CN103391714A - 减轻搅动引起的免疫原性组合物聚集的新制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了减轻免疫原性组合物、特别是具有多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物的搅动引起的聚集的新的制剂。具体地，新的制剂包含1100至17400的分子量范围内的泊洛沙姆，相比于先前使用的表面活性剂包括聚山梨酯80，其提供了显著的优势。在一个实施方案中，本发明提供了具有15种不同的多糖-蛋白缀合物和泊洛沙姆的多价免疫原性组合物。每种缀合物由制备自不同血清型的肺炎链球菌(1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F或33F)且缀合至载体蛋白、优选CRM197的荚膜多糖组成。

Description

减轻搅动引起的免疫原性组合物聚集的新制剂
技术领域
本发明提供了减轻搅动引起的含有多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物的聚集的新制剂。具体地，新制剂包含1100至17400分子量范围内的表面活性剂泊洛沙姆(poloxamer)，其相比于以前使用的表面活性剂包括聚山梨酯80具有显著的优势。
技术背景
疫苗制剂通常必须稳定并保持均一一致性，以满足长保存期和使用多剂量容器的需要。基于蛋白，包括多糖-蛋白缀合物的疫苗容易发生蛋白聚集和沉淀，沉淀的蛋白产品无法利用，导致疫苗的总浓度显著下降。特别是多糖-蛋白缀合物疫苗，似乎相比于单独的载体蛋白具有更强的趋势发生聚集。参见Berti等, 2004, Biophys J 86:3-9。
多糖-蛋白缀合物疫苗制剂的选择能够大大影响蛋白聚集。参见Ho等, 2001, Vaccine 19:716-725。例如，山梨糖醇已经被发现减少水分诱导的聚集(参见Schwendeman等，1995，Pro Natl Acad Sci USA 92:11234-11238)，并且聚山梨酯80和磷酸铝都显示抑制多糖-蛋白缀合物的沉淀(参见美国专利申请公开号2007/0253984A1)。
本领域对增强具有多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物的稳定性并抑制其聚集/沉淀的额外疫苗制剂存在持续的需要。
发明概述
本发明涉及抑制搅动引起的，含有一种或多种多糖-蛋白缀合物的免疫原性组合物的聚集的新制剂。本发明的制剂使免疫原性组合物对例如硅油相互作用、剪切力、运输搅动、热稳定性等因素保持稳定。
从而，本发明涉及的制剂包含(i)pH范围从5.0到8.0的pH缓冲盐溶液，(ii)分子量范围从1100到17,400的泊洛沙姆，(iii)一种或多种多糖-蛋白缀合物。
在某些实施方案中，泊洛沙姆具有7,500到15,000或7,500到10,000范围内的分子量。在某些实施方案中，制剂中的泊洛沙姆选自泊洛沙姆124、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆338和泊洛沙姆407。在一个具体实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆188或泊洛沙姆237。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.001％到5％质量/体积。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.025%到4%、0.025%到1%、0.025%到0.5%、或0.025%到0.15%质量/体积。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.05%到4%、0.05%到1%、0.05%到0.5%、或0.05%到0.15%质量/体积。在其它实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.01％、0.05%、0.1％、0.5%、1.0％、或5％质量/体积。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆188的终浓度为0.05％到1.0%质量/体积，或者制剂中泊洛沙姆237的终浓度为从0.1％到1.0％质量/体积。
在某些实施方案中，本发明制剂的pH缓冲盐溶液包含的缓冲液具有pH值5.2到8.0、5.2到7.5、或5.8到7.0。在某些实施方案中，缓冲液为磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、醋酸盐、柠檬酸盐、MES、MOPS、TRIS或HEPES。在某些实施方案中，缓冲液浓度为1mM到50mM。在某些实施方案中，缓冲液为浓度从5mM到50mM的组氨酸。在一个具体实施方案中，组氨酸缓冲液的终浓度为20mM。
在某些实施方案中，pH缓冲盐溶液中的盐包括氯化镁、氯化钾、氯化钠或其组合。 在一个具体实施方案中，pH缓冲盐溶液中的盐为氯化钠。在一个实施方案中，盐浓度为20mM到170mM。
在某些实施方案中，多糖-蛋白缀合物制剂的蛋白选自CRM197、破伤风类毒素、霍乱类毒素、百日咳类毒素、大肠杆菌热不稳定类毒素(LT)、肺炎球菌溶血素类毒素、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎链球菌黏附蛋白A(PsaA)、链球菌C5a肽酶、流感嗜血杆菌蛋白D、卵清蛋白、钥孔
Figure 276196DEST_PATH_IMAGE002
血蓝蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)和结核菌素纯化蛋白衍生物(PPD)。
在某些实施方案中，制剂的多糖-蛋白缀合物包含一种或多种肺炎球菌多糖。在某些实施方案中，一种或多种肺炎球菌多糖选自由血清型1型肺炎链球菌多糖、血清型2型肺炎链球菌多糖、血清型3型肺炎链球菌多糖、血清型4型肺炎链球菌多糖、血清型5型肺炎链球菌多糖、血清型6A型肺炎链球菌多糖、血清型6B型肺炎链球菌多糖、血清型7F型肺炎链球菌多糖、血清型8型肺炎链球菌多糖、血清型9N型肺炎链球菌多糖、血清型9V型肺炎链球菌多糖、血清型10A型肺炎链球菌多糖、血清型11A型肺炎链球菌多糖、血清型12F型肺炎链球菌多糖、血清型14型肺炎链球菌多糖、血清型15B型肺炎链球菌多糖、血清型17F型肺炎链球菌多糖、血清型18C型肺炎链球菌多糖、血清型19A型肺炎链球菌多糖、血清型19F型肺炎链球菌多糖、血清型20型肺炎链球菌多糖、血清型22F型肺炎链球菌多糖、血清型23F型肺炎链球菌多糖、和血清型33F型肺炎链球菌多糖组成的组。在一个实施方案中，多糖-蛋白缀合物制剂是15价肺炎球菌缀合物(15vPnc)制剂，包含缀合至CRM197多肽的血清型1型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型3型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型4型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型5型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6B型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型7F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型9V型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型14型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型18C型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型22F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型23F型肺炎链球菌多糖、和缀合至CRM197多肽的血清型33F型肺炎链球菌多糖。
在某些实施方案中，制剂进一步包含佐剂。在一个实施方案中，佐剂是基于铝的佐剂，例如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。在一个具体实施方案中，铝佐剂是磷酸铝。在某些实施方案中，制剂包含0.001mg到0.250mg元素铝。
在某些实施方案中，制剂包含0.001mg到0.250mg元素铝，优选0.112mg到0.130mg元素铝，140到160mM氯化钠和18到22mM L-组氨酸缓冲液。在一个示例性的实施方案中，制剂是单一的0.5mL剂量，其配制以包含：1.8到2.2μg每种多糖，除了6B型为3.6到4.4μg；约32μg CRM197载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；150mM氯化钠和20mM L-组氨酸缓冲液。
在某些实施方案中，制剂进一步包含防腐剂，所述防腐剂为间甲酚、苯酚、2-苯氧乙醇、氯丁醇、苯甲醇、或硫柳汞。
在某些实施方案中，该制剂包含在容器装置内，所述容器装置选自小瓶、小瓶塞、小瓶盖、玻璃盖、橡胶盖、塑料盖、注射器，包括预装注射器、注射器塞、注射器柱塞、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、试管、导管、包、广口瓶、安瓿、盒和一次性笔。在某些实施方案中，容器装置是硅化处理的，优选烤制硅化)。
附图简述
图1A-B: pH 5.8制剂在4℃(A)和37℃(B)搅动和不搅动下的大小分布 。
图2A-B: 存在0.1％(w/v)泊洛沙姆188，pH 5.8的制剂在4℃(A)和37℃(B)搅动和不搅动下的大小分布。
图3A-B: 存在0.1%(w/v)泊洛沙姆188，pH 7.0的制剂在4℃(A)和37℃(B)搅动和不搅动下的大小分布。
图4A-B: 存在0.1%(w/v)泊洛沙姆188，6％(w/v)蔗糖和50mM NaCl，pH 7.0的制剂在4℃(A)和37℃(B)下搅动和不搅动下的大小分布。
图5A-D：存在和不存在0.1%(w/v)泊洛沙姆188，pH 5.8的制剂的大小分布，经过ISTA标准运输研究(A)pH 5.8制剂的运输1，(B)pH 5.8制剂的运输2，(A)存在0.1％泊洛沙姆188的pH 5.8制剂的运输1，(D)存在0.1％泊洛沙姆188的pH 5.8制剂的运输2。
图6A-C：下列条件下，pH5.8和37℃在搅动和不搅动下的大小分布：不存在0.1%(w/v)泊洛沙姆188的间甲苯酚(A)，存在0.1%(w/v)泊洛沙姆188的间甲苯酚，和存在0.1%(w/v)泊洛沙姆188的苯酚(C)。
图7：存在0.1%(w/v)泊洛沙姆237，pH 5.8的制剂在37℃下搅动和不搅动下的大小分布。
发明详述
本发明部分基于发现，即在含多糖-蛋白缀合物的制剂中使用泊洛沙姆作为表面活性剂，能够减轻搅动诱导的聚集并且相比其它表面活性剂例如聚山梨酯能提供预料不到的优异性质。本发明解决了本领域中提高免疫原性组合物，如多糖-蛋白缀合物稳定性和抑制颗粒的形成(例如，聚集，沉淀)的持续需要。
如实施例中所述，最初的研究检验向疫苗制剂中加入浓度为0.1%(w/v)的泊洛沙姆188是否可以减轻热、机械应激等之后形成的聚集。多摇研究以及模拟运输研究(ISTA标准测试)表明泊洛沙姆188能减轻转动振动和使用当前ISTA标准方法模拟运输研究的聚集。
因此，本发明涉及稳定含有多糖-蛋白缀合物的制剂的制剂，该制剂包含pH缓冲盐溶液，其中缓冲液具有pH值从5到8，具有从1100到17,400分子量的泊洛沙姆和一种或多种多糖-蛋白缀合物。在某些实施方案中，多糖-蛋白缀合物制剂包含在容器装置中。
如本文所定义的，术语“含CpG的核苷酸”，“含CpG的寡核苷酸”，“CpG寡核苷酸”及其类似术语指长度为6-50个核苷酸并包含去甲基化CpG部分的核苷酸分子。参见Wang等, 2003, Vaccine 21:4297。
如本文所定义的，术语“多糖”指包括任何通常用于免疫和细菌疫苗领域中的抗原性糖元件(或抗原性单元)，包括但不限于“糖”、“寡糖”、“多糖”、“脂糖”、“脂寡糖(LOS)”、“脂多糖(LPS)”、“糖基化物”、“糖缀合物”等。
如本文所定义的，“多糖-蛋白缀合物”、“肺炎球菌缀合物”、“7价肺炎球菌缀合物(7vPnC)”、“13价肺炎球菌缀合物(13vPnC)”和“15价肺炎球菌缀合物(15vPnC)”，包括脂质制剂，冷冻液体制剂和固体(如冷冻干燥或冻干)制剂等。术语“PCV15”还指15价肺炎球菌缀合物并与术语15vPnC可以互换使用。
如本文所定义的，术语“沉淀”、“沉淀物”、“颗粒形成”、“混浊”和“聚集”可以互换使用，并且指任何造成多糖-蛋白缀合物聚集的物理相互作用或化学反应。聚集过程(如蛋白聚集)经常被很多物理化学应激条件所影响，包括热、压力、pH、搅动、剪切力、冻融、脱水、重金属、酚类化合物、硅油、变性剂等。
如本文所定义的，本发明的“表面活性剂”指任何降低免疫原性组合物制剂表面张力的分子或化合物。
泊洛沙姆是一种非离子型三嵌段共聚物，其由聚氧丙烯(聚(氧化丙烯))中心疏水链，和两侧的两个聚氧乙烯(聚(氧化乙烯))亲水链构成。还已知泊洛沙姆商品名为Pluronic®。由于多聚体嵌段的长度可以定制，所以存在很多性质略有差异的不同泊洛沙姆。对于一般术语“泊洛沙姆”，这些共聚物通常用字母“P”(对于泊洛沙姆)和其后三个数字进行命名，前两个数字x100为聚氧丙烯核心的近似分子量，最后的数字x10为聚氧乙烯含量的百分比(例如P407＝泊洛沙姆具有分子量4,000 g/mol 的聚氧丙烯和70％的聚氧乙烯含量)。对于Pluronic商品名，这些共聚物的编码从定义其室温下物理形式的字母开始(L＝液体，P＝膏体，F＝薄片(固体))，随后是两或三个数字。数字定义中的第一个数字(三数字中的前两个)乘以300，表示疏水部分的近似分子量；最后一个数字x10得到百分比聚氧乙烯含量(如L61＝具有分子量1800g/mol聚氧丙烯和10％聚氧乙烯含量的Pluronic®)。参见美国专利号3740421。
泊洛沙姆的实例具有通式：
HO(C2H4O)a(C3H6O)b(C2H4O)aH
其中a和b嵌段具有下值：
本文所用的分子量单位为道尔顿(Da)或g/mol。
在某些实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.001％到5％质量/体积。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.025%到4%、0.025%到1%、0.025%到0.5%、或0.025%到0.15%质量/体积。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.05%到4%、0.05%到1%、0.05%到0.5%、0.05%到0.15%质量/体积。在其它实施方案中，制剂中泊洛沙姆的终浓度为制剂的0.01％、0.05%、0.1％、0.5%、1.0％、或5.0％质量/体积。在另一个实施方案中，制剂中泊洛沙姆188的终浓度为制剂的0.05%到1.0%质量/体积，或者制剂中泊洛沙姆237的终浓度为制剂的从0.1%到1.0％质量/体积。
表面活性剂优选不缀合到载体蛋白上。
制剂还包含pH缓冲盐溶液。缓冲液可以，例如，选自TRIS、醋酸盐、谷氨酸盐、乳酸盐、马来酸盐、酒石酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、甘氨酸盐、组氨酸、甘氨酸、琥珀酸盐、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)、MOPS(3- N-吗啉基)丙磺酸)、MES(2 -(N-吗啉基)乙磺酸)和三乙醇胺缓冲液。缓冲液能够缓冲溶液pH在4到10、5.2到7.5、或5.8到7.0范围内。缓冲液可以进一步例如选自USP相容的缓冲液用于肠胃外用途，特别是，当药物制剂用于肠胃外用途时。缓冲液浓度范围从1mM到50mM或5mM到50mM。
虽然盐溶液(即含NaCl的溶液)是优选的，其它适用于制剂的盐包括但不限于CaCl2、KCl和MgCl2。非离子等渗试剂包括但不限于蔗糖、海藻糖、甘露糖、山梨醇和甘油，可用于替代盐。适当的盐范围包括但不限于25mM到500mM或40mM到170mM。
在优选的实施方案中，疫苗组合物配制在含氯化钠的L-组氨酸缓冲液中。
本发明制剂还可以含有另外的表面活性剂。优选地，表面活性剂包括，但不限于：聚氧乙烯脱水山梨醇酯表面活性剂(通常称为吐温)，特别是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80；以DOWFAXTM商品名出售的环氧乙烷(EO)，环氧丙烷(PO)，和/或环氧丁烷(BO)共聚物，如线性EO/PO嵌段共聚物；重复乙氧基(氧-1,2 -乙二基)基团数目可以变化的辛基酚聚醚，特别是辛基酚聚醚-9(Triton X-100，或叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇(t-octylphenoxypolyethoxyethanol))；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPAL CA-630/NP-40)；磷脂，如磷脂酰胆碱(卵磷脂)；壬基酚乙氧化物，如TergitolTM NP系列；衍生自月桂醇，十六烷基醇，鲸蜡硬脂醇，和油醇的聚氧乙烯脂肪醇醚(已知作为Brij类表面活性剂)，例如三甘醇单月桂醇醚(Brij 30)；和脱水山梨糖醇酯(通常被称为SPANs)，例如脱水山梨醇三油酸酯(Span 85)，和脱水山梨醇单月桂酸酯。
在本发明的某些实施方案中，本发明的制剂进一步与佐剂一起配制。佐剂是与免疫原或抗原一起施用时增强免疫应答的物质。免疫佐剂可以增强对作为弱免疫原，即单独施用时不诱导或诱导低抗体滴度或细胞介导的免疫应答的抗原的免疫应答，增加针对抗原的抗体滴度，和/或降低个体中有效获得免疫应答所需抗原的剂量。因此，佐剂经常用以增强免疫应答，为本领域技术人员所熟知。适用于增强组合物有效性的佐剂包括但不限于：
(1)铝盐(明矾)，例如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝等；
(2)水包油乳液制剂(有或没有其他特定的免疫刺激剂如胞壁肽(包括，但不限于，N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-降胞壁酰-L-丙氨酸-2-(1'-2' 二棕榈酰基-sn-甘油酰-3-羟基磷酰基氧基)-乙胺(MTP-PE)等)或细菌细胞壁成分)，如，例如，(a)MF59(国际专利申请公开号WO90/14837)，含有5%鲨烯，0.5%吐温80，和0.5%Span85(任选的含有不同量的MTP-PE)，其使用微流化仪如110Y型微流化仪(Microfluidics, Newton, MA)配制成亚微米颗粒，(b)SAF，含10%鲨烯，0.4%吐温80，5%Pluronic封闭的聚合物L121，和thr-MDP，其微流化成亚微米乳液或涡旋产生较大粒径的乳液，(c)RibiTM佐剂***(RAS)，(Corixa, Hamilton, MT) 含有2%鲨烯，0.2%吐温80，和一种或多种来自由美国专利号4,912,094中所述3-O-去酰基单磷酰基脂质A (MPLTM)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，和细胞壁骨架(CWS) 组成的组，优选MPL+CWS(DetoxTM)的细菌细胞壁成分；以及(d)Montanide ISA；
(3) 可以使用皂苷佐剂，如Quil A或STIMULONTM QS-21 (Antigenies, Framingham, MA)(参见，例如，美国专利号5,057,540)或由其产生的颗粒，如ISCOM(胆固醇、皂苷、磷脂和两亲性蛋白的组合形成的免疫刺激复合物)和美国专利号5,254,339所述的Iscomatrix®(与ISCOM具有基本上相同的结构，但没有蛋白(CSL Limited, Parkville, Australia))；
(4)细菌脂多糖，合成脂质A类似物，如氨基葡萄糖磷酸氨基烷酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其可以来自Corixa (Hamilton, Mont.)且描述于美国专利号6,113,918中；一种这种AGP为2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]乙基 2-脱氧-4-O-膦酸基-3-O-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰基氧基十四酰基氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也被称为529(原名RC529)，配制成含水形式或稳定的乳液。
(5)合成多核苷酸，例如含一个或多个CpU基序的寡核苷酸(美国专利号6,207,646)，包括具有使用任何合成核苷酸间连接的修饰寡核苷酸、修饰碱基和/或修饰糖的那些(参见，例如Sur等, 1999, J Immunol. 162:6284-93；Verthelyi,2006,Methods Mol Med. 127:139-58；和Yasuda等, 2006, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 23:89-110))；
(6)细胞因子和淋巴因子，例如白细胞介素(如IL-lα，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-12，IL-13，IL-14，IL-15，IL-16，IL-17，IL-18，等，包括其突变形式；美国专利号5,723,127)，干扰素(如，α，β和γ干扰素)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，共刺激分子B7-1和B7-2等，以及趋化因子，如MCP-1，MCP-1α，MCP-1β和RANTES；和
(7)补体，例如补体成分C3d的三聚体。
其它佐剂包括爱菲金(Amphigen)、阿夫立定(Avridine)、L121/鲨烯、D-交酯－聚交酯/糖苷、复合多元醇、胞壁酰二肽、杀死的博代氏杆菌、结核分枝杆菌、欧洲专利号1,296,713和1,326,634所述IC-31(Intercell AG, Vienna, Austria)、百日咳类毒素(PT)、或大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，特别是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参见，例如，国际专利公开号WO93/13302和WO92/19265。
在另一个实施方案中，佐剂为2、3或更多种上述佐剂的混合物，如SBAS2(也包含3－脱酰基单磷酸脂质A和QS21的水包油乳液)。
在某些实施方案中，佐剂为铝盐。铝盐佐剂可以是明矾沉淀的疫苗或明矾吸附的疫苗。铝盐佐剂为本领域熟知，并如Harlow, E.和D. Lane(1988; Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory)以及Nicklas, W.(1992; Aluminum salts. Research in Immunology 143:489-493)所述。铝盐包括但不限于，水合氧化铝、氧化铝水化物、三水合氧化铝(ATH)、铝水化物、铝三水化物、铝胶、Superfos、Amphogel、氢氧化(Ⅲ)铝、硫酸盐羟基磷酸铝(磷酸铝佐剂(APA))、无定形氧化铝、三水合氧化铝、或三羟基铝。
APA是羟基磷酸铝的水悬液。通过按照1:1体积比例混合氯化铝和磷酸钠沉淀羟基磷酸铝来制备APA。混合过程后，材料通过高剪切力混合器降低大小以获得2-8μm范围内的目标聚集颗粒大小。然后将产物相对生理盐水透析并蒸汽灭菌。
在某些实施方案中，商品化的Al(OH)3(如Denmark/Accurate Chemical and Scientific Co., Westbury, NY的Alhydrogel或Superfos)用于按照50-200g蛋白/mg氢氧化铝的比例吸附蛋白。在另一个实施方案中，蛋白吸附取决于蛋白pI(等电点pH)和介质的pH。较低pI的蛋白比较高pI的蛋白更强烈的吸附到正电铝离子上。铝盐可以建立Ag的储存，在2-3周的周期内缓慢释放，其参与巨噬细胞的非特异性活化和补体活化，和/或刺激先天免疫机制(可能通过尿酸的刺激)。参见例如Lambrecht等, 2009, Curr Opin Immunol 21:23。
本发明的多糖-蛋白缀合物制剂可以包含任何已知多糖和载体蛋白。多糖的实例包括肺炎球菌多糖，奈瑟氏球菌多糖和链球菌多糖。
在某些实施方案中，一种或多种肺炎球菌多糖选自血清型1型肺炎链球菌多糖、血清型2型肺炎链球菌多糖、血清型3型肺炎链球菌多糖、血清型4型肺炎链球菌多糖、血清型5型肺炎链球菌多糖、血清型6A型肺炎链球菌多糖、血清型6B型肺炎链球菌多糖、血清型7F型肺炎链球菌多糖、血清型8型肺炎链球菌多糖、血清型9N型肺炎链球菌多糖、血清型9V型肺炎链球菌多糖、血清型10A型肺炎链球菌多糖、血清型11A型肺炎链球菌多糖、血清型12F型肺炎链球菌多糖、血清型14型肺炎链球菌多糖、血清型15B型肺炎链球菌多糖、血清型17F型肺炎链球菌多糖、血清型18C型肺炎链球菌多糖、血清型19A型肺炎链球菌多糖、血清型19F型肺炎链球菌多糖、血清型20型肺炎链球菌多糖、血清型22F型肺炎链球菌多糖、血清型23F型肺炎链球菌多糖、和血清型33F型肺炎链球菌多糖。
本发明特别适用于含有从多种血清型的肺炎链球菌获得的多糖的多价肺炎球菌多糖-蛋白缀合物疫苗。7价肺炎球菌缀合物疫苗，Prevnar®，含有来自血清型4、6B、9V、14、18C、19F和23F的多糖。美国专利申请公开号US2006/0228380A1描述了13价肺炎球菌缀合物疫苗，包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F。中国专利申请公开号CN101590224A描述了14价肺炎球菌缀合物疫苗，包括血清型1、2、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F和23F。美国临时专利申请号61/302726描述了15价肺炎球菌缀合物疫苗，包括血清型1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F。
在某些实施方案中，多糖-蛋白缀合物制剂是7价肺炎球菌缀合物(7vPnC)制剂，包含缀合至CRM197多肽的血清型4型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6B型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型9V型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型14型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型18C型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19F型肺炎链球菌多糖、和缀合至CRM197多肽的血清型23F型链肺炎球菌多糖。
在某些其它实施方案中，多糖-蛋白缀合物制剂是13价肺炎球菌缀合物(13vPnC)制剂，包含缀合至CRM197多肽的血清型4型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6B型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型9V型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型14型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型18C型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型23F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型1型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型3型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型5型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型7F型肺炎链球菌多糖、和缀合至CRM197多肽的血清型19A型肺炎链球菌多糖。
在一个实施方案中，多糖-蛋白缀合物制剂是15价肺炎球菌缀合物(15vPnC)制剂，包含缀合至CRM197多肽的血清型1型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型3型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型4型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型5型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6B型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型7F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型9V型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型14型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型18C型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型22F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型23F型肺炎链球菌多糖、和缀合至CRM197多肽的血清型33F型肺炎链球菌多糖。
来自肺炎链球菌的夹膜多糖可以通过本领域技术人员已知的标准技术制备。例如，多糖可以从细菌分离获得，并且可以通过已知方法(参见例如欧洲专利号EP497524和EP497525)，优选通过微流化制成一定程度的大小。多糖可以改变大小以降低多糖样品中的粘度和/或增加缀合产物的滤过性。
在一个实施方案中，每种肺炎球菌多糖血清型在基于大豆的培养基中生长。然后个别多糖可以通过标准步骤进行纯化，包括离心，沉淀和超滤。参见美国专利申请公开号2008/0286838和美国专利号5,847,112。
载体蛋白优选无毒性和无反应性，并可以足够量和纯度获得的蛋白。载体蛋白可以缀合或连接肺炎链球菌多糖以增强多糖的免疫原性。载体蛋白应当可以耐受标准的缀合操作。在本发明的一个具体实施方案中，CRM197用作载体蛋白。在一个实施方案中，夹膜多糖缀合到相同的载体蛋白(每个夹膜多糖分子缀合到单个载体蛋白)。在另一个实施方案中，每种夹膜多糖缀合到两种或更多的载体蛋白(每个夹膜多糖分子缀合到单个载体蛋白)。在该实施方案中，每个相同血清型的夹膜多糖通常缀合到相同的载体蛋白。
CRM197是白喉毒素的无毒性变体(即类毒素)。在一个实施方案中，其分离自基于酪蛋白氨基酸和酵母提取物的培养基中生长的白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)C7菌株(β197)培养物。在另一个实施方案中，CRM197根据美国专利号5,614,382中所述方法重组制备。通常，CRM197通过超滤，硫酸铵沉淀和离子交换色谱组合纯化。在一些实施方案中，CRM197使用Pfenex Expression TechnologyTM (Pfenex Inc., San Diego, CA)在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中制备。
其它合适的载体蛋白包括额外灭活的细菌毒素如DT(白喉类毒素)、TT(破伤风类毒素)或TT的C片段、百日咳类毒素、霍乱类毒素(例如，如国际专利申请公开号WO2004/083251所述)、大肠杆菌LT、大肠杆菌ST、和铜绿假单胞菌外毒素A。细菌外膜蛋白质如外膜蛋白复合物c(OMPC)，膜孔蛋白，转铁蛋白结合蛋白，肺炎球菌表面蛋白A(PspA；参见国际专利申请公开号WO02/091998)，肺炎球菌黏附蛋白A(PsaA)，A组或B组链球菌C5a肽酶(例如，酶失活的链球菌C5a肽酶(SCP)，如一个或多个美国专利号6951653，美国专利号6355255和美国专利号6270775所述的SCP的变体)，或流感嗜血杆菌蛋白D，肺炎球菌溶血素(Kuo等，1995，Infect Immun 63; 2706-13)包括某种脱毒形式的ply，如dPLY-GMBS(参见国际专利申请公开号WO04/081515)或dPLY-甲醛(dPLY-formol)，PhtX，包括PhtA，PhtB，PhtD，PhtE和Pht融合蛋白，例如PhtDE融合蛋白，PhtBE融合蛋白(参见国际专利申请公开号WO01/98334和WO03/54007)，也可以使用。其它蛋白，如卵清蛋白，钥孔
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血蓝蛋白(KLH)，牛血清白蛋白(BSA)或结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)，PorB(来自脑膜炎奈瑟菌)，PD(流感嗜血杆菌蛋白D；参见，例如，欧洲专利号EP0594610B)，或其免疫功能等价物，合成肽(参见欧洲专利号EP0378881和EP0427347)，热休克蛋白(参见国际专利申请公开号WO93/17712和WO94/03208)，百日咳蛋白(参见国际专利申请公开号WO98/58668和欧洲专利号EP0471177)，细胞因子，淋巴因子，生长因子或激素(参见国际专利申请公开号WO91/01146)，包含来自多种病原体衍生抗原的人CD4+ T细胞表位的人工蛋白(参见Falugi等，2001，Fur J Immunol 31:3 816-3 824)如N19蛋白(参见Baraldoi等，2004, Infect Immun 72:4884-7)，铁摄取蛋白(参见国际专利申请公开号WO01/72337)，艰难梭菌(C. diffictle)毒素A或B(参见国际专利公开号WO00/61761)，和鞭毛蛋白(参见Ben-Yedidia等，1998，Immunol Lett 64:9)也可以用作载体蛋白。
也可以使用其它DT突变体，例如CRM176、CRM228、CRM45(Uchida等, 1973, J Biol Chem 218:3838-3844)；CRM9、CRM45、CRM102、CRM103和CRM107以及其它Nicholls和Youle在Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992中所述突变体；缺失或Glu-148向Asp、Gln或Ser的突变，和/或Ala 158向Gly的突变和其它美国专利号4,709,017或美国专利号4,950,740公开的突变；在Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534 中至少一个或多个残基的突变，以及其它美国专利号5,917,017或美国专利号6,455,673公开的突变，或美国专利号5,843,711公开的片段。
纯化的多糖随即进行化学活化(即，通过还原胺化)获得能够与载体蛋白反应的糖。一旦被活化，每种夹膜多糖通过已知的偶联技术单独与载体蛋白(如，CRM197)缀合形成糖缀合物(或者可选地，每种夹膜多糖缀合到相同载体蛋白)，并配制成单剂量制剂。
在一个实施方案中，多糖的化学活化和随后与载体蛋白的缀合通过美国专利4,365,170, 4,673,574和4,902,506中描述的方法实现。简单来说，该化学反应通过与任何氧化剂如高碘酸盐(包括高碘酸钠、高碘酸钾、或高碘酸)反应，氧化末端羟基成醛，使肺炎球菌多糖活化。该反应导致碳水化合物邻位羟基随机氧化裂解，形成具有反应性的醛基。
在一个实施方案中，偶联到载体蛋白(如CRM197)可以通过还原性胺化反应直接胺化蛋白的赖氨酰。例如，缀合可以通过使活化的多糖和载体蛋白的混合物与还原剂如氰基硼氢化钠反应进行。然后通过加入强还原剂如硼氢化钠封闭未反应的醛基。
在另一个实施方案中，缀合方法依赖于用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)活化糖形成氰酸酯。活化的糖因此可以直接或通过间隔(连接)基团与载体蛋白的氨基偶联。例如，间隔基团可以是胱胺或半胱胺得到巯基化的多糖，其可以通过与马来酰亚胺活化的载体蛋白(例如使用GMBS)或卤代乙酰化载体蛋白(使用碘乙酰胺[例如盐酸乙基碘乙酰胺]或N-琥珀酰亚胺基溴乙酸盐或STAB，或SIA，或SBAP)反应后得到的硫醚键连接到载体。优选地，氰酸酯(任选地，CDAP化学物制得)与己二胺和己二酸二酰肼(ADH)偶联，氨基酸衍生的糖采用碳二亚胺(例如EDAC或EDC)化学物通过载体蛋白上的羧基与载体蛋白偶联。这种缀合物在国际专利申请公开号WO93/15760, WO95/08348和WO96/29094，以及Chu等, 1983, Infect. Immunity 40:245-256中有描述。
其他合适的技术，使用碳化二亚胺、酰肼、活性酯、降冰片烷、对硝基苯甲酸、N-羟基琥珀酰亚胺、S-NHS、EDC、TSTU。很多技术在国际专利申请公开号WO98/42721中有描述。缀合可以涉及羰基连接基团，通过使糖游离羟基与CDI反应(参见Bethell等, 1979, J. Biol. Chem. 254:2572-4; Hearn等, 1981, J. Chromatogr. 218:50918)，之后与蛋白质反应形成氨基甲酸酯连接而形成。这涉及到异头末端还原到伯羟基，任选地，伯羟基基团的保护/脱保护，伯羟基基团与CDI形成CDI氨基甲酸酯中间体的反应，以及CDI氨基甲酸酯中间体与蛋白上氨基的偶联。
在一个实施方案中，配制之前，每种肺炎球菌夹膜多糖抗原单独从肺炎链球菌纯化，活化形成具有反应性的醛类，然后使用还原胺化共价缀合到载体蛋白CRM197。
夹膜多糖缀合到载体蛋白之后，通过一种或多种技术纯化(使多糖-蛋白缀合物的量富集)多糖-蛋白缀合物。这些技术的实例为本领域技术人员所熟知，包括浓缩/渗滤操作，超滤，沉淀/洗脱，柱色谱和深层过滤。参见，例如，美国专利号6,146,902。
在个别的糖缀合物纯化后，将它们混合配制本发明的免疫原性组合物。这些肺炎球菌缀合物通过单独的操作制备，并散装配制成单剂量制剂。本发明的多糖-蛋白缀合物的配制可以使用本领域认可的方法完成。例如，15种个别的肺炎球菌缀合物抗原使用生理可接受的媒介物以制备组合物。这些媒介物的实例包括但不限于水，缓冲盐溶液，多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)和葡萄糖溶液。
每个疫苗剂量中的缀合物的量选择为能够诱导免疫保护性应答而没有显著的副作用的量。所述量可以根据肺炎球菌血清型变化。通常，每个剂量包含0.1到100μg每种多糖，特别是0.1到10μg，更特别是1到5μg。例如每个剂量可以包含100、150、200、250、300、400、500或750 ng，或1、1.5、2、3、4、5、6、7、7.5、8、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、25、30、40、50、60、70、80、90、或100 μg。
在一个实施方案中，铝盐的剂量为10、15、20、25、30、50、70、100、125、150、200、300、500或700 μg, 或1、1.2、1.5、2、3、5 mg或更多。在另一个实施方案中，上述铝盐的剂量为每微克重组蛋白。
特定疫苗的成分的最优量可以通过标准研究确定，包括对受试者中适当免疫应答的观察。例如，在另一个实施方案中，人疫苗的剂量通过动物研究外推人体数据而确定。在另一个实施方案中，剂量根据经验确定。
在本发明的具体实施方案中，PCV-15疫苗是个别缀合至CRM197的血清型为1、3、4、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F的肺炎球菌夹膜多糖无菌液体制剂。配制每0.5mL剂量以包含：2μg每种多糖，除了6B型为4μg；约32μgCRM197载体蛋白(如32 μg ±5 μg, ±3 μg, ±2 μg, 或±1 μg)；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；和氯化钠以及L-组氨酸缓冲液。L-组氨酸缓冲液中氯化钠浓度为约150mM(例如150 mM ± 25 mM、± 20 mM、± 15 mM、±10mM、或±5mM)，和约20mM(例如20mM±5mM、±2.5mM、±2mM、±1 mM、或±0.5 mM)。
多糖-蛋白缀合物典型地在pH缓冲盐溶液中组合成不同血清型的混合物，然后组合佐剂(所述佐剂可以在盐溶液中)。泊洛沙姆可以在过程的任何阶段加入。
在一个实施方案中，操作包括将15种血清型的混合物与组氨酸、盐溶液和泊洛沙姆组合，然后将此混合材料与APA和盐溶液组合。
在一个具体的实施方案中，制剂含有组氨酸(20mM)，盐溶液(150mM)和泊洛沙姆188(0.1％w/v)，pH 5.8，和250μg/mL的APA(磷酸铝佐剂)。目前的研究已经检查了5.8-7.0的pH范围，显示所列制剂减轻了搅动引起的聚集。泊洛沙姆188的范围发现研究目前正检验从0.025到0.15%的范围。
本发明的组合物还可以包括一种或多种来自肺炎链球菌的蛋白。适用于纳入的肺炎链球菌蛋白的实例包括在国际专利申请公开号WO 02/083855和WO 02/053761中鉴定的实例。
上述制剂还可以包括一种或多种额外的药学可接受的稀释剂，赋形剂或药学可接受的载体。如本文所使用的，语言“药学可接受的载体”旨在包括任何和所有与施用于人或其它脊椎动物宿主相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延缓剂等。适当的载体对于本领域技术人员是明显的，并在很大程度上取决于施用途径。
对于液体制剂的药学可接受的载体为水或非水溶液、悬液、乳液或油。非水溶剂的实例为丙二醇、乙二醇、和注射用有机酯如油酸乙酯。水性载体包括(除了水之外)乙醇/水溶液、乳液或悬液。油的实例为来自动物，植物或合成来源的油，例如花生油，大豆油，橄榄油，葵花籽油，鱼肝油，另一种海生动物油(another marine oil)，或来自奶或蛋的脂质。
可以在免疫原性组合物制剂中存在的赋形剂包括但不限于防腐剂，化学稳定剂和悬浮或分散剂。典型地，稳定剂，防腐剂等进行优化以确定目标受体(如，人受试者)中效果的最优制剂。防腐剂的实例包括间甲酚、2-苯氧乙醇、苯甲醇、硫柳汞、氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯、乙基香兰素、甘油、苯酚、和对氯苯酚。稳定成分的实例包括酪蛋白氨基酸、蔗糖、明胶、酚红、N-Z胺、磷酸二氢钾、乳糖、乳清蛋白水解物、和奶粉。
在某些实施方案中，免疫原性组合物制剂制备用于施用人受试者，形式为，例如液体、粉末、气溶胶、片剂、胶囊、肠溶糖衣片或胶囊、或栓剂。因此，免疫原性组合物制剂还可以包括但不限于，悬液，溶液、油性或水性媒介物中的乳液、膏剂、和可植入缓释或生物可降解制剂。
在另一个实施方案中，本发明制剂通过口服施用，并且从而配制成适用于口服施用的形式，如作为固体或液体制剂。固体口服制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、小丸剂等。液体口服制剂包括溶液、悬液、分散液、乳液、油液等。
在某些实施方案中，制剂为单剂量小瓶，多剂量小瓶或预装注射器。
本发明的免疫原性组合物的选择不限于常规的，生理可接受载体，稀释剂和赋形剂，例如溶剂，缓冲剂，佐剂，或其它可用于上述药学制剂类型的成分。来自上述成分的这些药学可接受的组合物的制剂，具有适当的pH，等渗性，稳定性和其它本领域内的常规性质。
在某些实施方案中，本发明涉及包含在容器装置中的免疫原性组合物制剂。如本文所定义的，本发明的“容器装置”包括任何物质的组合，在研究、加工、开发、配制、制造、储存和/或施用时，其用于对免疫原性组合物“包含”、“容纳”、“混合”、“调和”、“分散”、“注射”、“转移”、“雾化”等。例如，本发明的容器装置包括但不限于，普通实验室玻璃器具、烧瓶、烧杯、量筒、发酵罐、生物反应器、试管、导管、包、广口瓶、小瓶、小瓶塞(例如，橡胶塞、螺盖)、安瓿、注射器、注射器塞、注射器柱塞、胶塞、塑料瓶盖、玻璃盖、等。本发明的容器装置不受制造材料的限制，包括材料，例如玻璃，金属(例如，钢，不锈钢，铝等)和聚合物(例如，热塑性塑料，弹性体，热塑性弹性体)。
本领域技术人员将明白上述容器装置绝不是一个详尽的列表，只是作为指导技术人员使用各种容器装置在研究、加工、开发、配制、制造、储存和/或施用免疫原或免疫原性组合物时，用于对所述组合物包含、容纳、混合、调和、分散、注射、转移、雾化等。考虑用于本发明的其它的容器装置可以在实验室设备经销商和制造商，如United States Plastic Corp. (Lima, Ohio), VWR (West Chester, Pa.), BD BiosClences (Franklin Lakes, N.J.), Fisher SClentific International Inc. (Hampton, N.H.)和Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo.)公开的目录中找到。
因此，本发明的新制剂是特别有利的，因为它们在研究、加工、开发、配制、制造、存储和/或施用该组合物的各个阶段稳定和抑制容器装置中包含的免疫原制剂且抑制其沉淀。本发明新制剂不仅使免疫原性组合物对物理/热应激条件(例如，温度，湿度，剪切力等)稳定，它们也提高免疫原性组合物对负面因素或影响，诸如与容器/密闭***(例如，硅化容器装置)的不相容性的稳定性并抑制其沉淀。
本发明免疫原性组合物的稳定性可以使用本领域技术人员熟知和常规的标准技术方便的进行测定。例如免疫原性组合物可以通过方法分析其稳定性、聚集、免疫原性、颗粒形成、蛋白(浓度)损失等，所述方法包括但不限于光散射、光密度、沉降速率离心、沉降平衡离心、圆二色性(CD)、Lowry分析、二喹啉甲酸(BCA)分析、抗体结合等。
通过所附的说明书和附图描述了本发明已经描述的各个实施方案，应当理解，本发明不限于那些精确的实施方案，并且在不脱离所附权利要求所限定的本发明的范围或精神的前提下，本领域技术人员其中可以实施各种变化和修改。
下面的实例用于阐释，而不是限制本发明。
实施例
实施例1：肺炎链球菌夹膜多糖的制备
培养肺炎球菌的方法是本领域熟知的。参见，例如 Chase, 1967, Methods of Immunology 和 Immunochemistry 1:52。制备肺炎球菌夹膜多糖的方法也是本领域熟知的。参见，例如欧洲专利号EPO497524。肺炎球菌亚型的分离物可从ATCC获得。
该细菌鉴定为具有夹膜的，非活动的，革兰氏阳性，柳叶刀形双球菌，其在血琼脂上是α溶血性的。使用特定抗血清基于Quelling反应进行亚型的区分。参见，例如，美国专利号5,847,112。
细胞库
PCV-15中存在的每种肺炎链球菌血清型的细胞库在冻存管中从默克培养物保藏中心(Merck Culture Collection (Rahway, NJ))获得。
接种
融化的菌种培养物转移到含有适当的预先灭菌的生长培养基的种子发酵罐中。
种子发酵
培养物在进行温度和pH控制的种子发酵罐中生长。种子发酵罐中全部体积的培养物转移到装有预先灭菌的生长培养基的生产发酵罐中。
生产发酵
生产发酵是操作的最后细胞生长阶段。控制温度、pH和搅动速率。
灭活
通过加入灭活试剂终止发酵过程。灭活后，批次被转移到灭活罐，在其中保持受控制的温度并搅动。
纯化
使用离心和过滤的组合去除细胞碎片。该批次进行超滤和渗滤。然后该批次进行基于溶剂的分级分离，除去杂质并回收多糖。
实施例2：肺炎球菌多糖-CRM197缀合物的制备
活化操作
使用常规的操作流程将不同血清型的糖单独缀合到纯化的CRM197载体蛋白上。在此操作中，将糖溶解并调整大小到目标分子量，化学活化并通过超滤交换缓冲液。然后将纯化的CRM197与活化的糖缀合，获得的缀合物通过超滤纯化，最后用0.2μm滤膜过滤。如本实施例所述，每个步骤内的多个操作参数，例如pH，温度，浓度和时间是血清型特异性的。
步骤 1 ：溶解
纯化的多糖以2-3mg/mL的浓度溶于水。溶解后的多糖通过预先设定压力为0-1000巴的机械匀浆器。降低大小后，糖在10kDa MWCO超滤器上浓缩并用无菌水渗滤。渗透液丢弃，截留液使用50mM终浓度的醋酸钠缓冲液调整pH4.1。对于血清型4和5，使用pH5.0的100mM 醋酸钠。对于血清型4，溶液在50℃± 2℃孵育。通过冷却到20-24℃终止水解。
步骤 2 ：高碘酸盐反应
肺炎球菌糖活化所需的高碘酸钠摩尔当量使用总糖含量确定。使用充分混合，进行3-20小时的氧化反应，对于所有血清型，温度均在20-24℃，除了5、7F和19F在2-6℃。
步骤 3 ：超滤
氧化的糖在10kDa MWCO超滤器上用10mM，pH6.4磷酸钾(对于血清型5采用10mM醋酸钠，pH4.3)浓缩并渗滤。丢弃渗透液，截留液加入3M磷酸钾缓冲液调整至pH6.3-8.4。
缀合操作
步骤 1 ：缀合反应
浓缩的糖与CRM197载体蛋白按照0.2-2比1的配料比混合。混合的糖-CRM197混合物过滤通过0.2μm滤器。
加入氰基硼氢化钠至每摩尔糖1.8-2.0摩尔氰基硼氢化钠来启动缀合反应。反应混合物在20-24℃(对于血清型3、5、6A、7F、19A和19F为8-12℃)孵育48-120小时。
步骤 2 ：硼氢化反应
缀合孵育结束时，反应混合物用1.2M碳酸氢钠缓冲液或3M磷酸钾缓冲液(除了血清型5)调整到4-8℃，pH8-10。加入硼氢化钠至每摩尔糖0.6-1.0摩尔硼氢化钠(对于血清型5加入0摩尔硼氢化物)来终止缀合反应。反应混合物孵育45-60分钟。
步骤 3 ：超滤步骤
反应混合物使用最少20倍体积的pH8.4，100mM磷酸钾缓冲液，在100kDa MWCO超滤器上渗滤。来自100kDa超滤器的截留液使用最少20倍体积的150mM氯化钠，在20-24℃下，300kDa MWCO超滤器上渗滤。渗透液被丢弃。
步骤 4 ：无菌过滤
来自300kDa MWCO渗滤的截留液过滤通过0.2μm滤器，按照适当体积装入硼硅酸盐玻璃容器，用于释放测试，过程中对照和配制(除了血清型19F)。血清型19F缀合物通过0.2μm滤器过滤到容纳罐内，在20-24℃孵育。孵育后，缀合物使用最少20倍体积的150mM氯化钠，在20-24℃下，300kDa MWCO超滤器上渗滤。渗透液被丢弃，截留液过滤通过0.2μm滤器，按照适当体积装入硼硅酸盐玻璃容器，用于释放测试，过程中对照和配制。最终容积浓缩液保存在2-8℃。
实施例3：15价肺炎球菌缀合物疫苗的配制
容积浓缩物所需体积的计算基于批次体积和容积糖浓度。组合后的15种缀合物通过加入赋形剂(如泊洛沙姆)进一步稀释到目标吸收浓度，所述赋形剂包括含有氯化钠、L-组氨酸的缓冲液，pH 5.8。充分混合后，混合物无菌过滤通过0.2μm滤膜。在与容积磷酸铝混合的同时和之后，无菌配制的容积物温和地混合。配制好的疫苗保存在2-8℃。
实施例4：赋形剂对搅动引起的聚集的影响
在旋转搅动研究后使用各种赋形剂和pH条件研究15价肺炎球菌缀合物疫苗-15(PCV-15)的稳定性。PCV-15配制在20mM组氨酸，pH 5.8和150mM 氯化钠及0.25mg/mL磷酸铝佐剂(APA)中。64μg/mLCRM197蛋白缀合到4μg/mL血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、和33F，8μg/mL血清型6B的肺炎球菌多糖(PnP)上，使多糖总浓度为64μg/mL。
对于旋转搅动研究，在pH 5.8，6.2和7.0，使用加入表面活性剂和渗透剂，以及表面活性剂和渗透剂的组合而制备PCV-15制剂主要成分。根据渗透剂的浓度，氯化钠浓度从150mM调整到100mM或50mM。搅动研究设计为在4℃，使用垂直和侧向旋转搅动24小时。肉眼和使用静态光散射观察聚集。
制剂材料：
PCV-15制剂材料根据实施例1-3所述制备。制剂材料保存在2-8℃直至所有搅动研究完成。下列制剂制备20mM组氨酸加0.25mg/mL磷酸铝佐剂(APA)和64μg/mL多糖：CRM197蛋白缀合物中：
1. 150mM NaCl, pH5.8
2. 150mM NaCl, pH 6.0
3. 150mMNaC1, pH 6.2
4. 150mM NaCl, pH 6.6
5. 150mM NaCl, pH 6.8
6. 150mMNaC1, pH 7.0
7. 3% 蔗糖, 100mM NaCl, pH 5.8
8. 3% 蔗糖, 100mMNaCl, 0.02% PS-80, pH 5.8
9. 6% 蔗糖, 50mM NaCl, pH 5.8
10. 6% 蔗糖, 50mM NaCl, 0.02% PS80, pH 5.8
11. 3% 蔗糖, 100mM NaCl, pH 6.2
12. 3% 蔗糖, 100mM NaCl, 0.02% PS-80, pH 6.2
13. 6% 蔗糖, 50mM NaCl, pH 6.2
14. 6% 蔗糖, 50mM NaCl, 0.02% P580, p1-I 6.2
15. 6% 海藻糖, 50mM NaCl, 0.02% PS-80, pH 6.2
16, 6% 蔗糖, 50mMNaC1, 0.1% 泊洛沙姆 188, pH 6.2
17. 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, 0.02% PS-80, pH 5.8
18. 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188, pH 5.8
19. 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, 0.02% PS-80, pH 5.8
20. 0.5% 海藻糖, 150mM NaCl, 0.02% PS-80, pH 5.8
21. 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, 0.02% PS-20, pH 5.8
22. 0.5% 海藻糖, 150mM NaCl, 0.02% PS-20, pH 5.8
23. 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, pH 5.8
24. 0.5% 海藻糖, 150mM NaCl, pH 5.8
25. 150mM NaC1, 0.02% PS-80, pH 5.8
26. 150mM NaC1, 0.02% PS-20, pH 5.8
27. 150mM NaC1, 0.02% PS-80, pH 6.2
28. 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188, pH 5.8
29. 150mM NaC1, 0. 1% 泊洛沙姆 188, pH 6.2
30. 150mM NaC1, 0.04% CTAB, pH 5.8
31. 50mM NaCl, 6% 蔗糖, 0.1% 泊洛沙姆 188, pH 7.0
32. 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188, pH 7.0。
搅动研究程序：
搅动研究的目的是将小瓶置于搅动条件下，然后测定那些条件对聚集形成的影响。此项研究表现为通过与亲水性表面相互作用(非研磨)和制剂对最终的容器组分和空气界面的暴露对PCV-15制剂的直接搅动。PCV-15制剂以0.75mL的分装体积装入非硫酸盐处理的，带有13mm瓶塞的2mL小瓶中。
对于旋转、振荡和翻滚搅动(end-over-end agitation)方法，小瓶在4℃和25℃垂直和侧向搅动24小时。除了在垂直旋转搅动(小瓶首先置于7x7冻存盒中)中，小瓶直接贴附于搅动设备。使用实验室规模的多用途旋转仪的最大速率进行旋转搅动，而数字旋涡振荡器使用1500rpm进行振荡搅动。对于翻滚搅动使用摇床的最高速率。对于旋转搅动方法以一小时间隔至多达八小时进行观察，振荡搅动法和翻滚搅动法至多达九小时，对所有三种搅动方法最后一次观察记录在24小时。由于可获得的制剂材料有限，在旋转法中，小瓶一式两份搅动，振荡和翻滚法中单一搅动。所有小瓶都与未搅动的小瓶对照进行比较。
另外对于旋转搅动方法，3％硫酸盐处理的2mL小瓶装入0.75mL制剂。小瓶在最大速率下垂直和侧向搅动24小时，然后用或不用10-bi产品纸盒在4℃包装，与在同样条件下搅动的非硫酸盐处理的小瓶进行比较。10-bi产品纸盒是一种最新上市的产品包装，最多可容纳10只小瓶并包含一个产品原型装置。
结果
在pH 5.8、6.0、6.2、6.6、6.8和7.0下的PCV-15制剂1搅动后，测量发现pH变化不显著到足以阻止聚集形成，特别是侧向搅动后聚集的形成。单独加入表面活性剂PS-80和与等渗剂蔗糖组合加入的确阻止一些搅动研究，但不是所有搅动研究中垂直和侧向搅动引起的聚集。向V114制剂中单独加入表面活性剂PS-20也阻止一些搅动研究，但不是所有搅动研究中垂直和侧向搅动引起的聚集。但是在pH 5.8，当PS-20与等渗剂蔗糖或海藻糖组合加入时，垂直和侧向搅动引起的聚集被阻止。最后，表面活性剂泊洛沙姆188的确单独阻止搅动引起的聚集，并在pH5.8，6.2和7.0下与等渗剂蔗糖组合阻止搅动引起的聚集。
结论
使用各种表面活性剂、等渗剂和pH条件的搅动研究结束后，表面活性剂PS-20能够与等渗剂蔗糖和海藻糖联合在pH 5.8阻止搅动引起的聚集。但是，无论pH条件如何，表面活性剂泊洛沙姆188都能够单独或与等渗剂蔗糖联合阻止搅动引起的聚集。
实施例5：温度、pH、盐浓度和蔗糖对搅动引起的聚集的影响
对热应激后旋转搅动对多种PCV-15制剂的影响进行了研究。对于旋转搅动研究，通过改变pH、盐浓度并加入蔗糖将PCV-15制备成多个制剂(表1)。然后这些制剂分为三组：4℃； 37℃应激一周；和25℃应激45天。4℃组立即进行搅动，而其它两组按照上述条件孵育后，再进行搅动。搅动研究设计为在4℃，使用旋转侧向搅动24小时。对所有的样品用肉眼观察以检测微粒，对4℃和37℃样品用静态光散射以检测样品中颗粒大小分布。
表1：制备用于搅动研究的制剂
20 m 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 和 250 μg/ml APA
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 0.1% (w/v) 泊洛沙姆 188,150 mM NaCl, 和 250 μg/ml APA
20 mM 组氨酸 pH 7.0, 0.1% (w/v) 泊洛沙姆 188,150 mM NaCl, 和 250 μg/ml APA
20 mM 组氨酸 pH 7.0, 0.1% (w/v) 泊洛沙姆 188, 6% (w/v) 蔗糖, 50 mM NaCl, 和 250 μg/ml APA
方法：
制剂的制备：
使用保存在10mM组氨酸，pH 7.0和盐溶液中的上文所述多糖-蛋白缀合物，在II级生物安全柜中无菌制备制剂，然后按照表1中定义的条件配制。
旋转搅动：
此项研究表现为通过与亲水性表面相互作用(非研磨)和制剂对最终的容器组分和气/液界面的暴露对PCV-15制剂的直接搅动。PCV-15制剂以0.75mL的分装体积装入非硫酸盐处理的，带有13mm瓶塞的2mL小瓶中。如果需要，这些小瓶置于热应激条件下，然后在4℃额外搅动24小时。对于旋转搅动，使用实验室规模多用途旋转仪的最高速率。对于侧向搅动，小瓶直接贴附于旋转仪。观察24小时。
结果
无论应激条件如何，不存在泊洛沙姆188，小瓶中的PCV-15制剂(表1)在4℃旋转搅动24小时后结果形成沉淀。加入泊洛沙姆188结果没有观察到微粒(表2)。每个条件下检验了15小瓶。
对照实验在4℃，存在或不存在APA，20 mM组氨酸，pH 5.8, 150 mM NaCl进行。结果是相当的，显示存在APA对抑制搅动引起的聚集没有贡献。
表2
表面活性剂对小瓶中搅动引起的聚集形成的影响。
Figure 305966DEST_PATH_IMAGE005
对于4℃和37℃的样品还进行静态光散射来观察大小分布。在不存在泊洛沙姆188的制剂中，观察到一群较大的微粒。含有泊洛沙姆188的制剂仅有一群与未搅动样品(图1A-4B)中观察到的群体相当的微粒。
结论
即使制剂在搅动之前经历热应激条件，终浓度为0.1％的泊洛沙姆188也能够减轻小瓶中搅动引起的聚集。
实施例6：ISTA标准测试期间表面活性剂对阻止搅动引起的聚集的影响
介绍：
ISTA标准3A研究的目的是将小瓶制剂暴露于日常运输中观察到的振荡应激条件和可能的跌落应激条件。对于该研究，PCV-15制备成多种制剂，然后进行ISTA 3A操作。参见国际安全运输协会规程3A(East Lansing, MI)。使用ISTA标准程序，结果与材料运输至发达世界时所要经历的预期条件材料更加一致。样品保存在2-8℃。在2-8℃保存之后，肉眼检查样品检测微粒，然后额外用静态光散射(SLS)分析颗粒大小分布。
方法：
制剂的制备：
使用上文所述保存在10mM组氨酸，pH 7.0和盐溶液中的多糖-蛋白缀合物，在II级生物安全柜中无菌制备制剂，然后按照表3中定义的条件配制。
表3：制备用于搅动研究的制剂μ
20 mM组氨酸pH 5.8, 150 mM NaCl, 和250 μg/ml APA
20 mM组氨酸pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.02% PS20 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.1%泊洛沙姆188 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 6.2, 6%蔗糖, 50 mM NaCl, 0.02% PS80 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 6.2, 3%蔗糖, 100 mM NaCl, 0.02% PS80 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 6.2, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 6.2, 6%海藻糖, 50 mM NaCl, 0.02% PS80 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 6.2, 150 mM NaCl, 0.1%泊洛沙姆188 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 6.2, 6%蔗糖, 50 mM NaCl, 0.1%泊洛沙姆188 和250 μg/mL APA
20 mM组氨酸pH 5.8, 0.5%蔗糖, 150 mM NaCl, 0.02% PS80
20 mM组氨酸pH 5.8, 0.5%蔗糖, 150 mM NaCl, 0.1%泊洛沙姆188
ISTA标准搅动研究：
小瓶进行ISTA 3A程序。
所使用的材料是那些在ISTA 3A程序中指定的，并包括凝胶运输装置基础(基于发泡聚苯乙烯(EPS)的热运输装置)；PolarPack凝胶，28盎司(制冷剂用于保持产品温度)；PCS 50913 Temp Tale显示器，带有0℃低温报警和25℃高温报警；PCS 50900波纹垫，开槽；Tape Scotch胶带和包装胶带，分别用于保持产品纸盒和凝胶运输装置封闭；10X产品纸盒(纸盒设计容纳10个塞住和卷曲的小瓶，以5×2模式，产品圆形装置以2排分开5个小瓶)；和PCS 50837凝胶运输装置盖(盖子由EPS制造)。
进行下列纸盒制备步骤：
用scotch胶带封闭一侧，组装1个10X产品纸盒。
用永久黑色记号笔涂抹10X产品纸盒的所有侧面。
获得10小瓶PCV15制剂。
将10小瓶V114 DP制剂放入ProQuad 10X产品纸盒。
将10X产品纸盒开口端封闭。
将包装好的10X产品纸盒放入凝胶运输装置中，在4个冷却的PolarPak胶之间，28盎司，2块胶在底部，2块胶在顶部。
纸盒制备完毕后，材料立即转运到Tegrant公司(Montgomeryville, PA)进行保存/预测试条件作用。直至进行测试之前，所有材料置于下列温度条件：PolarPack凝胶制冷剂，冷藏于5℃±3℃，PCV15制剂小瓶5℃±3℃；PolarPack凝胶制冷剂，冷冻于-20℃±5℃，所有其它组分在室温。所有材料在这些温度保存条件下超过24小时。
在Tegrant公司进行下列包装：
获得凝胶运输装置基础。
将1个冷却的PolarPark凝胶，28盎司平铺置于凝胶运输装置基础的底部。
将1个TempTale置于PolarPack凝胶顶部，触及凝胶运输装置内壁一边，将其开启。
将1个波纹垫置于冷却的PolarPack凝胶和TempTale顶部。
将装有PCV15制剂的产品纸盒置于波纹垫的顶部。
将1个TempTale置于装有PCV15制剂的产品纸盒内的顶层。
将1个波纹垫置于装有PCV15制剂的产品纸盒顶部。
将1个TempTale置于波纹垫内，触及凝胶运输装置底部相对一边，将其开启。
将1个冷却的PolarPark凝胶，28盎司平铺置于波纹垫和TempTale的顶部。
将2个冷冻的PolarPark凝胶，28盎司平铺置于冷却的PolarPark凝胶的顶部。
将凝胶运输装置盖置于凝胶运输装置基础上。
轻打用包装带封闭的凝胶运输装置。
包装好的凝胶运输装置转运到Mid-Atlantic Packaging(Montgomeryville)根据ISTA 3A测试程序进行分布测试。
除了ISTA测试之外，一个子集的小瓶还暴露于先前所述的旋转摇动条件。使用实验室规模的多用途旋转仪的最大速率进行旋转搅动。小瓶直接贴附于旋转仪进行侧向搅动。观察进行24小时。
结果
旋转搅动结果：
不存在泊洛沙姆，在小瓶中的PCV-15制剂在4℃旋转搅动24小时后结果形成沉淀。加入表面活性剂泊洛沙姆188结果没有观察到微粒(表4)。
表4：表面活性剂对小瓶中搅动引起的聚集形成的影响。
制剂 外观(肉眼检验)
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 150mM NaCl, 和 250 μg/m1 APA 中等量的小纤维聚集
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 在侧壁有小聚集 少量小聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaC1, 0.02% PS20 和 250 μg/mL APA 在侧壁有非常小聚集 两处非常小聚集物
20mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 和250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 6% 蔗糖, 50 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 在侧壁有小聚集
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 3% 蔗糖, 100 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 在侧壁有小聚集 少量到中量聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 在侧壁有小聚集 非常少量小聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 6% 海藻糖, 50 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 在侧壁有小聚集 非常少量小聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 150 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 6% 蔗糖, 50 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, 0.02% PS80 在侧壁有非常小的聚集 非常少量的小聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 0.5% 蔗糖, 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 无聚集物
ISTA标准测试结果：
经过ISTA标准3A程序的V114制剂(表3)肉眼检查聚集物。含泊洛沙姆188或聚山梨酯(PS)的制剂减轻了聚集物的出现(表5)。
表5：在暴露于ISTA 3A程序后表面活性剂对小瓶中搅动引起的聚集形成的影响
制剂 外观(肉眼检验)
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 和 250 μg/ml APA 很多小聚集物
20mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.02% PS20 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 150 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 6% 蔗糖, 50 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 3% 蔗糖, 100 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2,6% 海藻糖, 50 mM NaCl, 0.02% PS80 和 250 μg/mL APA 无聚集物，难以重悬
20 mM 组氨酸 pH 6.2, 150 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 6.2,6% 蔗糖, 50 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 和 250 μg/mL APA 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 0.5% 蔗糖, 150 mM NaCl, 0.02% PS80 无聚集物
20 mM 组氨酸 pH 5.8, 0.5% 蔗糖, 150 mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 188 无聚集物
除了肉眼检查，还在样品子集中进行静态光散射检查大小分布。ISTA测试后不含表面活性剂的对照制剂导致颗粒大小增加和颗粒分布范围更宽(图5A-B)。而含有泊洛沙姆188的制剂暴露于ISTA测试后显示更均一的产品(图5C-D)。
结论：
多种制剂同时暴露于旋转和振荡应激条件且通过肉眼和使用静态光散射观察颗粒大小分布。结果表明加入表面活性剂(聚山梨酯或泊洛沙姆188)可以减轻振荡应激条件引起的搅动引起的聚集(ISTA标准3A结果)。但是仅泊洛沙姆188能够同时减轻V114制剂的振荡和旋转应激条件引起的聚集。
实施例7：泊洛沙姆范围发现研究
PCV-15如实施例1-3所述制备为小瓶形式，在20mM组氨酸，pH 5.8和150mM 氯化钠及0.25mg/mL磷酸铝佐剂(APA)中。对于旋转搅动研究，将表面活性剂加入磷酸铝佐剂(APA)上而制备PCV-15。搅动研究设计为在4℃，使用侧向旋转搅动24小时。使一束光通路(丁达尔效应)通过小瓶以检测微粒。
方法：
制剂的制备：
按照实施例1-3所述，在II级生物安全柜中无菌制备制剂。制剂保存在4℃，直至开始搅动研究。
表6：本研究中评价的制剂
20 mM 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaC1
20 mM 组氨酸 pH 5,8 和 150 mM NaCl +0.025% 泊洛沙姆 188
20 mM 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaCl +0.05% 泊洛沙姆 188
20 mM 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaCl +0.1% 泊洛沙姆 188
20 mM 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaCl +0.15% 泊洛沙姆 188
20 mM 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaC1 +0.02% PS80
旋转搅动：
搅动研究的目的是将小瓶置于搅动条件下，然后测定那些条件对聚集物形成的影响。PCV-15制剂以0.75mL的分装体积装入非硫酸盐处理的，带有13mm瓶塞的2mL小瓶中。小瓶在4℃侧向搅动24小时。对于旋转搅动，使用实验室规模多用途旋转仪的最高速率用于旋转搅动。对于侧向搅动，小瓶直接贴附于旋转仪。
观察进行24小时。
结果：
在泊洛沙姆188不存在或PS80存在的情况下，小瓶中的PCV-15制剂在4℃旋转搅动24小时后形成沉淀。加入0.025%和0.15%之间浓度的表面活性剂泊洛沙姆188结果没有观察到颗粒。但是，在更高的浓度下，0.1％和0.15％，在空气/液体界面存在的区域观察到轻微的朦胧物的外观(铺开)(表7)。
表7：表面活性剂对含铝的PCV-15的小瓶中的搅动引起的聚集形成的影响。
制剂 n 外观(肉眼检验)
20 mm 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaCl 3 微粒
20 mm 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaCl & 0.025% 泊洛沙姆 188 3 无
20 mm 组氨酸 pH 5,8 和 150 mM NaCl & 0.05% 泊洛沙姆 188 3 无
20 mm 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaC1& 0.1% 泊洛沙姆 188 3 无/铺开
20 mm 组氨酸 pH 5.8 和 150 mM NaCl & 0.15% 泊洛沙姆 188 3 无/铺开
20 mm 组氨酸 pH 5.8 和 150 m NaCl & 0.02% PS80 3 微粒
结论：
浓度在0.025-0.15% (w/v)之间的表面活性剂泊洛沙姆188能够阻止小瓶中搅动引起的聚集。
实施例8：防腐剂对搅动引起的聚集的影响
使用各种防腐剂，单独或与表面活性剂组合，研究在旋转搅动研究后15价肺炎球菌缀合物疫苗-15(PCV-15)的稳定性。PCV-15制备在20mM组氨酸，pH 5.8和150mM 氯化钠及0.25mg/mL磷酸铝佐剂(APA)中。64μg/mLCRM197蛋白缀合到4μg/mL血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F、和33F，8μg/mL血清型6B的肺炎球菌多糖(PnP)上，使多糖总浓度为64μg/mL。
按照实施例4中所述进行旋转搅动研究。通过加入指定浓度的苯酚、2-苯氧乙醇、间甲酚、苯甲醇、或氯丁醇，单独或与泊洛沙姆188组合而制备PCV-15制剂的主要成分。一些防腐剂溶于指定的溶剂。搅动研究设计为在4℃，使用旋转侧向搅动24小时。使用肉眼，在一些情况下使用静态光散射观察聚集。
结果：
不存在泊洛沙姆188，在小瓶中的PCV-15制剂在4℃旋转搅动24小时后结果通常形成沉淀。加入0.1％的表面活性剂泊洛沙姆188结果对任何测试的防腐剂均未观察到微粒。
表8：防腐剂对含铝的PCV-15的小瓶中的搅动引起的聚集形成的影响。
Figure DEST_PATH_IMAGE007
Figure 805824DEST_PATH_IMAGE008
还对代表性的样品进行静态光散射来观察大小分布。在不存在泊洛沙姆188的制剂中，观察到一群较大的颗粒。含有泊洛沙姆188和间甲酚或苯酚的制剂仅有一群与未搅动样品(图6A-C)中观察到的群体相当的颗粒。
结论
所测试的各种防腐剂对泊洛沙姆188抑制搅动引起的聚集的能力没有任何不利影响。
实施例9：pH和缓冲液对搅动引起的聚集的影响
使用各种缓冲液和pH条件研究在旋转搅动研究后15价肺炎球菌缀合物疫苗-15(PCV-15)的稳定性。PCV-15制备在20mM指定缓冲液和150mM 氯化钠及0.25mg/mL磷酸铝佐剂(APA)中。64μg/mLCRM197蛋白缀合到4μg/mL血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，8μg/mL血清型6B的肺炎球菌多糖(PnP)上，使多糖总浓度为64μg/mL。
对于旋转搅动研究，在pH 5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.6、6.8、7.0和8.0，通过加入表面活性剂和渗透剂，以及表面活性剂和渗透剂的组合而制备PCV-15制剂主要成分。搅动研究设计为在4℃，使用旋转侧向搅动24小时。肉眼观察聚集。
结果：
在所测试的缓冲液和pH条件下，不存在泊洛沙姆188，在小瓶中的PCV15制剂在4℃旋转搅动24小时后结果形成沉淀。加入0.1％的表面活性剂泊洛沙姆188结果在任何测试的缓冲液和pH条件均未观察到微颗。
表8：缓冲液和pH条件对含铝的PCV15的小瓶中的搅动引起的聚集形成的影响。
制剂 n 温度 观察结果
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.2 1 2-8℃ 微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.4 1 2-8℃ 微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.6 1 2-8℃ 微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.8 1 2-8℃ 微粒
20mM 琥珀酸盐, 150mM NaCl, 5.7 1 2-8℃ 微粒
20mM 琥珀酸盐, 150mM NaCl, 6.0 1 2-8℃ 微粒
20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.0 1 2-8℃ 微粒
20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8.0 1 2-8℃ 微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.2 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.4 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.6 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl pH 5.8 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20mM 琥珀酸盐150mM NaCl, 5,7 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20mM 琥珀酸盐, 150mM NaCl, 6.0 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20 mM HEPES, 150 m NaC, pH 7.0 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
20 mM Tris-HCl, 150 mm NaCl, pH 8.0 和 0.1% 泊洛沙姆 188 1 2-8℃ 无微粒
结论：
所测试的各种缓冲液和pH对泊洛沙姆188抑制搅动引起的聚集的能力没有任何不利影响。
实施例10：各种分子量范围的泊洛沙姆对搅动引起的聚集的影响
使用各种商品化泊洛沙姆研究在旋转搅动研究后15价肺炎球菌缀合物疫苗-15(PCV-15)的稳定性。PCV-15配制在20mM组氨酸，pH 5.8和150mM 氯化钠及0.25mg/mL磷酸铝佐剂(APA)中。64μg/mLCRM197蛋白缀合到4μg/mL血清型1、3、4、5、6A、7F、9V、14、18C、19A、19F、22F、23F和33F，8μg/mL血清型6B的肺炎球菌多糖(PnP)上，使多糖总浓度为64μg/mL。
对于旋转搅动研究，加入指定浓度的泊洛沙姆237、泊洛沙姆338、或泊洛沙姆407而制备PCV-15制剂的主要成分配制。搅动研究设计为在4℃，使用旋转侧向搅动24小时。肉眼观察聚集。
结果：
在0.1% 泊洛沙姆237存在的情况下，小瓶中的PCV15制剂在旋转搅动后结果没有观察到微粒。其它测试的条件结果形成非常小的微粒，但是相比没有泊洛沙姆的对照制剂是显著的改善。
表9
各种分子量范围的泊洛沙姆对含铝的PCV-15的小瓶中的搅动引起的聚集形成的影响
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.05% 泊洛沙姆 237 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 237 pH 5.8 无微粒
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.05% 泊洛沙姆 338 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 338 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.005% 泊洛沙姆 407 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
20mM 组氨酸 150mM NaCl, 0.01% 泊洛沙姆 407 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.05% 泊洛沙姆 407 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
20mM 组氨酸, 150mM NaCl, 0.1% 泊洛沙姆 407 pH 5.8 非常小的微粒, 聚集物
对于含0.1％泊洛沙姆237的样品还进行静态光散射来观察大小分布。此制剂与非搅动样品中看到的群体相当(图7)。
结论：
各种分子量范围的泊洛沙姆抑制搅动引起的聚集的能力不同。优化条件应当允许完全抑制。

Claims (21)

1.制剂，包含(i)具有5.0到8.0范围内的pH的pH缓冲盐溶液，(ii)具有1100到17,400范围内的分子量的泊洛沙姆，和(iii)一种或多种多糖-蛋白缀合物。
2.权利要求1的泊洛沙姆，具有7,500到15,000范围内的分子量。
3.权利要求1的泊洛沙姆，具有7,500到10,000范围内的分子量。
4.权利要求1的制剂，其中所述泊洛沙姆为泊洛沙姆188或泊洛沙姆237。
5.权利要求1-4中任一项的制剂，其中所述制剂中所述泊洛沙姆的终浓度为所述制剂的0.001％到5％重量/体积。
6.权利要求1-4中任一项的制剂，其中所述制剂中所述泊洛沙姆的终浓度为所述制剂的0.025%到1%重量/体积。
7.权利要求1-4中任一项的制剂，其中所述制剂中泊洛沙姆188的终浓度为所述制剂的0.05%到1.0%重量/体积，或者所述制剂中泊洛沙姆237的终浓度为所述制剂的0.1%到1.0％重量/体积。
8.权利要求1-7中任一项的制剂，其中所述pH缓冲盐溶液具有5.2到8.0范围内的pH。
9.权利要求1-8中任一项的制剂，其中所述缓冲液剂选自Tris、磷酸盐、琥珀酸盐、组氨酸、MES、MOPS、HEPES、醋酸盐或柠檬酸盐。
10.权利要求1-9中任一项的制剂，其中所述缓冲液为终浓度5mM到50mM的组氨酸，或终浓度1mM到20mM的琥珀酸盐。
11.权利要求1-10中任一项的制剂，其中所述盐溶液以20nM到170nM的浓度存在。
12.权利要求1-11中任一项的制剂，其中所述蛋白为载体蛋白CRM197。
13.权利要求1-12中任一项的制剂，其中所述多糖-蛋白缀合物包含一种或多种肺炎球菌多糖。
14.权利要求1-13中任一项的制剂，其中所述多糖-蛋白缀合物制剂是15价肺炎球菌缀合物(15vPnc)制剂，包含缀合至CRM197多肽的血清型1型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型3型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型4型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型5型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型6B型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型7F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型9V型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型14型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型18C型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19A型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型19F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型22F型肺炎链球菌多糖、缀合至CRM197多肽的血清型23F型肺炎链球菌多糖、和缀合至CRM197多肽的血清型33F型肺炎链球菌多糖。
15.权利要求1-14中任一项的制剂，其中所述制剂进一步包含佐剂。
16.权利要求15的免疫原性组合物，其中所述佐剂为基于铝的佐剂。
17.权利要求16的制剂，其中所述佐剂为磷酸铝。
18.权利要求17的制剂，包含0.112mg到0.130mg元素铝，140到160mM氯化钠和18到22mM L-组氨酸缓冲剂。
19.权利要求18的制剂，所述制剂为配制以包含下列的单一的0.5mL剂量：1.8到2.2μg每种糖，除了6B型为3.6到4.4μg；约32μg CRM197 载体蛋白；0.125mg元素铝(0.5mg磷酸铝)佐剂；约150mM氯化钠和约20mM L-组氨酸缓冲剂。
20.权利要求1-19中任一项的制剂，其中所述制剂进一步包含防腐剂，所述防腐剂为间甲酚、苯酚、2-苯氧乙醇、氯丁醇、苯甲醇或硫柳汞。
21.小瓶或预装注射器，包含权利要求1-20中任一项的制剂。
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