CN107583676A - 一种微流控芯片及外泌体捕获和检测的研究方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的在于提供一种微流控芯片及外泌体捕获和检测的方法，其特征在于：该微流控芯片由玻璃基片和PDMS膜片组成；膜片上设有两个曲形混合通道、两个收集池、五个连接通道、四个进样口和一个出液口。本发明所述微流控芯片结合免疫磁性纳米粒子方法可以捕获微量液体内的外泌体，且所述微流控芯片使外泌体的捕获和检测可以在一个技术平台上完成，具有所用样本量小，检测时间短等优点。
Description
技术领域
本发明涉及将微流控芯片技术应用于生物检测领域，特别提供了一种研究外泌体捕获并检测的微流控芯片及研究方法。
背景技术
外泌体(Exosomes)是细胞分泌的直径为30～200纳米左右、由脂质双分子膜包裹的小囊泡，既可以转运蛋白质(膜蛋白、细胞因子、生长因子等)又可以转运核酸，是细胞间信息传递的重要媒介。外泌体的外膜是脂质双分子层，其内包裹着细胞浆中的各种分子成分，包括蛋白、DNA、mRNA、microRNA、lncRNA等。外泌体作为转运各种生物分子的重要载体，能以介导受体-配体结合的方式，或以磷脂酰丝氨酸依赖性方式与细胞膜融合，从而传递各类信息。其内含的蛋白质和核酸物质可作用于受体细胞，通过改变受体细胞蛋白表达谱、基因调控等方式，影响细胞间的通讯和正常生理过程。外泌体表面具有多种抗原，如CD63、CD82、MHC I、MHCⅡ、EpCAM等。正常细胞产生外泌体后，以自分泌、旁分泌和内分泌三种方式进行细胞间信息的交换和传递，一般通过表面信号分子的直接接触，或外泌体内活性成分的胞外释放，或者膜融合的过程，引起受体细胞基因表达和细胞功能的改变，对受体细胞的生理活动进行调节，参与多种病理生理反应。
目前常用的外泌体分离方法有超高速离心法、商品化试剂盒法(如ExoQuickexosome precipitation solutiou试剂盒)、流式细胞仪分离法等。传统的外泌体捕获方法有一个共同的缺点，就是消耗样品量大，而且捕获和检测不能同时进行。为解决上述难题，本发明采用微流控芯片技术提供了一个新的研究平台，构建基于免疫磁性纳米粒子的外泌体捕获和检测平台，可以更为灵敏地分离并检测液体中的外泌体。微流控芯片技术是20世纪90年代初在毛细管电泳基础上发展起来的一项新技术，近年迅速向生物医学领域渗透，显示了广阔的应用前景，该技术已被证明在检测方面具有很大的优势，消耗低、通量高，可适用于多种物质的分离与分析。微流控芯片上的微通道为微米尺寸，多种不同规格可以配套使用，自由配置。而且微流控芯片是操控流体的理想平台，分离效率高，耗时短，分析检测速度快。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微流控芯片及外泌体捕获与检测的研究方法。
本发明具体提供了一种用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，该微流控芯片由基片和膜片组成，其特征在于：所述膜片上设有曲形混合通道、收集池、连接通道、进样口和出液口；
其中，第一进样口6a和第二进样口6b通过连接通道5与第一曲形混合通道3a相连；第一曲形混合通道3a通过连接通道5与第一收集池4a相连，且在第一曲形混合通道3a与第一收集池4a之间设有第三进样口6c；第一收集池4a通过连接通道5与第二曲形混合通道3b相连；第二曲形混合通道3b通过连接通道5与第二收集池4b相连，且在第二曲形混合通道3b与第二收集池4b之间设有第四进样口6d；第二收集池4b与出液口7相连。
本发明所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：第三进样口6c和第四进样口6d均开口于连接通道5侧方。
本发明所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：所述基片为玻璃；所述膜片为聚二甲基硅氧烷(PDMS)；玻璃基片和膜片为不可逆封接。
本发明所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：第一曲形混合通道3a和第二曲形混合通道3b的长度、宽度和深度相同；长度为10～100毫米；宽度为10～1000微米；深度为10～1000微米。第一收集池4a和第二收集池4b的长度、宽度和深度相同；长度为0.1～10毫米；宽度为0.1～10毫米；深度为10～1000微米。
本发明还提供了一种采用所述微流控芯片进行外泌体捕获和检测的方法，其特征在于：
在微流控芯片的第一进样口6a加入第一预定类型材料和第二预定类型材料的混合物，在第二进样口6b加入第三预定类型材料，驱动第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料在第一曲形混合通道3a处混合，形成第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料的复合物A，通过磁铁将复合物A在第一收集池4a处富集；在第三进样口6c加入第四预定类型材料，驱动复合物A和第四预定类型材料在第二曲形混合通道3b处混合，形成复合物A和第四预定类型材料的复合物B，通过磁铁将复合物B在第二收集池4b处富集，将微流控芯片置于荧光显微镜下，考察复合物B的量；
所述第一预定类型材料为磁性纳米粒子，粒子表面连接有抗外泌体表面抗原的抗体；第二预定类型材料为含有外泌体的细胞培养液、血清或其它体液；第三预定类型材料为一抗；第四预定类型材料为荧光二抗。
本发明所述外泌体捕获和检测的方法，其特征在于，具体过程如下：
——将第一预定类型材料和第二预定类型材料混合，4℃震荡过夜，使第一预定类型材料与第二预定类型材料充分结合；
——在第一进样口6a加入第一预定类型材料与第二预定类型材料的混合物；
——在第二进样口6b加入第三预定类型材料；
——驱动第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料在第一曲形混合通道3a处混合，形成第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料的复合物A；
——在第一收集池4a的下方放置磁铁9，将复合物A富集在第一收集池4a内；
——在第三进样口6c加入第四预定类型材料；
——驱动复合物A和第四预定类型材料在第二曲形混合通道3b处混合，形成复合物A和第四预定类型材料的复合物B；
——在第二收集池4b的下方放置磁铁9，将复合物B富集在第二收集池4b内；
——将微流控芯片置于荧光显微镜下，考察复合物B的量。
本发明所述微流控芯片可以用于捕获微量液体内的总外泌体，进而通过检测外泌体表面蛋白标志物，对捕获的外泌体进行分型，捕获和检测过程均在微流控芯片上完成。本发明不但提供了一个从液体中捕获和检测外泌体的技术平台，并提供了外泌体捕获和检测的研究方法。
附图说明
图1本发明所述微流控芯片结构示意图。
图2 PDMS膜片结构示意图。
图3组装完成的微流控芯片示意图。
图4显示微流控芯片的横截面，在芯片收集池下方放置磁铁，对流经收集池的免疫磁性纳米粒子进行富集。
图5显示在微流控芯片的收集池内捕获的免疫磁性纳米粒子。
图6显示在本发明提供的微流控芯片平台上，从对照、正常成纤维细胞、MCF7、MDA-MB-231、SACC-83和SACC-LM细胞培养液中捕获总外泌体后，检测MHCⅠ阳性外泌体的含量。
(标号说明：1、玻璃基片，2、PDMS膜片，3a、第一曲形混合通道，3b、第二曲形混合通道，4a、第一收集池，4b、第二收集池，5、连接通道，6a、第一进样口，6b、第二进样口，6c、第三进样口，6d、第四进样口，7、出液口，8、注射泵，9、磁铁)
具体实施方式
实施例1
所用微流控芯片为本实验室自行设计及制备。
如图1-3所示，本发明提供的微流控芯片由玻璃基片1和膜片2组成，膜片2的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，通过不可逆封接技术将PDMS膜片2与玻璃基片1封接。PDMS膜片2上设有曲形混合通道、收集池、连接通道、进样口和出液口；
其中，第一进样口6a和第二进样口6b通过连接通道5与第一曲形混合通道3a相连；第一曲形混合通道3a通过连接通道5与第一收集池4a相连，且在第一曲形混合通道3a与第一收集池4a之间设有第三进样口6c，第三进样口6c开口于连接通道5侧方；第一收集池4a通过连接通道5与第二曲形混合通道3b相连；第二曲形混合通道3b通过连接通道5与第二收集池4b相连，且在第二曲形混合通道3b与第二收集池4b之间设有第四进样口6d，第四进样口6d开口于连接通道5侧方；第二收集池4b与出液口7相连。
第一曲形混合通道3a和第二曲形混合通道3b的长度、宽度和深度相同；长度为20毫米；宽度为10微米；深度为10微米。第一收集池4a和第二收集池4b的长度、宽度和深度相同；长度为1毫米；宽度为0.5毫米；深度为20微米。
实施例2
采用实施例1所述芯片进行研究，所述芯片的操作过程为：首先，将表面连接有抗外泌体表面抗原抗体的磁性纳米粒子加入第一进样口6a，将空白细胞培养液加入第二进样口6b，将小型磁铁9放置在第一收集池4a处(图4)；第二步，将两个注射泵8分别与第一进样口6a和第二进样口6b相连，以流速2微升/分钟的速度驱动磁性纳米粒子和培养液流经芯片的第一曲形混合通道3a；第三步，在显微镜下考察纳米粒子是否可以在收集池4a内富集(具体请见图5)。
实施例3
采用实施例1所述芯片进行研究，所述芯片的操作过程为：
首先，采用连接有CD63抗体的磁性纳米粒子分别与培养过正常成纤维细胞、MCF7、MDA-MB-231、SACC-83、SACC-LM细胞的培养液4℃条件下震荡过夜，使外泌体与免疫磁性纳米粒子表面的CD63抗体充分结合，以未培养过细胞的培养液为对照；
第二步，将免疫磁性纳米粒子与外泌体的混合物加入第一进样口6a，将检测一抗MHC I加入第二进样口6b，采用注射泵8驱动液体在芯片通道内流动，在第一曲形混液池3a处充分混合，形成免疫磁性纳米粒子、外泌体和MHC I的复合物A；
第三步，在第一收集池4a的下方放置小型磁铁9，对流经的免疫磁性纳米粒子进行富集；
第四步，通过第三进样口6c，采用注射泵8驱动磷酸盐缓冲液在芯片通道内流动，清洗去除第一收集池4a内多余的MHC I抗体；
第五步，将小型磁铁9从第一收集池4a下方移至第二收集池4b下方；
第六步，通过第三进样口6c驱动荧光二抗和复合物A在芯片通道内流动，在第二曲形混液器3b处充分混合形成复合物B，并富集在第二集液池4b内；
第七步，将芯片放置在荧光显微镜下观察、拍照(结果见图6)。
实施例4
与实施例1所述微流控芯片的不同之处在于：第一曲形混合通道3a和第二曲形混合通道3b的长度、宽度和深度相同；长度为100毫米；宽度为900微米；深度为100微米。第一收集池4a和第二收集池4b的长度、宽度和深度相同；长度为10毫米；宽度为9毫米；深度为1000微米。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，该微流控芯片由基片和膜片组成，其特征在于：所述膜片上设有曲形混合通道、收集池、连接通道、进样口和出液口；
其中，第一进样口(6a)和第二进样口(6b)通过连接通道(5)与第一曲形混合通道(3a)相连；第一曲形混合通道(3a)通过连接通道(5)与第一收集池(4a)相连，且在第一曲形混合通道(3a)与第一收集池(4a)之间设有第三进样口(6c)；第一收集池(4a)通过连接通道(5)与第二曲形混合通道(3b)相连；第二曲形混合通道(3b)通过连接通道(5)与第二收集池(4b)相连，且在第二曲形混合通道(3b)与第二收集池(4b)之间设有第四进样口(6d)；第二收集池(4b)与出液口(7)相连。
2.按照权利要求1所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：第三进样口(6c)开口于连接通道(5)侧方。
3.按照权利要求1所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：第四进样口(6d)开口于连接通道(5)侧方。
4.按照权利要求1所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：所述基片为玻璃；所述膜片为聚二甲基硅氧烷；玻璃基片和膜片为不可逆封接。
5.按照权利要求1-4任一所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：第一曲形混合通道(3a)和第二曲形混合通道(3b)的长度、宽度和深度相同；长度为10～100毫米；宽度为10～1000微米；深度为10～1000微米。
6.按照权利要求1-4任一所述用于外泌体捕获和检测的微流控芯片，其特征在于：第一收集池(4a)和第二收集池(4b)的长度、宽度和深度相同；长度为0.1～10毫米；宽度为0.1～10毫米；深度为10～1000微米。
7.一种采用权利要求1所述微流控芯片进行外泌体捕获和检测的方法，其特征在于：
在微流控芯片的第一进样口(6a)加入第一预定类型材料和第二预定类型材料的混合物，在第二进样口(6b)加入第三预定类型材料，驱动第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料在第一曲形混合通道(3a)处混合，形成第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料的复合物A，通过磁铁将复合物A在第一收集池(4a)处富集；在第三进样口(6c)加入第四预定类型材料，驱动复合物A和第四预定类型材料在第二曲形混合通道(3b)处混合，形成复合物A和第四预定类型材料的复合物B，通过磁铁将复合物B在第二收集池(4b)处富集，将微流控芯片置于荧光显微镜下，考察复合物B的量；
所述第一预定类型材料为磁性纳米粒子，粒子表面连接有抗外泌体表面抗原的抗体；第二预定类型材料为含有外泌体的细胞培养液、血清或其它体液；第三预定类型材料为一抗；第四预定类型材料为荧光二抗。
8.按照权利要求7所述外泌体捕获和检测的方法，其特征在于，具体过程如下：
——将第一预定类型材料和第二预定类型材料混合，4℃震荡过夜，使第一预定类型材料与第二预定类型材料充分结合；
——在第一进样口(6a)加入第一预定类型材料与第二预定类型材料的混合物；
——在第二进样口(6b)加入第三预定类型材料；
——驱动第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料在第一曲形混合通道(3a)处混合，形成第一预定类型材料、第二预定类型材料和第三预定类型材料的复合物A；
——在第一收集池(4a)的下方放置磁铁(9)，将复合物A富集在第一收集池(4a)内；
——在第三进样口(6c)加入第四预定类型材料；
——驱动复合物A和第四预定类型材料在第二曲形混合通道(3b)处混合，形成复合物A和第四预定类型材料的复合物B；
——在第二收集池(4b)的下方放置磁铁(9)，将复合物B富集在第二收集池(4b)内；
——将微流控芯片置于荧光显微镜下，考察复合物B的量。
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