用於改善多糖—蛋白質共軛物及其獲得的多價疫苗配製劑的吸附的方法
本發明屬於疫苗配製劑的技術領域。特定地，本發明關於用於改善多糖-蛋白質共軛物及其獲得的多價疫苗配製劑的吸附的方法。
肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae
)是兒童的細菌性肺炎、腦膜炎和敗血症的主要原因。由肺炎鏈球菌引起的兒童死亡的最近估計值範圍為全球每年70至100萬。在2000年，估計發生約1千4百50萬例嚴重肺炎球菌疾病(不確定性範圍為1千1百10萬至1千8百萬)事件。肺炎球菌疾病在年齡為1至59個月的兒童引起約82.6萬例死亡(58萬至92.6萬)，其中9.1萬(6.3萬至10萬)為HIV陽性兒童且73.5萬(51萬至82萬)為HIV陰性兒童。 已經許可多年的多種多價肺炎球菌多糖疫苗已經證明在成年人，特別是老年人和高風險者，預防肺炎球菌疾病是有價值的。然而，嬰兒和幼童較差地回應未共軛的肺炎球菌多糖。2000年2月在美國第一次許可的肺炎球菌共軛物疫苗Prevnar®含有7種最經常分離的血清型(4、6B、9V、14、18C、19F和23F)，所述血清型在當時在幼童和嬰兒引起侵入性肺炎球菌疾病。 此外，PrevnarTM
13(Wyeth)是一種得到批准的疫苗，其在1、3、4、5、7F、9V、14、18C和23F外含有血清型6A、6B、19A和19F的多糖共軛物。SynflorixTM
(GSK)是另一種得到批准的疫苗，其提供針對1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的保護及針對19A和6A的交叉保護。 疫苗配製劑一般必須是穩定且一致稠度的以適應長貨架期的需要和多劑量容器的使用。基於蛋白質(包括多糖-蛋白質共軛物)的疫苗經受蛋白質聚集和沉澱，該蛋白質聚集和沉澱可以由於沉澱的蛋白質產物的不可使用性而導致疫苗的較低的有效總濃度。特別地，多糖-蛋白質共軛物疫苗似乎具有比單獨的載體蛋白顯現更強的聚集趨勢(參見Berti et al, 2004, Biophys J 86:3-9)。多糖-蛋白質共軛物疫苗的配製劑的選擇可以大大地影響蛋白質聚集。參見Ho et al., 2001, Vaccine 19:716-725。 儘管全球開發了幾種現有的多價肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物疫苗組合物，本領域不斷需要能提供個別共軛物的高吸收且免於具有多糖-蛋白質共軛物的免疫原性組合物的聚集/沉澱之疫苗配製劑。 此類多價肺炎球菌疫苗中傳統使用的佐劑是鋁鹽，諸如氫氧化鋁和磷酸鋁。許多其他實驗佐劑是已知的；然而，對鋁鹽的吸附仍然是最常見的疫苗佐劑配製劑。雖然鋁鹽的用途廣泛，但是鋁鹽不可能總是與特定的抗原相容，從而對明礬上多糖-蛋白質共軛物的百分比吸附或抗原性上導致相當大的變化。 鋁佐劑上吸附的共軛物疫苗候選物的免疫學特性和穩定性取決於多種不同的參數，比如i)每種抗原的抗原性，ii)用於共軛的載體蛋白類型，和iii)使用的佐劑類型。最重要地，先前已經報告佐劑上抗原吸附的程度是表明配製過程的批次間一致性和其對疫苗產品的效力的可能影響的關鍵參數之一。此外，多糖-蛋白質共軛物的百分比吸附可以在貯存配製劑後或在不利的情況，諸如溫度偏移下，進一步下降。參見WHO Expert Committee on Biological Standardization, Recommendations for the production & control of Pneumococcal conjugate vaccines的第54次會議, 2003年11月17至21日；Carl E. Frasch, Session IV: Conjugate Vaccines；Vaccine Technology II；Portugal. 2008。 按照歐洲管理局(European regulatory agency，EMEA)的肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物指南，應當認為吸收的完整性(%未結合的共軛物)與明礬含量、無菌度、同一性和游離多糖含量一起是重要的品質控制參數。參見Assessment Report for Synflorix 2009, Procedure No. EMEA/H/C/000973。WHO推薦最大化明礬沉澱的抗原(例如白喉和破傷風類毒素)的吸附，其中這些疫苗中至少80%抗原是吸附的。 在製造多糖-蛋白質共軛物期間，配製劑可包含多糖-多糖類型、蛋白質-蛋白質類型或多糖-蛋白質類型的聚集體。在成品中也觀察到此類聚集，導致多糖-蛋白質共軛物疫苗的填充小瓶的4%至10%拒絕率，從而影響共軛物疫苗的穩定性和效力。 鑒於上文就多糖及其共軛物的聚集和穩定性討論的局限性，對在下游加工到肺炎球菌共軛物疫苗製造的最終配製劑貯存間降低聚集和穩定化所述多糖仍然有獨特的需要。
發明概述
本發明提供包含鋁鹽的疫苗的穩定性的改善，及特別地用於多價肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物疫苗中使個別共軛物聚集最小化且改善個別共軛物的百分比吸附的方法。本發明的發明人已經觀察到多糖-蛋白質共軛物的組合吸附和使用大於1:1的多糖比蛋白質比率導致i)血清型6A、9V和23F的肺炎鏈球菌共軛物的小於55%的百分比吸附和ii)其餘血清型共軛物的約80%至90%的百分比吸附，從而未能實現給定的多價肺炎球菌共軛物配製劑的個別血清型共軛物的完全吸附。還觀察到通過使用6.8-7.0的pH製備的疫苗配製劑導致約4至10%的聚集和較低的吸附。 本發明涉及製備穩定多價肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物疫苗配製劑的方法，所述配製劑顯示每種共軛物的75%至99%之間的最佳吸附，其中在所述方法中，通過採用下列至少一項防止聚集： a. 個別或分開吸附共軛物，所述共軛物在其他情況下通過組合吸附顯示相對較低的吸附； b. 組胺酸-琥珀酸緩衝液系統及從中性pH至酸性pH的pH轉變； c. 0.6至約1.4之間的多糖比蛋白質比率；和/或 d. 在配製容器中使用六葉片Rushton型渦輪葉輪。 本發明還揭露用於製備多糖-蛋白質共軛物的方法，所述共軛物具有改善的免疫原性和含有磷酸二酯連接的肺炎鏈球菌多糖(特別是19A、19F、6A和6B多糖)的較小的游離多糖含量。所述共軛方法使氰基化劑副產物介導的分篩多糖降解最小化並防止隨後的多糖-多糖聚集，從而使不穩定的多糖穩定。降低聚集的關鍵可歸因於使用100至200Da範圍的分篩多糖和(1):(0.8-1)範圍的多糖比CDAP(氰基化劑)比率。 根據本發明製備的免疫原性組合物提供多糖-多糖和多糖-蛋白質共軛物之間的降低的聚集及改善的穩定性和免疫原性。
本發明的目的提供包含鋁鹽的疫苗的穩定性的改善，及特別地用於多價肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物疫苗中使個別共軛物聚集最小化且改善個別共軛物的百分比吸附的方法。本發明的發明人已經觀察到多糖-蛋白質共軛物的組合吸附和使用大於1:1的多糖比蛋白質比率導致：i)血清型6A、9V和23F的肺炎鏈球菌共軛物的吸附百分比小於55%和ii)對於其餘的血清型共軛物，約80%至90%的吸附百分比，因此對於給定的多價肺炎球菌共軛物配製劑，未能實現個別血清型共軛物的完全吸附。還觀察到通過使用6.8至7.0的pH製備的疫苗配製劑導致約4至10%的聚集和較低的吸附。 使用專利案WO 2013088448A1所述的方法培養多糖，其中所述方法包括(a)提供表現CP的細菌菌株的接種物；(b)於pH 7.2下醱酵培養該菌株，其中進料培養基添加的速率等於添加鹼混合物以維持預設pH的速率；c)於35-38℃下以0.1-0.5 vvm的空氣流速且在50-150 RPM攪拌下醱酵培養基。 通過專利案WO 2012127485描述的方法純化多糖。通過該方法製備的Pn-Ps顯示約60至70%的回收率，其中與疏水相互作用層析(HIC)後或離子交換層析(IEC)前的C-Ps含量相比，C多糖污染減少1至5倍，蛋白質污染小於1%且核酸污染小於1%。已經在研究、先導性和商業規模進行所述方法。 與基於CTAB/醇的方法相比，該方法可以少80-90%的時間消耗和少90%的成本純化多糖。 根據本發明的一個重要實施方案，可以通過如下對肺炎鏈球菌共軛物獲得75%至95%的改善的百分比吸附：i)採用約0.8至1.4的多糖比蛋白質比率；ii)利用個別或分開吸附以吸附較差吸附的肺炎鏈球菌共軛物，iii)在配製期間保持較低pH。 根據第一個實施方案的第一方面，優選的多糖比蛋白質比率是1:1。 根據第一個實施方案的第二方面，所述組合物包含至少2種多糖蛋白質共軛物，其具有選自血清型1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9V、9F、9N、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F、33F和45的多糖。 根據第一個實施方案的第三方面，可以對選自2、3、4、6A、8、9V、9F、9N、12F、15B、17F、18C、20、22F、23F、33F和45的任何肺炎鏈球菌血清型，優選地肺炎鏈球菌血清型6A、9V和23F，利用個別吸附模式。 根據第一個實施方案的優選方面，該多價肺炎球菌共軛物疫苗是10價的，其中肺炎鏈球菌血清型6A、9V和23F個別以分開的混合物吸附，然後加入到另一混合物，該另一混合物包含已經以組合模式吸附的肺炎鏈球菌血清型1、5、6B、7F、14、19A和19F的混合物。 根據第一個實施方案的另一優選方面，該多價肺炎球菌共軛物疫苗是11、13、15、16或更多價的，其中選自2、3、4、6A、8、9V、9F、9N、12F、15B、17F、18C、20、22F、23F、33F和45的至少一種肺炎鏈球菌血清型經個別吸附或者在較小的組中以分開的混合物吸附，然後加入到另一混合物，該另一混合物包含已經以組合模式吸附的肺炎鏈球菌血清型1、5、6B、7F、14、19A 和19F的混合物。 根據第一個實施方案的又一優選方面，該多價肺炎球菌共軛物疫苗是16價的，其中選自2、3、4、6A、9V、12F、15B、18C和23F的至少一種肺炎鏈球菌血清型經個別吸附或者在較小的組中以分開的混合物吸附，然後加入到另一混合物，該另一混合物包含已經以組合模式吸附的肺炎鏈球菌血清型1、5、6B、7F、14、19A和19F的混合物。 本發明的第二個實施方案是可藉由下述完全防止多價肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物配製劑中的聚集：i)利用中性pH至酸性pH的pH轉變和ii)使用組胺酸-琥珀酸緩衝液組合。 根據第二個實施方案的一方面，可以發生從6.8至選自但不限於5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8和5.9的pH的pH轉變。更優選地，從6.8至選自5.4、5.5、5.6、5.7和5.8的pH轉變。 根據第二個實施方案的另一方面，所述組胺酸-琥珀酸緩衝液系統可以具有1 mM至200 M的濃度。濃度優選為至少1mM(例如至多200mM、150mM、100mM、90mM、80mM、70mM、60mM、50mM、40mM、30mM、20mM、10mM等)。更優選地，組合物中組胺酸-琥珀酸緩衝液的濃度在10mM至40mM之間。 本發明的第三個實施方案是可以通過在配製容器中利用Rushton渦輪平葉片葉輪替換磁力攪拌的軸向和徑向型葉輪來防止肺炎球菌本體共軛物中的絮狀物或聚集體形成。 使用本領域技術人員公知且常規的標準技術可容易地測定本發明的免疫原性組合物的穩定性。例如，通過方法對免疫原性組合物測定共軛物的百分比吸附、穩定性、聚集、免疫原性、顆粒形成、蛋白質(濃度)損失等，所述方法包括但不限於ELISA、光散射、光密度、沉降速度離心、沉降平衡離心、圓二色性(CD)、Lowry測定法、雙金雞寧酸(BCA)測定法。 在一個優選的實施方案中，本發明提供新的ELISA，其可以直接定量共軛的/結合的多糖而不影響多價肺炎球菌共軛物疫苗中共軛物的抗原性。其可用於定量配製劑基質中未吸附的共軛物含量作為百分比吸附的指示參數，其中共軛物顯示超過70%的吸附。優選地，所述ELISA可以採用預測定步驟，其牽涉從明礬佐劑中解吸共軛物而不影響載體蛋白及共軛多糖的抗原性。更具體地，使用氫氧化鈉和檸檬酸來實現明礬吸附的共軛物樣品的溶解。 載體蛋白可以選自但不限於CRM197、P4、白喉類毒素、破傷風類毒素、破傷風類毒素的片段C、百日咳類毒素、流感嗜血菌的蛋白D、大腸桿菌LT、大腸桿菌ST、來自銅綠假單胞菌的外毒素A、外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白、轉鐵蛋白結合蛋白、肺炎球菌溶血素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)、肺炎球菌PhtD、肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11、炭疽芽孢桿菌的保護性抗原(PA)、脫毒水腫因子(EF)和致死因子(LF)、卵清蛋白、鑰孔血藍蛋白(KLH)、人血清清蛋白、牛血清清蛋白(BSA)、和結核菌素(PPD)的純化的蛋白質衍生物，特別是CRM197或P4。 根據優選的實施方案，所述多價組合物可以包含： i) 至少一種具有CRM197作為載體蛋白的多糖蛋白質共軛物，至少一種具有TT作為載體蛋白的多糖蛋白；或 ii) 至少一種具有CRM197作為載體蛋白的多糖蛋白質共軛物，至少一種具有DT作為載體蛋白的多糖蛋白；或 iii) 至少一種具有CRM197作為載體蛋白的多糖蛋白質共軛物，至少一種具有肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)作為載體蛋白的多糖蛋白；或 iv) 至少一種具有CRM197作為載體蛋白的多糖蛋白質共軛物，至少一種具有TT作為載體蛋白的多糖蛋白，至少一種具有DT作為載體蛋白的多糖蛋白；或 v) 至少一種具有CRM197作為載體蛋白的多糖蛋白質共軛物，至少一種具有TT作為載體蛋白的多糖蛋白，至少一種具有肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)作為載體蛋白的多糖蛋白；或 vi) 至少一種具有CRM197作為載體蛋白的多糖蛋白質共軛物，至少一種具有DT作為載體蛋白的多糖蛋白，至少一種具有肺炎球菌表面黏附素A(PsaA)作為載體蛋白的多糖蛋白。 在另一個實施方案中，與血清型3共軛的優選載體蛋白是CRM-197，與血清型4的是TT或DT，且與血清型18C的是CRM197。 本發明的另一個實施方案包括在最終配製劑中使用PsaA作為載體蛋白。也可以在最終配製劑中使用PsaA作為佐劑。 在某些實施方案中，本發明的多價配製劑可以包含表面活性劑，優選為聚山梨醇酯(Polysorbate) 20。在某些實施方案中，配製劑中Polysorbate 20的終濃度是配製劑的0.01%至10% Polysorbate 20重量/體積。在其他實施方案中，配製劑中Polysorbate 20的終濃度是配製劑的0.01% Polysorbate 20重量/體積。在其他實施方案中，配製劑中Polysorbate 20的終濃度是配製劑的0.05% Polysorbate 20重量/體積。在其他實施方案中，配製劑中Polysorbate 20的終濃度是配製劑的0.1% Polysorbate 20重量/體積。在另一實施方案中，配製劑中Polysorbate 20的終濃度是配製劑的1.0% Polysorbate 20重量/體積。在又一實施方案中，配製劑中Polysorbate 20的終濃度是配製劑的10.0% Polysorbate 20重量/體積。 該多價疫苗配製劑可以包含防腐劑，其選自但不限於汞防腐劑(例如硫柳汞)、2-苯氧基乙醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯和苯甲醇(或彼等的混合物)。 根據本發明的優選實施方案，所述多價肺炎球菌多糖-蛋白質共軛物疫苗配製劑(優選為10或16價者)可以包含磷酸鋁吸附的共軛物、組胺酸、琥珀酸、氯化鈉、Polysorbate 20和硫柳汞。 本發明的疫苗組合物可以包含以每0.5 ml劑量20-375 μg、20-300 μg、20-200 μg、25-150 μg Al+++的量添加鋁鹽佐劑的步驟。 通常，將免疫原性組合物製備成注射液，其為液體溶液或者懸浮液；也可以製備適合於注射之前可溶解或懸浮於液體媒介物的固體形式。也可以在脂質體中乳化或包封製劑以增強佐劑效果。組合物的直接遞送通常是經胃腸外(例如注射，皮下、腹膜內、靜脈內或肌內或遞送至組織間隙)。也可以將組合物施用到損傷中。其他施用模式包括口服和經肺施用、栓劑和經真皮或經皮應用針和皮下注射器。劑量治療可以是單劑量日程表或多劑量日程表(例如包括加強劑量)。 優選地，本發明的疫苗可以在溶液中貯存或經凍乾，其中可以用含有磷酸鋁凝膠和NaCl的稀釋劑得到的1、5或10劑量配製劑給予本發明的凍乾的疫苗組合物。 本發明的另一個實施方案包括在配製容器中使用Rushton渦輪平葉片葉輪(參見圖5)。實施例 1 ： 醱 酵
方法包括(a)提供表現CP的細菌菌株的接種物；(b)於pH 7.2下醱酵培養該菌株，其中進料培養基添加的速率等於添加鹼混合物以維持預設pH的速率；c)於35-38℃下以0-0.5 vvm的空氣流速且在50-150 RPM攪拌下醱酵培養基。實施例 2 ：莢膜多糖純化 肺炎鏈球菌莢膜多糖血清型 19F 純化 (HIC 及接著的 IEC)
將5L來自肺炎鏈球菌血清型19F的醱酵罐培養物的澄清培養液濃縮並使用100 KDa MWCO膜滲濾至500 ml。使用25 mM的中性pH的磷酸鈉緩衝液實現滲濾，隨後用注射用水(WFI)滲濾。 將核酸酶加入到該多糖溶液以達到8 U/ml溶液的終濃度。在37℃和攪拌下進行酶處理達10±2小時。 將硫酸銨添加到經核酸酶處理的多糖溶液至50%飽和，並在2-8℃下溫育12±2小時(除血清型5和4以外)。將混合物進行離心。棄去糰粒(沉澱物)。將溶液(約500 ml)使用NaCl，然後使用冷凍的WFI進行100 kD滲濾。在HIC柱上載入含有多糖及緩衝液和高鹽濃度的滲濾溶液。 使用50%飽和硫酸銨緩衝液平衡疏水相互作用層析柱(300 ml)，然後將多糖溶液(500 ml)在6至8的pH範圍中，優選於pH 6至7的pH，載入到柱上。使用含有50%飽和硫酸銨的緩衝液進一步清洗該柱。在這些條件下，在來自該柱的流過物和平衡清洗液中回收該多糖。 然後，使用100 KDa MWCO濾器濃縮多糖溶液，然後用NaCl和注射用水(WFI)滲濾。 用20 mM磷酸鈉緩衝液平衡離子交換層析柱(300 ml)(強陰離子交換劑)，然後將該多糖溶液(500 ml)在6至8的pH範圍中，優選pH 6.5至7.5的pH，載入到該柱上。使用緩衝液進一步清洗該柱。使用1.0M NaCl經階式梯度洗脫來洗脫吸附的多糖(在NaCl的不同離子強度下洗脫各種多糖)。 然後，使用100 KDa MWCO濾器濃縮多糖溶液，然後用注射用水(WFI)滲濾。 將經滲濾的多糖溶液通過0.22 μ膜濾器過濾到聚丙烯瓶中。將純化的多糖在-20±5℃冷凍貯存。 上述過程也適用於血清型4、6A、6B、7F、9V、10A、14、18C、19A、19F和23F。 結果： 通過H1/P31 NMR譜估計HIC後和離子交換層析後的C多糖。該過程導致污染物含量減少2至3倍。實施例 3 ：分篩多糖
使用均化器(Microfluidics)裝置在活化步驟之前降低多糖的分子量。對於19A，在24-28KPSI完成大小降低，而對於19F，在26-30KPSI完成大小降低，其中通過數目為約1至3。對分篩多糖進行滲濾和濃縮，然後進行0.22μ過濾。然後，對分篩的多糖進行HPSEC-RI以估算平均分子量。實施例 4 ：通用 共軛 過程
使用Lees等人(Vaccine 26: 190-198, 1996)的CDAP共軛方法進行多糖與載體蛋白的共軛。在2M NaCl中溶解經機械化大小降低的多糖(除6A以外，所述6A以天然形式使用或根據6A的大小而分篩)。根據多糖:CDAP比率，將來自100 mg/ml儲備溶液的CDAP(在乙腈中)添加到多糖溶液中。約1分鐘後，添加2M NaOH以獲得特定的活化pH。在22℃下，在4至10分鐘期間，在此pH下進行多糖的活化。將CRM197(數量取決於初始Ps/蛋白質比率)添加到活化的多糖中，並根據血清型在特定的pH下進行偶聯反應達3至8小時。然後，將反應用甘胺酸在220o
C進行淬滅1小時，並在120o
C過夜。然後，通過300 kDa至500 kDa透濾，接著100 kDa透濾純化共軛物。進一步確定純化的0.22 um過濾的共軛物的多糖和蛋白質含量。 在單混合物方法中，血清型6A、9V和23F在配製劑中是較差吸附的，而對於兩種混合物，所有血清型的吸附百分比＞70%。對於PCV10配製劑，當與pH 6.8相比時，pH 5.6至5.8沒有發現聚集體。 發現多糖比蛋白質比率(1:1)對於配製劑中肺炎球菌共軛物的吸附程度具有有利的影響。在共軛物的吸附上觀察到多糖比蛋白質比率的影響。具有＞1.5的Ps比蛋白質比率的6A共軛物顯示差的吸附。PCV-10配製劑中使用的大多數血清型含有0.6至1.3範圍的Ps:Pr比率，其導致包括血清型6A在內的各種血清型的最佳吸附。基於6A血清型和PCV-10配製劑經實驗的吸附資料，在配製16價時，可以推斷在相似範圍內其餘的6種共軛物的Ps:Pr比率可以確保所有16種血清型共軛物的一致吸附。 實施例 6 ： ELISA 方案
使用修改的三明治式ELISA測定抗原含量和吸附百分比。 常規三明治式ELISA已經就以下測試條件/測定條件進行修改，並因此具有以下有利的屬性： i. 在10價疫苗中存在9種其他共軛抗原的情況下定量共軛的多糖 ii. 從磷酸鋁凝膠中洗脫所有10種共軛物，其中吸附大於80% iii. 其中在不損害共軛物抗原性的情況下發生共軛物的捕獲，即使在pH 9時 根據下文給出的方案，使用ELISA測定抗原含量和百分比吸附： 第1天 1. 用捕捉抗體(抗載體蛋白抗體)包被板，然後在35±5℃溫育0.5-2小時 2. 使用ELISA板清洗器將板清洗3-6次 3. 用封閉緩衝液(對於血清型14和9V，1X PBS和Tris緩衝液中的3%BSA)封閉板，接著在30±5℃溫育1.5-2.5小時 4. 使用ELISA板清洗器將板清洗3次 5. 將樣品添加到板 6. 將板於5±3℃溫育過夜 第2天 1. 讓板達到室溫 2. 將板清洗3次後添加一級抗體，然後在室溫(RT) 25±2o
C下溫育30分鐘，然後清洗 3. 添加二級抗體，然後在25±2o
C下溫育30分鐘 4. 添加受質TMB，然後在RT下在黑暗中溫育15-20分鐘 5. 添加終止溶液 6. 在450 nm下讀取板。 在不損害載體蛋白之表位的情況下使樣品溶解的方法 對2 ml疫苗樣品添加適量的0.5M至2M NaOH。將所述樣品輕輕地渦旋振盪，直至溶液變澄清。溶液的pH從9-12調節至溶液變澄清。使用0.5M至2M的檸檬酸使溶液pH回到6-7.4。將所述溶液在3000-6000 x g離心(溶解的樣品)5分鐘，並收集上清液用於測試。 實施例 7 ：肺炎球菌 共軛 物疫苗 -10 價 (PCV10) 實施例 8 ：配製劑 1(PCV16)
肺炎球菌共軛物疫苗-16價(PCV16) 實施例 9 ：配製劑 1(PCV16) 實施例 10 ： I) 在 DMAP 存在的情況下分篩的 PnP(19A 、 19F 、 6A 和 6B) 的降解：
反應溶液中的分篩的PnPs以1:1.5的比率用DMAP處理，並通過SEC-HP-RI檢查其降解概況。結果：
觀察到僅19A PnPs在DMAP存在的情況下經歷降解，而含有PnPs(19F、6A和6B)的其他磷酸二酯保持完整。參考圖1(沒有DMAP)和圖2，其顯示DMAP介導的PnPs降解。 為了使19A的降解最小化，使用2M NaCl將活化的PnPs進行10 KDa滲濾以在用CRM197
共軛前除去從反應溶液形成的DMAP。II) 在 CDAP 存在的情況下分篩的 PnPs(19A 、 19F 、 6A 和 6B) 的降解和聚集：
反應溶液中的分篩的PnPs在活化過程中以1:1.5的比率用CDAP處理。觀察到50%DMAP作為副產物(通過RP-HPLC測量)產生，其在活化的一定時間後導致PnPs的降解及活化的PnPs之間的聚集(參見表2)。通過SEC-HP-RI概況檢查降解和聚集。參考圖3A(沒有CDAP)、圖3B、圖3C和圖3D(對於19A)和圖4A(沒有CDAP)及圖4B(對於19F)，其顯示CDAP介導的PnPs聚集和降解。III) 通過採用滲濾步驟防止具有 PnPs:CDAP 為 1:1.5 的分篩的 PnPs(19A 和 19F) 的降解和聚集：
為了使19A的降解和聚集最小化，使用2M NaCl將活化的PnPs進行10 KDa滲濾以在用CRM197
共軛之前除去從反應溶液形成的DMAP。參見圖3E(不含10KDa DF的共軛物)和圖3F(具有10KDa DF的共軛物)，其顯示使用10 KDa滲濾的活化的PnPs和CRM197
的共軛物的SEC-HP-RI概況。然而，滲濾步驟不利地影響共軛物產率，導致總產率降低30%-40%。IV) 通過在不採用滲濾步驟的情況下將 PnPs:CDAP 比率降低到 1:1(19A) 和 1:0.8(19F) 來防止分篩的 PnPs(19A 和 19F) 的降解和聚集
對於19A和19F分別以1:1和1:0.8比率用CDAP處理反應溶液中的PnPs，並通過SEC-HP-RI檢查其降解和聚集概況。結果：
觀察到發現修改的Ps:CDAP比率(對於19A為1:1，並且對於19F為1:0.8)防止19A和19F PnPs兩者的降解和聚集。參見圖3(對於19A為G和H)和圖4(對於19F為C和D)。使用修改的比率的另一個優點是其沒有10 KDa滲濾步驟，從而確保總產率的最小損失。 觀察到在血清型19A的情況下，當“CDAP活化持續時間”超過10分鐘時，導致活化多糖與活化多糖的交聯，最終導致“多糖-多糖聚集體”的形成。 此外，在血清型19F的情況下，當“CDAP活化持續時間”超過20分鐘時，導致活化的多糖與活化的多糖的交聯，最終導致“多糖-多糖聚集體”的形成。此外，發現共軛反應的持續時間比活化的多糖與活化的多糖交聯所需要的時間更長，從而導致聚集體的形成。參見圖3和4。 然而，對於其他血清型如6APnPs和6BPnPs，沒有觀察到此類交聯。實施例 11 ： 製備 共軛 物： PnPs19A 和 PnPs19F
使用具有以下經修改的Lees等人(Vaccine 26: 190-198, 1996)的CDAP共軛方法進行多糖與載體蛋白的共軛： i) 為了製備19A共軛物，在22℃下使用1:1的多糖比CDAP比率以活化4分鐘並且使用多糖比蛋白質比率1:1進行 ii) 為了製備19F共軛物，在22℃下使用1:0.8的多糖比CDAP比率以活化9至10分鐘和對於19F為多糖比蛋白質比率1:1進行。 結果：
觀察到發現修改的多糖:CDAP比率、CDAP活化時間和初始多糖:蛋白質比率在活化過程中使4-二甲基胺基-吡啶介導的對分篩多糖的降解最小化，並且還防止隨後的多糖-多糖聚集，從而就游離多糖含量而言改善最終共軛物特徵。 用於製備19A和19F共軛物的改善的共軛方法產生共軛物，所述共軛物在各自共軛物概況(31
P質子NMR)中不顯示任何磷酸單酯信號，這表示發現經修改的共軛方法有效防止共軛反應間的多糖水解。 鑒於可以應用所公開的發明的原理的許多可能的實施方案，應該認識到，示例的實施方案僅僅是本發明的優選實例，而不應視為限制本發明的範圍。相反，本發明的範圍由所附申請專利範圍限定。因此，申請人主張落入申請專利範圍的範圍和精神內的所有方案屬於本發明的範疇。
圖1：DMAP處理前分篩的19A PnPs(178 KDa)的SEC-HP-RI概況 圖2：DMAP處理24小時後分篩的19A PnPs(70 KDa)(A)和72小時後14.5 KDa(B)的SEC-HP-RI概況-降解概況 圖3：分篩的19A PnPs(178 KDa; A)的SEC-HP-RI概況和不使用10 KDa滲濾步驟的CDAP介導的活化多糖(5B, 5C及5D)、5E(沒有10 KDa DF的共軛物)、5F(具有10 KDa DF的共軛物)、5G分篩的19A/5H活化的19A(對於19A，經修飾的Ps:CDAP比率1:1)共軛方法的時間依賴性聚集 圖4：分篩的19F PnPs(157 KDa; A)的SEC-HP-RI概況和不使用10 KDa滲濾步驟的CDAP介導的活化多糖(B)，6C/6D(對於19F，經修飾的Ps:CDAP比率1:1)共軛方法的時間依賴性聚集 圖5：六葉片Rushton型渦輪平葉片葉輪 圖6：吸附方案