CN110505883A - 供治疗癌症的方法中使用的白介素-2免疫缀合物,cd40激动剂,和任选地pd-1轴结合拮抗剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于治疗癌症的组合物和方法,该方法包括施用IL‑2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD‑轴结合拮抗剂。

Description

供治疗癌症的方法中使用的白介素-2免疫缀合物,CD40激动 剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂
发明领域
本发明涉及通过施用IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂来治疗癌症的方法。
发明背景
癌症是全世界首要死因之一。尽管有治疗选项的进步,具有晚期癌症的患者的预后仍然较差。因此,对在不引起不可接受的毒性的情况下延长癌症患者的存活的最佳疗法存在持久且迫切的医学需要。
最近来自临床试验的结果已经显示免疫疗法,诸如免疫检查点抑制剂能延长癌症患者的总体存活及引起持久的响应。尽管有这些有希望的结果,当前基于免疫的疗法仅仅在一部分患者中有效,而且需要组合策略来改善治疗益处。
白介素-2(IL-2),也称作T细胞生长因子(TCGF),是一种15.5kDa球状糖蛋白,在淋巴细胞生成,存活和稳态中发挥中枢作用。它刺激T细胞增殖和分化,诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)生成和外周血淋巴细胞分化成细胞毒性细胞和淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞,促进T细胞表达细胞因子和溶胞分子,推动B细胞增殖和分化和B细胞合成免疫球蛋白,和刺激天然杀伤(NK)细胞生成,增殖和激活(综述于例如Waldmann,Nat Rev Immunol 6,595-601(2009)；Olejniczak and Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-89(2008)；Malek,Annu RevImmunol 26,453-79(2008))。它在体内扩充淋巴细胞群体和提高这些细胞的效应器功能的能力赋予IL-2以抗肿瘤效果,而且高剂量IL-2治疗已经批准用于具有转移性肾细胞癌和恶性黑素瘤的患者。
经由它在抗原呈递细胞(APC),包括B淋巴细胞,树突细胞(DC),和单核细胞上的表达,CD40,肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的一个成员,是抗肿瘤免疫应答的一种关键调节物(参见例如Grewal,IS et al.,Ann Rev Immunol 1998,16:111-35；Van Kooten,C etal.,J Leukoc Biol 2000,67:2-17；或O'Sullivan,B et al.,Crit Rev Immunol 2003,23(12):83-107)。CD40刺激的DC上调抗原加工和呈递途径并迁移至***以激活幼稚T细胞。激动性CD40抗体显示出替代CD4+淋巴细胞的功能,导致细胞毒性T淋巴细胞(CTL)扩充,能够清除鼠模型中已建立的淋巴瘤(参见例如Sotomayor,EM et al.,Nature Medicine1999,5(7):780-7；Gladue,RP et al.,Cancer Immunol Immunother 2011,60(7):1009-17)。CD40激动剂通过激活宿主APC触发免疫刺激,然后驱动针对肿瘤的T细胞应答(参见例如Vonderheide,RH,Clin Cancer Res 2007,13:1083-8)。
编程性死亡配体1(PD-L1)是在免疫和肿瘤细胞的表面上找到的,而且它的表达受到干扰素伽马(IFNγ)诱导。通过与活化的T细胞上的抑制性编程性死亡-1(PD-1)和B7.1受体相互作用,产生T细胞抑制性信号,它阻止免疫***破坏癌细胞。
因此,靶向PD-1和经由与PD-1的相互作用发信号的其它分子,诸如编程性死亡配体1(PD-L1)和编程性死亡配体2(PD-L2)的治疗剂是一个强烈感兴趣的领域。PD-L1在许多癌症中过表达,而且常常与不良预后有关(Okazaki T et al.,Intern.Immun.2007,19(7):813)(Thompson RH et al.,Cancer Res 2006,66(7):3381)。有趣的是,与正常组织中的T淋巴细胞和外周血T淋巴细胞形成对比,大多数肿瘤浸润性T淋巴细胞主要表达PD-1,这指示肿瘤反应性T细胞上PD-1的上调能促成受损的抗肿瘤免疫应答(Blood 2009,114(8):1537)。这可以是由于利用由与PD-1表达性T细胞相互作用的PD-L1表达性肿瘤细胞介导的PD-L1信号传导以导致削弱T细胞活化及逃避免疫监视(Sharpe et al.,Nat Rev 2002)(Keir ME et al.,2008 Annu.Rev.Immunol.26:677)。因此,抑制PD-L1/PD-1相互作用可增强CD8+ T细胞介导的肿瘤杀伤。
已经提出抑制PD-L1信号传导作为一种增强T细胞免疫以治疗癌症(例如肿瘤免疫)和感染(包括急性和慢性(例如持久的)感染二者)的手段。一种最佳的治疗性处理可组合PD-1受体/配体相互作用的阻断与一种或多种增强肿瘤免疫(例如通过活化T细胞)的药剂。
如上所述,尽管某些免疫疗法可得,仍然需要用于在患者中治疗各种癌症,稳定各种癌症,预防各种癌症,和/或延迟各种癌症发生的最佳(组合)疗法。
发明概述
一方面,本文中提供的是一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包括对该个体施用有效量的白介素-2(IL-2)免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
另一方面,本文中提供的是一种在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法,其包括施用有效量的白介素-2(IL-2)免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
另一方面,本文中提供的是IL-2免疫缀合物在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途,其中该药物包含该IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和任选地进一步与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
另一方面,本文中提供的是CD40激动剂在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途,其中该药物包含该CD40激动剂和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和任选地进一步与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
另一方面,本文中提供的是PD-1轴结合拮抗剂在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途,其中该药物包含该PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和进一步与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
另一方面,本文中提供的是包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物,供在个体中治疗癌症或延迟癌症进展中使用,其中该治疗包含与第二组合物组合,和任选地进一步与第三组合物组合施用所述组合物,其中该第二组合物包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂,其中该第三组合物包含PD-1轴拮抗剂和任选的药学可接受载剂。
另一方面,本文中提供的是包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物,供在个体中治疗癌症或延迟癌症进展中使用,其中该治疗包含与第二组合物组合,和任选地进一步与第三组合物组合施用所述组合物,其中该第二组合物包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂,其中该第三组合物包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂。
另一方面,本文中提供的是包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物,供在个体中治疗癌症或延迟癌症进展中使用,其中该治疗包含与第二组合物组合,和进一步与第三组合物组合施用所述组合物,其中该第二组合物包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂,其中该第三组合物包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的药物,和包含说明书的包装插页,该说明书关于与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的药物,和包含说明书的包装插页,该说明书关于与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的第一药物,和包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的第二药物。在一些实施方案中,该试剂盒进一步包含包含说明书的包装插页,该说明书关于施用该第一药物和该第二药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的药物,和包含说明书的包装插页,该说明书关于与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和进一步与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的药物,和包含说明书的包装插页,该说明书关于与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和进一步与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的第一药物,包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的第二药物,和包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的第三药物。在一些实施方案中,该试剂盒进一步包含包含说明书的包装插页,该说明书关于施用该第一药物和该第二药物和该第三药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
另一方面,本文中提供的是一种试剂盒,其包含包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的药物,和包含说明书的包装插页,该说明书关于与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和进一步与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是人PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂选自由PD-1结合拮抗剂,PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂组成的组。在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,该抗体是人源化抗体,嵌合抗体或人抗体。在一些实施方案中,该抗体是抗原结合片段。在一些实施方案中,该抗原结合片段选自由Fab,Fab’,F(ab’)2,和Fv组成的组。
在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是PD-1结合拮抗剂。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对其配体结合配偶的结合。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1的结合。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L2的结合。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1和PD-L2二者的结合。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂选自由MDX1106(纳武单抗(nivolumab)),MK-3475(派姆单抗(pembrolizumab)),CT-011(匹迪单抗(pidilizumab)),MEDI-0680(AMP-514),PDR001,REGN2810,和BGB-108组成的组。
在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1的结合。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对B7-1的结合。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1和B7-1二者的结合。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂选自由MPDL3280A(阿特珠单抗(atezolizumab)),YW243.55.S70,MDX-1105,MEDI4736(度伐单抗(durvalumab)),和MSB0010718C(阿维单抗(avelumab))组成的组。在特定实施方案中,该抗PD-L1抗体是MPDL3280A(阿特珠单抗)。在一些实施方案中,以约800mg至约1500mg每三周(例如约1000mg至约1300mg每三周,例如约1100mg至约1200mg每三周)的剂量施用MPDL3280A。在一些实施方案中,以约1200mg每三周的剂量施用MPDL3280A。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含重链和/或轻链,该重链包含SEQ IDNO:19的HVR-H1序列,SEQ ID NO:20的HVR-H2序列,和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列,该轻链包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列,SEQ ID NO:23的HVR-L2序列,和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列,该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含重链可变区和轻链可变区,该重链可变区包含SEQ IDNO:25的氨基酸序列,该轻链可变区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含WO 2010/077634和美国专利No.8,217,149(其通过援引收入本文)中描述的抗体YW243.55.S70的三种重链HVR序列和/或抗体YW243.55.S70的三种轻链HVR序列。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含抗体YW243.55.S70的重链可变区序列和/或抗体YW243.55.S70的轻链可变区序列。
在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是PD-L2结合拮抗剂。在一些实施方案中,该PD-L2结合拮抗剂是抗体。在一些实施方案中,该PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是抗体(例如抗PD-1抗体,抗PD-L1抗体,或抗PD-L2抗体)且包含无糖基化位点突变。在一些实施方案中,该无糖基化位点突变是替代突变。在一些实施方案中,该替代突变在氨基酸残基N297,L234,L235,和/或D265(EU编号方式)处。在一些实施方案中,该替代突变选自由N297G,N297A,L234A,L235A,和D265A组成的组。在一些实施方案中,该替代突变是D265A突变和N297G突变。在一些实施方案中,该无糖基化位点突变降低抗体的效应器功能。在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-1抗体,抗PD-L1抗体,或抗PD-L2抗体)是具有依照EU编号方式的第297位处的Asn至Ala替代的人IgG1。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含特异性结合肿瘤抗原的抗体,和IL-2多肽。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含特异性结合癌胚抗原(CEA)的抗体。在一些实施方案中,该特异性结合CEA的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:38的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:39的HCDR2和SEQ ID NO:40的HCDR3,轻链可变区包含SEQ ID NO:41的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:42的LCDR2和SEQ ID NO:43的LCDR3。在一些实施方案中,该特异性结合CEA的抗体包含包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗体。在一些实施方案中,该特异性结合FAP的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ IDNO:47的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:47的重链可变区序列的重链互补决定区(HCDR)1,HCDR 2和HCDR3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的轻链互补决定区(LCDR)1,LCDR 2和LCDR 3。在一些实施方案中,该抗体包含包含SEQ IDNO:47的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:48的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物中包含的抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体是IgG类抗体,特别是IgG1亚类抗体。在一些实施方案中,该抗体包含Fc域,特别是IgG Fc域,更加特别是IgG1 Fc域。在一些实施方案中,该Fc域是人Fc域。在特定实施方案中,该Fc域是人IgG1 Fc域。
在一些实施方案中,该Fc域包含促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰。在一些实施方案中,在该Fc域的第一亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成***,该***可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,且在该Fc域的第二亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的***。在一些实施方案中,在该Fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在该Fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。在一些实施方案中,在该Fc域的第一亚基中另外位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C),且在该Fc域的第二亚基中另外位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一些实施方案中,与天然IgG1 Fc域相比,该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合,和/或效应器功能,特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的氨基酸替代。在一些实施方案中,该Fc域包含选自L234,L235,和P329(编号方式依照Kabat EU索引)的组的一个或多个位置处的一处或多处氨基酸替代。在一些实施方案中,该Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物中包含的该IL-2多肽是人IL-2多肽。在一些实施方案中,该IL-2多肽是包含氨基酸替代F42A,Y45A和L72G(编号方式相对于人IL-2序列SEQ ID NO:52)的突变体人IL-2多肽。在一些实施方案中,该IL-2多肽包含SEQ ID NO:53的序列。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含单一(即不多于一个)IL-2多肽。
在一个实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含包含与SEQ ID NO:44的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的多肽,包含与SEQ ID NO:45的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:46的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的多肽。在一个实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含包含SEQ ID NO:44的序列的多肽,包含SEQID NO:45的序列的多肽,和包含SEQ ID NO:46的序列的多肽。(CEA-IL2v)
在一个实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含包含与SEQ ID NO:49的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的多肽,包含与SEQ ID NO:50的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:51的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的多肽。在一个实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含包含SEQ ID NO:49的序列的多肽,包含SEQID NO:50的序列的多肽,和包含SEQ ID NO:51的序列的多肽。(FAP-IL2v)
在一个实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含cergutuzumab amunaleukin。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该CD40激动剂是特异性结合CD40的抗体。在一些实施方案中,该CD40激动剂是特异性结合并活化人CD40的抗体。在一些实施方案中,该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的重链互补决定区(HCDR)1,HCDR 2和HCDR 3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的轻链互补决定区(LCDR)1,LCDR 2和LCDR 3。在一些实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:57的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:58的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,该特异性结合CD40的抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体是IgG类抗体,特别是IgG2亚类抗体,更加特别是人IgG2亚类抗体。
在一个实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:59的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的重链多肽和包含与SEQ ID NO:60的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的轻链多肽。在一个实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:59的序列的重链多肽和包含SEQ ID NO:60的序列的轻链多肽。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该癌症是FAP阳性癌症。在一些实施方案中,该癌症是CEA阳性癌症。在一些实施方案中,该癌症是结肠癌,肺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,胰腺癌,子宫内膜癌,乳腺癌,肾癌,食管癌,***癌,或本文中描述的其它癌症。在一些实施方案中,该个体具有癌症或已经诊断有癌症。在一些实施方案中,该个体具有局部晚期或转移性癌症或已经诊断有局部晚期或转移性癌症。在一些实施方案中,该个体中的癌细胞表达PD-L1。在一些实施方案中,PD-L1的表达可以通过免疫组织化学(IHC)测定法来测定。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的治疗或施用可以在该个体中导致响应。在一些实施方案中,该响应是完全响应。在一些实施方案中,该响应是该治疗停止后的持久响应。在一些实施方案中,该响应是该治疗停止后持久的完全响应。在其它实施方案中,该响应是部分响应。在一些实施方案中,该响应是该治疗停止后持久的部分响应。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物在该CD40激动剂之前,与该CD40激动剂同时,或在该CD40激动剂之后施用。该PD-1轴结合拮抗剂可以在该IL-2免疫缀合物和该CD40激动剂之前,之间,之后或同时施用。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂,和任选地该PD-1轴结合拮抗剂在同一组合物中。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂在分开的组合物中。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,静脉内,肌肉内,皮下,表面,口服,经皮,腹膜内,眼窝内,通过植入,通过吸入,鞘内,室内,或鼻内施用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和/或该PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中,静脉内施用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和/或该PD-1轴结合拮抗剂。在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该治疗进一步包括施用化疗剂,用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展。在一些实施方案中,该个体在该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合治疗之前已经用化疗剂治疗。在一些实施方案中,用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合治疗的个体对化疗剂治疗不应。在一些实施方案中,用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合治疗的个体对化疗剂治疗不耐受。贯穿本申请描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案进一步包括施用化疗剂,用于治疗癌症或延迟癌症进展。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物和试剂盒的一些实施方案中,该个体中的CD8 T细胞具有相对于施用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合之前增强的引发,活化,增殖和/或溶胞活性。在一些实施方案中,CD8 T细胞的数目相对于施用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合之前升高。在一些实施方案中,该CD8 T细胞是抗原特异性CD8 T细胞。在一些实施方案中,Treg功能相对于施用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合之前受到遏制。在一些实施方案中,T细胞耗竭相对于施用该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂的组合之前降低。
要理解的是,可以组合本文中描述的各个实施方案的一个,一些,或所有特性以形成本发明的其它实施方案。本发明的这些和其它方面对本领域技术人员会变得显而易见。通过下面的详述进一步描述本发明的这些和其它实施方案。
附图简述
图1。作为单一药剂和在组合设置中的FAP-IL2v,CD40单抗和PD-L1单抗的功效实验的结果。将Panc02-H7-Fluc转染子胰腺癌细胞系注射入Black 6小鼠中的胰腺以研究胰腺正位同基因模型中的存活。以下面的剂量施用化合物:2mg/kg FAP-IL2v,10mg/kg CD40单抗和10mg/kg PD-L1单抗。一周一次腹膜内并行注射化合物达3周。(A)存活曲线。(B)中值和总体存活值。
图2。图1中显示的小鼠的生物发光成像。生物发光信号(光子/秒)的降低代表肿瘤抑制。
发明详述
本申请的发明人证明,IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地抗PD-L1免疫疗法在它们的抗癌特性中协同作用且它们的组合能在具有癌症的患者中提供有意义的临床益处。本申请中的数据显示,IL-2免疫缀合物与CD40激动剂,和任选地进一步与抗PD-L1免疫疗法的组合导致增强的中值和总体存活以及肿瘤生长抑制。
一方面,本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,组合物和用途,其包括施用有效量的IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
另一方面,本文中提供的是用于在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法,组合物和用途,其包括施用有效量的IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
I.定义
在详细描述本发明之前,要理解的是,本发明不限于特定的组合物或生物学***,它们当然可以有所变化。还要理解的是,本文中使用的术语仅仅出于描述特定实施方案的目的,并非意图是限制性的。
如本说明书和所附权利要求书中使用的,单数形式“一个”,“一种”和“该”包括复数所指物,除非内容另外清楚指明。如此,例如,提及“一个/种分子”任选包括两个/种或更多个/种此类分子的组合,诸如此类。
如本文中使用的,术语“第一”,“第二”,“第三”等就抗原结合域等而言用于在有超过一个每类域时方便区分。除非明确如此陈述,这些术语的使用并非意图赋予具体的次序或取向。
如本文中使用的,术语“约”指本技术领域的技术人员容易知道的相应数值的常规误差范围。本文中提到“约”数值或参数包括(且描述)涉及该数值或参数本身的实施方案。
理解的是,本文中描述的发明的各个方面和实施方案包括“包含”,“由……组成”,和“基本上由……组成”的方面和实施方案。
术语“PD-1轴结合拮抗剂”指如下的分子,其抑制PD-1轴结合配偶与一种或多种它的结合配偶相互作用,从而去除源自PD-1信号传导轴上的信号传导的T细胞功能障碍--一项结果是恢复或增强T细胞功能(例如增殖,细胞因子生成,靶细胞杀伤)。如本文中使用的,PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂,PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。“人”PD-1轴结合拮抗剂指对人PD-1信号传导轴具有上述效果的PD-1轴结合拮抗剂。
术语“PD-1结合拮抗剂”指如下的分子,其降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-L1,PD-L2)相互作用的信号转导。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1对一种或多种它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂抑制PD-1对PD-L1和/或PD-L2的结合。例如,PD-1结合拮抗剂包括降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-1与PD-L1和/或PD-L2相互作用的信号转导的抗PD-1抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,寡肽和其它分子。在一个实施方案中,PD-1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-1介导信号传导),从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中,PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体。在一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述MDX-1106(纳武单抗)。在另一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述MK-3475(派姆单抗)。在另一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述CT-011(匹迪单抗)。在另一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述MEDI-0680(AMP-514)。在另一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述PDR001。在另一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述REGN2810。在另一个具体的方面,PD-1结合拮抗剂是本文所述BGB-108。
术语“PD-L1结合拮抗剂”指如下的分子,其降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1,B7-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1和/或B7-1的结合。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂包括降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L1与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1,B7-1)相互作用的信号转导的抗PD-L1抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,寡肽和其它分子。在一个实施方案中,PD-L1结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L1介导信号传导),从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述YW243.55.S70。在另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述MDX-1105。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述MPDL3280A(阿特珠单抗)。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述MDX-1105。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述YW243.55.S70。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述MEDI4736(度伐单抗)。在仍有另一个具体的方面,抗PD-L1抗体是本文所述MSB0010718C(阿维单抗)。
术语“PD-L2结合拮抗剂”指如下的分子,其降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导。在一些实施方案中,PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2对一种或多种它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-L2结合拮抗剂抑制PD-L2对PD-1的结合。在一些实施方案中,PD-L2拮抗剂包括降低,阻断,抑制,消除或干扰源自PD-L2与一种或多种它的结合配偶(诸如PD-1)相互作用的信号转导的抗PD-L2抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,寡肽和其它分子。在一个实施方案中,PD-L2结合拮抗剂降低由或经由T淋巴细胞上表达的细胞表面蛋白质介导的负面共刺激信号(经由PD-L2介导信号传导),从而使得功能障碍性T细胞不太功能障碍性(例如增强对抗原识别的效应器应答)。在一些实施方案中,PD-L2结合拮抗剂是免疫粘附素。
术语“功能障碍”在免疫功能障碍的背景中指降低的对抗原性刺激的免疫响应性的状态。该术语包括可以发生抗原识别,但是随后的免疫应答对于控制感染或肿瘤生长无效的耗竭和/或无反应性二者的共同要件。
如本文中使用的,术语“功能障碍性”还包括对抗原识别的不感受或不响应,具体地,将抗原识别转化成下游T细胞效应器功能,诸如增殖,细胞因子生成(例如IL-2)和/或靶细胞杀伤的能力受损。
术语“无反应性”指源自经由T细胞受体投递的不完全或不充分信号(例如ras激活缺失下细胞内Ca+2的升高)的对抗原刺激的无响应性状态。T细胞无反应性也可以在共刺激缺失下在用抗原刺激后发生,导致细胞变成即使在共刺激的背景中也对随后抗原所致激活变得不感受。无响应性状态常常可以被白介素-2的存在制服。无反应性T细胞不经历克隆扩充和/或获得效应器功能。
术语“耗竭”指作为源自在许多慢性感染和癌症期间发生的持续TCR信号传导的T细胞功能障碍状态的T细胞耗竭。它与无反应性的区别在于它并非经由不完全或有缺陷的信号传导,而是由于持续信号传导而发生。它以较差的效应器功能,持续的抑制性受体表达和与功能性效应或记忆T细胞的转录状态不同的转录状态限定。耗竭阻止对感染和肿瘤的最佳控制。耗竭可以源自外在负调节途径(例如免疫调节性细胞因子)及细胞内在负调节(共刺激)途径(PD-1,B7-H3,B7-H4,等)二者。
“增强T细胞功能”意味着诱导,引起或刺激T细胞具有持续或放大的生物学功能,或者更新或再激活耗竭的或无活性的T细胞。增强T细胞功能的例子包括:相对于干预前的此类水平,升高的来自CD8+T细胞的γ-干扰素分泌,升高的增殖,升高的抗原响应性(例如病毒,病原体,或肿瘤清除)。在一个实施方案中,增强的水平是至少50％,或者60％,70％,80％,90％,100％,120％,150％,200％。本领域普通技术人员知道测量此增强的方式。
“T细胞功能障碍性病症”是以降低的对抗原性刺激的响应性为特征的T细胞病症或状况。在一个特定的实施方案中,T细胞功能障碍性病症是明确与不适当的升高的经由PD-1的信号传导有关的病症。在另一个实施方案中,T细胞功能障碍性病症是如下的病症,其中T细胞是无反应性的或具有降低的分泌细胞因子,增殖,或执行溶胞活性的能力。在一个具体的方面,降低的响应性导致对表达免疫原的病原体或肿瘤的无效控制。以T细胞功能障碍为特征的T细胞功能障碍性病症的例子包括未分辨的急性感染,慢性感染和肿瘤免疫。
“肿瘤免疫”指肿瘤逃避免疫识别和清除的过程。如此,作为一种治疗概念,当此类逃避削弱,而且肿瘤受到免疫***识别和攻击时,肿瘤免疫得到“治疗”。肿瘤识别的例子包括肿瘤结合,肿瘤收缩和肿瘤清除。
“免疫原性”指特定物质引发免疫应答的能力。肿瘤是免疫原性的,而且增强肿瘤免疫原性有助于通过免疫应答来清除肿瘤细胞。增强肿瘤免疫原性的例子包括用IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂处理。
“持续应答”指在停止治疗后对降低肿瘤生长的持续影响。例如,与施用阶段开始时的大小相比,肿瘤大小可以保持为相同或更小。在一些实施方案中,持续应答具有与治疗持续时间至少相同的持续时间,治疗持续时间的至少1.5倍,2.0倍,2.5倍,或3.0倍长度。
术语“药物组合物”指如下的制备物,其处于允许活性组分的生物学活性有效的形式,且不含另外的对会接受配制剂施用的受试者有不可接受的毒性的成分。优选地,此类组合物是无菌的。
“药学可接受载剂”指药学组合物中活性成分以外对受试者无毒的成分。药学可接受载剂包括但不限于缓冲剂,赋形剂,稳定剂或防腐剂。
如本文中使用的,术语“治疗/处理”指设计用于改变临床病理学过程期间所治疗/处理个体或细胞的自然进程的临床干预。治疗/处理的期望效果包括降低疾病进展速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。例如,若一种或多种与癌症有关的症状得到减轻或消除,包括但不限于降低癌性细胞的增殖(或破坏癌性细胞),减少/减轻源自疾病的症状,提高罹患疾病的那些的生活质量,降低治疗疾病需要的其它药物的剂量,和/或延长个体的存活,则个体得到成功“治疗”。
如本文中使用的,“延迟疾病进展”意味着推迟,阻碍,减缓,延迟,稳定,和/或延缓疾病(诸如癌症)的发生。根据疾病的历史和/或所治疗的个体,此延迟可以是不同时间长度的。如对于本领域技术人员明显的是,充分或显著的延迟实质上可以涵盖预防,因为个体不发生疾病。例如,可以延迟晚期阶段癌症,诸如转移的发生。
“有效量”至少是实现特定病症的可测量改善或预防需要的最小量。本文中的有效量可以随诸如患者的疾病状态,年龄,性别,和重量,及抗体在个体中引发期望的应答的能力等因素而变化。有效量也是治疗有益效果超过治疗的任何有毒或有害效果的量。为了预防性使用,有益或期望的结果包括如下的结果,诸如消除或降低风险,减轻严重性,或延迟疾病发作,包括疾病的生物化学,组织学和/或行为症状,其并发症和疾病发生期间呈现的中间病理学表型。为了治疗性使用,有益或期望的结果包括如下的临床结果,诸如减少/减轻源自疾病的一种或多种症状,提高罹患疾病的那些的生活质量,降低治疗疾病需要的其它药物的剂量,增强另一种药物的效果(诸如经由靶向),延迟疾病进展,和/或延长存活。在癌症或肿瘤的情况中,有效量的药物在减少癌细胞的数目；降低肿瘤大小；抑制(即在一定程度上减缓或期望停止)癌细胞浸润入外周器官中；抑制(即在一定程度上减缓且期望停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻一种或多种与病症有关的症状中可以具有效果。可以在一次或多次施用中施用有效量。出于本发明的目的,药物,化合物,或药物组合物的有效量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如在临床背景中理解的,药物,化合物,或药物组合物的有效量可以与或不与另一种药物,化合物,或药物组合物一起实现。如此,可以在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效量”,并且若与一种或多种其它药剂一起,可以实现期望的结果或者实现了期望的结果,则可以认为单一药剂是以有效量给予的。
如本文中使用的,“与……联合/组合/一起”指在一种治疗形态以外还施用另一种治疗形态。因而,“与……联合/组合/一起”指在对个体施用一种治疗形态之前,期间,或之后施用另一种治疗形态。
“病症”是会受益于治疗的任何状况,包括但不限于慢性和急性病症或疾病,包括那些使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中,细胞增殖性病症是癌症。在一个实施方案中,细胞增殖性病症是肿瘤。
如本文中使用的,“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖,无论是恶性的还是良性的,及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”,“癌性”,“细胞增殖性病症”,“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理学状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,和白血病或淋巴样恶性。此类癌症的更具体例子包括但不限于鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌),肺癌(包括小细胞肺癌,非小细胞肺癌,肺的腺癌和肺的鳞癌),腹膜癌,肝细胞癌,胃的癌或胃癌(包括胃肠癌和胃肠基质癌),胰腺癌,成胶质细胞瘤,***,卵巢癌,肝癌,膀胱癌,尿道癌,肝瘤,乳腺癌,结肠癌,直肠癌,结肠直肠癌,子宫内膜癌或子宫癌,唾液腺癌,肾癌或肾的癌,***癌,外阴癌,甲状腺癌,肝的癌,***癌,***癌,黑素瘤,浅表扩散性黑素瘤,恶性雀斑样痣黑素瘤,肢端黑素瘤,结节性黑素瘤,多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL),小淋巴细胞性(SL)NHL,中级/滤泡性NHL,中级弥漫性NHL,高级成免疫细胞性NHL,高级成淋巴细胞性NHL,高级小无核裂细胞性NHL,贮积病(bulkydisease)NHL,套细胞淋巴瘤,AIDS相关淋巴瘤,和瓦尔登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),急性成淋巴细胞性白血病(ALL),毛细胞性白血病,慢性成髓细胞性白血病,和移植后淋巴增殖性病症(PTLD),以及与瘢痣病(phakomatoses),水肿(诸如与脑瘤有关的),梅格斯(Meigs)氏综合征有关的异常血管增殖,脑,以及头和颈癌,及相关转移。在某些实施方案中,适合于通过本发明的抗体来治疗的癌症包括乳腺癌,结肠直肠癌,直肠癌,非小细胞肺癌,成胶质细胞瘤,非何杰金氏淋巴瘤(NHL),肾细胞癌,***癌,肝癌,胰腺癌,软组织肉瘤,卡波西(Kaposi)氏肉瘤,类癌癌(carcinoid carcinoma),头和颈癌,卵巢癌,间皮瘤,和多发性骨髓瘤。在一些实施方案中,癌症选自:小细胞肺癌,成胶质细胞瘤,成神经细胞瘤,黑素瘤,乳腺癌,胃癌,结肠直肠癌(CRC),和肝细胞癌。还有,在一些实施方案中,癌症选自:非小细胞肺癌,结肠直肠癌,成胶质细胞瘤和乳腺癌,包括那些癌症的转移性形式。在一些实施方案中,癌症是CEA阳性癌症。
如本文中使用的,术语“细胞毒剂”指任何对细胞有害(例如引起细胞死亡,抑制增殖,或以其它方式阻碍细胞功能)的药剂。细胞毒剂包括但不限于放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素)；化疗剂；生长抑制剂；酶及其片段,诸如溶核酶；和毒素,诸如小分子毒素或细菌,真菌,植物或动物起源的酶活性毒素,包括其片段和/或变体。例示性的细胞毒剂可选自抗微管剂,铂配位复合物,烷化剂,抗生剂,拓扑异构酶II抑制剂,抗代谢物,拓扑异构酶I抑制剂,激素和激素类似物,信号转导途径抑制剂,非受体酪氨酸激酶血管发生抑制剂,免疫治疗剂,促凋亡剂,LDH-A的抑制剂,脂肪酸生物合成的抑制剂,细胞周期信号传导抑制剂,HDAC抑制剂,蛋白酶体抑制剂,和癌代谢的抑制剂。在一个实施方案中,细胞毒剂是紫杉烷。在一个实施方案中,紫杉烷是帕利他赛(paclitaxel)或多西他赛(docetaxel)。在一个实施方案中,细胞毒剂是铂剂。在一个实施方案中,细胞毒剂是EGFR的拮抗剂。在一个实施方案中,EGFR的拮抗剂是N-(3-乙炔基苯基)-6,7-二(2-甲氧基乙氧基)喹唑啉-4-胺(例如厄洛替尼(erlotinib))。在一个实施方案中,细胞毒剂是RAF抑制剂。在一个实施方案中,RAF抑制剂是BRAF和/或CRAF抑制剂。在一个实施方案中,RAF抑制剂是维罗非尼(vemurafenib)。在一个实施方案中,细胞毒剂是PI3K抑制剂。
“化疗剂”包括在治疗癌症中有用的化合物。化疗剂的例子包括厄洛替尼(erlotinib)(Genentech/OSI Pharm.),硼替佐米(bortezomib)(Millennium Pharm.),双硫仑(disulfiram),没食子酸表没食子儿茶精(epigallocatechin gallate),salinosporamide A,carfilzomib,17-AAG(格尔德霉素(geldanamycin)),根赤壳菌素(radicicol),乳酸脱氢酶A(LDH-A),氟维司群(fulvestrant)(AstraZeneca),舒尼替尼(sunitib)(Pfizer/Sugen),来曲唑(letrozole)(Novartis),甲磺酸伊马替尼(imatinibmesylate)(Novartis),finasunate(Novartis),奥沙利铂(oxaliplatin)(Sanofi),5-FU(5-氟尿嘧啶),甲酰四氢叶酸(leucovorin),雷帕霉素(Rapamycin)(西罗莫司(Sirolimus),Wyeth),拉帕替尼(Lapatinib)(GSK572016,Glaxo Smith Kline),Lonafamib(SCH66336),索拉非尼(sorafenib)(Bayer Labs),吉非替尼(gefitinib)(AstraZeneca),AG1478,烷化剂类(alkylating agents),诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkylsulfonates),诸如白消安(busulfan),英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines),诸如苯佐替派(benzodopa),卡波醌(carboquone),美妥替派(meturedopa),和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺(altretamine),三乙撑蜜胺(triethylenemelamine),三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide),三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(camptothecin)(包括托泊替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin),卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；肾上腺皮质类固醇类(adrenocorticosteroids),包括***(prednisone)和***龙(prednisolone)；醋酸环丙孕酮(cyproterone acetate)；5α-还原酶,包括非那雄胺(finasteride)和度他雄胺(dutasteride)；vorinostat,romidepsin,panobinostat,丙戊酸(valproic acid),mocetinostat多拉司他汀(dolastatin)；阿地白介素(aldesleukin),滑石(talc)duocarmycin(包括合成类似物,KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards),诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil),萘氮芥(chlomaphazine),胆磷酰胺(chlorophosphamide),雌莫司汀(estramustine),异环磷酰胺(ifosfamide),双氯乙基甲胺(mechlorethamine),盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride),美法仑(melphalan),新氮芥(novembichin),苯芥胆甾醇(phenesterine),泼尼莫司汀(prednimustine),曲磷胺(trofosfamide),尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas),诸如卡莫司汀(carmustine),氯脲菌素(chlorozotocin),福莫司汀(fotemustine),洛莫司汀(lomustine),尼莫司汀(nimustine),和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类,诸如烯二炔类抗生素(例如加利车霉素(calicheamicin),尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ω1I(Angew Chem.Intl.Ed.Engl.1994,33:183-186)；蒽环类抗生素(dynemicin),包括dynemicin A；二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团),阿克拉霉素(aclacinomysins),放线菌素(actinomycin),氨茴霉素(authramycin),偶氮丝氨酸(azaserine),博来霉素(bleomycin),放线菌素C(cactinomycin),carabicin,洋红霉素(caminomycin),嗜癌霉素(carzinophilin),色霉素(chromomycinis),放线菌素D(dactinomycin),柔红霉素(daunorubicin),地托比星(detorubicin),6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸,(多柔比星(doxorubicin)),吗啉代多柔比星,氰基吗啉代多柔比星,2-吡咯代多柔比星和脱氧多柔比星),表柔比星(epirubicin),依索比星(esorubicin),伊达比星(idarubicin),麻西罗霉素(marcellomycin),丝裂霉素(mitomycin)诸如丝裂霉素C,霉酚酸(mycophenolic acid),诺拉霉素(nogalamycin),橄榄霉素(olivomycin),培洛霉素(peplomycin),泊非霉素(porfiromycin),嘌呤霉素(puromycin),三铁阿霉素(quelamycin),罗多比星(rodorubicin),链黑菌素(streptonigrin),链佐星(streptozocin),杀结核菌素(tubercidin),乌苯美司(ubenimex),净司他丁(zinostatin),佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类,诸如甲氨蝶呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物,诸如二甲叶酸(denopterin),甲氨蝶呤,蝶酰三谷氨酸(pteropterin),三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物,诸如氟达拉滨(fludarabine),6-巯基嘌呤(mercaptopurine),硫咪嘌呤(thiamiprine),硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物,诸如安西他滨(ancitabine),阿扎胞苷(azacitidine),6-氮尿苷,卡莫氟(carmofur),阿糖胞苷(cytarabine),双脱氧尿苷(dideoxyuridine),去氧氟尿苷(doxifluridine),依诺他滨(enocitabine),氟尿苷(floxuridine)；雄激素类,诸如卡鲁睾酮(calusterone),丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate),表硫雄醇(epitiostanol),美雄烷(mepitiostane),睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类,诸如氨鲁米特(aminoglutethimide),米托坦(mitotane),曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂,诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfomithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids),诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamnol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物(JHS Natural Products,Eugene,Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofuran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2”-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素,疣孢菌素(verracurin)A,杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；环磷酰胺(cyclophosphamide)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids),例如泰素(TAXOL)(帕利他塞(paclitaxel)；Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.),(无克列莫佛(Cremophor)的),帕利他塞的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(American Pharmaceutical Partners,Schaumberg,Ill.)和泰索帝(多西他塞(docetaxel,doxetaxel)；Sanofi-Aventis)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；(吉西他滨(gemcitabine))；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物,诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)；(长春瑞滨(vinorelbine))；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；卡培他滨(capecitabine)伊本膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸(retinoids),诸如视黄酸(retinoic acid)；及上述任一的药学可接受盐,酸和衍生物。
化疗剂还包括(i)起调节或抑制激素对肿瘤作用的作用的抗激素剂,诸如抗***类和选择性***受体调控物类(SERM),包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括柠檬酸他莫昔芬),雷洛昔芬(raloxifene),屈洛昔芬(droloxifene),iodoxyfene,4-羟基他莫昔芬,曲沃昔芬(trioxifene),那洛昔芬(keoxifene),LY117018,奥那司酮(onapristone),和(柠檬酸托瑞米芬(toremifine citrate))；(ii)抑制在肾上腺中调节***生成的酶芳香酶的芳香酶抑制剂,诸如例如4(5)-咪唑,氨鲁米特(aminoglutethimide),(醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)),(依西美坦(exemestane)；Pfizer),福美坦(formestanie),法倔唑(fadrozole),(伏罗唑(vorozole)),(来曲唑(letrozole)；Novartis),和(阿那曲唑(anastrozole)；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素类,诸如氟他米特(flutamide),尼鲁米特(nilutamide),比卡米特(bicalutamide),亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；布舍瑞林(buserelin),曲普瑞林(tripterelin),醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate),己烯雌酚(diethylstilbestrol),倍美力(premarin),氟***(fluoxymesterone),全反式视黄酸,芬维A胺(fenretinide),以及曲沙他滨(troxacitabine)(1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白质激酶抑制剂；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸,特别是抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的那些,诸如例如PKC-α,Ralf和H-Ras；(vii)核酶,诸如VEGF表达抑制剂(例如)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗,诸如基因疗法疫苗,例如 和拓扑异构酶1抑制剂,诸如 rmRH；和(ix)及上述任一的药学可接受盐,酸和衍生物。
化疗剂还包括抗体,诸如阿仑珠单抗(alemtuzumab)(Campath),贝伐珠单抗(bevacizumab)(Genentech)；西妥昔单抗(cetuximab)(Imclone)；帕尼单抗(panitumumab)(Amgen),利妥昔单抗(rituximab)(Genentech/Biogen Idec),帕妥珠单抗(pertuzumab)(2C4,Genentech),曲妥珠单抗(trastuzumab)(Genentech),托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar,Corixia),和抗体药物缀合物,吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumabozogamicin)(Wyeth)。具有作为与本发明化合物组合的药剂的治疗潜力的另外的人源化单克隆抗体包括:阿泊珠单抗(apolizumab),阿塞珠单抗(aselizumab),atlizumab,巴匹珠单抗(bapineuzumab),bivatuzumab mertansine,莫坎妥珠单抗(cantuzumab mertansine),西利珠单抗(cedelizumab),培舍珠单抗(certolizumabpegol),cidfusituzumab,cidtuzumab,达克珠单抗(daclizumab),依库珠单抗(eculizumab),依法珠单抗(efalizumab),依帕珠单抗(epratuzumab),厄利珠单抗(erlizumab),非维珠单抗(felvizumab),芳妥珠单抗(fontolizumab),吉妥珠单抗奥佐米星(gemtuzumab ozogamicin),英妥珠单抗奥佐米星(inotuzumab ozogamicin),伊匹木单抗(ipilimumab),拉贝珠单抗(labetuzumab),林妥珠单抗(lintuzumab),马妥珠单抗(matuzumab),美泊利单抗(mepolizumab),莫维珠单抗(motavizumab),motovizumab,那他珠单抗(natalizumab),尼妥珠单抗(nimotuzumab),nolovizumab,numavizumab,ocrelizumab,奥马珠单抗(omalizumab),帕利珠单抗(palivizumab),帕考珠单抗(pascolizumab),pecfusituzumab,pectuzumab,培克珠单抗(pexelizumab),ralivizumab,雷珠单抗(ranibizumab),reslivizumab,瑞利珠单抗(reslizumab),resyvizumab,罗维珠单抗(rovelizumab),卢利珠单抗(ruplizumab),西罗珠单抗(sibrotuzumab),西利珠单抗(siplizumab),索土珠单抗(sontuzumab),tacatuzumab tetraxetan,tadocizumab,他利珠单抗(talizumab),特非珠单抗(tefibazumab),托珠单抗(tocilizumab),托利珠单抗(toralizumab),tucotuzumab西莫白介素(celmoleukin),tucusituzumab,umavizumab,乌珠单抗(urtoxazumab),优特克单抗(ustekinumab),维西珠单抗(visilizumab),和抗白介素-12(ABT-874/J695,Wyeth Research and Abbott Laboratories),其为经遗传修饰以识别白介素-12p40蛋白的重组唯独人序列,全长IgG1λ抗体。
化疗剂还包括“EGFR抑制剂”,其指结合EGFR或以其它方式直接与EGFR相互作用并阻止或降低其信号传导活性的化合物,而且还称作“EGFR拮抗剂”。此类药剂的例子包括结合EGFR的抗体和小分子。结合EGFR的抗体的例子包括MAb 579(ATCC CRL HB 8506),MAb455(ATCC CRL HB 8507),MAb 225(ATCC CRL 8508),MAb 528(ATCC CRL 8509)(参见美国专利No.4,943,533,Mendelsohn等人)及其变体,诸如嵌合化225(C225或西妥昔单抗；)和重构人225(H225)(参见WO96/40210,Imclone Systems Inc.)；IMC-11F8,一种完全人的EGFR靶向性抗体(Imclone)；结合II型突变体EGFR的抗体(美国专利No.5,212,290)；结合EGFR的人源化和嵌合抗体,如美国专利No.5,891,996中描述的；和结合EGFR的人抗体,诸如ABX-EGF或帕尼单抗(Panitumumab)(参见WO98/50433,Abgenix/Amgen)；EMD55900(Stragliotto et al.,Eur.J.Cancer 32A:636-640(1996))；EMD7200(matuzumab),一种与EGF和TGF-α二者竞争EGFR结合的针对EGFR的人源化EGFR抗体(EMD/Merck)；人EGFR抗体,HuMax-EGFR(GenMab)；称作E1.1,E2.4,E2.5,E6.2,E6.4,E2.11,E6.3和E7.6.3且在US6,235,883中描述的完全人抗体；MDX-447(Medarex Inc)；和mAb 806或人源化mAb 806(Johns et al.,J.Biol.Chem.279(29):30375-30384(2004))。抗EGFR抗体可与细胞毒剂缀合,如此生成免疫缀合物(参见例如EP 659,439 A2,Merck Patent GmbH)。EGFR拮抗剂包括小分子,诸如美国专利No.5,616,582,5,457,105,5,475,001,5,654,307,5,679,683,6,084,095,6,265,410,6,455,534,6,521,620,6,596,726,6,713,484,5,770,599,6,140,332,5,866,572,6,399,602,6,344,459,6,602,863,6,391,874,6,344,455,5,760,041,6,002,008,和5,747,498,以及PCT公开文本WO98/14451,WO98/50038,WO99/09016,和WO99/24037中描述的化合物。具体的小分子EGFR拮抗剂包括OSI-774(CP-358774,厄洛替尼(erlotinib),Genentech/OSI Pharmaceuticals)；PD 183805(CI 1033,2-丙烯酰胺,N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7-[3-(4-吗啉基)丙氧基]-6-喹唑啉基]-,二氢氯化物,Pfizer Inc.)；ZD1839,吉非替尼(gefitinib)4-(3’-氯-4’-氟苯胺基)-7-甲氧基-6-(3-吗啉代丙氧基)喹唑啉,AstraZeneca)；ZM 105180((6-氨基-4-(3-甲基苯基-氨基)-喹唑啉,Zeneca)；BIBX-1382(N8-(3-氯-4-氟-苯基)-N2-(1-甲基-哌啶-4-基)-嘧啶并[5,4-d]嘧啶-2,8-二胺,Boehringer Ingelheim)；PKI-166((R)-4-[4-[(1-苯基乙基)氨基]-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚)；(R)-6-(4-羟基苯基)-4-[(1-苯基乙基)氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶)；CL-387785(N-[4-[(3-溴苯基)氨基]-6-喹唑啉基]-2-丁炔酰胺)；EKB-569(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-3-氰基-7-乙氧基-6-喹啉基]-4-(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(Wyeth)；AG1478(Pfizer)；AG1571(SU 5271；Pfizer)；双重EGFR/HER2酪氨酸激酶抑制剂,诸如拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016或N-[3-氯4-[(3氟苯基)甲氧基]苯基]-6[5[[[2甲基磺酰基)乙基]氨基]甲基]-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺)。
化疗剂还包括“酪氨酸激酶抑制剂”,包括前一段中提到的EGFR靶向药物；小分子HER2酪氨酸激酶抑制剂,诸如可从Takeda获得的TAK165；CP-724,714,一种口服ErbB2受体酪氨酸激酶选择性抑制剂(Pfizer和OSI)；双重HER抑制剂,诸如优先结合EGFR但抑制HER2和EGFR过表达性细胞二者的EKB-569(可从Wyeth获得)；拉帕替尼(lapatinib)(GSK572016；可从Glaxo-SmithKline获得),一种口服HER2和EGFR酪氨酸激酶抑制剂；PKI-166(可从Novartis获得)；泛HER抑制剂,诸如卡奈替尼(canertinib)(CI-1033；Pharmacia)；Raf-1抑制剂,诸如可从ISIS Pharmaceutica1s获得的,抑制Raf-1信号传导的反义药剂ISIS-5132；非HER靶向性TK抑制剂,诸如甲磺酸伊马替尼(可从Glaxo SmithKline获得)；多靶向性酪氨酸激酶抑制剂,诸如舒尼替尼(sunitinib)(可从Pfizer获得)；VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂,诸如瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787/ZK222584,可从Novartis/Schering AG获得)；MAPK细胞外调节激酶I抑制剂CI-1040(可从Pharmacia获得)；喹唑啉类,诸如PD 153035,4-(3-氯苯胺基)喹唑啉；吡啶并嘧啶类；嘧啶并嘧啶类；吡咯并嘧啶类,诸如CGP 59326,CGP 60261和CGP 62706；吡唑并嘧啶类,4-(苯基氨基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶类；姜黄素(二阿魏酰甲烷,4,5-双(4-氟苯胺基)-酞酰亚胺)；含有硝基噻吩模块的tyrphostine类；PD-0183805(Warner-Lamber)；反义分子(例如与编码HER的核酸结合的那些)；喹喔啉类(美国专利No.5,804,396)；tryphostin类(美国专利No.5,804,396)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；泛HER抑制剂,诸如CI-1033(Pfizer)；Affinitac(ISIS 3521；Isis/Lilly)；甲磺酸伊马替尼PKI166(Novartis)；GW2016(Glaxo SmithKline)；CI-1033(Pfizer)；EKB-569(Wyeth)；Semaxinib(Pfizer)；ZD6474(AstraZeneca)；PTK-787(Novartis/Schering AG)；INC-1C11(Imclone),雷帕霉素(西罗莫司,)；或如任何下述专利公开文本中描述的:美国专利No.5,804,396；WO1999/09016(American Cyanamid)；WO1998/43960(AmericanCyanamid)；WO1997/38983(Warner Lambert)；WO1999/06378(Warner Lambert)；WO1999/06396(Warner Lambert)；WO1996/30347(Pfizer,Inc)；WO1996/33978(Zeneca)；WO1996/3397(Zeneca)和WO1996/33980(Zeneca)。
化疗剂还包括***(dexamethasone),干扰素,秋水仙素(colchicine),氯苯氨啶(metoprine),环孢霉素(cyclosporine),两性霉素(amphotericin),甲硝唑(metronidazole),阿仑单抗(alemtuzumab),阿利维A酸(alitretinoin),别嘌醇(allopurinol),氨磷汀(amifostine),三氧化二砷(arsenic trioxide),天冬酰胺酶(asparaginase),活的BCG,贝伐珠单抗(bevacuzimab),贝沙罗汀(bexarotene),克拉屈滨(cladribine),里本灵(clofarabine),darbepoetin alfa,地尼白介素(denileukin),右雷佐生(dexrazoxane),阿法依伯汀(epoetin alfa),厄洛替尼(elotinib),非格司亭(filgrastim),醋酸组氨瑞林(histrelin acetate),ibritumomab,干扰素α-2a,干扰素α-2b,来那度胺(lenalidomide),左旋咪唑(levamisole),美司钠(mesna),甲氧沙林(methoxsalen),诺龙(nandrolone),奈拉滨(nelarabine),诺非单抗(nofetumomab),奥普瑞白介素(oprelvekin),palifermin,帕米膦酸盐(pamidronate),培加酶(pegademase),培门冬酶(pegaspargase),PEG非格司亭(pegfilgrastim),培美曲塞二钠(pemetrexeddisodium),普卡霉素(plicamycin),卟吩姆钠(porfimer sodium),喹纳克林(quinacrine),拉布立酶(rasburicase),沙格司亭(sargramostim),替莫唑胺(temozolomide),VM-26,6-TG,托瑞米芬(toremifene),tretinoin,ATRA,戊柔比星(valrubicin),唑来膦酸盐(zoledronate),和唑来膦酸(zoledronic acid),及其药学可接受盐。
化疗剂还包括氢化可的松(hydrocortisone),醋酸氢化可的松(hydrocortisoneacetate),醋酸可的松(cortisone acetate),替可的松匹伐酯(tixocortol pivalate),曲安奈德(triamcinolone acetonide),曲安西龙醇(triamcinolone alcohol),莫米松(mometasone),安西奈德(amcinonide),布***(budesonide),***(desonide),fluocinonide,fluocinolone acetonide,倍他米松(betamethasone),倍他米松磷酸钠(betamethasone sodium phosphate),***(dexamethasone),***磷酸钠(dexamethasone sodium phosphate),氟可龙(fluocortolone),氢化可的松-17-丁酸盐(hydrocortisone-17-butyrate),氢化可的松-17-戊酸盐(hydrocortisone-17-valerate),二丙酸阿氯米松(aclometasone dipropionate),戊酸倍他米松(betamethasone valerate),二丙酸倍他米松(betamethasone dipropionate),泼尼卡酯(prednicarbate),氯倍他松-17-丁酸盐(clobetasone-17-butyrate),氯倍他松-17-丙酸盐(clobetasol-17-propionate),己酸氟考龙(fluocortolone caproate),特戊酸氟考龙(fluocortolone pivalate)和醋酸氟甲叉龙(fluprednidene acetate)；免疫选择性抗炎肽(ImSAID),诸如苯丙氨酸-谷氨酰胺-甘氨酸(FEG)及其D-异构体形式(feG)(IMULANBioTherapeutics,LLC)；抗风湿药物,诸如硫唑嘌呤(azathioprine),环孢素(ciclosporin)(环孢霉素(cyclosporine)A),D-青霉胺,金盐,羟氯喹,来氟米特(leflunomide)米诺环素(minocycline),柳氮磺吡啶(sulfasalazine),肿瘤坏死因子α(TNFα)阻断剂,诸如依那西普(etanercept)(Enbrel),英夫利昔单抗(infliximab)(Remicade),阿达木单抗(adalimumab)(Humira),certolizumab pegol(Cimzia),golimumab(Simponi),白介素1(IL-1)阻断剂,诸如阿那白滞素(anakinra)(Kineret),T细胞共刺激阻断剂,诸如abatacept(Orencia),白介素6(IL-6)阻断剂,诸如tocilizumab白介素13(IL-13)阻断剂,诸如lebrikizumab；干扰素α(IFN)阻断剂,诸如Rontalizumab；β7整联蛋白阻断剂,诸如rhuMAb Beta7；IgE途径阻断剂,诸如抗M1prime；分泌型同三聚LTa3和膜结合型异三聚LTa1/β2阻断剂,诸如抗淋巴毒素α(LTa)；放射性同位素(例如At211,I131,I125,Y90,Re186,Re188,Sm153,Bi212,P32,Pb212和Lu的放射性同位素)；混杂调查性药剂,诸如thioplatin,PS-341,丁酸苯酯,ET-18-OCH3,或法尼基转移酶抑制剂(L-739749,L-744832)；多酚,诸如槲皮素(quercetin),白藜芦醇(resveratrol),piceatannol,没食子酸表没食子儿茶精(epigallocatechine gallate),茶黄素(theaflavin),黄烷醇(flavanol),原花青素(procyanidin),白桦脂酸(betulinic acid)及其衍生物；自噬抑制剂,诸如氯喹；δ-9-四氢***酚(tetrahydrocannabinol)(屈***酚(dronabinol),)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicine)；白桦脂酸(betulinic acid)；乙酰喜树碱,东莨菪亭(scopolectin),和9-氨基喜树碱)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；替加氟(tegafur)贝沙罗汀(bexarotene)二膦酸盐类(bisphosphonates),诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如或),依替膦酸盐(etidronate)NE-58095,唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)阿伦膦酸盐(alendronate)帕米膦酸盐(pamidronate)替鲁膦酸盐(tiludronate)或利塞膦酸盐(risedronate)和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗,诸如疫苗；哌立福辛(perifosine),COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)),蛋白体抑制剂(例如PS341)；CCI-779；tipifarnib(R11577)；orafenib,ABT510；Bcl-2抑制剂,诸如oblimersen sodiumpixantrone；法尼基转移酶抑制剂,诸如lonafarnib(SCH 6636,SARASARTM)；及上述任一的药学可接受盐,酸或衍生物；以及上述两项或更多项的组合,诸如CHOP(环磷酰胺,多柔比星,长春新碱,和***龙的组合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU和亚叶酸组合的治疗方案的缩写)。
化疗剂还包括具有止痛,退热和消炎效果的非类固醇消炎药。NSAID包括酶环氧合酶的非选择性抑制剂。NSAID的具体例子包括阿司匹林(aspirin),丙酸衍生物诸如布洛芬(ibuprofen),非诺洛芬(fenoprofen),酮洛芬(ketoprofen),氟比洛芬(flurbiprofen),奥沙普秦(oxaprozin)和荼普生(naproxen),乙酸衍生物诸如吲哚美辛(indomethacin),舒林酸(sulindac),依托度酸(etodolac),双氯芬酸(diclofenac),烯醇酸衍生物诸如吡罗昔康(piroxicam),美洛昔康(meloxicam),替诺昔康(tenoxicam),屈恶昔康(droxicam),氯诺昔康(lornoxicam)和伊索昔康(isoxicam),灭酸衍生物诸如甲灭酸(mefenamic acid),甲氯芬那酸(meclofenamic acid),氟芬那酸(flufenamic acid),托芬那酸(tolfenamicacid),和COX-2抑制剂诸如塞来考昔(celecoxib),依托考昔(etoricoxib),罗美考昔(lumiracoxib),帕瑞考昔(parecoxib),罗非考昔(rofecoxib),罗非昔布(rofecoxib),和伐地考昔(valdecoxib)。NSAID可指示用于诸如类风湿性关节炎,骨关节炎,炎性关节病,强直性脊柱炎,银屑病关节炎,莱特尔(Reiter)氏综合征,急性痛风,痛经,骨转移疼痛,头痛和偏头痛,手术后疼痛,炎症和组织损伤所致轻度至中度疼痛,发热,肠梗阻,和肾绞痛等状况的症状缓解。
“放射疗法”或“放疗”意指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱导对细胞的足够损伤,以限制其正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。会领会的是,会有本领域知道的许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予,而典型的剂量范围为每天10至200个单位(戈瑞(Gray))。
出于治疗的目的,“受试者”或“个体”指归为哺乳动物的任何动物,包括人,家畜和牲畜,及动物园,运动,或宠物动物,诸如犬,马,猫,牛,等。优选地,哺乳动物为人。个体或受试者可以是患者。
本文中的术语“抗体”以最广义使用,而且明确涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体),多克隆抗体,多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的生物学活性。
“分离的”抗体指已经与其天然环境的组分分开,即并不处于它的天然环境中的抗体。不需要特定水平的纯化。例如,分离的抗体可以从其天然或自然环境中取出。就本发明的目的而言,在宿主细胞中表达的重组生成的抗体被视为分离的,已通过任何合适的技术分开,分级,或部分或基本上纯化的天然的或重组的抗体也是如此。在一些实施方案中,抗体纯化至大于95％或99％的纯度,如通过例如电泳(例如SDS-PAGE,等电聚焦(IEF),毛细管电泳)或层析(例如离子交换或反相HPLC)方法测定的。关于用于评估抗体纯度的方法的综述,见例如Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
“天然抗体”通常是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。每条轻链通过一个共价二硫键连接至重链,而二硫化物连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间有变化。每条重和轻链还具有间隔规律的链内二硫桥。每条重链在一端具有一个可变域(VH),接着是一些恒定域。每条轻链具有一端的一个可变域(VL)及其另一端的一个恒定域；轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐,而轻链可变域与重链的可变域对齐。认为特定的氨基酸残基形成轻链和重链可变域之间的界面。
术语“恒定域”指免疫球蛋白分子中的如下部分,其相对于免疫球蛋白的其它部分(含有抗原结合位点的可变域)具有更加保守的氨基酸序列。恒定域含有重链的CH1,CH2和CH3域(合称CH)及轻链的CL域。
术语“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链中牵涉使抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别为VH和VL)一般具有类似的结构,每个域包含4个保守的框架区(FR)和3个高变区(HVR)。参见例如Kindt等,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freemanand Co.,第91页(2007)。单个VH或VL域可能足以赋予抗原结合特异性。如本文中结合可变区序列使用的,“Kabat编号方式”指由Kabat等,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)提出的编号***。
抗体或免疫球蛋白的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且这些中的数项可进一步分成亚类(同种型),例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,和IgA2。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是公知的且一般性描述于例如Abbaset al.,Cellular and Mol.Immunology,4th ed.(W.B.Saunders,Co.,2000)。
术语“全长抗体”,“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换使用,指基本上完整形式的抗体,而非下文定义的抗体片段。该术语特别指重链包含Fc区的抗体。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分,优选包含其抗原结合区。在一些实施方案中,本文所述抗体片段是抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab,Fab',F(ab')2,和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和自抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个具有一个抗原结合位点,和一个剩余的“Fc”片段,其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')2片段,其具有两个抗原结合位点且仍然能够交联抗原。
“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中,双链Fv种类由紧密,非共价联合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(scFv)种类中,一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价连接,使得轻和重链能以在与双链Fv种类中的类似的“二聚体”结构联合。正是在这种构造中,每个可变域的三个HVR相互作用,在VH-VL二聚体的表面上限定一个抗原结合位点。六个HVR一起赋予抗体以抗原结合特异性。然而,即使是单个可变域(或是只包含对抗原特异性的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力,尽管亲和力比完整结合位点要低。
Fab片段包含重和轻链可变域,而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1域的羧基端添加少数残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')2抗体片段最初是作为具有Fab'片段之间的铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL域,其中这些域存在于一条多肽链中。一般地,scFv多肽进一步包含VH和VL域之间的多肽接头,其使得scFv能够形成抗原结合期望的结构。关于scFv的综述参见例如Plückthun,于《The Pharmacology of MonoclonalAntibodies》,第113卷,Rosenburg和Moore编,Springer-Verlag,New York,1994,第269-315页。
术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的抗体片段,该片段包含同一条多肽链(VH-VL)中连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个域之间不能配对,迫使这些域与另一条链的互补域配对并产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更加完整地描述于例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)；及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三抗体和四抗体也描述于Hudson etal.,Nat.Med.9:129-134(2003)。
如本文中使用的,术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体,即构成群体的各个抗体是相同的和/或结合相同表位,除了例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制备物的生成期间发生的可能的变体抗体外,此类变体一般以极小量存在。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同,单克隆抗体制备物的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。如此,修饰语“单克隆”指示抗体自一群基本上同质的抗体获得的特征,而不应解释为要求通过任何特定方法来生成抗体。例如,可以通过多种技术来生成要依照本发明使用的单克隆抗体,包括但不限于杂交瘤方法,重组DNA方法,噬菌体展示方法,和利用含有所有或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法,本文中描述了用于生成单克隆抗体的此类方法和其它例示性方法。
单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体,其中重和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源,以及此类抗体的片段,只要它们展现期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567；及Morrison etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括抗体,其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。
“人源化”形式的非人(例如鼠)抗体指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中,人源化抗体指如下的人免疫球蛋白(受体抗体),其中来自受体HVR的残基用来自具有期望特异性,亲和力,和/或能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠,大鼠,家兔,或非人灵长动物)HVR的残基替换。在一些情况中,人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。而且,人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。可以进行这些修饰来进一步改进抗体的性能。一般而言,人源化抗体会包含至少一个,通常两个基本上整个如下可变域,其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的那些,而且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选还会包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人免疫球蛋白的。别的细节参见例如Jones etal.,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998)；Harris,Biochem.Soc.Transactions23:1035-1038(1995)；Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。
“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文中公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成,包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991)；Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。Cole et al.,Monoclonal Antibodies and CancerTherapy,Alan R.Liss,p.77(1985)；Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)中描述的方法也可用于制备人单克隆抗体。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)。人抗体可通过对经过修饰以响应抗原性攻击而生成此类抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物,例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584,关于XENOMOUSETM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 103:3557-3562(2006),关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。
如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触”)的每个区。一般地,抗体包含6个HVR；三个在VH中(H1,H2,H3),且三个在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:
(a)高变环,存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)CDR,存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)抗原接触,存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum et al.J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和
(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。
除非另有指示,可变域中的HVR残基和其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等,见上文编号。
“框架”或“FR”指除高变区(HVR)残基外的可变域残基。可变域的FR一般由4个FR域组成:FR1,FR2,FR3和FR4。因而,HVR和FR序列一般以下列次序出现在VH(或VL)中:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“如Kabat中的可变域残基编号方式”或“如Kabat中的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.,见上文中用于抗体编辑的重链可变域或轻链可变域编号***。使用此编号***,实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸,对应于可变域FR或HVR的缩短或***。例如,重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸***(依照Kabat的残基52a)和重链FR残基82后的***残基(例如依照Kabat的残基82a,82b,和82c,等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过在同源区比对抗体的序列与“标准”Kabat编号序列来确定。
Kabat编号***一般在提及可变域中的残基(大约轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.,Sequences of Immunological Interest.5th Ed.PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号***”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.,见上文中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1EU抗体的残基编号方式。
如本文中使用的,术语“结合”,“特异性结合”或“对……特异性的”指可测量且可再现的相互作用,诸如靶物和抗体之间的结合,其确定在分子(包括生物学分子)的异质群体存在下靶物的存在。例如,结合或特异性结合靶物(其可以是表位)的抗体是以比它结合其它靶物要大的亲和力,亲合力,更容易,和/或以更大的持续时间结合此靶物的抗体,即结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。在一个实施方案中,抗体结合无关靶物的程度小于抗体对靶物的结合的约10％,如例如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。在某些实施方案中,特异性结合靶物的抗体具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,或≤0.1nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中,抗体特异性结合蛋白质上在来自不同物种的蛋白质间保守的表位。在另一个实施方案中,特异性结合可以包括但不要求排他性结合。
术语“抗原结合域”指抗体中包含特异性结合部分或整个抗原且与其互补的区域的部分。抗原结合域可以由例如一个或多个抗体可变域(也称作抗体可变区)提供。优选地,抗原结合域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链中含有至少部分恒定区的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然IgG重链的Fc区的边界可以略微变化,但是人IgG重链Fc区通常定义为自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,由宿主细胞生成的抗体可经历翻译后切割,自重链的C端切除一个或多个,特别是一个或两个氨基酸。因此,通过表达编码全长重链的特定核酸分子由宿主细胞生成的抗体可包括全长重链,或者它可包括全长重链的切割变体(在本文中也称为“切割变体重链”)。在重链的最终两个C端氨基酸是甘氨酸(G446)和赖氨酸(K447,编号方式依照Kabat EU索引)的情况中可能就是这种情况。因此,Fc区的C端赖氨酸(Lys447),或C端甘氨酸(Gly446)和赖氨酸(K447)可以存在或不存在。如果没有另外指明的话,包括Fc域(或本文中定义的Fc域的亚基)的重链的氨基酸序列在本文中在没有C端甘氨酸-赖氨酸二肽的情况下表示。在本发明的一个实施方案中,例如,在本发明中有用的免疫缀合物中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)。在本发明的一个实施方案中,例如,在本发明中有用的免疫缀合物中包含的包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链包含另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)。本发明的组合物包含抗体或免疫缀合物的群体。抗体或免疫缀合物的群体可包含具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子。抗体或免疫缀合物的群体可以由具有全长重链的分子和具有切割变体重链的分子的混合物组成,其中至少50％,至少60％,至少70％,至少80％或至少90％的抗体或免疫缀合物具有切割变体重链。在本发明的一个实施方案中,包含抗体或免疫缀合物的群体的组合物包含如下的抗体或免疫缀合物,其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在本发明的一个实施方案中,包含抗体或免疫缀合物的群体的组合物包含如下的抗体或免疫缀合物,其包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链。在一个实施方案中,此类组合物包含由如下分子构成的抗体或免疫缀合物的群体:包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基的重链的分子；包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸残基(G446,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子,和包含包括本文中规定的Fc域的一个亚基及另外的C端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447,编号方式依照Kabat的EU索引)的重链的分子。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号方式依照EU编号***,也称作EU索引,如记载于Kabat等,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991(也参见上文)。如本文中使用的,Fc域的“亚基”指形成二聚体Fc域的两个多肽之一,即包含免疫球蛋白重链中能够稳定自身联合的C端恒定区的多肽。例如,IgG Fc域的亚基包含IgG CH2和IgG CH3恒定域。
“融合”意味着各成分(例如抗体和IL2多肽)通过肽键连接,或是直接地或是经由一个或多个肽接头。
“促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰”是降低或防止包含Fc域亚基的多肽与相同多肽联合以形成同二聚体的肽主链操作或Fc域亚基的翻译后修饰。如本文中使用的,具体地,促进联合的修饰包括对期望联合的两个Fc域亚基(即Fc域的第一亚基和第二亚基)中的每一个进行的分开的修饰,其中所述修饰彼此互补,从而促进两个Fc域亚基的联合。例如,促进联合的修饰可以改变一种或两种Fc域亚基的结构或电荷,从而在立体或静电上分别促进它们的联合。如此,(异)二聚化在包含第一Fc域亚基的多肽和包含第二Fc域亚基的多肽之间发生,其在融合至每个亚基的别的组分(例如抗原结合模块)不同这一意义上讲可能是不相同的。在一些实施方案中,促进联合的修饰包含在Fc域中的氨基酸突变,具体为氨基酸替代。在一个具体的实施方案中,促进联合的修饰包含Fc域的两个亚基的每一个中分开的氨基酸突变,具体为氨基酸替代。
“激活性Fc受体”是在通过抗体的Fc区啮合后引发刺激携带受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。激活性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32),和FcαRI(CD89)。
术语“效应器功能”在提及抗体使用时指那些可归于抗体Fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,和B细胞激活。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)是一种导致通过免疫效应器细胞对抗体包被的靶细胞裂解的免疫机制。靶细胞是包含Fc区的抗体或其衍生物一般经由Fc区的N端的蛋白质部分特异性结合的细胞。如本文中使用的,术语“降低的ADCC”定义为通过上文定义的ADCC机制,以靶细胞周围介质中给定浓度的抗体,在给定的时间内裂解的靶细胞数目的降低,和/或通过ADCC机制,实现给定时间内给定数目的靶细胞裂解需要的靶细胞周围介质中抗体浓度的增加。ADCC的降低相对于使用相同的标准生产,纯化,配制和贮存方法(其是本领域技术人员已知的),由同一类型的宿主细胞生成但尚未工程化改造的相同抗体介导的ADCC。例如,由在其Fc域包含降低ADCC的氨基酸替代的抗体所介导的ADCC中的降低,是相对于由在Fc域中无此氨基酸替代的相同抗体介导的ADCC而言。测量ADCC的合适测定法是本领域中公知的(参见例如PCT公开文本No.WO 2006/082515或PCT公开文本No.WO 2012/130831)。
如本文中使用的,术语“工程化”视为包括对肽主链的任何操作或对天然存在或重组的多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列,糖基化模式或各氨基酸侧链基团的修饰,以及这些办法的组合。
如本文中使用的,术语“免疫缀合物”指包括至少一个IL-2分子和至少一个抗体的多肽分子。如本文中描述的,IL-2分子可以通过多种相互作用及以多种构造连接至抗体。在特定实施方案中,IL-2分子经由肽接头融合至抗体。在本发明中有用的特定免疫缀合物本质上由通过一个或多个接头序列连接的一个IL-2分子和抗体组成。
“降低/减小/减弱”,例如“结合降低”,指相应数量减少,如通过本领域知道的适宜方法测量的。为了清楚,该术语还包括降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除。相反,“升高的/增大的/增多的”指相应数量增多。例如,“降低的结合”指相应相互作用的亲和力降低,如例如通过SPR测量,而且还包括亲和力降低至0(或低于分析方法的检测限),即完全消除相互作用。相反,“升高的结合”指相应相互作用的结合亲和力升高。
除非另外指示,如本文中使用的,术语“白介素-2”或“IL-2”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-2。该术语涵盖未加工的IL-2以及起因于细胞中加工的IL-2的任何形式。该术语还涵盖IL-2的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。一种例示性人IL-2的氨基酸序列在SEQ ID NO:52中显示。未加工的人IL-2另外包含N端20个氨基酸的信号肽,其具有SEQ ID NO:55的序列,在成熟IL-2分子中缺失。
如本文中使用的,术语“IL-2突变体”或“突变体IL-2多肽”意图涵盖各种形式的IL-2分子的任何突变体形式,包括全长IL-2,截短形式的IL-2和IL-2诸如通过融合或化学缀合连接至另一分子的形式。当提及IL-2使用时,“全长”意图表示成熟,天然长度IL-2分子。例如,全长人IL-2指具有133个氨基酸的分子(见例如SEQ ID NO:52)。各种形式的IL-2突变体特征在于具有至少一处影响IL-2与CD25相互作用的氨基酸突变。此突变可牵涉正常情况下位于该位置的野生型氨基酸残基的替代,删除,截短或修饰。通过氨基酸替代获得的突变体是优选的。除非另外指明,IL-2突变体在本文中可称作突变体IL-2肽序列,突变体IL-2多肽,突变体IL-2蛋白或突变体IL-2类似物。
各种形式的IL-2的命名在本文中是就SEQ ID NO:52中显示的序列而言进行的。可以在本文中使用多种命名来指示同一突变。例如,位置42处的苯丙氨酸变成丙氨酸的突变可以以42A,A42,A42,F42A,或Phe42Ala标示。
如本文中使用的,“人IL-2分子”表示包含与SEQ ID NO:52的人IL-2序列至少约90％,至少约91％,至少约92％,至少约93％,至少约94％,至少约95％或至少约96％同一的氨基酸序列的IL-2分子。特别地,序列同一性是至少约95％,更加特别是至少约96％。在特定实施方案中,人IL-2分子是全长IL-2分子。
如本文中使用的,术语“氨基酸突变”意为涵盖氨基酸替代,删除,***和修饰。可以进行替代,删除,***和修饰的任意组合来实现最终构建体,只要最终构建体拥有期望的特性,例如降低的对CD25的结合。氨基酸序列删除和***包括氨基和/或羧基端删除和氨基酸***。末端删除的一个例子是删除全长人IL-2的位置1中的丙氨酸残基。优选的氨基酸突变是氨基酸替代。为了改变例如IL-2多肽的结合特征,特别优选非保守性的氨基酸替代,即将一个氨基酸用具有不同结构和/或化学特性的另一种氨基酸替换。优选的氨基酸替代包括用亲水性氨基酸替换疏水性氨基酸。氨基酸替代包括由非天然存在的氨基酸或由20种标准氨基酸的天然存在的氨基酸衍生物(例如4-羟脯氨酸,3-甲基组氨酸,鸟氨酸,高丝氨酸,5-羟赖氨酸)替换。可以使用本领域中公知的遗传或化学方法生成氨基酸突变。遗传方法可以包括定点诱变,PCR,基因合成等。认为通过遗传工程以外的方法如化学修饰来改变氨基酸侧链基团的方法也可能可用。
如本文中使用的,“野生型”形式的IL-2是IL-2的一种形式,它在其它方面与突变体IL-2多肽相同,只是野生型形式在突变体IL-2多肽的每个氨基酸位置处具有野生型氨基酸。例如,如果IL-2突变体是全长IL-2(即未与任何其它分子融合或缀合的IL-2),那么这种突变体的野生型形式是全长天然IL-2。如果IL-2突变体是IL-2和在IL-2下游编码的另一多肽(例如抗体链)之间的融合物,那么这种IL-2突变体的野生型形式是与相同下游多肽融合的具有野生型氨基酸序列的IL-2。而且,如果IL-2突变体是截短形式的IL-2(IL-2的非截短部分内的突变的或修饰的序列),那么这种IL-2突变体的野生型形式是类似截短的具有野生型序列的IL-2。为了将各种形式的IL-2突变体与相应的野生型形式的IL-2比较IL-2受体结合亲和力或生物学活性目的,术语野生型涵盖与天然发生的天然IL-2相比包含一处或多处不影响IL-2受体结合的氨基酸突变(诸如例如将与人IL-2的残基125对应的位置处的半胱氨酸替代成丙氨酸)的形式的IL-2。在一些实施方案中,为了本发明的目的,野生型IL-2包含氨基酸替代C125A (见SEQ ID NO:54)。在依照本发明的某些实施方案中,与突变体IL-2多肽比较的野生型IL-2多肽包含SEQ ID NO:52的氨基酸序列。在其它实施方案中,与突变体IL-2多肽比较的野生型IL-2多肽包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列。
除非另外指示,如本文中使用的,术语“CD25”或“IL-2受体的α亚基”指来自任何脊椎动物来源,包括哺乳动物如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然CD25。该术语涵盖“全长”,未加工的CD25以及起因于细胞中加工的CD25的任何形式。该术语还涵盖CD25的天然存在变体,例如剪接变体或等位变体。在某些实施方案中,CD25是人CD25。人CD25的氨基酸序列见例如UniProt条目号P01589(版本185)。
如本文中使用的,术语“高亲和力IL-2受体”指由受体γ亚基(也称作共同细胞因子受体γ亚基,γc,或CD132,参见UniProt条目号P14784(版本192)),受体β亚基(也称作CD122或p70,参见UniProt条目号P31785(版本197))和受体α亚基(也称作CD25或p55,参见UniProt条目号P01589(版本185))组成的异三聚体形式的IL-2受体。对比而言,术语“中等亲和力IL-2受体”指仅仅包括γ亚基和β亚基,没有α亚基的IL-2受体(综述参见例如Olejniczak and Kasprzak,Med Sci Monit 14,RA179-189(2008))。
“亲和力”指分子(例如受体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如配体)之间非共价相互作用总和的强度。除非另外指示,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对的成员(例如抗原结合模块和抗原,或受体及其配体)之间1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以以解离常数(KD)来表述,其为解离与结合速率常数(分别为K解离和K结合)的比率。如此,相等的亲和力可能包含不同的速率常数,只要速率常数的比率保持相同。亲和力可以通过本领域知道的确立方法来测量,包括本文中描述的那些方法。用于测量亲和力的一种具体方法是表面等离振子共振(SPR)。突变体或野生型IL-2多肽对各种形式的IL-2受体的亲和力可以依照WO 2012/107417中列出的方法通过表面等离振子共振(SPR)使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare)和受体亚基(诸如可通过重组表达来获得)来测定(见例如Shanafelt et al.,Nature Biotechnol 18,1197-1202(2000))。或者,IL-2突变体对不同形式的IL-2受体的结合亲和力可以使用已知表达一种或另一种此类形式的受体的细胞系来评估。本文中下文描述了用于测量结合亲和力的具体的示例性和例示性实施方案。
“调节性T细胞”或“Treg细胞”意指一种能遏制其它T细胞的应答的专门化类型的CD4+T细胞。Treg细胞特征在于表达IL-2受体的α亚基(CD25)和转录因子叉头盒(forkheadbox)P3(FOXP3)(Sakaguchi,Annu Rev Immunol 22,531-62(2004))且在诱导和维持针对抗原(包括那些由肿瘤表达的)的外周自我耐受中发挥至关重要作用。Treg细胞需要IL-2来实现它们的功能和发育及诱导它们的遏制性特征。
如本文中使用的,术语“效应细胞”指如下的一群淋巴细胞,它们介导IL-2的细胞毒性效应。效应细胞包括效应T细胞诸如CD8+细胞毒性T细胞,NK细胞,淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞和巨噬细胞/单核细胞。
关于参照多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后,且不将任何保守性替代视为序列同一性的一部分时,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。为测定百分比氨基酸序列同一性目的比对可以以本领域技术范围内的多种方式进行,例如使用公众可得到的计算机软件,如BLAST,BLAST-2,Clustal W,Megalign(DNASTAR)软件或FASTA程序包。本领域技术人员可决定用于比对序列的适宜参数,包括在比较序列的全长里获得最大比对需要的任何算法。然而,为了本文中的目的,％氨基酸序列同一性值是使用36.3.8c或更晚的版本FASTA包的ggsearch程序及BLOSUM50比较矩阵生成的。FASTA程序包由W.R.Pearson and D.J.Lipman(1988)“Improved Tools for Biological SequenceAnalysis”,PNAS 85:2444-2448；W.R.Pearson(1996)“Effective protein sequencecomparison”Meth.Enzymol.266:227-258；和Pearson et al.(1997)Genomics 46:24-36撰写且自http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml公众可得。或者,可使用在http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi处可及的公共服务器来比较序列,使用ggsearch(全局蛋白质:蛋白质)程序和默认选项(BLOSUM50；打开:-10；延伸:-2；Ktup＝2)以确保实施全局而非局部比对。百分比氨基酸同一性在输出比对标题中给出。
如本文中使用的,术语“多肽”指由通过酰胺键(也称作肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指具有两个或更多个氨基酸的任何链,并且不指特定长度的产物。如此,肽,二肽,三肽,寡肽,“蛋白质”,“氨基酸链”或任何其它用于指具有两个或更多个氨基酸的链的术语均包括在“多肽”的定义中,而且术语“多肽”可以代替这些术语中任一个或与其交换使用。术语“多肽”还意图指多肽的表达后修饰的产物,包括但不限于糖基化,乙酰化,磷酸化,酰化,通过已知的保护性/封闭性基团衍生化,蛋白水解切割,或通过非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可以自天然的生物学来源衍生或通过重组技术生成,但不必从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式来生成,包括通过化学合成。多肽可以具有限定的三维结构,尽管它们不必具有此类结构。具有限定的三维结构的多肽被称作折叠的,而不具有限定的三维结构而可以采用大量不同构象的多肽被称作未折叠的。
术语“免疫球蛋白分子”指具有天然存在的抗体结构的蛋白质。例如,IgG类的免疫球蛋白是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,其由二硫键连接的两条轻链和两条重链构成。从N端至C端,每条重链具有可变域(VH),也称作可变重域或重链可变区,接着是3个恒定域(CH1,CH2和CH3),也称作重链恒定区。类似地,从N端至C端,每条轻链具有可变域(VL),也称作可变轻域或轻链可变区,接着是恒定轻(CL)域(也称作轻链恒定区)。免疫球蛋白的重链可以归入称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG)或μ(IgM)的5类之一,其中一些可以进一步分成亚类,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,免疫球蛋白的轻链可以归入称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的两类之一。免疫球蛋白基本由经由免疫球蛋白铰链区连接的两个Fab分子和Fc域组成。
如本文中使用的,“CD40激动剂”包括激动CD40/CD40L相互作用的任何模块。典型地,这些模块会是激动性CD40抗体或激动性CD40L多肽。“激动剂”与细胞上的受体结合并启动与该受体的天然配体所启动的相似或相同的反应或活性。“CD40激动剂”可诱导任何或所有但不限于下面的应答:B细胞增殖和/或分化；经由诸如ICAM-1,E-选择蛋白,VC AM,等分子上调细胞间粘附；分泌促炎症细胞因子,诸如IL-1,IL-6,IL-8,IL-12,TNF,等；通过诸如TRAF(例如TRAF2和/或TRAF3),MAP激酶,诸如NIK(NF-kB诱导性激酶),I-卡帕B激酶(IKK/贝塔),转录因子NF-kB,Ras和MEK/ERK途径,PI3K AKT途径,P38MAPK途径,等途径的经由CD40受体的信号转导；通过诸如XIAP,mcl-1,bcl-x,等分子的抗凋亡信号的转导；B和/或T细胞记忆生成；B细胞抗体生成；B细胞同种型转换,上调MHC II类和CD80/86的细胞表面表达,等等。激动剂活性意图是比由阴性对照诱导的激动剂活性大至少30％,35％,40％,45％,50％,60％,70％,75％,80％,85％,90％,95％,或100％的激动剂活性,如在B细胞应答的测定法测量的。在另一个实施方案中,CD40激动剂具有比由阴性对照诱导的激动剂活性大至少2倍或大至少3倍的激动剂活性,如在B细胞应答的测定法测量的。如此,例如,在感兴趣的B细胞应答是B细胞增殖的情况中,激动剂活性会是诱导比由阴性对照诱导的B细胞增殖水平大至少2倍或大至少3倍的B细胞增殖水平。
II.IL-2免疫缀合物
对本发明的方法,用途,组合物和试剂盒有用的IL-2免疫缀合物的例子,和用于生成它们的方法描述于PCT公开文本No.WO 2012/107417和WO 2012/146628,通过援引将每一篇完整收入本文。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含特异性结合肿瘤抗原的抗体,和IL-2多肽。
免疫缀合物中包含的IL-2多肽
在本发明中有用的免疫缀合物包含IL-2多肽。在一些实施方案中,该IL-2多肽是人IL-2多肽。在一些实施方案中,该IL-2多肽是其中位置125处的半胱氨酸用中性氨基酸诸如丝氨酸(C125S),丙氨酸(C125A),苏氨酸(C125T)或缬氨酸(C125V)替换的人IL-2多肽。
对本发明特别有用的免疫缀合物包含具有对于免疫疗法的有利特性的突变体IL-2多肽。特别地,在该突变体IL-2多肽中消除有助于IL-2的毒性但对于功效不是必需的IL-2药理学特性。此类突变体IL-2多肽详细描述于WO 2012/107417,通过援引将其完整收入本文。如上文讨论的,不同形式的IL-2受体由不同的亚基组成且展现不同的对IL-2的亲和力。由β和γ受体亚基组成的中等亲和力IL-2受体在静息的效应细胞上表达且足以实现IL-2信号传导。另外包含受体的α亚基的高亲和力IL-2受体主要在调节性T(Treg)细胞上以及在激活的效应细胞上表达,在那里它通过IL-2的啮合能分别促进Treg细胞介导的免疫遏制或激活诱导的细胞死亡(AICD)。如此,不希望受理论束缚,降低或消除IL-2对IL-2受体的α亚基的亲和力应当降低IL-2诱导的调节性T细胞对效应细胞功能的下调和通过AICD过程发展肿瘤耐受。在另一个方面,维持对中等亲和力IL-2受体的亲和力应当保留IL-2对效应细胞(像NK和T细胞)增殖和激活的诱导。
在本发明中有用的免疫缀合物中包含的突变体白介素-2(IL-2)多肽包含至少一处消除或降低突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力且保留突变体IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力(均与野生型IL-2多肽相比)的氨基酸突变。
具有降低的对CD25的亲和力的人IL-2(hIL-2)的突变体可以例如通过氨基酸位置35,38,42,43,45或72或其组合(编号方式相对于人IL-2序列SEQ ID NO:52)处的氨基酸替代来生成。例示性氨基酸替代包括K35E,K35A,R38A,R38E,R38N,R38F,R38S,R38L,R38G,R38Y,R38W,F42L,F42A,F42G,F42S,F42T,F42Q,F42E,F42N,F42D,F42R,F42K,K43E,Y45A,Y45G,Y45S,Y45T,Y45Q,Y45E,Y45N,Y45D,Y45R,Y45K,L72G,L72A,L72S,L72T,L72Q,L72E,L72N,L72D,L72R,和L72K。在用于本发明的免疫缀合物中有用的特定IL-2突变体包含与人IL-2的残基42,45,或72对应的氨基酸位置处的氨基酸突变,或其组合。在一个实施方案中,所述氨基酸突变是选自F42A,F42G,F42S,F42T,F42Q,F42E,F42N,F42D,F42R,F42K,Y45A,Y45G,Y45S,Y45T,Y45Q,Y45E,Y45N,Y45D,Y45R,Y45K,L72G,L72A,L72S,L72T,L72Q,L72E,L72N,L72D,L72R,和L72K的组的氨基酸替代,更加具体地是选自F42A,Y45A和L72G的组的氨基酸替代。与该IL-2突变体的野生型形式相比,这些突变体展现实质性相似的对中等亲和力IL-2受体的结合亲和力,而且具有实质性降低的对IL-2受体的α亚基和高亲和力IL-2受体的亲和力。
有用的突变体的其它特征可包括诱导携带IL-2受体的T和/或NK细胞增殖的能力,诱导携带IL-2受体的T和/或NK细胞中的IL-2信号传导的能力,由NK细胞生成干扰素(IFN)-γ作为次级细胞因子的能力,降低诱导由外周血单个核细胞(PBMC)生成次级细胞因子(特别是IL-10和TNF-α)的能力,降低的激活调节性T细胞的能力,降低的诱导T细胞中的凋亡的能力,和降低的体内毒性概况。
在用于本发明的IL-2免疫缀合物中有用的特定突变体IL-2多肽包含三处消除或降低突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变体IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在一个实施方案中,所述三处氨基酸突变在与人IL-2的残基42,45和72对应的位置处。在一个实施方案中,所述三处氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中,所述三处氨基酸突变是选自F42A,F42G,F42S,F42T,F42Q,F42E,F42N,F42D,F42R,F42K,Y45A,Y45G,Y45S,Y45T,Y45Q,Y45E,Y45N,Y45D,Y45R,Y45K,L72G,L72A,L72S,L72T,L72Q,L72E,L72N,L72D,L72R,和L72K的组的氨基酸替代。在一个具体实施方案中,所述三处氨基酸突变是氨基酸替代F42A,Y45A和L72G(编号方式相对于SEQ ID NO:52的人IL-2序列)。
在某些实施方案中,所述氨基酸突变将突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少5倍,具体是至少10倍,更加具体是至少25倍。在有多于一处降低突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力的氨基酸突变的实施方案中,这些氨基酸突变的组合可将突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力降低至少30倍,至少50倍,或甚至至少100倍。在一个实施方案中,所述氨基酸突变或氨基酸突变的组合消除突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力,使得通过表面等离振子共振检测不到结合。
当IL-2突变体展现大于约70％的该IL-2突变体的野生型形式对中等亲和力IL-2受体的亲和力时,实现实质性相似的对中等亲和力受体的结合,即保留突变体IL-2多肽对所述受体的亲和力。在本发明中有用的IL-2突变体可展现大于约80％和甚至大于约90％的此类亲和力。
降低IL-2对IL-2受体的α亚基的亲和力与消除IL-2的O-糖基化组合产生具有改良特性的IL-2蛋白。例如,当在哺乳动物细胞(诸如CHO或HEK细胞)中表达突变体IL-2多肽时,消除O-糖基化位点产生更加均质的产物。
如此,在某些实施方案中,该突变体IL-2多肽包含消除在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O-糖基化位点的另外的氨基酸突变。在一个实施方案中,所述消除在与人IL-2的残基3对应的位置处的IL-2的O-糖基化位点的另外的氨基酸突变是氨基酸替代。例示性氨基酸替代包括T3A,T3G,T3Q,T3E,T3N,T3D,T3R,T3K,和T3P。在一个具体实施方案中,所述另外的氨基酸突变是氨基酸替代T3A。
在某些实施方案中,该突变体IL-2多肽本质上是全长IL-2分子。在某些实施方案中,该突变体IL-2多肽是人IL-2分子。在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽包含SEQ IDNO:52的序列及至少一处与包含SEQ ID NO:52且没有所述突变的IL-2多肽相比消除或降低突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变体IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。在另一个实施方案中,该突变体IL-2多肽包含SEQ ID NO:54的序列及至少一处与包含SEQ ID NO:54且没有所述突变的IL-2多肽相比消除或降低突变体IL-2多肽对IL-2受体的α亚基的亲和力但保留突变体IL-2多肽对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变。
在一个具体实施方案中,该突变体IL-2多肽能引发一种或多种选自由下述各项组成的组的细胞应答:激活的T淋巴细胞中的增殖,激活的T淋巴细胞中的分化,细胞毒性T细胞(CTL)活性,激活的B细胞中的增殖,激活的B细胞中的分化,天然杀伤(NK)细胞中的增殖,NK细胞中的分化,激活的T细胞或NK细胞的细胞因子分泌,和NK/淋巴细胞激活的杀伤(LAK)抗肿瘤细胞毒性。
在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽具有与野生型IL-2多肽相比降低的诱导调节性T细胞中的IL-2信号传导的能力。在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽诱导与野生型IL-2多肽相比更少的T细胞中的激活诱导的细胞死亡(AICD)。在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽具有与野生型IL-2多肽相比降低的体内毒性概况。在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽具有与野生型IL-2多肽相比延长的血清半衰期。
在用于本发明的IL-2免疫缀合物中有用的一种特定突变体IL-2多肽包含四处在与人IL-2的残基3,42,45和72对应的位置处的氨基酸替代。具体的氨基酸替代是T3A,F42A,Y45A和L72G。如WO 2012/107417中证明的,所述四重突变体IL-2多肽展现检测不到的对CD25的结合,降低的诱导T细胞中的凋亡的能力,降低的诱导Treg细胞中的IL-2信号传导的能力,和降低的体内毒性概况。然而,它保留激活效应细胞中的IL-2信号传导,诱导效应细胞的增殖,和由NK细胞生成IFN-γ作为次级细胞因子的能力。
而且,所述突变体IL-2多肽具有别的有利特性,诸如降低的表面疏水性,好的稳定性,和好的表达产量,如WO 2012/107417中描述的。出乎意料地,所述突变体IL-2多肽还提供与野生型IL-2相比延长的血清半衰期。
在具有IL-2中形成IL-2与CD25的界面或糖基化位点的区域中的突变以外,在本发明中有用的IL-2突变体还可以具有在这些区域以外的氨基酸序列中的一处或多处突变。人IL-2中的此类另外的突变可提供另外的优点,诸如升高的表达或稳定性。例如,可以用中性氨基酸,诸如丝氨酸,丙氨酸,苏氨酸或缬氨酸替换位置125处的半胱氨酸,分别产生C125SIL-2,C125A IL-2,C125T IL-2或C125V IL-2,如美国专利No.4,518,584中描述的。如其中描述的,还可以删除IL-2的N末端丙氨酸残基,产生诸如des-A1 C125S或des-A1 C125A等突变体。代替地/组合地,该IL-2突变体可包括突变,其中在正常情况下在野生型人IL-2的位置104处存在的甲硫氨酸用中性氨基酸,诸如丙氨酸替换(见美国专利No.5,206,344)。所得突变体,例如des-A1 M104A IL-2,des-A1 M104A C125S IL-2,M104A IL-2,M104A C125AIL-2,des-A1 M104A C125A IL-2,或M104A C125S IL-2(这些和其它突变体可以在美国专利No.5,116,943中和在Weiger et al.,Eur J Biochem 180,295-300(1989)中找到)可以与本文中上文描述的特定IL-2突变组合使用。
如此,在某些实施方案中,该突变体IL-2多肽包含在与人IL-2的残基125对应的位置处的另外的氨基酸突变。在一个实施方案中,所述另外的氨基酸突变是氨基酸替代C125A。
技术人员会能够确定哪些另外的突变可以为本发明的目的提供另外的优点。例如,他会领会IL-2序列中降低或消除IL-2对中等亲和力IL-2受体的亲和力的氨基酸突变,诸如D20T,N88R或Q126D(见例如US 2007/0036752)可能不适合于包括在突变体IL-2多肽中。
在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽与相应的野生型IL-2序列,例如SEQ IDNO:52的人IL-2序列相比包含不多于12,不多于11,不多于10,不多于9,不多于8,不多于7,不多于6,或不多于5处氨基酸突变。在一个特定实施方案中,该突变体IL-2多肽与相应的野生型IL-2序列,例如SEQ ID NO:52的人IL-2序列相比包含不多于5处氨基酸突变。
在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽包含SEQ ID NO:53的序列。在一个实施方案中,该突变体IL-2多肽由SEQ ID NO:53的序列组成。
免疫缀合物格式
在本发明中有用的免疫缀合物包含IL-2分子和抗体。通过直接将IL-2靶向入例如肿瘤微环境,此类免疫缀合物显著提高IL-2疗法的功效。该免疫缀合物中包含的抗体可以是整个抗体或免疫球蛋白,或其具有生物学功能,诸如抗原特异性结合亲和力的部分或变体。
免疫缀合物疗法的益处是显而易见的。例如,免疫缀合物中包含的抗体识别肿瘤特异性表位且导致免疫缀合物分子对肿瘤部位的靶向。因此,能将高浓度的IL-2投递入肿瘤微环境,由此使用比未缀合的IL-2会需要的低得多的剂量的免疫缀合物导致本文中提到的多种免疫效应细胞的激活和增殖。而且,由于以免疫缀合物的形式应用IL-2容许更低剂量的细胞因子自身,因此IL-2的不期望的副作用的可能性受到限制,而且通过免疫缀合物将IL-2靶向身体中的特定部位还可能导致***性暴露降低和如此比用未缀合的IL-2获得的更少的副作用。另外,免疫缀合物与未缀合的IL-2相比延长的循环半衰期有助于免疫缀合物的功效。然而,IL-2免疫缀合物的这种特征可能再次加剧IL-2分子的潜在副作用:由于血流中IL-2免疫缀合物相对于未缀合的IL-2显著更长的循环半衰期,融合蛋白分子的IL-2或其它部分激活脉管***中一般存在的成分的概率升高。相同的担忧适用于含有与另一种模块,诸如Fc或清蛋白融合(导致IL-2在循环中的半衰期延长)的IL-2的其它融合蛋白。因此,包含如本文中和WO 2012/107417中描述的具有与野生型形式的IL-2相比降低的毒性的突变体IL-2多肽的免疫缀合物是特别是有利。
因而,在本发明中特别有用的是包含如本文中上文描述的突变体IL-2多肽和结合靶抗原的抗体的IL-2免疫缀合物。在一个实施方案中,该(突变体)IL-2多肽和该抗体形成融合蛋白,即该(突变体)IL-2多肽与该抗体分享肽键。在一些实施方案中,该抗体包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在一个具体实施方案中,该(突变体)IL-2多肽在它的氨基末端氨基酸处与该Fc域的亚基之一的羧基末端氨基酸融合,任选地经由接头肽。在一些实施方案中,该抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体是免疫球蛋白分子,特别是IgG类免疫球蛋白分子,更加特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子。在一个此类实施方案中,该(突变体)IL-2多肽与免疫球蛋白重链之一分享氨基末端肽键。在某些实施方案中,该抗体是抗体片段。在一些实施方案中,该抗体是Fab分子或scFv分子。在一个实施方案中,该抗体是Fab分子。在另一个实施方案中,该抗体是scFv分子。该免疫缀合物还可以包含多于一个抗体。在该免疫缀合物中包含多于一个抗体(例如第一和第二抗体)的情况中,每个抗体可以独立选自各种形式的抗体和抗体片段。例如,该第一抗体可以是Fab分子且该第二抗体可以是scFv分子。在一个具体实施方案中,所述第一和所述第二抗体每个是scFv分子或所述第一和所述第二抗体每个是Fab分子。在一个特定实施方案中,所述第一和所述第二抗体每个是Fab分子。在一个实施方案中,所述第一和所述第二抗体每个结合相同的靶抗原。
例示性免疫缀合物格式描述于PCT公开文本No.WO 2011/020783,通过援引将其完整收入本文。这些免疫缀合物包含至少两个抗体。如此,在一个实施方案中,对本发明有用的免疫缀合物包含如本文中描述的(突变体)IL-2多肽,和至少第一和第二抗体。在一个特定实施方案中,所述第一和第二抗体独立选自由Fv分子,特别是scFv分子,和Fab分子组成的组。在一个具体实施方案中,所述(突变体)IL-2多肽与所述第一抗体分享氨基或羧基末端肽键且所述第二抗体与i)该(突变体)IL-2多肽或ii)该第一抗体分享氨基或羧基末端肽键。在一个特定实施方案中,该免疫缀合物本质上由通过一个或多个接头序列连接的(突变体)IL-2多肽和第一和第二抗体,特别是Fab分子组成。此类格式具有如下优点,即它们以高亲和力结合靶抗原,但是仅仅提供对IL-2受体的单体结合,如此避免将免疫缀合物靶向除了靶部位以外的位置处的携带IL-2受体的免疫细胞。在一个特定实施方案中,(突变体)IL-2多肽与第一抗体,特别是第一Fab分子分享羧基末端肽键,而且进一步地与第二抗体,特别是第二Fab分子分享氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一抗体,特别是第一Fab分子与(突变体)IL-2多肽分享羧基末端肽键,而且进一步地与第二抗体,特别是第二Fab分子分享氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一抗体,特别是第一Fab分子与第一(突变体)IL-2多肽分享氨基末端肽键,而且进一步地与第二抗体,特别是第二Fab分子分享羧基末端肽。在一个特定实施方案中,(突变体)IL-2多肽与第一重链可变区分享羧基末端肽键且进一步地与第二重链可变区分享氨基末端肽键。在另一个实施方案中,(突变体)IL-2多肽与第一轻链可变区分享羧基末端肽键且进一步地与第二轻链可变区分享氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一重或轻链可变区通过羧基末端肽键连接(突变体)IL-2多肽且进一步地通过氨基末端肽键连接第二重或轻链可变区。在另一个实施方案中,第一重或轻链可变区通过氨基末端肽键连接(突变体)IL-2多肽且进一步通过羧基末端肽键连接第二重或轻链可变区。在一个实施方案中,(突变体)IL-2多肽与第一Fab重或轻链分享羧基末端肽键且进一步与第二Fab重或轻链分享氨基末端肽键。在另一个实施方案中,第一Fab重或轻链与(突变体)IL-2多肽分享羧基末端肽键且进一步与第二Fab重或轻链分享氨基末端肽键。在其它实施方案中,第一Fab重或轻链与(突变体)IL-2多肽分享氨基末端肽键且进一步与第二Fab重或轻链分享羧基末端肽键。在一个实施方案中,该免疫缀合物包含(突变体)IL-2多肽,其与一个或多个scFv分子分享氨基末端肽键且进一步与一个或多个scFv分子分享羧基末端肽键。
然而,对于在本发明中有用的免疫缀合物特别合适的格式包含免疫球蛋白分子作为抗体。此类免疫缀合物格式描述于WO 2012/146628,通过援引将其完整收入本文。
因而,在特定实施方案中,该免疫缀合物包含如本文中描述的(突变体)IL-2多肽和结合靶抗原的免疫球蛋白分子,特别是IgG分子,更加特别是IgG1分子。在一个实施方案中,该免疫缀合物包含不多于一个(突变体)IL-2多肽。在一个实施方案中,该免疫球蛋白分子是人的。在一个实施方案中,该免疫球蛋白分子包含人恒定区,例如人CH1,CH2,CH3和/或CL域。在一个实施方案中,该免疫球蛋白包含人Fc域,特别是人IgG1Fc域。在一个实施方案中,该(突变体)IL-2多肽与该免疫球蛋白分子分享氨基或羧基末端肽键。在一个实施方案中,该免疫缀合物本质上由通过一个或多个接头序列连接的(突变体)IL-2多肽和免疫球蛋白分子,特别是IgG分子,更加特别是IgG1分子组成。在一个具体实施方案中,该(突变体)IL-2多肽在它的氨基末端氨基酸处与该免疫球蛋白重链之一的羧基末端氨基酸融合,任选地经由接头肽。
该(突变体)IL-2多肽可以直接或经由包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的接头肽与该抗体融合。接头肽是本领域已知的且在本文中有描述。合适的非免疫原性接头肽包括例如(G4S)n,(SG4)n,(G4S)n或G4(SG4)n接头肽。“n”一般是1至10,典型地2至4的整数。在一个实施方案中,该接头肽具有至少5个氨基酸的长度,在一个实施方案中,5至100个氨基酸的长度,在又一个实施方案中,10至50个氨基酸的长度。在一个特定实施方案中,该接头肽具有15个氨基酸的长度。在一个实施方案中,该接头肽是(GxS)n或(GxS)nGm,其中G＝甘氨酸,S＝丝氨酸,且(x＝3,n＝3,4,5或6,且m＝0,1,2或3)或(x＝4,n＝2,3,4或5且m＝0,1,2或3),在一个实施方案中,x＝4和n＝2或3,在又一个实施方案中,x＝4且n＝3。在一个特定实施方案中,该接头肽是(G4S)3(SEQ ID NO:67)。在一个实施方案中,该接头肽具有SEQID NO:67的氨基酸序列(或由其组成)。
在一个特定实施方案中,该免疫缀合物包含(突变体)IL-2分子和结合靶抗原的免疫球蛋白分子,特别是IgG1亚类免疫球蛋白分子,其中该(突变体)IL-2分子在它的氨基末端氨基酸处经由SEQ ID NO:67的接头肽与该免疫球蛋白重链之一的羧基末端氨基酸融合。
在一个特定实施方案中,该免疫缀合物包含(突变体)IL-2分子和结合靶抗原的抗体,其中该抗体包含由第一和第二亚基构成的Fc域,特别是人IgG1Fc域,且该(突变体)IL-2分子在它的氨基末端氨基酸处经由SEQ ID NO:67的接头肽与该Fc域的亚基之一的羧基末端氨基酸融合。
免疫缀合物中包含的抗体
在本发明中有用的免疫缀合物中包含的抗体结合靶抗原,特别是人靶抗原,而且能够将(突变体)IL-2多肽引导至该抗原在那里表达的靶部位,特别是肿瘤。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含特异性结合癌胚抗原(CEA)的抗体。
“CEA”的备选名称包括CEACAM5。如本文中使用的,术语“CEA”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CEA,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人),非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语涵盖“全长”和未加工的CEA以及源自细胞中的加工的任何形式的CEA(例如成熟蛋白)。该术语还涵盖CEA的天然发生变体和同等型,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,CEA是人CEA。人CEA的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号P06731,或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004354.2。
可以在用于本发明的免疫缀合物中使用的合适的CEA抗体描述于PCT公开文本No.WO 2012/117002,通过援引将其完整收入本文。
该免疫缀合物可包含两个或更多个抗体,它们可结合相同或不同的抗原。然而,在特定实施方案中,这些抗体中的每个结合CEA。在一个实施方案中,本发明的免疫缀合物中包含的抗体是单特异性的。在一个特定实施方案中,该免疫缀合物包含单个单特异性抗体,特别是单特异性免疫球蛋白分子。
该抗体可以是任何类型的抗体或其保留对CEA,特别是人CEA的特异性结合的片段。抗体片段包括但不限于Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子。然而,在特定实施方案中,该抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在一些实施方案中,该抗体是免疫球蛋白,特别是IgG类,更加特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施方案中,该抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,该特异性结合CEA的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:38的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:39的HCDR2,和SEQ ID NO:40的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:41的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:42的LCDR2和SEQ ID NO:43的LCDR3。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区包含人框架区(FR)。
在一些实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR 1,包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR 2,包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HCDR 3,包含SEQID NO:41的氨基酸序列的LCDR 1,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR 2,和包含SEQID NO:43的氨基酸序列的LCDR 3。
在一些实施方案中,该抗体包含(a)重链可变区(VH),其包含包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的HCDR 1,包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的HCDR 2,和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的HCDR 3,和(b)轻链可变区(VL),其包含包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的LCDR 1,包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的LCDR 2,和包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的LCDR 3。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区是人源化可变区。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区包含人框架区(FR)。
在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,该抗体包含(a)重链可变区(VH),其包含与SEQ ID NO:34的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列,和(b)轻链可变区(VL),其包含与SEQ ID NO:35的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列。
在一个特定实施方案中,该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中,该抗体是人源化抗体。在一个实施方案中,该抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子,特别是包含人CH1,CH2,CH3和/或CL域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO 68和69(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:70(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,该重链恒定区可包含如本文中描述的Fc域中的氨基酸突变。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物包含特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗体。
“FAP”的备选名称包括Seprase。如本文中使用的,术语“FAP”指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人),非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语涵盖“全长”和未加工的FAP以及源自细胞中的加工的任何形式的FAP(例如成熟蛋白)。该术语还涵盖FAP的天然发生变体和同等型,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,FAP是人FAP。人FAP的氨基酸序列显示于UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884,或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451。
可以在用于本发明的免疫缀合物中使用的合适的FAP抗体描述于PCT公开文本No.WO 2012/020006,通过援引将其完整收入本文。
该免疫缀合物可包含两个或更多个抗体,它们可结合相同或不同的抗原。然而,在特定实施方案中,这些抗体中的每个结合FAP。在一个实施方案中,该免疫缀合物中包含的抗体是单特异性的。在一个特定实施方案中,该免疫缀合物包含单个单特异性抗体,特别是单特异性免疫球蛋白分子。
该抗体可以是任何类型的抗体或其保留对FAP,特别是人FAP的特异性结合的片段。抗体片段包括但不限于Fv分子,scFv分子,Fab分子,和F(ab')2分子。然而,在特定实施方案中,该抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体包含由第一和第二亚基构成的Fc域。在一些实施方案中,该抗体是免疫球蛋白,特别是IgG类,更加特别是IgG1亚类免疫球蛋白。
在一些实施方案中,该抗体是单克隆抗体。
在一些实施方案中,该特异性结合FAP的抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:47的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:47的重链可变区序列的重链互补决定区(HCDR)1,HCDR 2和HCDR 3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的轻链互补决定区(LCDR)1,LCDR 2和LCDR 3。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区是人可变区。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区包含人框架区(FR)。
在一些实施方案中,该特异性结合FAP的抗体包含来自SEQ ID NO:47的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,和来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含来自SEQ ID NO:47的重链可变区序列的重链互补决定区(HCDR)1,HCDR 2和HCDR 3,和来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的轻链互补决定区(LCDR)1,LCDR 2和LCDR 3。
在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含与SEQ IDNO:47的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含与SEQ ID NO:48的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个特定实施方案中,该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中,该抗体是人抗体。在一个实施方案中,该抗体是包含人恒定区的免疫球蛋白分子,特别是包含人CH1,CH2,CH3和/或CL域的IgG类免疫球蛋白分子。人恒定域的例示性序列在SEQ ID NO 68和69(分别是人卡帕和拉姆达CL域)和SEQ ID NO:70(人IgG1重链恒定域CH1-CH2-CH3)中给出。在一些实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:69的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:68的氨基酸序列的轻链恒定区。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:70的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链恒定区。特别地,该重链恒定区可包含如本文中描述的Fc域中的氨基酸突变。
Fc域
在特定实施方案中,在本发明中有用的免疫缀合物中包含的抗体包含由第一和第二亚基构成的Fc域。抗体的Fc域由一对包含免疫球蛋白分子重链域的多肽链组成。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。在一个实施方案中,在本发明中有用的免疫缀合物包含不超过一个Fc域。
在一个实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体的Fc域是IgG Fc域。在一个具体的实施方案中,Fc域是IgG1Fc域。在另一个实施方案中,Fc域是IgG4Fc域。在一个更加具体的实施方案中,Fc域是包含位置S228(Kabat EU索引编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4Fc域。此氨基酸替代降低IgG4抗体的体内Fab臂交换(参见Stubenrauch等,Drug Metabolism and Disposition 38,84-91(2010))。在又一个具体的实施方案中,Fc域是人Fc域。在一个甚至更加具体的实施方案中,Fc域是人IgG1Fc域。人IgG1Fc区的一种例示性序列在SEQ ID NO:66中给出。
促进异二聚化的Fc域修饰
在本发明中有用的免疫缀合物包含(突变体)IL-2多肽,特别是单个(不多于一个)IL-2多肽,其融合至Fc域的两个亚基之一个或另一个,如此Fc域的两个亚基通常包含在两条不相同的多肽链中。这些多肽的重组共表达和随后二聚化导致两种多肽的数种可能组合。为了改进重组生产中免疫缀合物的产量和纯度,如此在抗体的Fc域中引入促进期望多肽联合的修饰会是有利的。
因而,在具体的实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体的Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛的蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,在一个实施方案中,所述修饰在Fc域的CH3域中。
有数种办法来修饰Fc域的CH3域以加强异二聚化,它们详细记载于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012058768,WO 2013157954,WO2013096291。典型地,在所有此类办法中,Fc域的第一亚基的CH3域和Fc域的第二亚基的CH3域二者以互补方式进行工程化改造使得每个CH3域(或包含它的重链)不再能与其自身同二聚化但被迫与互补工程化改造的其它CH3域异二聚化(使得第一和第二CH3域异二聚化且两个第一CH3域或两个第二CH3域之间不形成同二聚体)。
在一个特定的实施方案中,所述促进Fc域的第一亚基和第二亚基联合的修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,其包含在Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和在Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。
节-入-穴技术记载于例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等,Prot Eng 9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入***(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得***可以置于空腔中从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽界面的小氨基酸侧链用更大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建***。在第二多肽的界面中创建具有与***相同或相似大小的互补性空腔,其通过将大氨基酸侧链用更小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换进行。
因而,在一个具体的实施方案中,在免疫缀合物中包含的抗体的Fc域的第一亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成***,其可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,而且在Fc域的第二亚基的CH3域中,一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,其中可安置第一亚基的CH3域内的***。
优选地,所述具有更大侧链体积的氨基酸残基选自下组:精氨酸(R),苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),和色氨酸(W)。
优选地,所述具有更小侧链体积的氨基酸残基选自下组:丙氨酸(A),丝氨酸(S),苏氨酸(T),和缬氨酸(V)。
可以通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变或通过肽合成来生成***和空腔。
在一个特定的实施方案中,在Fc域第一亚基的CH3域(“节”亚基)中,第366位的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),而在Fc域第二亚基的CH3域(“穴”亚基)中,第407位的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)。在一个实施方案中,在Fc域第二亚基中,另外,第366位的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且第368位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在还有又一个实施方案中,在Fc域的第一亚基中,另外,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C)或第356位的谷氨酸残基用半胱氨酸残基替换(E356C)(特别是,第354位的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换),而在Fc域的第二亚基中,另外,第349位的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。这两个半胱氨酸残基的引入导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥,进一步稳定了二聚体(Carter,JImmunol Methods 248,7-15(2001))。
在一个具体的实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代S354C和T366W,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代Y349C,T366S,L368A和Y407V(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一些实施方案中,Fc域的第二亚基另外包含氨基酸替代H435R和Y436F(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个具体的实施方案中,将突变体IL-2多肽融合(任选地经由接头肽)至Fc域的第一亚基(其包含“节”修饰)。不希望受理论束缚,突变体IL-2多肽与Fc域的含节的亚基的融合会(进一步)使包含两个突变体IL-2多肽的免疫缀合物的生成最小化(两条含节的多肽的空间碰撞)。
涵盖修饰CH3以增强异二聚化的其它技术作为备选,它们记载于例如WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO 2007/110205,WO 2007/147901,WO 2009/089004,WO2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO 2012/058768,WO 2013/157954,WO2013/096291。
在一个实施方案中,备选地使用EP 1870459中记载的异二聚化办法。这种办法基于在Fc域的两个亚基之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置引入具有相反电荷的带电荷的氨基酸。免疫缀合物中包含的抗体的一个具体的实施方案是(Fc域的)两个CH3域之一中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的CH3域之另一中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变T366S,L368A,Y407V,和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(编号方式依照Kabat EU索引)。
在另一个实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366S,L368A,Y407V,或所述抗体包含Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变Y349C,T366W和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变S354C,T366S,L368A,Y407V和另外的Fc域的第一亚基的CH3域中的氨基酸突变R409D；K370E和Fc域的第二亚基的CH3域中的氨基酸突变D399K；E357K(所有编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2013/157953中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366K且第二CH3域包含氨基酸突变L351D(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含氨基酸突变L351K。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含选自Y349E,Y349D和L368E的氨基酸突变(优选L368E)(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2012/058768中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含位置T411,D399,S400,F405,N390,或K392处的氨基酸突变,例如选自a)T411N,T411R,T411Q,T411K,T411D,T411E或T411W,b)D399R,D399W,D399Y或D399K,c)S400E,S400D,S400R,或S400K,d)F405I,F405M,F405T,F405S,F405V或F405W,e)N390R,N390K或N390D,f)K392V,K392M,K392R,K392L,K392F或K392E(编号方式依照Kabat EU索引)。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变L351Y,Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366V,K409F。在又一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变Y407A且第二CH3域包含氨基酸突变T366A,K409F。在又一个实施方案中,第二CH3域进一步包含氨基酸突变K392E,T411E,D399R和S400R(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO 2011/143545中记载的异二聚化办法,例如进行选自下组的位置处的氨基酸修饰:368和409(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,备选地使用WO2011/090762中记载的异二聚化办法,它也使用上文所述节-入-穴技术。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366W且第二CH3域包含氨基酸突变Y407A。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变T366Y且第二CH3域包含氨基酸突变Y407T(编号方式依照Kabat EU索引)。
在一个实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体或它的Fc域是IgG2亚类的且备选地使用WO 2010/129304中记载的异二聚化办法。
在一个备选的实施方案中,促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰包含介导静电操纵效应(electrostatic steering effect)的修饰,例如如记载于PCT公开文本WO 2009/089004的。一般地,此方法涉及将在两个Fc域亚基界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基,从而在静电上不利于同二聚体形成而在静电上有利于异二聚化。在一个此类实施方案中,第一CH3域包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K392或N392的氨基酸替代(优选K392D或N392D)且第二CH3域包含带正电荷的氨基酸(例如赖氨酸(K)或精氨酸(R))对D399,E356,D356,或E357的氨基酸替代(优选D399K,E356K,D356K,或E357K,更优选D399K和E356K)。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K409或R409的氨基酸替代,优选K409D或R409D。在又一个实施方案中,第一CH3域进一步或二选一地包含带负电荷的氨基酸(例如谷氨酸(E),或天冬氨酸(D))对K439和/或K370的氨基酸替代(所有编号方式依照Kabat EU索引)。
在还有又一个实施方案中,备选地使用WO 2007/147901中记载的异二聚化办法。在一个实施方案中,第一CH3域包含氨基酸突变K253E,D282K,和K322D且第二CH3域包含氨基酸突变D239K,E240K,和K292D(编号方式依照Kabat EU索引)。
在仍有另一个实施方案中,可以备选地使用WO 2007/110205中记载的异二聚化办法。
在一个实施方案中,Fc域的第一亚基包含氨基酸替代K392D和K409D,且Fc域的第二亚基包含氨基酸替代D356K和D399K(编号方式依照Kabat EU索引)。
降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰
Fc域赋予免疫缀合物以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。然而,同时它可能导致不想要的免疫缀合物对表达Fc受体的细胞而非优选的携带抗原的细胞的靶向。此外,Fc受体信号传导途径的共激活可能导致细胞因子释放,其与免疫缀合物的IL-2多肽和长半衰期组合,在***性施用后引起细胞因子受体的过度活化和严重的副作用。与此一致,已经描述了常规IgG-IL-2免疫缀合物与输注反应有关(见例如King et al.,J Clin Oncol 22,4463-4473(2004))。
因而,在具体的实施方案中,在本发明中有用的免疫缀合物中包含的抗体的Fc域展现出与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个此类实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的抗体)展现出与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的抗体)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的对Fc受体的结合亲和力,和/或与天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的抗体)相比少于50％,优选少于20％,更优选少于10％且最优选少于5％的效应器功能。在一个实施方案中,Fc域(或包含所述Fc域的抗体)没有实质性结合Fc受体和/或诱导效应器功能。在一个具体的实施方案中,所述Fc受体是Fcγ受体。在一个实施方案中,所述Fc受体是人Fc受体。在一个实施方案中,所述Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中,所述Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个实施方案中,效应器功能是选自下组的一项或多项:CDC,ADCC,ADCP,和细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中,所述效应器功能是ADCC。在一个实施方案中,所述Fc域展现出与天然IgG1Fc域相比基本相似的对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力。当Fc域(或包含所述Fc域的抗体)展现出超过约70％,特别是超过约80％,更特别是超过约90％的天然IgG1Fc域(或包含天然IgG1Fc域的抗体)对FcRn的结合亲和力时,实现基本相似的对FcRn的结合。
在某些实施方案中,Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在具体的实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。通常,Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。在一个实施方案中,所述氨基酸突变降低Fc域对Fc受体的结合亲和力。在一个实施方案中,所述氨基酸突变将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少2倍,至少5倍,或至少10倍。在有超过一处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力的氨基酸突变的实施方案中,这些氨基酸突变的组合可以将Fc域对Fc受体的结合亲和力降低至少10倍,至少20倍,或甚至至少50倍。在一个实施方案中,包含工程化Fc域的抗体展现出与包含非工程化Fc域的抗体相比少于20％,特别是少于10％,更特别是少于5％的对Fc受体的结合亲和力。在一个具体的实施方案中,Fc受体是Fcγ受体。在一些实施方案中,所述Fc受体是人Fc受体。在一些实施方案中,Fc受体是活化性Fc受体。在一个特定的实施方案中,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更特别是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最特别是人FcγRIIIa。优选地,对这些受体的每一种的结合是降低的。在一些实施方案中,对补体成分的结合亲和力,特别是对C1q的结合亲和力也是降低的。在一个实施方案中,对新生儿Fc受体(FcRn)的结合亲和力没有降低。当Fc域(或包含所述Fc域的抗体)展现出非工程化形式的Fc域(或包含所述非工程化形式的Fc域的抗体)对FcRn的结合亲和力的超过约70％时,实现基本相似的对FcRn的结合,即保留该Fc域对所述受体的结合亲和力。Fc域或包含所述Fc域的免疫缀合物中包含的抗体可以展现出超过约80％和甚至超过约90％的此类亲和力。在某些实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体的Fc域工程化改造为具有与非工程化Fc域相比降低的效应器功能。所述降低的效应器功能可包括但不限于下列一项或多项:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞的抗原摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的靶物结合的抗体的交联,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。在一个实施方案中,所述降低的效应器功能是选自下组的一项或多项:降低的CDC,降低的ADCC,降低的ADCP,和降低的细胞因子分泌。在一个具体的实施方案中,所述降低的效应器功能是降低的ADCC。在一个实施方案中,所述降低的ADCC是小于20％的由非工程化Fc域(或包含非工程化Fc域的抗体)诱导的ADCC。
在一个实施方案中,所述降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变是氨基酸替代。在一个实施方案中,Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代:E233,L234,L235,N297,P331和P329(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更特定的实施方案中,Fc域包含在选自下组的位置处的氨基酸替代:L234,L235和P329(编号方式依照KabatEU索引)。在一些实施方案中,Fc域包含氨基酸替代L234A和L235A(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中,Fc域是IgG1Fc域,特别是人IgG1Fc域。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代。在一个更加特定的实施方案中,氨基酸替代是P329A或P329G,特别是P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个实施方案中,Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代和又一处在选自以下位置处的氨基酸替代:E233,L234,L235,N297和P331(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个更加特定的实施方案中,所述又一处氨基酸替代是E233P,L234A,L235A,L235E,N297A,N297D或P331S。在具体的实施方案中,所述Fc域包含在位置P329,L234和L235处的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。在更具体的实施方案中,所述Fc域包含氨基酸突变L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,“PGLALA”或“LALAPG”)。具体而言,在具体的实施方案中,所述Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(Kabat EU索引编号方式),即在所述Fc域的第一和第二亚基每个中,第234位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L234A),第235位的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L235A)且第329位的脯氨酸残基用甘氨酸残基替换(P329G)(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个此类实施方案中,Fc域是IgG1Fc域,特别是人IgG1Fc域。氨基酸替代组合“P329GLALA”几乎完全消除了人IgG1Fc域的Fcγ受体(以及补体)结合,如记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831,其通过提述完整并入本文。WO 2012/130831还描述了制备此类突变体Fc域的方法和用于测定其特性(诸如Fc受体结合或效应器功能)的方法。
IgG4抗体展现出与IgG1抗体相比降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。因此,在一些实施方案中,免疫缀合物中包含的抗体的Fc域是IgG4Fc域,特别是人IgG4Fc域。在一个实施方案中,所述IgG4Fc域包含在位置S228处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P(编号方式依照Kabat EU索引)。为了进一步降低其对Fc受体的结合亲和力和/或其效应器功能,在一个实施方案中,所述IgG4Fc域包含在位置L235处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代L235E(编号方式依照Kabat EU索引)。在另一个实施方案中,所述IgG4Fc域包含在位置P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。在一个具体的实施方案中,所述IgG4Fc域包含在位置S228,L235和P329处的氨基酸替代,具体是氨基酸替代S228P,L235E和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。此类IgG4Fc域突变体及其Fcγ受体结合特性记载于PCT公开文本No.WO 2012/130831,其通过提述完整并入本文。
在一个具体的实施方案中,展现出与天然IgG1Fc域相比降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能的Fc域是包含氨基酸替代L234A,L235A和任选地P329G的人IgG1Fc域,或包含氨基酸替代S228P,L235E和任选地P329G的人IgG4Fc域(编号方式依照Kabat EU索引)。
在某些实施方案中,已消除Fc域的N-糖基化。在一个此类实施方案中,所述Fc域包含在位置N297处的氨基酸突变,特别是用丙氨酸(N297A)或天冬氨酸(N297D)替换天冬酰胺的氨基酸替代(编号方式依照Kabat EU索引)。
在上文和PCT公开文本No.WO 2012/130831中描述的Fc域以外,具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238,265,269,270,297,327和329中一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)(编号方式依照Kabat EU索引)。此类Fc突变体包括具有在氨基酸位置265,269,270,297和327的两个或更多个处的替代的Fc突变体,包括所谓的“DANA”Fc突变体,其具有残基265和297到丙氨酸的替代(美国专利No.7,332,581)。
可以使用本领域中公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,***或修饰来制备突变体Fc域。遗传方法可以包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成等。正确的核苷酸变化可以通过例如测序来验证。
可以容易地测定对Fc受体的结合,例如通过ELISA或通过使用标准仪器诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的表面等离振子共振(SPR)进行,并且Fc受体诸如可通过重组表达获得。或者,可使用已知表达特定Fc受体的细胞系,如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来估测Fc域或包含Fc域的抗体对Fc受体的结合亲和力。
可通过本领域中已知的方法来测量Fc域或包含Fc域的抗体的效应器功能。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的例子记载于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA 83,7059-7063(1986)和Hellstrom等,Proc Natl Acad Sci USA82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者,可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。对于此类测定法有用的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外,可体内评估感兴趣分子的ADCC活性,例如在动物模型中,诸如披露于Clynes等,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)的。
在一些实施方案中,Fc域对补体成分(特别是对C1q)的结合是降低的。因而,在其中Fc域工程化为具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可实施C1q结合测定法来测定Fc域或包含Fc域的抗体是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro等,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg等,Blood 101,1045-1052(2003)；以及Cragg和Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。
还可以使用本领域已知方法实施FcRn结合和体内清除/半衰期测定(见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929)。
特定的免疫缀合物
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种包含突变体IL-2多肽和结合CEA的抗体的免疫缀合物,
其中该突变体IL-2多肽是包含氨基酸替代F42A,Y45A和L72G(编号方式相对于人IL-2序列SEQ ID NO:52)的人IL-2分子；且
其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种包含突变体IL-2多肽和结合CEA的抗体的免疫缀合物,
其中该突变体IL-2多肽是包含氨基酸替代T3A,F42A,Y45A,L72G和C125A(编号方式相对于人IL-2序列SEQ ID NO:52)的人IL-2分子；且
其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种包含突变体IL-2多肽和结合CEA的抗体的免疫缀合物,
其中该突变体IL-2多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；且
其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在依照本发明的任何上述方面的一个实施方案中,该抗体是IgG类免疫球蛋白,其包含由第一和第二亚基构成的人IgG1Fc域,
其中在该Fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在该Fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引),
且其中进一步地该Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(KabatEU索引编号方式)。
在这个实施方案中,该突变体IL-2多肽可以经由SEQ ID NO:67的接头肽在它的氨基末端氨基酸处与该Fc域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种免疫缀合物,其包含包含与SEQ IDNO:44的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:45的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:46的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽。
对本发明特别有用的一种免疫缀合物是cergutuzumab amunaleukin(参见WHO药物信息(药学物质的国际非专有名称),推荐INN:列表75,2016,发布前拷贝(通过援引完整收入本文)。
在又一个方面,在本发明中特别有用的是一种免疫缀合物,其包含突变体IL-2多肽和结合FAP的抗体,
其中该突变体IL-2多肽是包含氨基酸替代F42A,Y45A和L72G(编号方式相对于SEQID NO:52的人IL-2序列)的人IL-2分子；且
其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种免疫缀合物,其包含突变体IL-2多肽和结合FAP的抗体,
其中该突变体IL-2多肽是包含氨基酸替代T3A,F42A,Y45A,L72G和C125A(编号方式相对于SEQ ID NO:52的人IL-2序列)的人IL-2分子；且
其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种免疫缀合物,其包含突变体IL-2多肽和结合FAP的抗体,
其中该突变体IL-2多肽包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列；且
其中该抗体包含(a)包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在依照本发明的任何上述方面的一个实施方案中,该抗体是IgG类免疫球蛋白,其包含由第一和第二亚基构成的人IgG1Fc域,
其中在该Fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在该Fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照Kabat EU索引),
且其中进一步地该Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(KabatEU索引编号方式)。
在这个实施方案中,该突变体IL-2多肽可以经由SEQ ID NO:67的接头肽在它的氨基末端氨基酸处与该Fc域的第一亚基的羧基末端氨基酸融合。
在一个方面,在本发明中特别有用的是一种免疫缀合物,其包含包含与SEQ IDNO:49的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽,包含与SEQ ID NO:50的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽,和包含与SEQ ID NO:51的序列至少约80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的多肽。
在本发明中有用的IL-2免疫缀合物,包括含有此类IL-2免疫缀合物的组合物,可以与CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂组合使用,用于治疗癌症。
III.CD40激动剂
对本发明的方法,用途,组合物和试剂盒有用的CD40激动剂的例子,和用于生成它们的方法描述于PCT公开文本No.WO 2003/040170,通过援引完整收入本文。
在上文和本文中描述的方法,用途,组合物,和试剂盒的一些实施方案中,该CD40激动剂是特异性结合CD40的抗体。在一些实施方案中,该CD40激动剂是特异性结合并活化人CD40的抗体。
CD40在本领域还称作“肿瘤坏死因子超家族成员5”,TNFRSF5,B细胞表面抗原40,CD40L受体,CDw40和p50。如本文中使用的,术语“CD40”指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD40,包括哺乳动物,诸如灵长动物(例如人),非人灵长动物(例如食蟹猴)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语涵盖“全长”和未加工的CD40以及源自细胞中的加工的任何形式的CD40(例如成熟蛋白)。该术语还涵盖CD40的天然发生变体和同等型,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,CD40是人CD40。人CD40的氨基酸序列显示于UniProtKB/Swiss-Prot登录号P25942。
在一些实施方案中,该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的重链互补决定区(HCDR)1,HCDR 2和HCDR 3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的轻链互补决定区(LCDR)1,LCDR 2和LCDR 3。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区是人可变区。在一些实施方案中,该重和/或轻链可变区包含人框架区(FR)。
在一些实施方案中,该抗体包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,和来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。在一些实施方案中,该抗体包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的重链互补决定区(HCDR)1,HCDR 2和HCDR 3,和来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的轻链互补决定区(LCDR)1,LCDR 2和LCDR 3。
在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:57的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH)。在一些实施方案中,该抗体包含包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中,该抗体包含(a)包含与SEQ IDNO:57的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(VH),和(b)包含与SEQ ID NO:58的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:57的序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:58的序列的轻链可变区。
在一些实施方案中,该特异性结合CD40的抗体是全长抗体。在一些实施方案中,该抗体是IgG类抗体,特别是IgG2亚类抗体,更加特别是人IgG2亚类抗体。在一些实施方案中,该特异性结合CD40的抗体是IgG2亚类的完全人抗体。在一个实施方案中,该抗体是以4x10-10M或更小的KD结合人CD40的IgG2亚类的完全人抗体。
在一个实施方案中,该特异性结合CD40的抗体包含包含与SEQ ID NO:59的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的重链多肽和包含与SEQ IDNO:60的序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％,或99％同一的序列的轻链多肽。在一个实施方案中,该抗体包含包含SEQ ID NO:59的序列的重链多肽和包含SEQ ID NO:60的序列的轻链多肽。
在一些实施方案中,所述CD40激动剂是如WO2003/040170中具体公开的任何抗CD40抗体。在一些实施方案中,该CD40激动剂选自依照WO2003/040170的称作3.1.1,7.1.2,10.8.3,15.1.1,21.4.1,21.2.1,22.1.1,23.5.1,23.25.1,23.29.1和24.2.1的抗体的组。分泌那些抗体的杂交瘤已经依照布达佩斯条约保藏。保藏号可以在WO2003/040170的段落[0250]中找到。在一个实施方案中,该CD40激动剂是WO 2003/040170的抗体21.4.1。在一个实施方案中,该CD40激动剂是包含WO 2003/040170的抗体21.4.1的重和轻链可变域氨基酸序列的抗体。在还有另一个实施方案中,该CD40激动剂是包含WO 2003/040170的抗体21.4.1的重和轻链氨基酸序列的抗体。
在本发明中有用的CD40激动剂,包括含有此类CD40激动剂的组合物,可以与IL-2免疫缀合物和任选地PD-1轴结合拮抗剂组合使用,用于治疗癌症。
IV.PD-1轴结合拮抗剂
可以任选地在本发明的方法,用途,组合物和试剂盒中使用PD-1轴结合拮抗剂。例如,可以使用的PD-1轴结合拮抗剂包括PD-1结合拮抗剂,PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂。PD-1(编程性死亡1)在本领域中也称为“编程性细胞死亡1”,PDCD1,CD279和SLEB2。一种例示性人PD-1显示于UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q15116。PD-L1(编程性死亡配体1)在本领域中也称为“编程性细胞死亡1配体1”,PDCD1LG1,CD274,B7-H,和PDL1。一种例示性人PD-L1显示于UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7。PD-L2(编程性死亡配体2)在本领域中也称为“编程性细胞死亡1配体2”,PDCD1LG2,CD273,B7-DC,Btdc,和PDL2。一种例示性人PD-L2显示于UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9BQ51。在一些实施方案中,PD-1,PD-L1,和PD-L2是人PD-1,PD-L1和PD-L2。
在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1对它的配体结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,该PD-1配体结合配偶是PD-L1和/或PD-L2。在另一个实施方案中,PD-L1结合拮抗剂是抑制PD-L1对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-L1结合配偶是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中,该PD-L2结合拮抗剂是抑制PD-L2对它的结合配偶的结合的分子。在一个具体的方面,PD-L2结合配偶是PD-1。该拮抗剂可以是抗体,其抗原结合片段,免疫粘附素,融合蛋白,或寡肽。
在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂是抗PD-1抗体(例如人抗体,人源化抗体,或嵌合抗体)。在一些实施方案中,该抗PD-1抗体选自由MDX 1106(纳武单抗),MK-3475(派姆单抗),CT-011(匹迪单抗),MEDI-0680(AMP-514),PDR001,REGN2810,和BGB-108组成的组。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如包含融合至恒定区(例如免疫球蛋白序列的Fc区)的PD-L1或PD-L2胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在一些实施方案中,该PD-1结合拮抗剂是AMP-224。在一些实施方案中,该PD-L1结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体选自由YW243.55.S70,MPDL3280A(阿特珠单抗),MDX-1105,MEDI4736(度伐单抗),和MSB0010718C(阿维单抗)组成的组。在一个优选实施方案中,该抗PD-L1抗体是阿特珠单抗。抗体YW243.55.S70是WO 2010/077634中描述的一种抗PD-L1。MDX-1105,也称为BMS-936559,是WO2007/005874中描述的一种抗PD-L1抗体。MEDI4736是WO2011/066389和US2013/034559中描述的一种抗PD-L1单克隆抗体。纳武单抗,也称为MDX-1106-04,MDX-1106,ONO-4538,BMS-936558,和是WO2006/121168中描述的一种抗PD-1抗体。派姆单抗,也称为MK-3475,Merck 3475,lambrolizumab,和SCH-900475,是WO2009/114335中描述的一种抗PD-1抗体。CT-011,也称为hBAT,hBAT-1或匹迪单抗,是WO2009/101611中描述的一种抗PD-1抗体。AMP-224,也称为B7-DCIg,是WO2010/027827和WO2011/066342中描述的一种PD-L2-Fc融合可溶性受体。
在一些实施方案中,该PD-1轴结合拮抗剂是抗PD-L1抗体。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体能够抑制PD-L1和PD-1之间和/或PD-L1和B7-1之间的结合。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是单克隆抗体。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是选自由Fab,Fab’-SH,Fv,scFv,和(Fab’)2片段组成的组的抗体片段。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是人源化抗体。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体是人抗体。
对本发明的方法,用途,组合物和试剂盒有用的抗PD-L1抗体的例子,及其生成方法描述于PCT专利申请WO2010/077634,WO2007/005874,WO2011/066389,和US2013/034559,其通过援引完整收入本文。在本发明中有用的抗PD-L1抗体,包括含有此类抗体的组合物,可以与IL-2免疫缀合物和CD40激动剂组合使用来治疗癌症。
抗PD1抗体
在一些实施方案中,该抗PD-1抗体是MDX-1106。“MDX-1106”的备选名称包括MDX-1106-04,ONO-4538,BMS-936558或纳武单抗。在一些实施方案中,该抗PD-1抗体是纳武单抗(CAS登记号:946414-94-4)。在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-1抗体,其包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:1的重链可变区氨基酸序列,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:2的轻链可变区氨基酸序列。在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-1抗体,其包含重链和/或轻链序列,其中:
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性:
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLDCKASGITFSNSGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSKRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLFLQMNSLRAEDTAVYYCATNDDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:1),且
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性:
EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQSSNWPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:2)。
抗PD-L1抗体
WO 2010/077634 A1和US 8,217,149中描述的抗PD-L1抗体可用于本文所述方法,用途,组合物和试剂盒。在一些实施方案中,该抗PD-L1抗体包含SEQ ID NO:3的重链可变区序列和/或SEQ ID NO:4的轻链可变区序列。在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和/或轻链序列,其中:
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:3),且
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一个实施方案中,该抗PD-L1抗体包含重链可变区多肽,其包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3序列,其中:
(a)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5)；
(b)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)；
(c)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7)；
进一步地其中:X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S。在一个具体的方面,X1是D；X2是S且X3是T。
在另一个方面,该多肽进一步包含依照下式的在HVR间并置的可变区重链框架序列:
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4)。
在还有另一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在又一个方面,该框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面,至少一个框架序列如下:
HC-FR1是EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS(SEQ ID NO:8)
HC-FR2是WVRQAPGKGLEWV(SEQ ID NO:9)
HC-FR3是RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
HC-FR4是WGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:11)。
在仍有又一个方面,该重链多肽进一步与可变区轻链组合,该可变区轻链包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3,其中:
(a)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)；
(b)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:13)；
(c)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)；
其中:X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y,G,F,或S；X12是L,Y,F或W；X13是Y,N,A,T,G,F或I；X14是H,V,P,T或I；X15是A,W,R,P或T。在仍有又一个方面,X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。
在仍有又一个方面,该轻链进一步包含依照下式的在HVR间并置的可变区轻链框架序列:
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面,该框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面,至少一个框架序列如下:
LC-FR1是DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
LC-FR2是WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
LC-FR3是GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
LC-FR4是FGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:18)。
在另一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体或抗原结合片段,其包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链包含HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,其中进一步地:
(i)HVR-H1序列是GFTFSX1SWIH(SEQ ID NO:5),
(ii)HVR-H2序列是AWIX2PYGGSX3YYADSVKG(SEQ ID NO:6)
(iii)HVR-H3序列是RHWPGGFDY(SEQ ID NO:7),且
(b)轻链包含HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3,其中进一步地:
(i)HVR-L1序列是RASQX4X5X6TX7X8A(SEQ ID NO:12)
(ii)HVR-L2序列是SASX9LX10S(SEQ ID NO:13)；且
(iii)HVR-L3序列是QQX11X12X13X14PX15T(SEQ ID NO:14)；
其中:X1是D或G；X2是S或L；X3是T或S；X4是D或V；X5是V或I；X6是S或N；X7是A或F；X8是V或L；X9是F或T；X10是Y或A；X11是Y,G,F,或S；X12是L,Y,F或W；X13是Y,N,A,T,G,F或I；X14是H,V,P,T或I；X15是A,W,R,P或T。在一个具体的方面,X1是D；X2是S且X3是T。在另一个方面,X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H；X15是A。在还有另一个方面,X1是D；X2是S且X3是T,X4是D；X5是V；X6是S；X7是A；X8是V；X9是F；X10是Y；X11是Y；X12是L；X13是Y；X14是H且X15是A。
在又一个方面,该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是自Kabat亚组I,II,或III序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8,9,10和11所列。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是自KabatκI,II,II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15,16,17和18所列。
在仍有又一个具体的方面,该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面,该人恒定区选自由IgG1,IgG2,IgG2,IgG3,IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面,该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面,该鼠恒定区选自由IgG1,IgG2A,IgG2B,IgG3组成的组。在仍有又一个方面,该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面,该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面,该最小限度的效应器功能源自“效应器较小(effector-less)的Fc突变”或无糖基化(aglycosylation)。在仍有又一个实施方案中,该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在还有另一个实施方案中,有用的是一种抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链进一步包含分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19),AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％序列同一性的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3序列,或(b)轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22),SASFLYS(SEQID NO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％序列同一性的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3序列。
在一个具体的方面,该序列同一性是86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。
在另一个方面,该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是自Kabat亚组I,II,或III序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8,9,10和11所列。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是自KabatκI,II,II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15,16,17和18所列。
在仍有又一个具体的方面,该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面,该人恒定区选自由IgG1,IgG2,IgG2,IgG3,IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面,该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面,该鼠恒定区选自由IgG1,IgG2A,IgG2B,IgG3组成的组。在仍有又一个方面,该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面,该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面,该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中,该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在另一个又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25),和/或
(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一个具体的方面,该序列同一性是86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。在另一个方面,该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在又一个方面,该重链框架序列是自Kabat亚组I,II,或III序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8,9,10和WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)所列。
在仍有又一个方面,该轻链框架序列是自KabatκI,II,II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15,16,17和18所列。
在仍有又一个具体的方面,该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面,该人恒定区选自由IgG1,IgG2,IgG2,IgG3,IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面,该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面,该鼠恒定区选自由IgG1,IgG2A,IgG2B,IgG3组成的组。在仍有又一个方面,该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面,该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面,该最小限度的效应器功能源自原核细胞中的生成。在仍有又一个具体的方面,该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中,该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在又一个方面,该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在仍有又一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是自Kabat亚组I,II,或III序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个重链框架序列如下:
HC-FR1 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS(SEQ ID NO:29)
HC-FR2 WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:30)
HC-FR3 RFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:10)
HC-FR4 WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:27)。
在仍有又一个方面,该轻链框架序列是自KabatκI,II,II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个轻链框架序列如下:
LC-FR1 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:15)
LC-FR2 WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:16)
LC-FR3 GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:17)
LC-FR4 FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:28)。
在仍有又一个具体的方面,该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面,该人恒定区选自由IgG1,IgG2,IgG2,IgG3,IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面,该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面,该鼠恒定区选自由IgG1,IgG2A,IgG2B,IgG3组成的组。在仍有又一个方面,该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面,该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面,该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中,该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在还有另一个实施方案中,有用的是一种抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中:
(c)重链进一步包含分别与GFTFSDSWIH(SEQ ID NO:19),AWISPYGGSTYYADSVKG(SEQ ID NO:20)和RHWPGGFDY(SEQ ID NO:21)具有至少85％序列同一性的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3序列,和/或(d)轻链进一步包含分别与RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:22),SASFLYS(SEQ ID NO:23)和QQYLYHPAT(SEQ ID NO:24)具有至少85％序列同一性的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3序列。
在一个具体的方面,该序列同一性是86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％。
在另一个方面,该重链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(HC-FR1)-(HVR-H1)-(HC-FR2)-(HVR-H2)-(HC-FR3)-(HVR-H3)-(HC-FR4),且该轻链可变区包含如下的在HVR间并置的一个或多个框架序列:
(LC-FR1)-(HVR-L1)-(LC-FR2)-(HVR-L2)-(LC-FR3)-(HVR-L3)-(LC-FR4)。在还有另一个方面,该框架序列是自人共有框架序列衍生的。在仍有又一个方面,该重链框架序列是自Kabat亚组I,II,或III序列衍生。在仍有又一个方面,该重链框架序列是VH亚组III共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个重链框架序列如SEQ ID NO:8,9,10和WGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:31)所列。
在仍有又一个方面,该轻链框架序列是自KabatκI,II,II或IV亚组序列衍生的。在仍有又一个方面,该轻链框架序列是VLκI共有框架。在仍有又一个方面,一个或多个轻链框架序列如SEQ ID NO:15,16,17和18所列。在仍有又一个具体的方面,该抗体进一步包含人或鼠恒定区。在仍有又一个方面,该人恒定区选自由IgG1,IgG2,IgG2,IgG3,IgG4组成的组。在仍有又一个具体的方面,该人恒定区是IgG1。在仍有又一个方面,该鼠恒定区选自由IgG1,IgG2A,IgG2B,IgG3组成的组。在仍有又一个方面,该鼠恒定区是IgG2A。在仍有又一个具体的方面,该抗体具有降低的或最小限度的效应器功能。在仍有又一个具体的方面,该最小限度的效应器功能源自“效应器较小的Fc突变”或无糖基化。在仍有又一个实施方案中,该效应器较小的Fc突变是恒定区中的N297A或D265A/N297A替代。
在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:25),或
(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中该重链可变区序列与SEQID NO:25的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或100％序列同一性且该重链可变区序列与SEQ ID NO:25的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或100％序列同一性。在一些实施方案中,可以在重和/或轻链的N端删除,替代或修饰一个,两个,三个,四个或五个氨基酸残基。
在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中:
(a)重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTK(SEQ ID NO:26),或
(b)轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO:4)。
在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中该重链可变区序列与SEQID NO:26的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链可变区序列,其中该轻链可变区序列与SEQ ID NO:4的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或100％序列同一性且该重链可变区序列与SEQ ID NO:26的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,至少99％,或100％序列同一性。在一些实施方案中,可以在重和/或轻链的N端删除,替代或修饰一个,两个,三个,四个或五个氨基酸残基。
在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链序列,其中:
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO:32),和/或
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:33)。
在仍有又一个实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链序列,其中:
(a)该重链序列与下述重链序列具有至少85％序列同一性:
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDSWIHWVRQAPGKGLEWVAWISPYGGSTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCARRHWPGGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:56),和/或
(b)该轻链序列与下述轻链序列具有至少85％序列同一性:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYLYHPATFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:33)。
在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链序列,其中该轻链序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链序列,其中该重链序列与SEQ ID NO:32或56的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链序列,其中该轻链序列与SEQ ID NO:33的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％序列同一性且该重链序列与SEQ ID NO:32或56的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％序列同一性。在一些实施方案中,有用的是一种分离的抗PD-L1抗体,其包含重链和轻链序列,其中该轻链序列与SEQID NO:33的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％序列同一性且该重链序列与SEQ ID NO:32的氨基酸序列具有至少85％,至少86％,至少87％,至少88％,至少89％,至少90％,至少91％,至少92％,至少93％,至少94％,至少95％,至少96％,至少97％,至少98％,或至少99％序列同一性。
在一些实施方案中,该分离的抗PD-L1抗体是无糖基化的。抗体的糖基化典型地是N连接的或O连接的。N连接的指碳水化合物模块附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除脯氨酸以外的任何氨基酸)是碳水化合物模块酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。如此,这些三肽序列任一在多肽中的存在创建潜在的糖基化位点。O连接的糖基化指糖N-乙酰基半乳糖胺,半乳糖,或木糖之一附着至羟基氨基酸,最常见的是丝氨酸或苏氨酸,尽管也可以使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。通过改变氨基酸序列,使得去除上文所述三肽序列(用于N连接的糖基化位点)之一,方便地实现自抗体去除糖基化位点。可以通过将糖基化位点内的天冬酰胺,丝氨酸或苏氨酸残基用另一种氨基酸残基(例如甘氨酸,丙氨酸或保守氨基酸替代)替代来进行该改变。
在本文中的任何实施方案中,该分离的抗PD-L1抗体能结合人PD-L1(例如UniProtKB/Swiss-Prot登录号Q9NZQ7.1中所示人PD-L1)或其变体。
IV.药物组合物和配制剂
本文中还提供的是包含本文所述IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和/或PD-1轴结合拮抗剂和药学可接受载剂的药物组合物和配制剂。
可以通过混合具有期望纯度的活性组分(例如IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和/或PD-1轴结合拮抗剂)与一种或多种任选的药学可接受载剂(Remington’sPharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980))以冻干配制剂或水溶液的形式制备如本文中描述的药物组合物和配制剂。一般地,药学可接受载剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的,而且包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。本文中的例示性药学可接受载剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rHuPH20(Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法,包括rHuPH20描述于美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968。在一个方面,sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。
例示性冻干抗体配制剂描述于美国专利No.6,267,958。水性抗体配制剂包括那些描述于美国专利No.6,171,586和WO2006/044908的,后一种配制剂包含组氨酸-乙酸盐缓冲剂。
本文中的组合物和配制剂还可含有超过一种所治疗特定适应症所必需的活性组分,优选那些活性互补且彼此没有不利影响的。合适地是,此类活性组分以对于预定目的有效的量组合存在。
活性组分可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶状药物投递***中(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳剂,纳米颗粒和纳米胶囊),或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第16版,Osol,A.编(1980)。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有抗体的固体疏水性聚合物的半透性基质,该基质处于成形物品的形式,例如膜,或微胶囊。要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可容易地实现,例如通过穿过无菌滤膜过滤。
IV.治疗方法
本文中提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包括对该个体施用有效量的IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合。在一些实施方案中,该治疗在治疗后在该个体中导致响应。在一些实施方案中,该响应是部分响应。在一些实施方案中,该响应是完全响应。在一些实施方案中,该治疗在该治疗停止后在该个体中导致持久响应(例如持久部分响应或完全响应)。本文所述方法可用于治疗期望增强免疫原性的状况,诸如为了治疗癌症提高肿瘤免疫原性。本文中还提供的是在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法,其包括对该个体施用有效量的IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
在一些情况中,本文中提供的方法包括施用有效量的选自由PD-1结合拮抗剂,PD-L1结合拮抗剂,和PD-L2结合拮抗剂组成的组的PD-1轴结合拮抗剂。在一些情况中,该PD-L1结合拮抗剂是抗体,诸如能够抑制PD-L1结合PD-1和B7.1,但是不破坏PD-1结合PD-L2的抗体。在一些情况中,该PD-L1结合拮抗性抗体是MPDL3280A,其可以以约800mg至约1500mg每三周(例如约1000mg至约1300mg每三周,例如约1100mg至约1200mg每三周)的剂量施用。在一些实施方案中,MPDL3280A以约1200mg每三周的剂量施用。
作为一般性建议,可施用于人的PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)的治疗有效量会在约0.01至约50mg/kg患者体重的范围中,无论是通过一次或多次施用。在一些实施方案中,例如,该拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)以例如每天施用约0.01至约45mg/kg,约0.01至约40mg/kg,约0.01至约35mg/kg,约0.01至约30mg/kg,约0.01至约25mg/kg,约0.01至约20mg/kg,约0.01至约15mg/kg,约0.01至约10mg/kg,约0.01至约5mg/kg,或约0.01至约1mg/kg的剂量施用。在一些实施方案中,该拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)以15mg/kg施用。然而,其它剂量方案可能是有用的。在一个实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)以约100mg,约200mg,约300mg,约400mg,约500mg,约600mg,约700mg,约800mg,约900mg,约1000mg,约1100mg,约1200mg,约1300mg,约1400mg,或约1500mg的剂量施用于人。在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)以约1150mg至约1250mg每三周的剂量施用。在一些实施方案中,PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)以约1200mg每三周的剂量施用。该剂量可以作为单剂或作为多剂(例如2或3剂)施用,诸如输注。该抗体在组合治疗中施用的剂量可以与单一治疗相比降低。在一些实施方案中,例如,该用于在个体中治疗癌症或延迟其进展的方法包括包含如下治疗周期的剂量给药方案,其中对该个体在每个周期的第1天以约1200mg的剂量施用PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A),其中每个周期是21天(即每21天重复每个周期)。此疗法的进展易于通过常规技术来监测。
在一些情况中,本文中提供的方法包括施用有效量的IL-2免疫缀合物(例如CEAIL2v,FAP IL2v)。在一些情况中,该IL-2免疫缀合物以约5mg至约100mg每周(例如约10mg至约60mg每周,例如约10mg至约40mg每周)的剂量施用于该个体。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物以约10mg每周的剂量施用。作为一般性建议,IL-2免疫缀合物施用于人的治疗有效量会在约5至约100mg的范围中(例如约5mg,约10mg,约15mg,约20mg,约25mg,约30mg,约35mg,约40mg,约45mg,约50mg,约55mg,约60mg,约65mg,约70mg,约75mg,约80mg,约85mg,约90mg,约95mg,或约100mg),无论是通过一次或多次施用。例如,在一些实施方案中,施用约10mg的IL-2免疫缀合物。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物以10mg一周一次施用。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物可以每周,每2周,每3周,每4周,在每个21天周期的第1,8和15天,或在每个28天周期的第1,8,和15天施用。
在一些情况中,本文中提供的方法包括施用有效量的CD40激动剂。在一些情况中,该CD40激动剂以约2mg至约100mg每周(例如约4mg至约60mg每周,例如约4mg至约20mg每周)的剂量施用于该个体。在一些实施方案中,该CD40激动剂以约8mg每周的剂量施用。作为一般性建议,CD40激动剂施用于人的治疗有效量会在约2至约100mg的范围中(例如约2mg,约4mg,约5mg,约8mg,约10mg,约12mg,约15mg,约16mg,约20mg,约30mg,约40mg,约50mg,约60mg,约70mg,约80mg,约90mg,或约100mg),无论是通过一次或多次施用。例如,在一些实施方案中,施用约8mg的CD40激动剂。在一些实施方案中,该CD40激动剂以8mg一周一次施用。在一些实施方案中,该CD40激动剂可以每周,每2周,每3周,每4周,在每个21天周期的第1,8和15天,或在每个28天周期的第1,8,和15天施用。
在一些情况中,该IL-2免疫缀合物(例如CEA IL2v或FAP IL2v),该CD40激动剂,和任选地该PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)在一个剂量给药方案中施用。在该剂量给药方案的背景中这些药剂的施用可以是并行的或分开的。例如,在一些情况中,本文中提供的方法包括包含如下治疗周期的剂量给药方案,其中对该个体在每个周期的第1天以约1200mg的剂量施用PD-1轴结合拮抗剂,并在每个周期的第1,8,和15天以约10mg的剂量施用IL-2免疫缀合物,并在每个周期的第1天以约16mg的剂量施用CD40激动剂,每21天重复每个周期。
在一些实施方案中,该个体是人。在一些实施方案中,该个体罹患局部晚期或转移性癌症。在一些实施方案中,该个体具有CEA阳性癌症。在一些实施方案中,该个体具有FAP阳性癌症。在一些实施方案中,该癌症是实体瘤。在一些实施方案中,该癌症是结肠癌,肺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,胰腺癌,子宫内膜癌,乳腺癌,肾癌,食管癌,或***癌。在一些实施方案中,该乳腺癌是乳腺癌瘤或乳腺腺癌。在一些实施方案中,该乳腺癌瘤是侵入性导管癌。在一些实施方案中,该肺癌是肺腺癌。在一些实施方案中,该结肠癌是结肠直肠腺癌。在一些实施方案中,该个体中的癌细胞表达PD-L1。在一些实施方案中,该个体中的癌细胞以可检测的(例如使用本领域已知方法可检测的)水平表达CEA蛋白质。在一些实施方案中,该个体中的癌细胞(特别是癌症的基质细胞,诸如成纤维细胞)以可检测的(例如使用本领域已知方法可检测的)水平表达FAP蛋白质。
在一些实施方案中,该个体在IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂的组合治疗之前已经用癌症疗法治疗过。在一些实施方案中,该个体具有对一种或多种癌症疗法有抗性的癌症。在一些实施方案中,对癌症疗法的抗性包括癌症的复发或顽固性癌症。复发可以指治疗后在原始部位或新部位癌症的再出现。在一些实施方案中,对癌症疗法的抗性包括用抗癌疗法治疗期间癌症的进展。在一些实施方案中,对癌症疗法的抗性包括不响应治疗的癌症。该癌症可以是在治疗开始时有抗性的,或者它可以在治疗期间变成有抗性的。在一些实施方案中,该癌症处于早期阶段或处于晚期阶段。
在一些实施方案中,本发明的组合疗法包括施用IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。该IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和PD-1轴结合拮抗剂可以以本领域已知的任何合适方式施用。例如,该IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和PD-1轴结合拮抗剂可以序贯(在不同时间)或并行(在相同时间)施用。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和PD-1轴结合拮抗剂各自在分开的组合物中。在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物与该CD40激动剂和/或该PD-1轴结合拮抗剂在同一组合物中。
该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂,和该PD-1轴结合拮抗剂可以通过相同施用路径或通过不同施用路径来施用。在一些实施方案中,静脉内,肌肉内,皮下,表面,口服,经皮,腹膜内,眼窝内,通过植入,通过吸入,鞘内,室内,或鼻内施用该PD-1轴结合拮抗剂。在一些实施方案中,静脉内,肌肉内,皮下,表面,口服,经皮,腹膜内,眼窝内,通过植入,通过吸入,鞘内,室内,或鼻内施用该CD40激动剂。可以施用有效量的该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和任选地该PD-1轴结合拮抗剂来预防或治疗疾病。该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂和/或该PD-1轴结合拮抗剂的适宜剂量可以基于要治疗的疾病的类型,该IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和PD-1轴结合拮抗剂的类型,该疾病的严重程度和过程,该个体的临床状况,该个体的临床史和对该治疗的响应,和主治医师的斟酌来确定。
在一些实施方案中,该方法可进一步包括另外的疗法。该另外的疗法可以是放射疗法,手术(例如***肿瘤切除术和***切除术),化学疗法,基因疗法,DNA疗法,病毒疗法,RNA疗法,免疫疗法,骨髓移植,纳米疗法,单克隆抗体疗法,或前述的组合。该另外的疗法可以是辅助或新辅助疗法的形式。在一些实施方案中,该另外的疗法是施用小分子酶抑制剂或抗代谢剂。在一些实施方案中,该另外的疗法是施用副作用限制剂(例如旨在减少治疗的副作用的发生和/或减轻治疗的副作用的严重程度的药剂,诸如治恶心药,等)。在一些实施方案中,该另外的疗法是放射疗法。在一些实施方案中,该另外的疗法是手术。在一些实施方案中,该另外的疗法是放射疗法和手术的组合。在一些实施方案中,该另外的疗法是γ照射。在一些实施方案中,该另外的疗法是靶向PI3K/AKT/mTOR途径的疗法,HSP90抑制剂,微管蛋白抑制剂,凋亡抑制剂,和/或化学预防剂。该另外的疗法可以是本文所述化疗剂中的一种或多种。
其它组合疗法
本文中还提供的是用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包括对该个体施用与另一种抗癌剂或癌症疗法联合的IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂(例如抗PD-L1抗体,例如MPDL3280A)。
在一些实施方案中,IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂可以与化疗或化疗剂联合施用。在一些实施方案中,IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂可以与放射疗法或放疗剂联合施用。在一些实施方案中,IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂可以与靶向疗法或靶向治疗剂联合施用。在一些实施方案中,IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂可以与免疫疗法或免疫治疗剂,例如单克隆抗体联合施用。
V.制品或试剂盒
在本发明的另一个实施方案中,提供包含IL-2免疫缀合物,CD40激动剂,和/或PD-1轴结合拮抗剂的制品或试剂盒。在一些实施方案中,该制品或试剂盒进一步包含包含说明书的包装插页,该说明书关于与CD40激动剂和任选地PD-1轴结合拮抗剂联合使用IL-2免疫缀合物来在个体中治疗癌症或延迟癌症进展或增强具有癌症的个体的免疫功能。该制品或试剂盒中可以包括本文所述任何IL-2免疫缀合物,CD40激动剂和/或PD-1轴结合拮抗剂。
在一些实施方案中,该IL-2免疫缀合物,该CD40激动剂,和该PD-1轴结合拮抗剂在同一容器或分开的容器中。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,袋和注射器。该容器可以自各种材料形成,诸如玻璃,塑料(诸如聚氯乙烯或聚烯烃),或金属合金(诸如不锈钢或哈氏合金)。在一些实施方案中,该容器装有该配制剂,而且该容器上或与该容器关联的标签可指示使用说明。该制品或试剂盒可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针头,注射器,和印有使用说明的包装插页。在一些实施方案中,该制品进一步包括一种或多种另一种药剂(例如化疗剂和抗肿瘤剂)。适合于该一种或多种药剂的容器包括例如瓶,管形瓶,袋和注射器。
认为本说明书足以使得本领域技术人员能够实施本发明。根据上述描述,在本文所示和所述之外对本发明的各种修改对本领域技术人员会变得明显且落在所附权利要求的范围内。通过援引将本文中引用的所有出版物,专利,和专利申请完整收入本文用于所有目的。
实施例
通过参考下述实施例,会更加全面地理解本发明。然而,它们不应解释为限制本发明的范围。理解的是,本文中描述的实施例和实施方案只是出于例示目的,而且根据它们,本领域技术人员会想到各种变更或变化,而且它们被包括在本申请的精神和范围及所附权利要求的范围内。
实施例1:单独的和与抗CD40单抗和抗PD-L1单抗组合的针对FAP的靶向性IL2v免疫缀合物在小鼠肿瘤细胞系同基因模型中的体内功效
在同基因小鼠模型中对单独的和与CD40单抗和PD-L1单抗组合的针对FAP的靶向性IL2v免疫缀合物测试它们的抗肿瘤功效。
Panc02-Fluc胰腺同基因模型
在胰内注射入Black 6小鼠的小鼠胰腺Panc02-Fluc转染子细胞系中测试鼠替代物FAP靶向性FAP-IL2v免疫缀合物。
Panc02-H7细胞(小鼠胰腺癌)最初自MD Anderson癌症中心(Texas,USA)获得并在扩充后保藏于Roche-Glycart内部细胞库。Panc02-H7-Fluc细胞系通过钙转染和亚克隆技术内部生成。在含有10％FCS(Sigma),500μg/ml潮霉素和1％Glutamax的RPMI培养基中培养Panc02-H7-Fluc。在5％CO2的水饱和气氛中于37℃培养细胞。将第14代用于移植。细胞存活力是92.8％。使用0.3ml结核菌素注射器(BD Biosciences,Germany)将1x105个细胞每只动物注射入小鼠的胰腺。为此,在麻醉的Black 6小鼠的左腹部位做一小切口。打开腹膜壁并用钳子小心分离胰腺。在胰尾中注射10μl(RPMI培养基中的1x105个Panc02-H7-Fluc细胞)细胞悬浮液。使用5/0可分解缝合线关闭腹膜壁和皮肤伤口。
依照承诺的指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)以12小时光亮/12小时黑暗的日周期在无特定病原体条件下维持实验开始时8-9周龄的雌性Black 6小鼠(Charles River,Lyon,France)。实验性研究方案得到当地政府审查和批准(ZH193/2014)。到达后,将动物维持1周以适应新环境和观察。定期进行连续健康监测。
在研究第0天给小鼠胰腺内注射1x105个Panc02-Fluc细胞,随机化并称重。注射肿瘤细胞后1周,给小鼠静脉内注射FAP-IL-2v(40μg),PD-L1单抗(200μg),CD40单抗(200μg)和它们的组合；FAP-IL-2v+PD-L1单抗,FAP-IL-2v+CD40单抗,FAP-IL-2v+PD-L1单抗+CD40单抗,一周一次,持续三周。对媒介组中的小鼠注射组氨酸缓冲液。
图1显示组合FAP-IL-2v+CD40单抗+PD-L1单抗介导与所测试的所有其它单一药剂和组合相比卓越的就增强的中值和总体存活而言的功效。
为了通过SPECTRUM的生物发光成像,在生物发光成像采集(BLI)前10分钟给小鼠腹膜内注射150mg/kg D-萤光素,稍后用4％异氟烷麻醉。随后,将小鼠转移入隔离室,放置入SPECTRUM。通过采集发光信号达10-50秒来实施体内BLI采集。作为辐射率(光子)/sec/cm2/sr保存数据。用Living4.4软件实施体内BLI数据分析并以肿瘤抑制曲线表示。
图2显示组合FAP-IL-2v+CD40单抗+PD-L1单抗介导与所测试的所有其它单一药剂和组合相比卓越的就降低生物发光信号(光子/秒)而言的功效。
在体内肿瘤模型中使用基于WO 2010/077634中描述的YW243.55.S70 PD-L1抗体(序列显示于图11)的抗小鼠PD-L1抗体。此抗体含有DAPG突变以消除FcγR相互作用。将YW243.55.S70的可变区附着至具有DAPG Fc突变的鼠IgG1恒定域。
在完全免疫胜任小鼠中的体内肿瘤模型中使用鼠源化嵌合型式的FAP靶向性IL-2变体免疫细胞因子FAP-IL2v,称作muFAP-muIL2v,以降低抗药物抗体(ADA)的形成。在鼠源化替代分子中,在muIgG1上用DDKK突变替换Fc域节-入-穴突变且在muIgG1上用DAPG突变替换LALA P329G突变。
在体内肿瘤模型中使用抗小鼠CD40抗体。
在体内肿瘤模型中使用的分子的多肽序列如下:
序列表
<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-La Roche AG）
<120> 供治疗癌症的方法中使用的
白介素-2免疫缀合物, CD40激动剂, 和任选地PD-1轴结合拮抗剂
<130> P34242
<160> 70
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu
435
<210> 2
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 2
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 3
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 3
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 4
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Asp 或 Gly
<400> 5
Gly Phe Thr Phe Ser Xaa Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 6
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Ser 或 Leu
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> Thr 或 Ser
<400> 6
Ala Trp Ile Xaa Pro Tyr Gly Gly Ser Xaa Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 7
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 8
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 9
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 9
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
1 5 10
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 10
Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
20 25 30
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 11
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala
1 5 10
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Asp 或 Val
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Val 或 Ile
<220>
<221> 变体
<222> (7)..(7)
<223> Ser 或 Asn
<220>
<221> 变体
<222> (9)..(9)
<223> Ala 或 Phe
<220>
<221> 变体
<222> (10)..(10)
<223> Val 或 Leu
<400> 12
Arg Ala Ser Gln Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Xaa Ala
1 5 10
<210> 13
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Phe 或 Thr
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> Tyr 或 Ala
<400> 13
Ser Ala Ser Xaa Leu Xaa Ser
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> Tyr, Gly, Phe 或 Ser
<220>
<221> 变体
<222> (4)..(4)
<223> Leu, Tyr, Phe 或 Trp
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> Tyr, Asn, Ala, Thr, Gly, Phe 或 Ile
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(6)
<223> His, Val, Pro, Thr 或 Ile
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> Ala, Trp, Arg, Pro 或 Thr
<400> 14
Gln Gln Xaa Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Thr
1 5
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 15
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys
20
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 16
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 17
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys
20 25 30
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 18
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 19
Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His
1 5 10
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 20
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 21
Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr
1 5
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 22
Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 23
Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser
1 5
<210> 24
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 24
Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr
1 5
<210> 25
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 25
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120
<210> 27
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 27
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 28
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser
20 25 30
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 30
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 31
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
1 5 10 15
<210> 32
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 33
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 34
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 34
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
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<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr
180 185 190
Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro
210 215 220
Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Ala Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp
260 265 270
Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser
305 310 315 320
Ala Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln
340 345 350
Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe
355 360 365
Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu
370 375 380
Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe
385 390 395 400
Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn
405 410 415
Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr
420 425 430
Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
435 440
<210> 37
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
100 105 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
115 120 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
130 135 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145 150 155 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
165 170 175
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180 185 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 38
Glu Phe Gly Met Asn
1 5
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 39
Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 40
Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 41
Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala
1 5 10
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 42
Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 43
His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr
1 5 10
<210> 44
<211> 598
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
450 455 460
Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu
465 470 475 480
His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr
485 490 495
Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro
500 505 510
Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu
515 520 525
Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His
530 535 540
Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu
545 550 555 560
Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr
565 570 575
Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser
580 585 590
Ile Ile Ser Thr Leu Thr
595
<210> 45
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 46
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu
85 90 95
Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 47
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 47
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
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85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 594
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 49
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
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435 440 445
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala
450 455 460
Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu Leu Leu
465 470 475 480
Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys
485 490 495
Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys Lys Ala Thr
500 505 510
Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu
515 520 525
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565 570 575
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580 585 590
Leu Thr
<210> 50
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 50
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
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65 70 75 80
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85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
210 215 220
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 51
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 51
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 52
<211> 133
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 52
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 53
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 53
Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 54
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 54
Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His
1 5 10 15
Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
20 25 30
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
35 40 45
Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys
50 55 60
Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu
65 70 75 80
Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu
85 90 95
Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala
100 105 110
Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile
115 120 125
Ile Ser Thr Leu Thr
130
<210> 55
<211> 20
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 55
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 56
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 56
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser
20 25 30
Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
225 230 235 240
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
245 250 255
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
260 265 270
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
275 280 285
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Ala Ser Thr Tyr Arg Val Val
290 295 300
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
305 310 315 320
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
325 330 335
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
340 345 350
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
355 360 365
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
370 375 380
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
385 390 395 400
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
405 410 415
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
420 425 430
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
<210> 57
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Asn Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gln Pro Leu Gly Tyr Cys Thr Asn Gly Val Cys Ser Tyr
100 105 110
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser
115 120 125
Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr
130 135 140
Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro
145 150 155 160
Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val
165 170 175
His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser
180 185 190
Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr
195 200 205
Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val
210 215 220
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val
225 230 235 240
Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro
450
<210> 60
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Tyr Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Thr Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ile Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 61
<211> 438
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 61
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Asp Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg His Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp
165 170 175
Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro
180 185 190
Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys
195 200 205
Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile
210 215 220
Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val
260 265 270
Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala
305 310 315 320
Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro
325 330 335
Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala
340 345 350
Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu
355 360 365
Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr
370 375 380
Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr
385 390 395 400
Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe
405 410 415
Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys
420 425 430
Ser Leu Ser His Ser Pro
435
<210> 62
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 62
Asp Thr Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Asp Ser Val Ser Thr Leu Met
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Leu Ala Ser His Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp
65 70 75 80
Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Trp Asn Asp Pro Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro
100 105 110
Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn
130 135 140
Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn
145 150 155 160
Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr
180 185 190
Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Asn Glu Cys
210
<210> 63
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 63
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Asp Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Asp Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
435 440 445
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Ser Ser
450 455 460
Ser Thr Ala Glu Ala Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln
465 470 475 480
Gln His Leu Glu Gln Leu Leu Met Asp Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg
485 490 495
Met Glu Asn Tyr Arg Asn Leu Lys Leu Pro Arg Met Leu Thr Ala Lys
500 505 510
Phe Ala Leu Pro Lys Gln Ala Thr Glu Leu Lys Asp Leu Gln Cys Leu
515 520 525
Glu Asp Glu Leu Gly Pro Leu Arg His Val Leu Asp Gly Thr Gln Ser
530 535 540
Lys Ser Phe Gln Leu Glu Asp Ala Glu Asn Phe Ile Ser Asn Ile Arg
545 550 555 560
Val Thr Val Val Lys Leu Lys Gly Ser Asp Asn Thr Phe Glu Cys Gln
565 570 575
Phe Asp Asp Glu Ser Ala Thr Val Val Asp Phe Leu Arg Arg Trp Ile
580 585 590
Ala Phe Ala Gln Ser Ile Ile Ser Thr Ser Pro Gln
595 600
<210> 64
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 64
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp
180 185 190
Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys
210 215 220
Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
225 230 235 240
Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val
245 250 255
Val Val Ala Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe
260 265 270
Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu
275 280 285
Gln Ile Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His
290 295 300
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg
325 330 335
Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Lys Gln Met
340 345 350
Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro
355 360 365
Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn
370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Lys Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val
385 390 395 400
Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr
405 410 415
Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu
420 425 430
Lys Ser Leu Ser His Ser Pro
435
<210> 65
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 65
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro
85 90 95
Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala
100 105 110
Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser
115 120 125
Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp
130 135 140
Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val
145 150 155 160
Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser
180 185 190
Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys
195 200 205
Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
210 215
<210> 66
<211> 225
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 66
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro
225
<210> 67
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建物
<400> 67
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 68
<211> 107
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 68
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 69
<211> 105
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 69
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65 70 75 80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
85 90 95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
100 105
<210> 70
<211> 328
<212> PRT
<213> 人（Homo sapiens）
<400> 70
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
325

Claims (52)

1.一种用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法,其包括对该个体施用有效量的白介素-2(IL-2)免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
2.一种在具有癌症的个体中增强免疫功能的方法,其包括施用有效量的白介素-2(IL-2)免疫缀合物,CD40激动剂,和任选地PD-1轴结合拮抗剂。
3.IL-2免疫缀合物在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途,其中该药物包含该IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和任选地进一步与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
4.CD40激动剂在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途,其中该药物包含该CD40激动剂和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和任选地进一步与包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
5.PD-1轴结合拮抗剂在制造用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的药物中的用途,其中该药物包含该PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂,且其中该治疗包含与包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物组合,和进一步与包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物组合施用该药物。
6.包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的组合物,供在个体中治疗癌症或延迟癌症进展中使用,其中该治疗包含与第二组合物组合,和任选地进一步与第三组合物组合施用所述组合物,其中该第二组合物包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂,其中该第三组合物包含PD-1轴拮抗剂和任选的药学可接受载剂。
7.包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的组合物,供在个体中治疗癌症或延迟癌症进展中使用,其中该治疗包含与第二组合物组合,和任选地进一步与第三组合物组合施用所述组合物,其中该第二组合物包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂,其中该第三组合物包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂。
8.包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的组合物,供在个体中治疗癌症或延迟癌症进展中使用,其中该治疗包含与第二组合物组合,和进一步与第三组合物组合施用所述组合物,其中该第二组合物包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂,其中该第三组合物包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂。
9.一种试剂盒,其包含包含IL-2免疫缀合物和任选的药学可接受载剂的第一药物,和包含CD40激动剂和任选的药学可接受载剂的第二药物,和任选地包含PD-1轴结合拮抗剂和任选的药学可接受载剂的第三药物。
10.权利要求9的试剂盒,其中该试剂盒进一步包含包装插页,包含关于施用该第一药物和该第二药物和任选地该第三药物在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的用法说明书。
11.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该IL-2免疫缀合物包含特异性结合肿瘤抗原的抗体和IL-2多肽。
12.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该IL-2免疫缀合物包含特异性结合癌胚抗原(CEA)的抗体。
13.权利要求12的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含SEQ ID NO:38的重链CDR(HCDR)1,SEQ ID NO:39的HCDR2和SEQID NO:40的HCDR3,该轻链可变区包含SEQ ID NO:41的轻链CDR(LCDR)1,SEQ ID NO:42的LCDR2和SEQ ID NO:43的LCDR3。
14.权利要求12或13的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的轻链可变区。
15.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该IL-2免疫缀合物包含特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)的抗体。
16.权利要求15的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:47的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:48的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。
17.权利要求15或16的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含包含SEQ ID NO:47的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:48的序列的轻链可变区。
18.权利要求11至17任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体是全长抗体。
19.权利要求11至18任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体是IgG类抗体,特别是IgG1亚类抗体。
20.权利要求11至19任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含Fc域,特别是IgG Fc域,更加特别是IgG1Fc域,最特别是人IgG1Fc域。
21.权利要求20的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该Fc域包含促进Fc域的第一和第二亚基联合的修饰。
22.权利要求20或21的方法,用途,组合物或试剂盒,其中在该Fc域的第一亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更大侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第一亚基的CH3域内生成***,该***可安置于第二亚基的CH3域内的空腔中,且在该Fc域的第二亚基的CH3域中一个氨基酸残基用具有更小侧链体积的氨基酸残基替换,由此在第二亚基的CH3域内生成空腔,该空腔内可安置第一亚基的CH3域内的***。
23.权利要求20至22任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中在该Fc域的第一亚基中位置366处的苏氨酸残基用色氨酸残基替换(T366W),且在该Fc域的第二亚基中位置407处的酪氨酸残基用缬氨酸残基替换(Y407V)且任选地位置366处的苏氨酸残基用丝氨酸残基替换(T366S)且位置368处的亮氨酸残基用丙氨酸残基替换(L368A)(编号方式依照KabatEU索引)。
24.权利要求23的方法,用途,组合物或试剂盒,其中在该Fc域的第一亚基中另外位置354处的丝氨酸残基用半胱氨酸残基替换(S354C),且在该Fc域的第二亚基中另外位置349处的酪氨酸残基用半胱氨酸残基替换(Y349C)(编号方式依照Kabat EU索引)。
25.权利要求20至24任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中与天然IgG1Fc域相比,该Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合,和/或效应器功能,特别是抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的氨基酸替代。
26.权利要求20至25任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该Fc域包含选自L234,L235,和P329(编号方式依照Kabat EU索引)的组的一个或多个位置处的一处或多处氨基酸替代。
27.权利要求20至26任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该Fc域的每个亚基包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。
28.权利要求11至27任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该IL-2多肽是人IL-2多肽。
29.权利要求11至28任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该IL-2多肽是包含氨基酸替代F42A,Y45A和L72G(编号方式相对于SEQ ID NO:52的人IL-2序列)的突变体人IL-2多肽。
30.权利要求11至29任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该IL-2多肽包含SEQID NO:53的序列。
31.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该CD40激动剂是特异性结合CD40的抗体。
32.权利要求31的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含重链可变区和/或轻链可变区,该重链可变区包含来自SEQ ID NO:57的重链可变区序列的HVR-H1,HVR-H2和HVR-H3,该轻链可变区包含来自SEQ ID NO:58的轻链可变区序列的HVR-L1,HVR-L2和HVR-L3。
33.权利要求31或32的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含包含SEQ ID NO:57的序列的重链可变区和/或包含SEQ ID NO:58的序列的轻链可变区。
34.权利要求31至33任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体是全长抗体。
35.权利要求31至34任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体是IgG类抗体,特别是IgG2亚类抗体,更加特别是人IgG2亚类抗体。
36.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-1轴结合拮抗剂选自由PD-1结合拮抗剂,PD-L1结合拮抗剂和PD-L2结合拮抗剂组成的组。
37.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-1轴结合拮抗剂是PD-L1结合拮抗剂。
38.权利要求37的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-L1结合拮抗剂抑制PD-L1对PD-1和/或B7-1的结合。
39.权利要求37或38的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-L1结合拮抗剂选自由MPDL3280A(阿特珠单抗(atezolizumab)),YW243.55.S70,MDX-1105,MEDI4736(度伐单抗(durvalumab)),和MSB0010718C(阿维单抗(avelumab))组成的组。
40.权利要求37至39任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-L1结合拮抗剂是MPDL3280A(阿特珠单抗)。
41.权利要求37或38的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-L1结合拮抗剂是抗体。
42.权利要求41的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含包含SEQ ID NO:19的HVR-H1序列,SEQ ID NO:20的HVR-H2序列,和SEQ ID NO:21的HVR-H3序列的重链；和包含SEQ ID NO:22的HVR-L1序列,SEQ ID NO:23的HVR-L2序列,和SEQ ID NO:24的HVR-L3序列的轻链。
43.权利要求41或42的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该抗体包含包含SEQ ID NO:25或26的氨基酸序列的重链可变区和包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的轻链可变区。
44.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该PD-1轴结合拮抗剂是抗体且包含无糖基化位点突变。
45.权利要求44的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该无糖基化位点突变是替代突变。
46.权利要求45的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该替代突变在氨基酸残基N297,L234,L235,和/或D265(EU编号方式)处。
47.权利要求45或46的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该替代突变选自由N297G,N297A,L234A,L235A,和D265A组成的组。
48.权利要求45至47任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该替代突变是D265A突变和N297G突变。
49.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该癌症是CEA阳性癌症和/或FAP阳性癌症。
50.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该癌症是结肠癌,肺癌,卵巢癌,胃癌,膀胱癌,胰腺癌,子宫内膜癌,乳腺癌,肾癌,食管癌,或***癌。
51.前述权利要求任一项的方法,用途,组合物或试剂盒,其中该癌症表达PD-L1。
52.如说明书中描述的本发明。
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