具有肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)作为载体蛋白的多糖蛋白。
在另一个实施方案中，与血清型3缀合的优选载体蛋白是CRM-197，血清型4是TT或DT，并且血清型18C是CRM197。
本发明的另一个实施方案包括在最终配制剂中使用PsaA作为载体蛋白。也可以最终配制剂中使用PsaA作为佐剂。
在某些实施方案中，本发明的多价配制剂可以包含表面活性剂，优选Polysorbate20。在某些实施方案中，配制剂中Polysorbate 20的终浓度是配制剂的0.01％至10％Polysorbate 20重量/体积。在其它实施方案中，配制剂中Polysorbate 20的终浓度是配制剂的0.01％Polysorbate 20重量/体积。在其它实施方案中，配制剂中Polysorbate 20的终浓度是配制剂的0.05％Polysorbate 20重量/体积。在其它实施方案中，配制剂中Polysorbate 20的终浓度是配制剂的0.1％Polysorbate 20重量/体积。在另一个实施方案中，配制剂中Polysorbate 20的终浓度是配制剂的1.0％Polysorbate 20重量/体积。在又一个实施方案中，配制剂中Polysorbate 20的终浓度是配制剂的10.0％Polysorbate 20重量/体积。
本多价疫苗配制剂可以包含防腐剂，其选自但不限于汞防腐剂(例如硫柳汞)、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯和苯甲醇(或其混合物)。
根据本发明的优选实施方案，所述多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗配制剂(优选10或16价)可以包含磷酸铝吸附的缀合物、组氨酸、琥珀酸、氯化钠、Polysorbate 20和硫柳汞。
本发明的疫苗组合物可以包含以每0.5ml剂量20-375μg、20-300μg、20-200μg、25-150μg Al+++的量添加铝盐佐剂的步骤。
通常，将免疫原性组合物制备成注射液，作为液体溶液或者悬浮液；也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。也可以在脂质体中乳化或包封制剂以增强佐剂效果。组合物的直接递送通常是胃肠外(例如注射，皮下、腹膜内、静脉内或肌内或递送至组织间隙)。也可以将组合物施用到损伤中。其它施用模式包括口服和肺施用、栓剂和经真皮或经皮应用针和皮下注射器。剂量治疗可以是单剂量日程表或多剂量日程表(例如包括加强剂量)。
优选地，本发明的疫苗可以在溶液中贮存或冻干，可以以用含有磷酸铝凝胶和NaCl的稀释剂得到的1、5或10剂量配制剂给予其中本发明的冻干疫苗组合物。
本发明的另一个实施方案包括在配制容器中使用Rushton涡轮平叶片叶轮(参见图5)。
实施例
实施例1：发酵
方法包括(a)提供表达CP的细菌菌株的接种物；(b)通过于pH 7.2的发酵培养菌株，其中补料培养基添加的速率等于添加碱混合物以维持预设pH的速率；c)于35-38℃以0-0.5vvm的空气流速在以50-150RPM搅拌下发酵培养基。
实施例2：荚膜多糖纯化
肺炎链球菌荚膜多糖血清型19F纯化(HIC及接着的IEC)
将5L来自肺炎链球菌血清型19F的发酵罐培养物的澄清培养液浓缩并使用100KDaMWCO膜渗滤至500ml。使用25mM的中性pH的磷酸钠缓冲液实现渗滤，随后用注射用水(WFI)渗滤。
将核酸酶加入到多糖溶液以达到8U/ml溶液的终浓度。在37℃在搅拌下进行酶处理达10±2小时。
将硫酸铵添加到经核酸酶处理的多糖溶液至50％饱和，并在2-8℃温育12±2小时(除血清型5和4以外)。将混合物进行离心。弃去团粒(沉淀物)。将溶液(约500ml)使用NaCl，然后用冷冻的WFI进行100kD渗滤。在HIC柱上加载含有多糖及缓冲液和高盐浓度的渗滤溶液。
用50％饱和硫酸铵缓冲液平衡疏水相互作用层析柱(300ml)，然后将多糖溶液(500ml)在6-8的pH范围中，优选于pH 6-7的pH加载到柱上。用含有50％饱和硫酸铵的缓冲液进一步清洗柱。在这些条件下，在来自柱的流过物和平衡清洗液中回收多糖。
然后，使用100KDa MWCO滤器浓缩多糖溶液，然后用NaCl和注射用水(WFI)渗滤。
用20mM磷酸钠缓冲液平衡离子交换层析柱(300ml)(强阴离子交换剂)，然后将多糖溶液(500ml)在6-8的pH范围中，优选pH 6.5-7.5的pH加载到柱上。用缓冲液进一步清洗该柱。使用1.0M NaCl用步式梯度洗脱来洗脱吸附的多糖(在NaCl的不同离子强度下洗脱各种多糖)。
然后，使用100KDa MWCO滤器浓缩多糖溶液，然后用注射用水(WFI)渗滤。
将经渗滤的多糖溶液通过0.22μ膜滤器过滤到聚丙烯瓶中。将纯化的多糖在-20±5℃冷冻贮存。
上述过程也用于血清型4、6A、6B、7F、9V、10A、14、18C、19A、19F和23F。
结果：
通过H1/P31NMR谱估计HIC后和离子交换层析后的C多糖。该过程导致污染物含量减少2-3倍。
实施例3：分筛多糖
使用均化器(Microfluidics)装置在活化步骤之前降低多糖的分子量。对于19A，在24-28KPSI完成大小降低，而对于19F，在26-30KPSI完成大小降低，其中通过数目为约1-3。对分筛多糖进行渗滤和浓缩，然后进行0.22μ过滤。然后，对分筛的多糖进行HPSEC-RI以估算平均分子量。
实施例4：通用缀合过程
使用Lees等人(Vaccine 26:190-198,1996)的CDAP缀合方法进行多糖与载体蛋白的缀合。在NaCl 2M中溶解机械大小降低的多糖(除6A以外，所述6A以天然形式使用或根据6A的大小而分筛)。根据多糖:CDAP比率，将来自100mg/ml储备溶液的CDAP(在乙腈中)添加到多糖溶液中。约1分钟后，添加2M NaOH以获得特定的活化pH。在22℃，在4-10分钟期间，在此pH进行多糖的活化。将CRM-197(数量取决于初始Ps/蛋白质比率)添加到活化的多糖中，并根据血清型在特定的pH进行偶联反应达3-8小时。然后，将反应用甘氨酸在220C淬灭1小时，并在120C过夜。然后，通过300kDa至500kDa透滤，接着100kDa透滤纯化缀合物。进一步确定纯化的0.22um过滤的缀合物的多糖和蛋白质含量。
表1：10种血清型的血清型特异性缀合反应参数变化：
表2：配制过程的单和两混合物方法中PCV-10配制剂的个别血清型的百分比吸附的比较。
在单混合物方法中，血清型6A、9V和23F在配制剂中是较差吸附的，而对于两种混合物，所有血清型的吸附百分比>70％。
表3：pH转变对PCV-10配制剂的聚集行为的影响
对于PCV10配制剂，当与pH 6.8相比时对pH 5.6-5.8没有发现聚集体。
发现多糖比蛋白质比率(1:1)对于配制剂中肺炎球菌缀合物的吸附程度具有有利的影响。
表4：Ps比CRM197比率对配制剂中肺炎球菌缀合物(血清型6A)的吸附的影响
在缀合物的吸附上观察到多糖比蛋白质比率的影响。具有>1.5的Ps比蛋白质比率的6A缀合物显示差的吸附。PCV-10配制剂中使用的大多数血清型含有0.6-1.3范围内的Ps:Pr比率，其导致包括血清型6A在内的各种血清型的最佳吸附。基于6A血清型和PCV-10配制剂经验实现的吸附数据，在配制16价时，可以推断在相似范围内剩余的6种缀合物的Ps:Pr比率可以确保所有16种血清型缀合物的一致吸附。
表5：不同容器的Rushton涡轮平叶片叶轮的规格
几何体积(L) 14
工作体积(L) 10.0
叶片直径(mm) 74.7
叶片高度(mm) 17.3
叶片数目 6
搅拌控制(rpm) 50-500
桨尖速度(m/s) 0.19-1.95
实施例6：ELISA方案
使用修改的三明治式ELISA测定抗原含量和吸附百分比。
常规三明治式ELISA已经就以下测试条件/测定条件而言进行了修改，并由此具有以下有利的属性：
i.在10价疫苗中存在9种其它缀合抗原的情况下定量缀合的多糖
ii.从磷酸铝凝胶中洗脱所有10种缀合物，其中吸附大于80％
iii.其中在不损害缀合物抗原性的情况下发生缀合物的捕获，即使在pH9时
根据下文给出的方案，使用ELISA测定抗原含量和百分比吸附：
第1天
1.用捕捉抗体(抗载体蛋白抗体)包被板，然后在35±5℃温育0.5-2小时
2.使用ELISA板清洗器将板清洗3-6次
3.用封闭缓冲液(对于血清型14和9V，1X PBS和tris缓冲液中的3％BSA)封闭板，接着在30±5℃温育1.5-2.5小时
4.使用ELISA板清洗器将板清洗3次
5.将样品添加到板
6.将板于5±3℃温育过夜
第2天
1.让板达到室温
2.将板清洗3次后添加一抗，然后在RT 25±2温育30分钟，然后清洗。
3.添加二抗，然后在25±2温育30分钟。
4.添加底物TMB，然后在RT在黑暗中温育15-20分钟
5.添加终止溶液
6.在450nm读取板。
在不损害载体蛋白表位的情况下样品溶解的程序
对2ml疫苗样品添加适量的0.5M-2M NaoH。将所述样品轻轻地涡旋振荡，直至溶液变澄清。溶液的pH从9-12调节至溶液变澄清。使用0.5M至2M的柠檬酸使溶液的pH回到6-7.4。将所述溶液在3000-6000xg离心(溶解的样品)5分钟，并收集上清液用于测试。
表6
实施例7：肺炎球菌缀合物疫苗-10价(PCV10)
表7-PCV10组合物：
*活性成分与载体蛋白CRM197缀合
实施例8：配制剂1(PCV16)
肺炎球菌缀合物疫苗-16价(PCV16)
表8-PCV16组合物“I”
*疫苗的活性成分与选自CRM197、TT和DT的至少一种载体蛋白缀合。
**仅在多剂呈现中添加
实施例9：配制剂1(PCV16)
表9-PCV16组合物“II”
*疫苗的活性成分与选自CRM197、TT和DT的至少一种载体蛋白缀合。
**仅在多剂呈现中添加
实施例10：
I)在DMAP存在的情况下分筛的PnP(19A、19F、6A和6B)的降解：
反应溶液中的分筛的PnPs以1:1.5的比率用DMAP处理，并通过SEC-HP-RI检查其降解概况。
结果：
观察到仅19A PnPs在DMAP存在的情况下经历降解，而含有PnPs(19F、6A和6B)的其它磷酸二酯保持完整。参考图1(没有DMAP)和2，其显示了DMAP介导的PnPs降解。
为了使19A的此类降解最小化，使用2M NaCl将活化的PnPs进行10KDa渗滤以在用CRM197缀合前除去从反应溶液形成的DMAP。
II)在CDAP存在的情况下分筛的PnPs(19A、19F、6A和6B)的降解和聚集：
反应溶液中的分筛的PnPs在活化过程中以1:1.5的比率用CDAP处理。观察到50％DMAP作为副产物(通过RP-HPLC测量)产生，其在活化的一定时间后导致PnPs的降解以及活化的PnPs之间的聚集(参见表2)。通过SEC-HP-RI概况检查降解和聚集。参考图3A(没有CDAP)、3B、3C和3D(对于19A)和4A(没有CDAP)4B(对于19F)，其显示了CDAP介导的PnPs聚集和降解。
表10：负责多糖-多糖交联和聚集的因素
“CDAP活化持续时间”对“多糖-多糖聚集体”形成的影响
III)通过采用渗滤步骤防止具有PnPs:CDAP为1:1.5的分筛的PnPs(19A和19F)的降解和聚集：
为了使19A的此类降解和聚集最小化，使用2M NaCl将活化的PnPs进行10KDa渗滤以在用CRM197缀合之前除去从反应溶液形成的DMAP。参见图3E(不含10KDa DF的缀合物)和3F(具有10KDa DF的缀合物)，其显示了使用10KDa渗滤的活化的PnPs和CRM197的缀合物的SEC-HP-RI概况。然而，渗滤步骤不利地影响缀合物产率，导致总产率降低30％-40％。
IV)通过在不采用渗滤步骤的情况下将PnPs:CDAP比率降低到1:1(19A)和1:0.8(19F)来防止分筛的PnPs(19A和19F)的降解和聚集
对于19A和19F分别以1:1和1:0.8比率用CDAP处理反应溶液中的PnPs，并通过SEC-HP-RI检查其降解和聚集概况。
结果：
观察到发现修改的Ps:CDAP比率(对于19A为1:1，并且对于19F为1:0.8)防止19A和19F PnPs两者的降解和聚集。参见图3(对于19A为G和H)和4(对于19F为C和D)。使用修改的比率的另一个优点是它没有10KDa渗滤步骤，从而确保总产率的最小损失。
观察到在血清型19A的情况下，当“CDAP活化持续时间”超过10分钟时，它导致活化多糖与活化多糖的交联，最终导致“多糖-多糖聚集体”的形成。
此外，在血清型19F的情况下，当“CDAP活化持续时间”超过20分钟时，它导致活化的多糖与活化的多糖的交联，最终导致“多糖-多糖聚集体”的形成。此外，发现缀合反应的持续时间比活化的多糖与活化的多糖交联，从而导致聚集体的形成所需要的时间更长。参见图3和4。
然而，对于其它血清型如6APnPs和6BPnPs，没有观察到此类交联。
实施例11：
制备缀合物：PnPs19A和PnPs19F
使用具有以下修改的Lees等人(Vaccine 26:190-198,1996)的CDAP缀合方法进行多糖与载体蛋白的缀合：
i)为了制备19A缀合物，在22℃使用1:1的多糖比CDAP比率以活化期4分钟并且使用多糖比蛋白质比率1:1进行
ii)为了制备19F缀合物，在22℃使用1:0.8的多糖比CDAP比率以活化期9至10分钟和对于19:F为多糖比蛋白质比率1:1进行。
表10：用“传统CDAP缀合方法”(批次1)和“改善的缀合方法”(批次2)的19A和19F缀合物结果的比较
结果：
观察到发现修改的多糖:CDAP比率、CDAP活化时间和初始多糖:蛋白质比率在活化过程中使4-二甲基氨基-吡啶介导的对分筛多糖的降解最小化，并且还防止随后的多糖-多糖聚集，从而就游离多糖含量而言改善最终缀合物特征。
用于制备19A和19F缀合物的改善的缀合方法产生缀合物，所述缀合物在各自缀合物概况(31P质子NMR)中不显示任何磷酸单酯信号，这指示发现经修改的缀合方法有效防止缀合反应间的多糖水解。
鉴于可以应用所公开的发明的原理的许多可能的实施方案，应该认识到，示例的实施方案仅仅是本发明的优选实例，而不应视为限制本发明的范围。相反，本发明的范围由所附权利要求书限定。因此，我们主张落入这些权利要求的范围和精神范围内的所有方案为我们的发明。

Claims (19)

1.用于制备稳定的多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗配制剂的方法，所述疫苗配制剂显示每种缀合物的最佳吸收，其中在所述方法中，通过采用下列至少一项防止聚集：
i.缀合物的个别或分开吸收，所述缀合物在其它情况下通过组合吸收显示相对较低的吸收，
ii.组氨酸-琥珀酸缓冲液***以及中性pH至酸性pH的pH转变，
iii.0.5至约1.4之间的多糖比蛋白质比率，和/或
iv.在配制容器中使用Rushton型涡轮叶轮。
2.如权利要求1中要求保护的方法，其中所述吸收在75-99％的范围中。
3.根据权利要求1制备的多价肺炎球菌缀合物疫苗组合物，其中所述组合物包含至少2种多糖蛋白质缀合物，其具有选自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9F、9N、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和45的多糖。
4.根据权利要求3制备的多价肺炎球菌缀合物疫苗组合物，其中所述组合物包含至少10多糖蛋白质缀合物，其具有来自血清型1、5、6A、6B、7F、9V、14、19A、19F和23F的多糖。
5.根据权利要求3制备的多价肺炎球菌缀合物疫苗组合物，其中所述组合物包含至少16多糖蛋白质缀合物，其具有来自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9V、12F、14、15B、18C、19A、19F和23F的多糖。
6.如权利要求1中要求保护的组合物，其中载体蛋白是选自下组的一种或多种：CRM197、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、破伤风类毒素的片段C、百日咳类毒素、流感嗜血菌的蛋白D、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和来自铜绿假单胞菌的外毒素A、外膜复合物c(OMPC)、孔蛋白、转铁蛋白结合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢杆菌的保护性抗原(PA)和炭疽芽孢杆菌的脱毒水肿因子(EF)和致死因子(LF)、卵清蛋白、钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH),人血清清蛋白,牛血清清蛋白(BSA)和结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)，特别是CRM197、破伤风类毒素、白喉类毒素或PsaA。
7.如权利要求1中要求保护的组合物，其中所述多价组合物包含：
i.至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有TT作为载体蛋白的多糖蛋白；或
ii.至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有DT作为载体蛋白的多糖蛋白；或
iii.至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物，至少一种具有肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)作为载体蛋白的多糖蛋白；或
iv.至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物、至少一种具有TT作为载体蛋白的多糖蛋白、至少一种具有DT作为载体蛋白的多糖蛋白；或
v.至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物、至少一种具有TT作为载体蛋白的多糖蛋白、至少一种具有肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)作为载体蛋白的多糖蛋白；或
vi.至少一种具有CRM197作为载体蛋白的多糖蛋白质缀合物、至少一种具有DT作为载体蛋白的多糖蛋白、至少一种具有肺炎球菌表面粘附素A(PsaA)作为载体蛋白的多糖蛋白。
8.如权利要求3中要求保护的组合物，其中血清型3优选与CRM-197缀合，血清型18C优选与CRM197缀合，并且血清型4可以与TT或DT缀合。
9.如权利要求1中要求保护的方法，其中所述组氨酸-琥珀酸缓冲液具有1mM和200mM之间，优选10mM和40mM之间，更优选20mM的浓度。
10.如权利要求1中要求保护的方法，其中发生所述组氨酸-琥珀酸缓冲液的pH转变，优选从6.8到5.6-5.8的pH。
11.如权利要求1中要求保护的方法，其中所述方法包括以下步骤：
i.以预先确定的比率，优选0.8至1.4，且更优选1:1，并且于预先确定的pH，优选5.2-5.9将多糖分子添加到蛋白质载体，以获得多个独特的多糖-蛋白质缀合物；
ii.在具有预先确定的浓度的组氨酸-琥珀酸缓冲液中的第一铝盐佐剂上个别吸附第一预先确定组的多糖-蛋白质缀合物，其选自步骤(i)中获得的所述多个多糖-蛋白质缀合物，其中所述铝盐佐剂的量范围为每0.5ml剂量最终疫苗配制剂的20-375μg Al+++；其中所述组的多糖-蛋白质缀合物包含6A、9V和23F；
iii.在具有预先确定的浓度的组氨酸-琥珀酸缓冲液中的第二铝盐佐剂上以组合模式吸附第二预先确定组的多糖-蛋白质缀合物，其选自步骤(i)中获得的所述多个多糖-蛋白质缀合物，其中所述铝盐佐剂的量范围为每0.5ml剂量最终疫苗配制剂的20-375μg Al+++；其中所述组的多糖-蛋白质缀合物包含1、5、6B、7F、14、19A和19F；
iv.借助于Rushton涡轮平面叶片叶轮混合步骤(ii)中获得的所述第一吸附组与步骤(iii)中获得的所述第二吸附组，并且任选地添加表面活性剂，优选Polysorbate-20和/或至少一种防腐剂，以获得稳定多价肺炎球菌多糖-蛋白质缀合物疫苗配制剂，所述防腐剂选自下组：汞防腐剂如硫柳汞、2-苯氧基-乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲醇及其混合物。
12.用于降低分筛和缀合反应间的多糖-多糖聚集从而提供每种缀合物的改善的免疫原性和稳定性的方法，特别对于肺炎链球菌多糖，所述肺炎链球菌多糖含有使用氰基化化学与载体蛋白共价连接的重复单元间的磷酸二酯连接，其中所述方法包括：
i)于约22℃至约25℃以1:0.8-1:1的比率将具有130KDa-190KDa的平均大小的多糖与氰基化剂反应约4分钟至约10分钟的时段，产生氰酸盐活化的多糖；并且
ii)于约9至约9.5的pH以1:1的比率使氰酸盐活化的多糖与蛋白质接触3小时-5小时的时段，接着用甘氨酸淬灭；
其中所述缀合过程使氰基化剂副产物介导的对分筛多糖的降解最小化，并且防止后续的多糖-多糖聚集，产生具有最小游离多糖含量的缀合物。
13.权利要求12的方法，其中所述多糖包含源自肺炎链球菌血清型19A、19F、6A或6B之一的重复单元之间的磷酸二酯连接。
14.如权利要求13中要求保护的方法，其中所述多糖是肺炎链球菌血清型19A多糖并且氰基化剂是1-氰基-4-二甲基-氨基-吡啶-四氟硼酸盐，以1:1的比率于22℃混合4分钟的时段，产生氰酸盐活化的多糖。
15.如权利要求13中要求保护的方法，其中多糖是肺炎链球菌血清型19F多糖，并且氰基化剂是1-氰基-4-二甲基-氨基-吡啶-四氟硼酸盐，于22℃以1:0.8的比率混合8-10分钟的时段，产生氰酸盐活化的多糖。
16.如权利要求14或15中要求保护的方法，其中所述缀合物具有小于1.6％的游离多糖含量。
17.权利要求2的方法，其中通过三明治式ELISA测量百分比吸附，所述三明治式ELISA特别包括使用氢氧化钠和柠檬酸盐溶解明矾吸附的缀合物样品的步骤。
18.如前述权利要求中任一项中要求保护的组合物，其中PsaA用作佐剂。
19.如前述权利要求中任一项中要求保护的组合物，其还包括贮存以冻干状态获得的所述缀合物疫苗配制剂，直至以用含有磷酸铝凝胶和NaCl的稀释剂得到的1、5或10剂量配制剂施用的步骤。
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