CN105164246A - 用于分析定义的多细胞组合的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

提供了用于细胞分析的方法，包括细胞捕获、表征、运送、和培养。在示例性方法中，单独的细胞(和/或细胞单元)流入微流通道，该通道被分隔为多个连续的区段，在至少一个区段中捕获至少一个细胞。确定一个或更多个捕获的细胞的特性且基于所确定的特性将细胞或细胞的组合运送至指定的细胞保持室。还提供了用于细胞分析的设备和***。

Description

用于分析定义的多细胞组合的方法和设备
相关申请
本申请要求3015年3月13日提交的美国临时申请号61/852,135的优先权，其内容通过引用并入本文。
发明领域
本发明涉及用于分析单独的细胞和定义的细胞组合的方法和设备。
背景
许多出版物已讨论了操作单细胞的方法，包括以下(其中没有一个被承认是现有技术)：Sims等人，2007,"Analysisofsinglemammaliancellson-chip"LabChip7:423-440；Wheeler等人，2.003,"Microfluidicdeviceforsingle-cellanalysis"AnalChem75:3581-3586；Skelley等人，2009"Microfluidiccontrolofcellpairingandfusion"NatMethods6:147-152；Marcus等人，2006,"Microfluiclicsingle-cellmRNAisolationandanalysis"AnalChem78:3084-3089；Bontoux等人，2008"Integratingwholetranscriptomeassaysonalab-on-a-chipforsinglecellgeneprofiling"LabChip8:443---450；Zhong等人，2008"Amicrofluidicprocessorforgeneexpressionprofilingofsinglehumanembryonicstemcells"LabChip8:68---74；Wheeler2003"MicrofluidicDeviceforSingle-CellAnalysisAnal.Chem."75:3581-3586；和White等人，August23,2011"High-throughputmicrofluidicsingle-cellRT-qPCRPNAS"第108卷,34:13999---14004。以上列出的出版物的每个通过引用并入本文。
本发明提供了具有在现有技术的方法和设备不存在的特征和优势的新方法。
发明概述
本发明涉及用于分析单独的细胞和定义的细胞组合的方法和设备。以下实施方案并不意图是限制性的。相反，应该理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，且根据其的各种修改或改变将被暗示给本领域技术人员，并被包括在本申请的精神和范围内。
在实施方案和整个说明书的以下叙述中，为简单起见，通常提到“单独的细胞”或“单个捕获的细胞”。除非从上下文的地方另有清楚，对于每一个这样的引述，预期在可选的实施方案中“单独的细胞”和“单个捕获的细胞”应被理解为“单独的细胞单元”和“单个捕获的细胞单元”。还预期其中在一些区段和过程中捕获单个细胞和在其他区段和过程中捕获单个细胞单元的实施方案。
在一个方面，本申请公开了方面1，其是用于细胞分析的方法，包括进行至少两轮细胞捕获、表征、和运送，每轮包括：a)使包含多个单独的细胞(和/或细胞单元)的溶液流入第一微流通道；b)将通道分隔为多个连续的区段(S)，由此在至少一个区段中捕获至少一个细胞，其中i)一个或更多个所述区段包含单个捕获的细胞(和/或单个捕获的细胞单元)，和c)确定一个或更多个所述单个捕获的细胞和/或细胞单元的至少一个特性；和d)基于所确定的特性将每个所述捕获的细胞或单元独立地运送至指定的细胞保持室，由此对于每个指定的目标室，运送至其的细胞的特性是已知的。
在一个方面，本申请公开了方面2，方面1的方法，其中进行至少三轮、至少四轮、至少五轮、至少六轮、至少10轮、至少15轮、或至少20轮的细胞捕获、表征、和运送。
在一个方面，本申请公开了方面3，任一前述方面的方法，其中在(b)中至少30％所述区段包含不超过一个细胞。
在一个方面，本申请公开了方面4，方面3的方法，其中大多数所述区段包含不超过一个细胞。
在一个方面，本申请公开了方面5，任一前述方面的方法，其中一个或更多个区段不包含任何细胞。
在一个方面，本申请公开了方面6，任一前述方面的方法，其中流入被分隔的第一微流通道的部分的单独的细胞(或细胞单元)的数目小于由于分隔产生的区段的数目。
在一个方面，本申请公开了方面7，任一前述方面的方法，其中方法在包含两个或更多个分隔通道的设备中进行，且细胞可从任何分隔通道的任何区段运送至任何细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面8，方面7的方法，其中存在两个分隔通道。
在一个方面，本申请公开了方面9，任一前述方面的方法，其中第一(分隔)微流通道的内腔基本上无特征。
在一个方面，本申请公开了方面10，方面1-9的任一项的方法，其中确定的特性是细胞大小、形态、或存在或不存在胞外或胞内抗原。
在一个方面，本申请公开了方面11，方面1-9的任一项的方法，其中确定的特性是细胞行为。
在一个方面，本申请公开了方面12，方面1-9的任一项的方法，其中确定的特性是细胞对物理、化学或生物激发的响应。
在一个方面，本申请公开了方面13，任一前述方面的方法，其中所述细胞通过大量流体流运送。
在一个方面，本申请公开了方面14，任一前述方面的方法，其中使用化合物歧管***从任何区段运送细胞至任何细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面15，任一前述方面的方法，其中从区段运送至细胞保持室的每个细胞被运送通过(例如，流过)相同连接通道。
在一个方面，本申请公开了方面16，任一前述方面的方法，其中所述区段的每个与共同第二微流通道流体连通，且所述捕获的细胞被运送通过第二微流通道，输送至道指定的细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面17，任一前述方面的方法，其中至少10个单独的细胞(或细胞单元)被从区段运送至细胞保持室和/或至少10个细胞保持室被细胞占据。
在一个方面，本申请公开了方面18，方面16或17的方法，其中化合物歧管连接至少5个区段和至少5个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面19，方面18的方法，其中化合物歧管连接至少10个区段和至少10个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面20，方面19的方法，其中化合物歧管连接至少10个区段和至少10个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面21，方面20的方法，其中化合物歧管连接至少20个区段和至少20个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面22，方面21的方法，其中化合物歧管连接至少10个区段和至少10个至100个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面23，方面22的方法，其中化合物歧管连接至少50个区段和至少50个-100个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面24，任一前述方面的方法，其中区段的数目与细胞保持室的数目的比大于1。
在一个方面，本申请公开了方面25，方面24的方法，其中区段的数目比细胞保持室的数目大了约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、或约200％倍。
在一个方面，本申请公开了方面26，任一前述方面的方法，其中将多个细胞单独地运送至同一细胞保持室，由此产生包含定义的细胞组合的细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面27，方面26的方法，其中将两个、三个或四个细胞单独地运送至同一细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面28，方面27的方法，其中每个单独运送的细胞在不同轮分隔中被捕获。
在一个方面，本申请公开了方面29，任一前述方面的方法，其中流入第一微流通道的细胞是真核细胞。
在一个方面，本申请公开了方面30，方面29的方法，其中细胞是动物细胞。
在一个方面，本申请公开了方面31，方面30的方法，其中细胞是人细胞。
在一个方面，本申请公开了方面32，任一前述方面的方法，其中细胞是植物细胞。
在一个方面，本申请公开了方面33，任一前述方面的方法，其中(a)中的包含多个单独的细胞(或细胞单元)的溶液包含来自两种不同真核物种的细胞。
在一个方面，本申请公开了方面34，任一前述方面的方法，其中(a)中的包含多个单独的细胞(或细胞单元)的溶液包含来自相同物种的两种不同个体或样本的细胞。
在一个方面，本申请公开了方面35，任一前述方面的方法，其中(a)中的多个单独的细胞(或细胞单元)包括稀有细胞和其他细胞，步骤(d)中运送至细胞保持室的至少一种细胞是稀有细胞，且所述溶液中所述其他细胞与所述稀有细胞的比大于100:1，有时大于1000:1，有时大于10,000:1，且有时大于100,000:1。
在一个方面，本申请公开了方面36，方面35的方法，其中稀有细胞是干细胞、肿瘤细胞，任选地循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、或胎儿细胞。
在一个方面，本申请公开了方面37，方面1-36的任一项的方法，其中在细胞保持室中培养细胞。
在一个方面，本申请公开了方面38，方面37的方法，其中培养细胞约1小时至约4星期。
在一个方面，本申请公开了方面39，方面37的方法，其中培养细胞约1小时至约24小时。
在一个方面，本申请公开了方面40，方面37-39的任一项的方法，其中细胞***产生后代。
在一个方面，本申请公开了方面41，方面37-40的任一项的方法，其中在培养期间观察细胞中。
在一个方面，本申请公开了方面42，方面37-41的任一项的方法，其中在培养期间激发细胞。
在一个方面，本申请公开了方面43，方面37-42的任一项的方法，其中激发包括将细胞暴露于试剂。
在一个方面，本申请公开了方面44，方面43的方法，其中试剂是药物、测试试剂、蛋白、核酸或小分子。
在一个方面，本申请公开了方面45，方面37-44的任一项的方法，其中第一细胞或细胞的组合被培养至少一小时，且然后在设备中通过细胞捕获、表征、和运送获得的一个或更多个另外的细胞被引入细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面46，方面37-45的任一项的方法，其中培养一段时间后，从细胞保持室中收获有存活力的细胞。
在一个方面，本申请公开了方面47，方面37-46的任一项的方法，其中培养一段时间后，将细胞保持室中的细胞原位固定。
在一个方面，本申请公开了方面48，方面37-45的任一项的方法，其中将试剂、溶液或物理刺激应用于在一个或更多个细胞保持室中的一个或多个细胞，并导致所述一个或多个细胞的裂解。
在一个方面，本申请公开了方面49，方面48的方法，其中将从裂解的细胞释放的大分子运出至少一个细胞保持室。
在一个方面，本申请公开了方面50，方面49的方法，其中收集大分子。
在一个方面，本申请公开了方面51，方面49的方法，其中将从裂解的细胞释放的大分子运出细胞保持室进入相应微流室，其中所述相应微流室与所述细胞保持室流体连通且不与其他细胞保持室流体连通。
在一个方面，本申请公开了方面52，方面50或51的方法，其中大分子是核酸，任选地扩增所述核酸(任选地逆转录)，且任选地所述核酸或相应扩增子在微流***中测定，其中所述步骤全部在流体回路内发生，其中任选地所述测定确定遗传特性或基因、RNA或蛋白表达模式。
在一个方面，本申请公开了方面53，微流设备中的室，其被配置以用于接收并保持活细胞，该室包括：输入通道，其被配置使得有核的真核细胞可完整通过输入通道并进入室；四个或更多个的多个排出通道，其被配置使得流体可以而有核的真核细胞不可以退出该室；和气体透性膜，其把室和供给通道分开，其中供给通道被配置为将气体混合物带至室，且气体透性膜被配置为使得气体可在室和供给通道之间互相交换。
在一个方面，本申请公开了方面54，方面53的室，其中将室或输入通道连接至试剂通道，所述试剂通道被配置用于供应用于保持或处理室中的细胞的流体，所述流体包含一种或更多种试剂。
在一个方面，本申请公开了方面55，方面54的室，其中将试剂通道连接至包含细胞营养物质的流体的供给。
在一个方面，本申请公开了方面56，方面54的室，其中将试剂通道连接至将流体递送进入室后裂解细胞的流体的供给。
在一个方面，本申请公开了方面57，方面53-56的任一项的室，其中输入通道朝向室逐渐变尖细，由此指引细胞朝向室的中心。
在一个方面，本申请公开了方面58，方面53-57的任一项的室，其中排出通道以允许流体从输入通道流入室且流出排出通道而不吸引室中的细胞朝向排出通道的方式围绕室分布。
在一个方面，本申请公开了方面59，方面58的室，其中室具有基本上是环形或椭圆形的周界，且排出通道超过周界的180度分布。
在一个方面，本申请公开了方面60，方面53-59的任一项的室，所述室包含十个或更多个排出通道。
在一个方面，本申请公开了方面61，方面53-60的任一项的室，其中排出通道通过排出口连接至室，且输入通道通过输入口连接至通道，且排出口的直径小于输入口的直径的20％，由此抑制完整细胞通过进入排出通道。
在一个方面，本申请公开了方面62，方面53-61的任一项的室，其中排出通道包含珠或过滤器，由此抑制完整细胞通过进入排出通道。
在一个方面，本申请公开了方面63，方面53-62的任一项的室，所述室足够大以容纳至少3个真核细胞。
在一个方面，本申请公开了方面64，方面53-63的任一项的室，所述室足够大以容纳至少10个真核细胞。
在一个方面，本申请公开了方面65，方面53-64的任一项的室，所述室跨在它最窄处的直径至少50微米。
在一个方面，本申请公开了方面66，方面53-65的任一项的室，所述室跨其最窄处直径至少200微米。
在一个方面，本申请公开了方面67，方面53-66的任一项的室，所述室包含凸形下表面。
在一个方面，本申请公开了方面68，方面53-67的任一项的室，所述室包含涂有促进细胞粘附的物质的下表面。
在一个方面，本申请公开了方面69，方面68的室，其中物质是细胞外基质。
在一个方面，本申请公开了方面70，方面68的室，其中物质是纤连蛋白。
在一个方面，本申请公开了方面71，方面53-70的任一项的室，其中室、输入通道、和排出通道充满流体。
在一个方面，本申请公开了方面72，方面53-71的任一项的室，所述室包含至少两个真核细胞。
在一个方面，本申请公开了方面73，包含根据方面53-71的任一项的四个或更多个的多个室的设备，所述四个或更多个的多个室各具有它自己的单独的输入通道，其中每个输入通道被配制为从共用源供给细胞。
在一个方面，本申请公开了方面74，根据方面73的设备，其中单独的输入通道各具有可独立于其他输入通道中的阀门操作的阀门。
在一个方面，本申请公开了方面75，根据方面73或74的设备，其中单独的输入通道是第一多路器的部分，且共用源是将第一多路器与第二多路器连接的连接通道，其中第二多路器被配制为将细胞从多个不同的源递送至连接通道。
在一个方面，本申请公开了方面76，根据方面75的设备，其中不同的源是共同分隔通道的分隔的区域。
在一个方面，本申请公开了方面77，保持培养中的细胞的方法，所述方法包括递送细胞至根据方面53-72的任一项的室，通过输入通道或单独的试剂通道供给营养培养基进入室，并且通过供给通道供给气体至气体透性膜。
在一个方面，本申请公开了方面78，方面77的方法，所述方法还包括从细胞混合物单独选择递送至室的细胞。
在一个方面，本申请公开了方面79，从根据方面53-72的任一项的室中存在的一个或更多个细胞提取细胞内组分的方法，所述方法包括通过递送导致细胞裂解的流体进入室来裂解细胞，并从室回收裂解的产物。
在一个方面，本申请公开了方面80，方面79的方法，其中产物通过排放通道回收。
在一个方面，本申请公开了方面81，方面79或80的方法，其中产物包含核酸。
在一个方面，本申请公开了方面82，方面78-81的任一项的方法，所述方法还包括使产物经受化学或生物化学反应。
在一个方面，本申请公开了方面83，在微流设备中的通道和阀门的构造，包括：(a)输入多路器，其包括：(i)四个或更多个的多个输入通道；(ii)多个输入阀门，其被配置和排列以控制输入通道使得输入通道的任何一个中的流体可独立于其他输入通道中的流体流动；(iii)一个或更多个合并通道，其被配置和排列以接受流过输入通道的任何一个或更多个的流体并通过单一连接通道发送流体；(b)连接通道；和(c)输出多路器，其包括：(i)四个或更多个的多个输出通道；(ii)多个输出阀门，其被配置和排列以控制输出通道使得输出通道的任何一个中的流体可独立于其他输出通道中的流体流动；(iii)一个或更多个分配通道，其被配置和排列以接收流过连接通道的流体并依据输出阀门的操作通过输出通道的任何一个或更多个发送流体。
在一个方面，本申请公开了方面84，方面83的构造，其中一个或更多个合并通道是歧管。
在一个方面，本申请公开了方面85，方面83或84的构造，其中从任何一个输入通道通过合并通道至连接通道的路径长度相同。
在一个方面，本申请公开了方面86，方面83-85的任一项的构造，其中一个或多个分配通道是歧管。
在一个方面，本申请公开了方面87，方面83-86的任一项的构造，其中从连接通道通过分配通道至任何一个输出通道的路径长度相同。
在一个方面，本申请公开了方面88，方面83至87的任一项的构造，所述构造被配置使得真核细胞可通过任何一个输入通道并从任何一个输入通道，通过合并通道，通过连接通道，通过分配通道，且通过任何一个输出通道完整传送。
在一个方面，本申请公开了方面89，方面83-88的任一项的构造，其中每个输入通道相连并被配置以从分隔通道的不同区域接收流体。
在一个方面，本申请公开了方面90，方面89的构造，其中输入阀门放置在分隔通道和合并通道之间。
在一个方面，本申请公开了方面91，方面89的构造，其中分隔通道放置在输入阀门和分隔通道之间。
在一个方面，本申请公开了方面92，方面83-91的任一项的构造，其中多个输出通道各自连接至单独的保持室。
在一个方面，本申请公开了方面93，方面92的构造，其中保持室被配制用于细胞培养。
在一个方面，本申请公开了方面94，方面91-93的任一项的构造，其中输入歧管中的通道、连接通道、和输出歧管中的通道都充满流体。
在一个方面，本申请公开了方面95，被配置以支撑和操作微流设备的装置，所述装置包括：(a)平台，其包括：(i)腔，其形状和大小能够接收和支撑微流设备的；(ii)光学透明(例如，玻璃)视窗，其被放置在腔上方，使得当细胞被腔中的设备处理时，细胞可通过该视窗成像；(iii)界面板，其包括多个开口，被配置以密封控制腔中的微流设备中的通道并通过气动压力操作设备中的阀门；(iv)整合加热构件，其包围平台的平面中的腔，被配置以保持腔中的微流设备在适合于细胞培养的温度下；(b)混合箱，其包括：(i)被配置以接收气体混合物的入口；(ii)被配置以加湿气体混合物的加湿器；(iii)被配置以加热气体混合物至适合于细胞培养的温度的加热器；和(c)被配置使得通过混合箱中的加热器加热的气体可通过平台进入腔中的微流设备中的导管。
在一个方面，本申请公开了方面96，方面95的装置，所述装置还包括：(d)被配置使得来自腔中的微流设备的废气可回传至混合箱并通过混合箱出来的导管；和(e)被配置使得来自腔中的微流设备的废流体可回传至混合箱并通过混合箱出来的导管。
在一个方面，本申请公开了方面97，方面95或96的装置，其中平台还包括：(v)被配置以确定流入和/或流出腔中的微流设备的气体混合物的湿度的湿度传感器。
在一个方面，本申请公开了方面98，方面95-97的装置，其中混合箱还包括：(iv)被配置以连接入口至气体混合物的源的luer锁定连接器；和(v)电插座。
在一个方面，本申请公开了方面99，方面95-98的任一项的装置，其中整合加热构件从平台延伸至混合箱以同时加热腔中的微流设备和混合箱中的气体混合物。
在一个方面，本申请公开了方面100，方面95-99的任一项的装置，其中整合加热构件包括聚酰胺。
在一个方面，本申请公开了方面101，方面95-100的任一项的装置，其中光学透明(例如，玻璃)视窗涂敷有抑制冷凝的涂层。
在一个方面，本申请公开了方面102，方面101的装置，其中涂层包含铱和锡。
在一个方面，本申请公开了方面103，微流***，所述微流***包括根据方面95-98的任一项的支撑装置与腔中的微流设备。
在一个方面，本申请公开了方面104，方面103的微流***，其中微流设备是如以上所述的设备。
在一个方面，本申请公开了方面105，方面103或104的微流***，所述微流***还包括用于在微流设备中培养细胞的气体混合物供给和营养培养基供给。
在一个方面，本申请公开了方面106，方面103-105的任一项的微流***，还包括被配置以捕获微流设备中的细胞的图像的成像装置。
在一个方面，本申请公开了方面107，方面103-106的任一项的微流***，还包括被配置和编程以控制微流设备的操作的计算机处理器。
在一个方面，本申请公开了方面108，方面107的微流***，其中计算机处理器是专用处理器。
在一个方面，本申请公开了方面109，方面107的微流***，其中计算机处理器是包括编码以控制微流设备的操作的应用程序(app)的便携式计算机***中的处理器。
在一个方面，本申请公开了方面110，方面107至109的微流***，其中计算机处理器被配置和编程以显示微流设备中的细胞的图像。
在一个方面，本申请公开了方面111，如以上描述的微流设备中的分隔通道在细胞群的处理中的用途。
在一个方面，本申请公开了方面112，如以上描述的微流设备中的连接至输出多路器的输入多路器在细胞群的处理中的用途。
在一个方面，本申请公开了方面113，如以上描述的微流设备中的多个保持室在细胞群的处理中的用途。
在一个方面，本申请公开了方面114，如以上描述的微流设备的支撑装置在细胞群的处理中的用途。
在一个方面，本申请公开了方面115，根据方面111-114的任一项的用途，其中处理包括从细胞群中分离和分拣单独的细胞(或细胞单元)。
在一个方面，本申请公开了方面116，根据方面111-115的任一项的用途，其中处理包括单独地培养来自细胞群的单独的细胞(或细胞单元)。
在一个方面，本申请公开了方面117，根据方面111-116的任一项的用途，其中处理包括从细胞群中分离单独的细胞(或细胞单元)并将单独的细胞(或细胞单元)与从细胞群分离的其他单独的细胞(或细胞单元)合并。
在一个方面，本申请公开了方面118，根据方面111-117的任一项的用途，其中处理包括从群中单独地收集单独的细胞(或细胞单元)的内含物，并使每个细胞的内含物经受化学反应。
在一个方面，本申请公开了方面119，根据方面118的用途，其中化学反应是测定的一部分。
在一个方面，本申请公开了方面120，根据方面118-119的任一项的用途，其中处理包括将来自群的单独的细胞(或细胞单元)单独地成像。
在一个方面，本申请公开了方面121，确定细胞群的性质的方法，所述包括提供无细胞组合物，所述无细胞组合物包含来自确切的N个细胞的大分子，其中N＝2，其中所述N个细胞已一起培养至少2小时；以及对所述大分子进行分析步骤。
在一个方面，本申请公开了方面122，方面121的方法，其中大分子是核酸，且分析步骤包括扩增、转录、逆转录、克隆或测序。
在一个方面，本申请公开了方面123，方面121的方法，其中大分子是蛋白，且分析步骤包括将蛋白与抗体混合。
在一个方面，本申请公开了方面124，方面121-123的任一项的方法，不同的是N＝3、4、5、6、7、8、或小于10。
附图简述
图1是显示用于实施本发明的示例性步骤的流程图。
图2A和2B示出了本发明包括分隔通道和沿该通道的长度隔开的阀门的实施方案的示意图。多路器未示出。图2A示出了具有一个分隔通道的实施方案，且图2B示出了具有两个分隔通道的实施方案。
图3A和3B示出了可用于从任何区段独立地运送单细胞至任何预定的目标室的多路器的原理。图3A和3B示出了分隔通道和多路器的两种位置关系。
图4示出了设备的示例性设计。图4A示出了流体***，其中合并歧管的通道和类似地分配歧管的通道被分成两个块，每个块经由第二歧管***保持连接以提供单个的一体的合并歧管，类似地，通过连接通道连接的单个的一体的分配歧管。图4B是图4A的细节。
图5示出了在一个实施方案中区段、流体通道和多路器通道的关系。
图6A-6C示出了目标室的示例性设计。
图7示出了设备的示例性设计。
图8示出了可流体地连接至细胞保持室的多室反应结构。
图9示出了***的图形用户界面的虚拟屏幕截图。
图10示出了微流***，包括使得能够控制PDMSIFC的内部部分(例如，阀门和通道)以及控制PDMS芯片周围的环境条件，例如湿度、温度和气体组分的界面板。
图11示出了排出的说明图。
图12和13示出了用于将细胞从区段运送至细胞保持室的可选通路。
图14和15示出了其中使用多于一个连接通道的实施方案。
发明详述
1.介绍
本发明涉及用于分析单独的细胞(或细胞单元)和定义的细胞组合的方法和设备。方法包括使用用于进行几轮细胞捕获、表征、和运送的微流***。细胞和细胞组合一起培养并可经受进一步分析或操作，包括基因分型、核酸扩增和预扩增、基因表达分析、用miRNA处理、DNA和蛋白靶点分析(例如活性测定)。
在一个方面，本发明提供了用于细胞分析的方法，通过包括进行至少两轮细胞捕获、表征、和运送，每一轮轮包括：a)使包含多个单独的细胞(和/或细胞单元)的溶液流入第一微流通道；b)将通道分隔为多个连续的区段，由此在至少一个区段中捕获至少一个细胞，其中一个或更多个所述区段包含单个捕获的细胞或单个捕获的细胞单元；c)确定一个或更多个所述单个捕获的细胞或单个捕获的细胞单元的至少一个特性；和d)基于确定的特性将每个所述捕获的细胞或单个捕获的细胞单元独立地运送至指定的目标室，由此对于每个指定的目标室，运送至其的细胞的特性是已知的。细胞和细胞的组合被直接分析、培养和，任选地收获用于分子生物学处理。见图1。
用于细胞分离和操作的各种方法和设备公开于2013年2月28日提交并公布为US2013-0302883Al的美国专利申请号13/781,292中，其为所有目的整体并入本文。
2.定义
“多个”意指至少三个。
“大多数”意指多于50％。
“细胞”可以是真核细胞或原核细胞。
“单独的细胞”是不与其他细胞物理接触的细胞，例如，不是固体组织或多细胞结构的一部分的细胞。单独的细胞可以是以其天然状态，或至少其生命的一部分，不与其他细胞接触的细胞(例如，循环淋巴细胞；***、***、有核红细胞、单细胞藻类、原生动物等)。可选地，单独的细胞可以是以其天然状态通常与其他细胞(例如，肝细胞、神经元细胞)接触但其已从那些其他细胞分离(例如，通过解裂组织)的细胞。
“单独的细胞单元”是小数目的细胞的聚集体(例如，2个、3个、4个、5个细胞，或少于10个细胞和/或具有能够流过具有1000微米直径内腔的微流通道的大小的小数目的细胞的聚集体)。例如，多能干细胞聚集体可以是细胞单元。
短语“单独的细胞(或细胞单元)”应理解为“在一些实施方案中，单独的细胞；在其他实施方案中，单独的细胞单元”和“在又其他实施方案中，单独的细胞和细胞单元的混合物”。同样地，短语“单个捕获的细胞或单个捕获的细胞单元”应理解为“在一些实施方案中，单个捕获的细胞；在其他实施方案中，单个捕获的单个细胞单元”和“在又其他实施方案中，单个捕获的细胞和单个捕获的细胞单元的混合物”。
当微流设备的两个组件通过微流通道或可从组件的一个运送流体至另一个的其他导管连接时，微流设备的两个组件称为“流体地连接”。
“阀门”用于通过通道限制细胞的移动和/或流体(空气或液体)的移动。如本文以下讨论(§17A)，阀门可以具有多种设计和结构。另外，阀门按功能来提及(例如，“分隔阀门”、“上游阀门”、“下游阀门”、“多路阀门”、“渗透阀门”、“单向阀门”和“泵阀门”)。
“通道过滤器”是指，通道(例如，上游通道或排出通道)中的不可驱动的(non-actuatable)屏障，其阻止细胞通过或进入通道但允许流体流过。在一些实施方案中，过滤器通过用珠填充通道的一部分制成或包括玻璃料、柱、多孔聚合物整体材料等。
微流通道的“长度”是指作为将细胞引入并且被分隔为多个连续区段的通道或通道的部分。
“捕获”是指使用物理屏障将细胞限制至通道的特定区段。
如本文所用，“地址”是指微流***中的位置。例如，在本发明的微流***中的每个区段可被分配一个地址(例如，1-10)且各细胞保持室可被分配一个地址(例如，a-z)。
3.分隔通道
单独的细胞(或细胞单元)可通过使包含多个细胞的组合物流入微流通道(称为“分隔信道”)且在通道中将至少一个单独的细胞与其他细胞物理隔离来分离。物理隔离的步骤可通过将分隔通道分隔为多个区段，至少一个分隔通道包含一个单细胞来完成。图2A示出了分隔通道和沿着通道的长度间隔开的阀门。当阀门驱动时，通道分隔为多个区段。(图2A和一些其他示意图中，选定的阀门的位置使用细长实心矩形图示出。这将从阀门在特定操作期间打开或关闭的上下文中是明显的。未示出所有的阀门。)
分隔通道的尺寸可依据通道材料、阀门设计，以及其他因素而变化，但无论如何尺寸足以允许细胞，通常是真核细胞，流过通道。真核细胞的尺寸通常在约4至约100微米的范围内。用于分隔通道的示例性横截面尺寸为约15微米至约1000微米、约15微米至约500微米、有时约500微米至约1000微米，有时约200微米至约800微米。
从上下文将理解并清楚的是提及“分隔通道”通常是指分隔通道的一部分，沿着该分泵通道的部分阀门被驱动以产生区段。将理解，分隔通道通常将具有通常在两端缺乏分隔阀门的区段，通过该缺乏分隔阀门的区段细胞引入通道或从通道抽出。在一些实施方案中，微流***包括多个(例如，两个)分隔通道。参见以下§4。
4.将细胞引入分隔通道
在本发明的方法的第一步中，将包含细胞的溶液流入分隔通道，并进入其中细胞被捕获的通道的长度。通常，细胞在其中细胞是活的溶液中，诸如细胞培养基。确定用于正在研究的细胞合适的培养基在本领域的普通技术人员的能力范围内。在一些实施方案中，细胞在规定温度(例如，室温或37摄氏C)、湿度、和/或气氛(例如，CO2/O2分压)下来保持。
在将细胞引入分隔通道前，它们可保存于恒定地或可逆地与分隔通道流体连通的容器中。
细胞通常通过大量流体流引入分隔通道，如以下§9中所述，但可使用如本领域已知以及以下§9中所述的运送的其他方法引入分隔通道。
在一些实施方案中，微流***包括多个(例如，2个)分隔通道。见图2B。当两个明显不同的细胞群或细胞类型被分析和组合，特别是，具有显著不同尺寸的细胞，确定具有不同特性的细胞，需要不同培养基的细胞，其中一定避免细胞制品之间的交叉污染的实验等等时，具有多个分隔通道的设备可具有优势。
可选地，如以下讨论的，可将不同的细胞群或细胞类型在不同的时间(例如，连续地)引入相同的分隔通道。另外，不同的细胞类型或不同的细胞群可混合并在捕获之后基于确定的特性进行选择。频繁地，获得包含不同细胞类型的混合物的样品，且本发明的方法和***用于从混合物中选择感兴趣的单独的细胞(或细胞单元)，通常丢弃其他细胞。
在一些实施方案中，感兴趣的细胞在群中是稀有的。例如，在引入分隔室的溶液中感兴趣的细胞与其他细胞的比可大于100：1、有时大于1000：1、有时大于10,000：1、并且有时大于100,000：1。稀有细胞的实例包括干细胞、肿瘤细胞(例如，循环肿瘤细胞)、循环内皮细胞、和胎儿细胞。
5.阀门、分隔、区段
如以上所述，阀门沿着分隔通道的长度间隔开，该阀门可驱动使通道分隔为多个区段。
如本文所用，术语“阀门”是指用于限制细胞移动和/或液体移动通过通道的结构。阀门可驱动(可响应于驱动关闭或打开)，且通常是可逆的(响应于一个或多个信号既可关闭又可打开)。如本文以下§17A中讨论，阀门可以具有多种设计和结构。另外，阀门可按功能来提及(例如，“分隔阀门”、“上游阀门”、“下游阀门”、“多路阀门”、“渗透阀门”、“单向阀门”和“泵阀门”)。
有些阀门阻止液体通过通道的移动(例如，通过完全阻塞通道内腔)。这些阀门还将阻断细胞通过通道的移动。“可渗透”阀门阻断细胞移动，但允许流体流过他们。例如，部分关闭的阀门可阻塞足够的内腔，以防止细胞通过，同时让流体通过。部分关闭阀门的一个方法参见，例如属于Quake的美国专利公布20080264863(描述筛阀门)。另一可渗透阀门是具有与膜结构一体的支柱的阀门，使得当阀门关闭时，支柱保持允许流体而非细胞流过的间隙。参见，例如美国专利号7291512的图27AB。不可驱动的通道“过滤器”描述如下，并且也允许阻断细胞移动，但允许流体流过。
将分隔通道阀分隔的阀门可称为“分隔阀门”。
分隔通道成区段的分隔是通过其单独的细胞(或细胞单元)与其他细胞物理间隔开的机制。当在它们之间施置物理屏障且细胞各自限制在独特空间时，两个细胞物理上分开。通常细胞捕获基于细胞在分隔通道中的随机分布的随机过程。
分隔通道可基本上是无特征的，或可具有用于定位细胞以增加该区段将包含单独的细胞(或细胞单元)的可能性的次要特征。次要特征的实例参见美国专利公布20100120077的图17和实施例5，描述了可用于在通道(例如，通道616)中定位单独的细胞(或细胞单元)然后分隔的“细胞梳子”。另一个实例是，在沿着它的长度的宽度上具有显著和定期的差异的通道(即，通过影响流速，可增加颗粒在较慢区域中的沉淀。
相比之下，基本上无特征的通道通常具有恒定的内腔尺寸和形状。尽管，预期具有次要特征的实施方案，优选基本上无特征的分隔通道。
如以上所述，当阀门被驱动时，通道分隔为多个区段。通常这些区段是连续的。在一个实施方案中，阀门沿通道的长度基本上等距间隔开，导致约相等尺寸的区段。
产生的区段的数目可跨越例如从10-200、通常从50-100，以及有时多于100的宽范围而变化。通常存在至少25个区段，有时至少50个区段，且有时至少75个区段。
区段的大小(体积和尺寸)可在大范围内变化。区段应足够大以包含单独的细胞，但足够小以有效使用空间。示例性区段长度是约20微米、约30微米、或约40微米长度(例如，约20微米至约40微米长度)。
在一些实施方案中，各区段的体积是单个靶细胞的体积的许多倍。多数真核细胞的体积在0.05皮升至4.2纳升的范围内。
在另一个实施方案中，流体流动不停止并分类各种细胞和各种位置(即，并行移位寄存器)。这个过程需要阀门驱动的紧密协调，但具有在并行模式中的多个细胞的更快的细胞选择的优势。
6.细胞浓度
本发明可用于表征和合并单细胞、单细胞单元、或组合。因此，可期望，至少一些分隔的区段包含单细胞，且通常在实用程度上最大化包含单细胞的分隔的区段的是有利的(与不包含细胞或包含多细胞的区段相比)。可选择区段的尺寸、细胞的浓度、以及其他因素以选择以最大化单细胞的捕获。用于引入分隔通道的最佳细胞浓度，例如，可经验上或可数学上计算来确定。
在一些实施方案中，在确定区段包含单细胞中，当其他细胞的存在不干扰待进行的分析时，计数特定类的细胞。例如，如果使用包含少量真核细胞和大量过量的细菌细胞的溶液，一些区段将包含单个真核细胞，且一些或所有区段将可能包含许多细菌细胞。在这种情况下，包含一个真核细胞和许多细菌细胞的区段可认为具有单个细胞(特定类的)。类似地，如果使用包含少量有核细胞和大量过量的无核红细胞的溶液，一些区段将包含单个有核细胞，且一些或所有区段将可能包含许多红细胞。在一些情况下，感兴趣的细胞群是(i)所有真核细胞、(ⅱ)所有有核细胞、(ⅲ)所有动物细胞、(ⅳ)所有人细胞、(v)所有原核细胞、(vi)所有原生动物、(vii)所有寄生虫、(ⅷ)所有真菌细胞。
如以下所讨论，预期，将进行多轮细胞捕获以用感兴趣的细胞填充多个细胞保持室。优选地，每轮细胞捕获导致至少一个区段具有单细胞。通常将存在至少一个无细胞的区段。优选地至少30％，可选择地至少40％，并且优选地大多数区段包含不超过一个的细胞(即，它们包含一个细胞或零个细胞)。
7.确定捕获的细胞的至少一个特性
在细胞被捕获在区段中时，确定捕获的细胞(即，一些或全部的捕获细胞)的一种或更多种特性或等效“性质”。可确定的特性的实例包括，例如但不限于：尺寸、形态、光学性质(例如，颜色，折射率；参见，例如，Coelho等人，2006，"Measuringopticalandmechanicalpropertiesofalivingcellwithdefocusingmicroscopy,"BiophysJ.91:1108-15)、细胞外或细胞内抗原的存在或不存在、核酸含量、细胞膜电性能、流动性，对刺激的响应等。
确定特性的方法将取决于检测的特定特性。例如，细胞性质可光学地(例如，使用显微镜或CCD照相机)、分光镜地(例如，使用拉曼光谱)、通过测量的介电电泳性质(参见，例如K.Hoettges2008,"DielectrophoresisasaCellCharacterisationTool"inMethodsinMolecularBiology583:183-198)、或通过检测与细胞抗原或核酸相关的信号(例如，荧光信号)来确定。用于检测细胞性质的设备，可全部或部分地与微流设备一体，或可在设备之外。确定过程可手动、或部分或全部自动。示例性信号检测器监控可见光、荧光、和UV光(强度、散射、吸收)发光、差分反射率、电阻、电阻率、阻抗和电压。应用还可利用共焦激光扫描、放射化学检测、荧光偏振以及其他方法。将认识到，在微流***的构建中使用的设计和材料将与检测的机制兼容。例如，当使用光学方法时，分隔通道可使用对至少检测需要的波长的光透过的材料制成。另外，可使用光纤和其他***。
捕获的细胞可通过多于一种特性的组合来表征，诸如数个细胞外抗原、或包括抗原(蛋白)、特定RNA或DNA序列的细胞内生物标志物的存在或不存在、或蛋白存在或活性的组合。
感兴趣的细胞的不同群可通过测定捕获的细胞的两种不同的特性，一个群的一个特性，和第二个群的第二特性来确定。在一种方法中，基于感兴趣的细胞中存在(阳性选择)或不存在(阴性选择)的性质使至少一种可检测的标记物与的群中的细胞缔合。用于表征细胞的合适的免疫细胞化学方法是本领域熟知的。
出于说明而非限制，细胞特性包括三类性质，其任何一类可用于表征细胞。(1)未处理的细胞的特性；(2)与细胞组分缔合的可检测的标记物；及(3)细胞对激发的响应。
未处理的细胞的特性可包括形态学、光学性质、电性质、代谢性质(例如，O2消耗)、行为(移动性、膜起皱，等)。
与细胞组分缔合的可检测的标记物可包括与核酸、细胞抗原、以及其他细胞组分缔合的可检测的标记物。在§17(B)中提供了示例性可检测标记物的非完整列表。
细胞对激发的响应是指检测响应于细胞的物理或化学环境的变化而变化的细胞性质。例如，捕获的细胞可暴露于物理变化(温度变化、光照、pH变化等)并检测细胞的响应。作为另一实例，捕获的细胞可通过暴露于试剂(例如，药物、测试试剂、抑制剂等)来激发并检测细胞的响应。
将理解，可使用可检测标记物检测未处理的细胞的特性和细胞对激发的响应。例如，内吞作用(作为细胞属性)或响应于物理或化学激发的增加的内吞作用，可通过将细胞暴露于用荧光标记的聚苯乙烯纳米颗粒孵育细胞，并检测荧光标记物的更新来检测。
在将细胞引入分隔通道之前，在细胞引入分隔通道之后，或两者，可用可检测的标记物激发和/或标记细胞。
例如，在一些实施方案中，至少一些细胞在引入分隔通道之前被可检测地标记引入。在其他实施方案中，至少一些细胞在通道中被捕获时被例如通过将检测试剂流过通道而标记。细胞群可在捕获前用一个标记物来标记，且在捕获后用不同的标记物来标记。细胞群可通过将细胞在捕获前暴露于一种试剂且在捕获后暴露于相应可检测的标记物进行标记。例如，细胞群可在捕获前暴露于识别细胞表面抗原的小鼠抗体，且然后在捕获的时暴露于若丹明标记的抗小鼠抗体，以制备细胞。
被确定具有感兴趣的性质的单捕获的细胞被运送至细胞保持室。剩余的细胞可通过例如打开分隔通道中的阀门并除去未运送至细胞保持室的细胞和其他材料丢弃。在一个实施方案中，可对选择运送至细胞目的室的细胞进行数个询问。例如而非限制，可对每个区段进行以下询问：
-该区段包含细胞吗？
↓如是
-该区段包含单个细胞吗？
↓如是
-该单个细胞具有感兴趣的性质吗？
8.与区段相关的多路器通道和流体通道。
被确定为具有适当特性的捕获的细胞被运送至数个细胞目的室中的一个(以下§10中所述)。可使用允许选择的单细胞(或单细胞单元)被独立地运送至指定的细胞目的室的任何运输***。如本上下文中所用，“独立地运送”意指单独的细胞可从多个(例如，10个-500个)区段的任何一个运送至多个(例如，10个-500个)细胞保持室的任何一个，允许选择细胞的组合运送至同一细胞目的室。
在一种方法中，使用化合物歧管***运送细胞。化合物歧管包括通过连接通道X连接的“合并歧管”和“分配歧管”。分隔通道的每个区段S与组合歧管的独特合并通道Cc流体连通。通过各独特通道Cc的流体可通过驱动选择的阀门或以其他方式控制流体(或在电渗运送的情况下的细胞移动)通过每个通道Cc来控制，使得细胞可仅流过单个的选择的通道Cc。每个通道Cc流体地连接至连接通道X。合并通道Cc可通过单个共同通道(如图2和3中示意性示出)、通过次级歧管***(如图4A、4B、和7中示出)、通过多于一个的连接器、或以其他方式连接至连接通道X。(术语“合并歧管”或“分配歧管”包括相关的次级歧管***)。安排***使得当配置通道以允许颗粒(例如，细胞)仅流过一个合并通道Cc时，颗粒将流入连接通道X。
分配歧管在一定程度上对映合并歧管。每个细胞保持室H与分配歧管的独特分配通道Cd流体连通。通过各独特通道Cd的流体可通过驱动选择的阀门或以其他方式控制流体(或在电渗运送的情况下的细胞移动)通过每个通道Cd来控制，使得细胞可仅流过单个的选择的通道Cd。每个通道Cd流体地连接至连接通道X。合并通道Cd可通过单个共同通道(如图2和3中示意性示出)、通过次级歧管***(如图4和7中示出)、或以其他方式连接至连接通道X。安排***使得当配置分配通道以允许颗粒(例如，细胞)仅流过一个分配通道Cd时，颗粒将从连接通道X流入至仅一个细胞保持室X。
将通过参考本文的附图和说明书理解，使用化合物歧管，细胞可独立地从任何区段S(即，分隔通道中的任何区段地址)运送至任何细胞保持室H(即，任何细胞保持区段地址)。
“合并歧管”和相关的阀门，以及“分配歧管”和相关的阀门的每一个可被称为“多路器”***。
在一种方法中，使用这样的化合物歧管或多路器***运送细胞。单多路器***描述于，例如，美国专利号7143785，其通过引用并入本文。还参见，T.Thorsen"MicrofluidicTechnologiesforHigh-ThroughputScreenApplications,"Ph.D.论文，CaliforniaInstituteofTechnology，第5章；以及Melin和Quake,2007,"MicrofluidicLarge-ScaleIntegration:TheEvolutionofDesignRulesforBiological,"AutomationAnna,Rev.Biophys.Biomol.Struct.36:213-31；Hua等人，2006,Aversatilemicroreactorplatformfeaturingachemical-resistantmicrovalvearrayforaddressablemultiplexsynthesesandassays,JMicromechMicroeng16:1433-1443；每个通过引用并入本文。微流体多路器可将流体从多个可单独寻址的输入(通道)切换至单独的输出，或将流体从单个输入切换至多个可单独寻址的输出。
任选地多路器***包括：移位寄存器。(参见Sai等人，2102,"PressuredrivendigitallogicinPDMSbasedmicrofluidicdevicesfabricatedbymultilayersoftlithography"LabonaChip12,4809-4815；DOI:10.1039/c21c21155f)。任选地，多路器***通过控制由移位寄存器产生的信号运行，其中移位寄存器通过用户可设置输入、重复'计时器'、和触发阀门来控制。用户可设置输入提供串行输入指令，其被“读”进移位寄存器，每个'计时器'循环移动输入信号一个'位元(bit)'通过寄存器。触发阀门用于打开气动移位寄存器输出和流体多路器“控制”通道之间的连通。
图3A和3B示出了本发明的多路器***的原理。在这些图中示出了，通过控制通道500驱动的弹性阀门。参见Unger等人，2000,"Monolithicmicrofabricatedvalvesandpumpsbymultilayersoftlithography"Science288:113-116。在图中，控制通道具有较宽的区域和较窄的区域。阀门600在控制通道跨越流体通道(或在流体通道之下)的宽截面处创建。通过驱动控制通道的选择的组合，可创建从任何区段至任何细胞保持室的路径。将理解，图3A和3B中的阀门图案是用于说明性的，并可使用各种其他图案。参见，例如，图7。弹性体***是高效的，并允许控制流使用<n个控制通道通过n个流体通道。然而，将理解，该方法不限于弹性体实施方案。事实上，可使用基本上完全阻止流体流动的任何数量的阀门。例如，在一种方法中，通过每个多路器通道的流体可由独立地可驱动阀门来控制，并且流体可通过，例如，关闭分隔室扇区中的除了一个以外所有的阀门和保持室扇区的除了一个以外所有的阀门来控制。
在一个实施方案中，大量流体流动用于从一个区段运送选择的细胞至细胞保持室。为了说明，参考参见图5，每个分隔通道区段与多路器通道107和流体通道105流体连通。多路器通道可以是下游多路器通道(图3A、图7)或上游多路器通道(图3B)。流体通道105可以是上游流体通道(图3A、图7)或下游流体通道(图3B)。下游通道位于分隔通道和细胞目的室之间。在每一种方法中，下游通道具有适当的尺寸且其他方面适合于运送细胞(即，细胞流过下游通道)。相比之下，上游通道提供了促进细胞流入下游通道的液体。将认识到，下游多路器通道与上游流体通道一起使用，反之亦然。
分隔后，细胞可通过流体流按以下路径来运送：(1)流体源→(2)上游通道→(3)区段→(4)下游通道→(5)连接器(例如，连接歧管)→(6)保持室扇区流体通道→(7)细胞保持室→(8)(任选地)多室反应结构。
如图5中示出的，除了用于产生因分隔通道的分隔造成的纵向间隔的阀门外，可任选地使用另外的阀门来控制细胞流入上游通道(上游阀门106)和/或下游通道(下游阀门104)。例如，细胞可随分隔阀门102打开流过分隔通道，且阀门104和106可关闭以防止细胞流入上游通道和下游通道。可选择地，上游通道和/或下游通道可不具有阀门。例如，上游通道可具有阻止细胞进入该通道的通道尺寸或几何形状。在另一种方法中，它们可具有通道过滤器，其允许流体流过它们，但阻止细胞通过。在另一种方法中，在上游多路器的情况下，当关闭时多路器阀门将阻止上游通道。在这种情况下，即使细胞迁移进上游通道，它们可被运出那些通道至目的室或丢弃。将认识到，这种设计可使除去未选择的细胞的步骤更复杂。在另一种方法中，可选择通道尺寸以使上游阀门和/或下游阀门不必要。这是因为，在其中将细胞流入分隔通道的负载步骤期间，将存在流体通过分隔通道，但无流体(“静态流体”)通过***剩余部分；结果流过分隔通道的细胞不易于掉进由流体占据的上游通道或下游通道。
通常每个区段与不同的(独特的)多路器通道流体连通。可选择地，使用歧管连接区段对使得通道对或多个通道连接至分配多路器通道(例如，当仅连接的对的一个区段包含靶细胞时，使用)是可能的，尽管这样的设计通常需要牺牲效率。
图7示出了多路器***的示例性设计。***包括分隔通道100、分隔阀门110、上游流体通道105、包括下游多路器通道101和下游阀门104的分隔通道选择器(多路器)200、次级歧管***300、连接器400(未示出)、细胞保持室通道选择器(多路器)500、和细胞保持室600。还示出了控制限制(containment)阀门的控制通道700。
与图3中示出的示意性多路器相比，图7中示出了次级歧管***。歧管确保任何区段和任何细胞保持室之间的距离(和近似通过时间)是相同的。该均匀性具有保持一致的驱动时间和从任何区段运送细胞至任何细胞保持室的装阀分隔之间的惯例的优势。
图14和15示出了其中使用多于一个连接通道的实施方案。图14中，两个合并歧管的每个通过单独的连接器(C1和C2)连接至单个分配歧管(比较图2B)。图15示出了具有两个连接器C1和C2的***。在时间N，细胞被运送通过C1，并进入细胞保持室。在时间N+1，不同的细胞被运送通过C2，并进入不同的细胞保持室。
用于从区段运送细胞至细胞保持室的另一种方法示出在图12中。在这种方法中，将细胞引入分隔通道100，并通过分隔阀门101限于区段102，如以上所述。选择的区段的内含物(即，选择的单个细胞或单个细胞组)。选择的细胞，通过合并歧管200运送至连接器300，通常如以上所述。图12中示出的方法与，例如，图7示出的方法在细胞通过分配歧管500从连接器至指定的细胞保持室的运送中不同。如图12中所示，连接通道连接至“第二分隔通道”。为了避免混淆，该第二分隔通道称为“停止通道”400，但停止通道的特征与如以上所述的分隔通道的那些类似。停止通道独立地包括可控制的停止阀门401和CHC阀门402。图13示出了，通过驱动选择的停止阀门和选择的CHC阀门，如何将流动引导至特定细胞保持室(箭头)。在图12和13中，一个停止阀门加粗以说明它被关闭使得将细胞导向特定的室。
9.流动
可将流体和细胞以现有技术中各种已知的方式运送进并通过通道。通常，细胞在本发明中的运送通过大量流动而发生(即，在移动的流体流中携带细胞)。溶液的流动可通过多种方法来完成。为了说明，溶液可通过泵送(例如，使用如描述于美国专利号6,408,878中的蠕动泵，美国专利号6,408,878通过引用并入本文)、通过在通道中产生正压力差(例如，细胞可通过压下柱塞由此创造压力差从注射器引入分隔通道)或负压力差(例如，注射器可用于从通道抽出流体引起通过通道流动)、通过重力驱动流，或任何其他方法引入。
在可选择的实施方案中，细胞使用电泳、电动或电渗透方法移动。(参见，例如，Glawdel和hen,2009,"Electro-osmoticflowcontrolforlivingcellanalysisinrnicrofluidicPDMSchips"MechanicsResearchCommunications36:75-81，通过引用并入本文)。
10.细胞保持室和细胞培养
10.1.细胞保持室
本发明的***具有细胞保持室用于培养如上述被捕获、表征和运送的单独的细胞(或细胞单元)和细胞的组合。细胞保持室的数目可在宽范围内变化，但通常在10-500、更经常100-500、更经常150-400、和通常约300微米的范围内。细胞保持室的数目可小于、等于、或大于区段的数目。通常细胞保持室的数目较小。
微流体细胞保持室的最小属性是双重的：室必须足够大，以包含至少一个细胞，并优选地至少2个-10个细胞，且室必须与细胞存活力兼容。对于存活力的要求将从细胞至细胞而变化(例如，人肿瘤细胞浆与人肝细胞或海藻细胞不同)，但通常室必须保持在适当的温度和湿度下，营养物质必须提供给细胞，且废弃产物必须移除至存活力需要的程度。室通常包括入口和出口，以允许流体流入和流出室。支持细胞生长的营养物质可从入口通道或出口通道提供。
培养室的表面的一些或全部，诸如壁、顶部、和/或底层可被处理或修改以促进细胞培养的方面，特别是特异性或非特异性细胞粘附、细胞存活、细胞生长、和/或细胞分化(或其缺乏)，以及其他。细胞保持室表面或底部可被修改以包括支持细胞生长、模拟组织的细胞外基质(ECM)的表面。通常ECM的实例包括，但不限于，纤连蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白、层粘连蛋白、透明质酸、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角质素。
细胞培养机构可使用任何适当的环境控制机构在任何合适的环境条件下培养细胞。合适的环境条件可包括所期望的气体组分、温度、培养基交换的速率和频率，和/或类似物。环境控制机构可操作微流***的内部和/或外部。内部机构可包括机载加热器、气体导管，和/或培养基贮器。外部机构可包括气氛控制的-和/或温度控制的培养箱/热源，和/或***的外部培养基源。当***至少部分由可透气材料，诸如PDMS形成时，气氛控制的培养箱可更适合。
培养室可具有与以上要求一致的任何形状或组分。
10.2.示例性细胞保持室
图6A、6B和6C示出了用于本发明的细胞保持室的示例性构造。配置室，使得包含细胞的流体流过输入通道，且一个或更多个排出通道充当选择性地运转以允许流体排出而细胞不排出的出口。本文描述的保持室基本上是圆形或环形，具有围绕保持室超过180度定位的连接至共同出口的多个排出通道。
在一些实施方案中，本发明的保持腔室可以是50微米至2毫米的直径，或100至500微米之间的直径。尺寸根据操作员希望在每个室中处理的细胞的大小和数目来选择。为了培养或保持活细胞，保持室具有气体透性膜(通常在室的上面或下面)使得气体在流体中的分压可适当地保持并调整。保持室还可装备有促进细胞粘附，诸如蛋白，诸如纤连蛋白和/或胶原蛋白，或自细胞系产生的蛋白混合物的细胞外基质(ECM)的表面。
图6B示出了输入和排出通道的一个合适的构造(示出了300微米直径的保持室)。图6C示出了其中排出通道已填充有珠子(即，“通道过滤器”)以进一步抑制细胞从保持隔室流向排出管的构造。
图6A示出了其中输入通道从多路器朝向保持室逐渐变细以形成聚集通道的构造。这种结构聚集递送至保持室的每个细胞，使得细胞趋向朝向室的中心流动或迁移。有关室的周边的多个排出通道的分配还有助保持细胞处于或接近室的中心。这种结构倾向于保持细胞处于或接近保持室的中心，由于排出是散开的且细胞不被拉向排出管。此外，将细胞限制于这些室的能力通过包括入口(A)处和/或出口处(A和B)的流量限制器的元件组合来授予。此外，可应用出口排出管处的多孔至液体(porous-to-liquid)材料的使用以防止细胞离开室(C)。控制流体体积、压力和偏航的能力对赋予细胞存活力是重要的考虑因素。用于促使细胞朝向室的中心的第三个工具是在细胞被捕获在其上的在室的较下表面或支承表面中的凹形。处于或接近室的中心放置细胞有助于细胞相互作用。
细胞培养基可通过采取细胞相同的路径或通过其他通道引入细胞保持室。例如，参考图6，培养基可经由主输入引入。可选择地，培养基和其他溶液可通过其他路径，诸如经由连接输入通道的分支通道引入。
排出通道优选地是细胞保持室100的底表面(“地板)上的“墙”上的低开口，但可预期，它们可放置在其他位置(例如，在该室的底板上)。如图6和图11中所示，排出管101连接至主排出管102。优选地排水管的长度是短的(例如约7.5至约25微米)。宽度可在，例如，约10至约25微米范围内，且排出通道的高度优选是低的(通常小于约5微米，有时小于约4微米，诸如约3微米)。对于排出通道连接的主排出管，被设计为具有低的流体阻力，且可具有10-60微米x20-40微米的尺寸。用于排出通道的一个设计示于图11中。
10.3将试剂引入细胞保持室
本发明的***提供了研究细胞相互作用(或共培养)对代谢、蛋白表达等的效应的强有力的方法。除了培养基和营养物质以外，添加其他试剂至细胞保持室，以评估细胞或细胞组合对试剂的响应和/或提供用于测定细胞活性等的试剂，有时将是有用的。将理解，可使用各种试剂，例如但不限于，化学调节剂或生物调节剂、药物、潜在药物(测试剂)、病原体、蛋白、抗体、核酸(例如，DNA、RNA、修饰的核酸、有义/反义表达载体、报告物基因、用于基因组整合/修饰反义寡核苷酸的载体、dsRNA、siRNA)。用于检测的试剂/测定试剂包括，为了说明而非限制，染料、酶、底物、辅因子、配体、抗配、转染试剂(例如，脂质试剂、磷酸钙、DMSO)、聚乙二醇、包裹核酸的病毒包衣，和/或诸如此类。
10.4.环境控制
细胞保持室的环境适合于被培养的细胞类型的存活力，包括适当的温度、湿度、pH、和气体组分。
10.5.细胞培养
用于培养细胞的微流体技术已在别处描述。参见Gómez等人，2007,"Versatile,fullyautomated,microfluidiccellculturesystem"AnalChem.79:8557-63；Zhong等人，2008,"Amicrofluidicprocessorforgeneexpressionprofilingofsinglehumanembryonicstemcells,"LabChip.8:68-74；Glotzbach等人，2011,"Aninformationtheoretic,microfluidic-basedsinglecellanalysispermitsidentificationofsubpopulationsamongputativelyhomogeneousstemcells,"PLoSOne6:e21211；Sanchez-Freire等人，2012,"Microfluidicsingle-cellreal-timePCRforcomparativeanalysisofgeneexpressionpatterns,"NatProtoc.7:829-38；美国专利7,378,280"Apparatusandmethodsforconductingassaysandhighthroughputscreening"；US2010/0255471"Singlecellgeneexpressionfordiagnosis,prognosisandidentificationofdrugtargets"。上述列出的出版物为了所有目的通过引用整体并入本文。
11.轮
预期，用于分析单独的细胞(或细胞单元)和细胞的组合的本发明的实践通常将包括以下的多轮：将包含多个单独的细胞(或细胞单元)的溶液流进第一微流通道的长度；将长度分隔为多个连续的区段，由此在至少一个区段中捕获至少一个细胞；确定一个或更多个单个捕获的细胞的至少一个特性；以及独立地运送捕获的细胞至细胞保持室。捕获的轮数将在宽范围内变化，并将部分地取决于感兴趣的细胞在细胞群中是否稀有。通常轮数在2-1000的范围内。在示例性实施方案中，方法包括至少两轮、至少三轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、或至少9轮。在示例性实施方案中，方法包括2至10轮、3至10轮、4至10轮、或5至10轮。在一个实施方案中，方法包括多于50轮、多于100轮或多于200轮的捕获和选择。
12.丢弃细胞
在循环之间，分隔通道中剩余的未选择的细胞在运送选择的细胞至细胞保持室后可被除去。一种方法是用培养基或缓冲液“清洗”通道，从分隔通道转移包含未选择的细胞的溶液，并进入例如废物贮器中。可选择地，未选择的细胞可通过使包含多个单独的细胞(或细胞单元)的溶液流入分隔通道的行为移动。
13.细胞相互作用
基于所确定的性质，将捕获的细胞独立地运送至指定的细胞保持室。“独立地运送”意指每个单独的捕获的细胞可根据实施者的需要转移至指定的目的室。因此可运送细胞，使得在每个目的室中的每个细胞或细胞组合的特性是已知的。通常(但任选地)细胞在细胞保持室中培养。可研究具有已知性质(例如，已知细胞类型的)单独的细胞(或细胞单元)和/或它们的后代之间的相互作用的效应。
表1和2示出这点，通过成像具有4个区段(1-4)、5个细胞保持室(1-5)的设备，和两种细胞类型(A和B)。在这种假设中，在细胞捕获的六个循环后，进行确定和运送，如表1中概述的，表2中示出了细胞分配至细胞细胞保持室1-5。
表1
轮数(6轮) 细胞性质 区段(4区段) 目的室(5室)
1 A 4 1
1 A 3 3
2 B 4 2
3 A 1 3
4 B 2 3
4 B 3 4
5 B 1 4
6 A 4 5
如表2中所示，培养两天后，可确定细胞保持室的每个中的细胞的基因表达模式(例如，k-ras的表达)。在表2中所示的假设结果中，细胞类型A和细胞类型B的相互作用的效应是增加K-ras基因的表达(由细胞类型中的一个或两者)。
表2
与分隔通道(或分隔通道对)关联的细胞保持室的数目可变化，但通常在范围1-150、更经常10-100、且常常35-75内变化。
细胞保持室及在它们中的细胞培养的其他性质在下面讨论。
14.收获
细胞可在细胞保持室中培养持续期望的时间段(例如，1小时至4周)。通常，使用短期培养(例如，1小时至24小时)。在培养期间，可观察细胞，并任选地，可操作或激发细胞。例如，细胞可与microRNA接触以实现转分化。在一些实施方案中，捕获的或培养的细胞可用导致细胞外或细胞内可检测信号诸如比色或荧光分子的变化的组分来测定。在培养期结束时，细胞可丢弃，回收作为活细胞，或者裂解或以其他方式使得无存活力用于分析。
14.1.细胞回收作为活细胞
活细胞可从细胞保持室以多种方式回收。在一种方法中，细胞酶促地从基底分离，如需要，并然后流出细胞保持室用于收集。原则上，流动路径可与细胞被运送进细胞保持室的路径相反。可选择地，可使用辅助出口通道。
在另一个方法中，配置***以容易拆卸暴露细胞保持室，允许除去内含物(例如，使用微量吸管)。在一种方法中，贴壁细胞通过将细胞所粘附至的基底移出微流***而移除。
14.2.分析细胞组分
在一些实施方案中，在培养期后，细胞保持室中的细胞被处理(例如，裂解)以释放细胞组分诸如核酸、蛋白等。参考图6，裂解溶液可通过主输入或，可选地，通过辅助通道(未示出)引入。然后细胞组分可被带入“主排出管”用于收集和分析。当使用具有不同设计的细胞保持室时，普通技术从业者通过本公开内容指导，将能够设计类似结构。
在一些实施方案中，细胞组分分析在微流***中进行，例如在流体地连接至细胞保持室的多室反应结构中进行。分析包括核酸分析(例如，扩增、测序或克隆来自细胞RNA或DNA)、蛋白分析、细胞固定，以及用于表征细胞或细胞组合的任何其他方法。为了说明而非限制，图8示出了根据各种实施方案的多室反应结构220-c的实例。多室反应结构220-c根据各种实施方案可包括不同的组件或方面。多室反应结构220-c可被配置以进行不同的处理，包括，但不限于：STA、RT-STA、mRNA-SEO、预扩增、WMA、多模式应用、蛋白应用、样品处理器应用、WTA、WGA、实时PCR制备、CNV，和/或单体型分析(haplotyping)。多室反应结构220-c可被配置以进行多个反应步骤，该多个反应步骤可包括活性混合。
多室反应结构220-c可包括许多阀门520，阀门520可用于控制溶液通过多室反应结构220-c的流动。在一些实施方案中，泵530，诸如蠕动泵，可包括在多室反应结构220-c中以促进运送溶液通过多室反应结构220-c。泵530可包括多个阀门520；在本实施例中，泵530可包括三个阀门。一个或更多个泵530可位于不同的位置。
多室反应结构220-c可还包括多个反应室510。在一些实施方案中，可认为捕获结构210-c是反应室510中的一个。仅仅通过举例的方式，阀门520-d、520-e、520-f、和520-g可用于分别控制反应室510-a、510-b、510-i、和510-j中的直通流量。另外的阀门诸如阀门520-h—520-o以不同的组合可用于引入试剂、混合和/或循环来自一个或更多个反应室510的溶液。另外的阀门520-a和/或520-b可控制不同捕获结构之间的流动。阀门520-b可用于控制溶液诸如试剂至捕获结构210-c的流动。多室反应结构220-c可被配置以在热循环期间混合和/或循环溶液。反应产物可递送540至出口结构(未示出)，其在一些情况下可称为收获结构、收获孔、和/或收获入口。
多室反应结构是灵活的，且可用于分离和扩增核酸、分离蛋白、准备cDNA，以及各种各样的其他分子生物学方法和测定步骤。***可还包括另外的流体回路，包括但不限于，各种公开的或商购可得的***。例如，FluidigmBioMarkTMHD***可用于基因表达、单细胞基因表达、单细胞mRNA测序、SNP基因分型、拷贝数目变化、用于测序样品定量。Fluidigm的qdPCR37KTMIFC芯片可用于数字PCR。这些和其他测定***可整合进本发明的***(即，由微流通道流体地连接的)，以允许较高的自动化和较短的处理时间，以及其他优势。参见美国专利号7,604,965；美国专利公布号2012-0115143("UniversalProbeAssayMethods")、US2012-0288857("MultifunctionalProbe-Primers")、和US2013-0045881("ProbeBasedNucleicAcidDetection")；共同待审的共同拥有的国际专利申请号PCT/US2012/065376("NucleicAcidDetectionUsingProbes")，和共同待审的共同拥有的临时申请61/799,559("SimultaneousDetectionOfTargetProteinAndTargetNucleicAcidsInASingleCell")，它们的每个为了所有目的通过引用明确并入。
15.成像
在优选的实施方案中，该***包括成像模块，其被整合用于成像微流设备的一个或更多个细胞和位置。用于收集和处理图像的方法和设备是本领域已知的。成像模块可包括被配置以使微流设备中的一个或更多个捕获的细胞成像的至少一个显微镜或照相机。在一些实施方案中，成像模块包括CCD照相机。
可配置成像模块以成像整合的流体回路的一个、多于一个、或所有区域，包括如分隔通道、细胞保持室、分隔通道扇区、保持室扇区、后培养处理扇区、和测定(扩增)扇区。
在一些实施方案(例如，成像可检测标记的细胞)，有必要例如，在检测标记有荧光标签的细胞中，以适当的波长照射细胞和/或反应，以例如而非限制，用于分析其中产生荧光信号的扩增反应。元件诸如滤光轮(filterwheel)和其他光学元件是本领域普通技术人员已知的。参见，例如，美国专利号7906072，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，基本上整个微流体回被成像且任选地显示给用户。在其他实施方案中，分隔通道被成像且细胞保持室被成像，而不成像歧管。在一些实施方案中，使用软件驱动图像分析监测细胞。
成像模块可以是被配置以成像整个微流设备而无缝合或扫描过程的CCD或CMOS照相机。在一个实施方案中，成像模块进一步被配置以在细胞被选择并捕获后在成像来自微流设备上或微流设备内进行的反应的荧光发射。用于选择待成像的波长的结构可包括以滤光轮或滤光块(filtercube)结构布置的荧光过滤器。在另外的实施方案中，荧光辐射的过滤在成像模块本身(诸如在成像表面内)进行或由软件进行。包括细胞捕获和细胞保持部位和反应部位的成像区域的大小可为约30.5×30.5mm(930.25mm2)或更大。在另一个实施方案中，包括细胞捕获和细胞保持部位和反应部位的成像区域将是从约930至约1200mm2或从约1200-1600mm2或从约1600至2000mm2。在另外的实施方案中，成像区域将是从约2000至2600mm2。成像模块通常将具有成像表面，诸如CCD或CMOS成像表面，其等于或大于成像的区域。成像模块的成像表面将通常具有从15,000,000至100,000,000像素，且有时200,000,000像素，每个约6至9微米大小。在一些实施方案中，像素是约9微米大小。用于像素尺寸的有用的范围是从约3至6微米或在一些实施方案中，从约5至7微米，或从约6至10微米。在另一个实施方案中，像素是约6微米大小。成像区域可还具有从约200,000,000至约300,000,000像素或从约300,000,000至400,000,000像素。在另一个实施方案中，成像区域将具有从约500,000,000像素至约750,000,000像素。
将了解，在其中***中存在另外的测定(例如，实时PCR测定)的实施方案中，成像模块可用于观察细胞的特性和移动两者并用于检测PCR和其他反应产物。
16.自动化
16.1计算机实现
预期，本发明的方法将部分自动化。例如，基于用户输入的阀门驱动，控制泵、流体和细胞的移动、和成像可通过计算机来实现。预计该***将包括可使用的一个或更多个计算机处理模块和/或一个或更多个存储模块。计算机功能可整合进该设备或可远离它。
16.2用户界面
在一个方面，本发明提供了容易地进行方法的自动化步骤的用户界面。图9提供了示例性图形用户界面的虚拟屏幕截图。概括地，提供了触摸屏设备，其显示区段(区段的图像或图形表示)、区段中捕获的细胞(细胞的图像或图形表示，任选地包括细胞特性的表示)和细胞保持室(细胞保持室的图像或图形表示)。图像可使用CCD照相机来产生。在一个实施方案中，触摸屏设备显示细胞和区段的图像，以及细胞保持室的表示。在一个实施方案中，触摸屏设备显示细胞的图像，以及区段和细胞保持室的表示。术语“表示”用于包括图象和图形表示。
已经鉴定了捕获的感兴趣的细胞，或，等同地，包含捕获的感兴趣的细胞的区段之后，用户命令***运送该细胞至选择的细胞保持室(靶)。可使用各种用户手势。例如，使用拖和放手势，用户点击细胞或区段的图像，并拖动手指或光标至指定的细胞保持室的表示。任选地，示出了细胞从区段移动至细胞保持室的图像。可使用其他手势。例如，用户可在第一位置(区段)处的表示细胞(对象)上点击，并然后在目的地位置(细胞保持室)处点击。
因此，本发明提供了用于通过操作计算机的图形用户界面中的对象来运送细胞的方法，所述计算机为其中存储于存储器中的物体的表示在显示器上向用户显示的类型，所述方法包括以下步骤：选择其的表示在所述显示器上显示的第一细胞的步骤；将第一细胞的表示从显示器上的第一区段位置拖动至第一细胞保持室；以及单独地选择多个另外的细胞中的每个，并运送它们中的每个至可与第一细胞保持室相同或不同的独立选择的细胞保持室。此外，本发明提供了用于具有显示设备的计算机的图形用户界面，包括用户控制的组件，所述用户控制的组件用于选择并将在所述显示设备上显示的细胞的表示从所述显示设备上的区段移动至所述设备上显示的细胞保持室位置。
17.设备
图10中示出了本发明的示例性***。图10A示出了微流体芯片保持装置从左侧的顶部斜视图。图10B示出了装置从右侧的的分解图。配置保持装置以通过供应试剂、保持适当的温度和湿度、以及操作阀门控制流体的流量来操作微流设备。它包括在前侧的平台，和在背侧的混合箱(在图10A中的左侧和图10B中的右侧所示)。参考图10B，装置的底部是具有样品输入孔的IFC载体，样品输入孔具有形状和大小能够接收微量滴定板或芯片的腔:通常35平方mm。载体上面是界面板，界面板包括连接至芯片中的控制通道的垫圈，垫圈通过气动控制操作阀门。板上面是聚酰亚胺层，其被配置为整合加热器以保持芯片周围的平台上的期望的温度，并连接上混合箱以使输入气体混合物达到温度。平台上的加热器上面是由玻璃托架包围的玻璃表面。玻璃被铱锡涂覆以抑制提供给芯片潮湿的气体的冷凝。玻璃表面被配置为光学透明的，使得芯片中的每个细胞可通过成像而根据其形态定位和表征。参考图10A，混合箱接收适合于保持培养中的细胞存活的空气或气体混合物(通常95％O2和5％CO2)，空气或气体混合物从混合箱通过平台供给芯片中的气体供给通道。使气体混合物至少60％、80％或90％湿度以抑制水分从芯片的保持室通过气体供给通道的损失。通过芯片后，潮湿气体混合物带着它已在芯片附近形成的任何凝露从平台退出，通过混合箱并离开湿空气排出口。
18.示例性阀门、可检测标记物、细胞、微流***
18.1:阀门
各种类型的阀门是本领域已知的，包括微机械阀门、弹性阀门、固态微型阀门以及其他阀门。参见，例如，Felton,2003,TheNewGenerationofMicrovalves"AnalyticalChemistry429-432。建造微机电(HEMS)结构诸如泵和阀门的两种常见的方法是，基于硅的整体微机械加工(bulkmicro-machining)(是消减制造方法，由此单晶硅被光刻图案化，并然后蚀刻以形成三维结构)，和表面微机械加工(其是叠加法，其中半导体型材料层诸如多晶硅、氮化硅、二氧化硅、和各种金属顺序地添加并被图案化以制造三维结构)。
在一个实施方案中，阀门是单片阀门。在一个优选的实施方案中，阀门是压力驱动的“弹性阀门”。压力驱动的弹性阀门由其中两个微通道被弹性区段分离的结构组成，弹性区段可响应向另一个通道(例如，控制通道)应用的驱动力而偏转进一个通道(例如，流体通道)或从一个通道(例如，流体通道)缩回。弹性阀门的实例包括向上偏转阀门(参见，例如，US20050072946)、向下偏转阀门(参见，例如，美国专利号6,408,878)、侧驱动阀门(参见，例如，US20020127736，例如，0215-0219段)、常闭阀门(参见，例如，美国专利号6,408,878和美国专利号6,899,137)以及其他。具有弹性组件的化学抗性微流体阀门由Hua等人，2006,JMicromechMicroeng:16:1433-1443描述。在一些实施方案中，设备可具有阀门的组合(例如，向上和向下偏转阀门)。阀门可通过将气体(例如，空气、氮气和氩气)、液体(例如，水、硅油以及其他油)、包含盐和/或聚合物(包括但不限于聚乙二醇、甘油和碳水化合物)的溶液等注入进控制通道来驱动。一些阀门可通过将真空施加至控制通道来驱动。
除了通过基于压力的驱动***驱动的弹性阀门以外，还可使用具有弹性组件、和静电、磁性、电解和电动驱动***的单片阀门。参见，例如，US20020109114；US20020127736,，例如，0168-0176；以及美国专利号6,767,706。还描述了单向阀(参见，例如，Adams等人，2005,J.Micrornech.Microeng.)。
其他微型阀门包括基于电磁驱动(电磁螺线管柱塞)、压电效应(磁盘、悬臂和堆叠类型)、气动和热气动***、静电驱动器和双金属梁的微型阀门(参见Shoji等人1994,J.Micrornech.Microeng.4(4):157-171,Dec.1994)；响应于pH变化膨胀或收缩(并由此关闭或打开)的基于水凝胶的阀门(Beebe等人Nature404(6778):588-90,62000年4月)；包括电化学产生的气泡的微流体阀门(Hua等人AnalChem.74(24):6392-6,152002年12约)；由UV光驱动的基于聚合物独石的阀门；(Hasselbrink等人AnalChem.74(19):4913-8,12002年10月)；通过静电控制的微型阀门[美国专利号5,417,235和5,452,878]；或通过材料的热屈曲控制的微型阀门(美国专利号5,785,295)。
18.3:可检测标记物
对于通过光学工具监测、评估、成像和以其他方式处理细胞，合适的可检测标记物可以是，例如但不限于，着色、荧光、发光、或磷光。它可缀合或结合至细胞表面，或掺入细胞内。在一些实施方案中，它构成或缀合至抗体、凝集素、配体、底物、或反应产物。单独的细胞(或细胞单元)可还根据将他们与在设备中处理的其他细胞区分开的形态特征来跟踪和监测。
18.4:细胞
本发明的微流设备通常具有大小和形状允许二倍体和有核的两者的真核细胞通过的通道和室。并不意味着对本发明的实践的任何限制，这样的细胞可来源于脊椎动物、哺乳动物、家养动物、小鼠、灵长类动物或人。它可以是星形胶质细胞、神经元细胞、许旺氏细胞、上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞、肾细胞、外分泌细胞、成纤维细胞、软骨细胞、牙细胞(odontocyte)、胰岛细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、横纹肌细胞、肾细胞、肝细胞、枯否细胞、垂体细胞、粘膜细胞、激素分泌细胞、角化细胞、基底细胞、肺细胞、周细胞或髓核细胞。它可以是血液相关的细胞，诸如红细胞、网织红细胞、巨核细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、粒细胞、嗜酸性细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、淋巴细胞、细胞毒性T细胞、辅助T细胞、抑制性T细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、或树突细胞。它可以是各种类型的癌症细胞或癌症干细胞，白血病或淋巴瘤细胞，或杂交瘤细胞。它可以是多能干细胞或组织特异性干细胞、祖细胞、***、或生殖细胞。可选择地，它可以是植物细胞诸如实质细胞、厚角细胞(collenchymalcell)、厚壁细胞(Sclerenchymalcell)、石细胞(scleridcell)、分生细胞、木质部细胞或表皮细胞。可选择地，它可以是单细胞生物，诸如原生生物或真菌，诸如酵母。一起处理或培养的细胞可以是相同类型或多个不同类型的任何组合。
还预期，处理单倍体细胞、原核生物诸如细菌、无核细胞诸如血小板、和非生物颗粒以及其他实体。在一些实施方案中，微流设备及其通道被缩放和配置以便处理并允许这些细胞和颗粒单独通过。在其他实施方案中，微流设备及其通道被缩放和配置以便大量处理这些细胞和颗粒。
在一些实施方案中，所述细胞：不是配子、不是卵子、不是***。
在一些实施方案中，在细胞保持室中培养的细胞的组合不包括配子。
在一些实施方案中，在细胞保持室中培养的细胞的组合不包括卵子和***两者。
18.5:微流***
本发明的设备可由任何各种材料构造出，或可制造来自通道、阀门和其他微流体组件的材料的组合。可由其制造芯片的材料包括但不限于，弹性体、硅、玻璃、金属、聚合物、陶瓷、无机材料，和/或这些材料的组合。
在微流设备的制造中使用的方法将随所用的材料而变化，并且包括软光刻技术方法、微型装配、整体微机械加工法、表面微机械加工法、标准平版印刷法、湿蚀刻、反应离子蚀刻、等离子蚀刻、立体光刻和激光化学三维写作方法、模块化装配法、复制模塑方法、注射成型法、热成型法、激光烧蚀方法、方法的组合，以及本领域已知的或在将来开发的其他方法。各种示例性制造方法描述于Fiorini和Chiu,2005,"Disposablemicrofluidicdevices:fabrication,function,andapplication"Biotechniques38:429-46；Beebe等人，2000,"Microfluidictectonics:acomprehensiveconstructionplatformformicrofluidicsystems."Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:13488-13493；Rossier等人，2002,"Plasmaetchedpolymermicroelectrochemicalsystems"LabChip2:145-150；Becker等人，2002,"Polymermicrofluidicdevices"Talanta56:267-287；Becker等人，2000,"Polymermicrofabricationmethodsformicrofluidicanalyticalapplications"Electrophoresis21:12-26；美国专利号6,767,706B2，例如，6.8节"MicrofabricationofaSiliconDevice"；Terry等人，1979,AGasChromatographyAirAnalyzerFabricatedonaSiliconWafer,IEEETrans.onElectronDevices,v.ED-26,1880-1886页；Berg等人，1994,MicroTotalAnalysisSystems,NewYork,Kluwer；Webster等人，1996,MonolithicCapillaryGelElectrophoresisStagewithOn-ChipDetectorinInternationalConferenceOnMicroElectromechanicalSystems,MEMS96,491496页；以及Mastrangelo等人，1989,Vacuum-SealedSiliconMicromachinedIncandescentLightSource,inIntl.ElectronDevicesMeeting,IDEM89,503-506页中。
在一些实施方案中，该设备使用弹性材料制造。使用弹性体材料的制造方法将仅简要地在此描述，因为弹性体材料、使用这样的材料制造设备的制造方法、和设备的设计方法及其组件已经详细描述(参见，例如，Unger等人，2000,Science288:113-16；美国专利号6,960,437(Nucleicacidamplificationutilizingmicrofluidicdevices)；6,899,137(Microfabricatedelastomericvalveandpumpsystems)；6,767,706(Integratedactivefluxmicrofluidicdevicesandmethods)；6,752,922(Microfluidicchromatography)；6,408,878(Microfabricatedelastomericvalveandpumpsystems)；6,645,432(Microfluidicsystemsincludingthree-dimensionallyarrayedchannelnetworks)；美国专利公布号2004/0115838、20050072946；20050000900；20020127736；20020109114；20040115838；20030138829；20020164816；20020127736；和20020109114；PCT专利公布WO2005/084191；WO05030822A2；和WO01/01025；Quake和Scherer,2000,"Frommicrotonanofabricationwithsoftmaterials"Science290:1536-40；Xia等人，1998,"Softlithography"AngewandteChemieInternationalEdition37:551-575；Unger等人，2000,"Monolithicmicrofabricatedvalvesandpumpsbyrnultilayersoftlithography"Science288:113-116；Thorsen等人，2002,"Microfluidiclarge-scaleintegration"Science298:580-584；Chou等人，2000,"MicrofabricatedRotaryPump"BiomedicalMicrodevices3:323-330；Liu等人，2003,"Solvingthe"world-to-chip"interfaceproblemwithamicrofluidicmatrix"AnalyticalChemistry75,4718-23,"Hong等人，2004,"Ananoliter-scalenucleicacidprocessorwithparallelarchitecture"NatureBiotechnologyFioriniandChiu,2005,"Disposablemicrofluidicdevices:fabrication,function,andapplication"Biotechniques38:429-46；Beebe等人，2000,"Microfluidictectonics:acomprehensiveconstructionplatformformicrofluidicsystems."Proc.Natl.Acad.Sci.USA97:13488-13493；Rolland等人，2004,"Solvent-resistantphotocurable"liquidTeflon"formicrofluidicdevicefabrication"J.Amer.Chem.Soc.126:2322-2323；Bossier等人，2002,"Plasmaetchedpolymermicroelectrochemicalsystems"LabChip2:145-150；Becker等人，2002,"Polymermicrofluidicdevices"Talanta56:267-287；Becker等人，2000,"Polymermicrofabricationmethodsformicrofluidicanalyticalapplications"Electrophoresis21::12-26；Terry等人，1979,AGasChromatographyAirAnalyzerFabricatedonaSiliconWafer,IEEETrans.onElectronDevices,v.ED-26,1880-1886页；Berg等人，1994,MicroTotalAnalysisSystems,NewYork,Kluwer；Webster等人，1996,MonolithicCapillaryGelElectrophoresisStagewithOn-ChipDetectorinInternationalConferenceOnMicroElectromechanicalSystems,MEMS96,491496页；以及Mastrangelo等人，1989,Vacuum-SealedSiliconMicromachinedIncandescentLightSource,inIntl.ElectronDevicesMeeting,IDEM89,503-506页；以及本文引用的和在科学文献和专利文献中发现的其他参考文献。通常，可使用弹性材料，诸如PDMS利用各种弹性体材料的方法制造的本文描述的不同微流设备，设计微流设备以及它们的组件的方法已详细描述于科学文献和专利文献中。参见，例如，Unger等人(2000)Science288:113-116；美国专利号US6,960,437(Nucleicacidamplificationutilizingmicrofluidicdevices)；6,899,137(Microfabricatedelastomericvalveandpumpsystems)；6,767,706(Integratedactivefluxmicrofluidicdevicesandmethods)；6,752,922(Microfluidicchromatography)；6,408,878(Microfabricatedelastomericvalveandpumpsystems)；6,645,432(Microfluidicdevicesincludingthree-dimensionallyarrayedchannelnetworks)；美国专利公布号2004/0115838；2005/0072946；2005/0000900；2002/0127736；2002/0109114；2004/0115838；2003/0138829；200210164816；2002/0127736；以及2002/0109114；PCT公布号WO2005/084191；WO05/030822A2；以及WO01101025；Quake和Scherer,2000,"Frommicrotonanofabricationwithsoftmaterials"Science290:1536-40；Unger等人，2000,"Monolithicmicrofabricatedvalvesandpumpsbymultilayersoftlithography"Science288:113-116；Thorsen等人，2002,"Microfluidiclarge-scaleintegration"Science298:580-584；Chou等人，2000,"MicrofabricatedRotaryPump"BiomedicalMicrodevices3:323-330；Liu等人，2003,"Solvingthe"world-to-chip"interfaceproblemwithamicrofluidicmatrix"AnalyticalChemistry75,4718-23,Hong等人，2004,"Ananoliter-scalenucleicacidprocessorwithparallelarchitecture"NatureBiotechnology22:435-39，所有通过引用为了所有目的并入。
微流通道的某些特征将随它们的功能而变化。例如，细胞通过其运送的通道将具有适合于被研究的细胞类型的尺寸，溶液(例如，细胞培养基)通过其运送的通道通常具有较小的尺寸。在某些弹性微流设备中使用来驱动阀门的控制通道可具有变化的尺寸。因此，通道的尺寸可广泛变化，但通常包括小于2mm、通常小于1mm、有时小于0.5mm、且有时小于0.3mm的至少一个横截面尺寸(例如，高度、宽度、或直径)。通道通常具有在0.05至1000微米、有时0.2至500微米、且有时10至250微米的范围内的至少一个横截面尺寸。通道可具有允许流体和/或细胞运送的任何合适的横截面形状，例如，正方形通道、环形通道、圆通道，矩形信道等。在一个示例性方面，流体通道是矩形的并具有约在0.05至1000微米、有时0.2至500微米、且有时10至250微米的范围内的宽度。在一个示例性方面，通道具有0.01至1000微米、有时0.05至500微米、有时0.2至250微米、且有时1至100微米的深度。在一个示例性方面，流体通道具有约0.1:1至100:1、更优选地1:1至50:1、更优选地2:1至2.0:1、且最优选地3:1至15:1，以及常常约10:1的宽度与深度比。
本发明的微流设备可包括用于运送流体通过流体通道并进入且流出其他设备组件(例如，柱或反应器)或设备本身的一个或更多个整合的泵。合适的泵可以是电子的、静电的、磁的、机械的、注射器、气动的、或蠕动的。优选地，使用蠕动泵，诸如美国专利号6,408,878所描述的那些。可选择地，泵可在芯片外部。泵还用于运送流体(例如，水)通过控制通道以驱动阀门。泵还用于，例如，在排气通道中抽真空。
其他微流体组件也可整合进芯片中，包括，例如，控制通道、保护通道、排气通道、流体容器、混合反应器、旋转式混合器、分离模块(例如，分离柱)、分拣区域、泵、端口、小瓶、喷嘴、监测***、透镜、传感器、温度控制***、热源、光源、波导等。
应该理解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性的目的，且根据其的各种修改或改变将被建议给本领域技术人员，并被包括在本申请的精神和范围以及所附权利要求的范围内。此外，本文所引用的所有其他出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (124)

1.一种用于细胞分析的方法，所述方法包括进行至少两轮细胞捕获、表征、和运送，每轮包括：
a)使包含多个单独的细胞(和/或细胞单元)的溶液流入第一微流通道；
b)将所述通道分隔为多个连续的区段(S)，由此在至少一个区段中捕获至少一个细胞，其中
i)一个或更多个所述区段包含单个捕获的细胞(和/或单个捕获的细胞单元)，和
c)确定一个或更多个所述单个捕获的细胞和/或细胞单元的至少一个特性；以及
d)基于所确定的特性，将每个所述捕获的细胞或单元独立地运送至指定的细胞保持室，由此对于每个指定的目的室，运送至其的细胞的特性是已知的。
2.如权利要求1所述的方法，其中进行至少三轮、至少四轮、至少五轮、至少六轮、至少10轮、至少15轮、或至少20轮的细胞捕获、表征、和运送。
3.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中至少30％的所述区段包含不超过一个细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述区段的大多数包含不超过一个细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中一个或更多个区段不包含任何细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其中流入被分隔的所述第一微流通道的部分的单独的细胞(或细胞单元)的数目小于由于所述分隔产生的区段的数目。
7.如权利要求1所述的方法，其中方法在包含两个或更多个分隔通道的设备中进行，且细胞可从任何分隔通道的任何区段运送至任何细胞保持室。
8.如权利要求7所述的方法，其中存在两个分隔通道。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述第一微流通道的内腔基本上无特征。
10.如权利要求1-9的任一项所述的方法，其中所述确定的特性是细胞大小、形态、或胞外或胞内抗原的存在或不存在。
11.如权利要求1-9的任一项所述的方法，其中所述确定的特性是细胞行为。
12.如权利要求1-9的任一项所述的方法，其中所述确定的特性是所述细胞对物理、化学或生物激发的所述响应。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞通过大量流体流运送。
14.如权利要求13所述的方法，其中使用化合物歧管***将细胞从任何区段运送至任何细胞保持室。
15.如权利要求1所述的方法，其中从区段运送至细胞保持室的每个细胞被运送通过(例如，流过)相同连接通道。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述区段的每个与共同第二微流通道流体连通，且所述捕获的细胞被运送通过所述第二微流通道，输送至指定的细胞保持室。
17.如权利要求1所述的方法，其中至少10个单独的细胞(或细胞单元)被从区段运送至细胞保持室和/或至少10个细胞保持室被细胞占据。
18.如权利要求16或17所述的方法，其中所述化合物歧管连接至少5个区段和至少5个细胞保持室。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述化合物歧管连接至少10个区段和至少10个细胞保持室。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述化合物歧管连接至少10个区段和至少10个细胞保持室。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述化合物歧管连接至少20个区段和至少20个细胞保持室。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述化合物歧管连接至少10个区段和至少10个至100个细胞保持室。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述化合物歧管连接至少50个区段和至少50个-100个细胞保持室。
24.如权利要求1所述的方法，其中区段的数目与细胞保持室的数目的比大于1。
25.如权利要求24所述的方法，其中区段的数目比细胞保持室的数目大了约10％、约20％、约50％、约75％、约100％、或约200％倍。
26.如权利要求1所述的方法，其中将多个细胞单独地运送至所述同一细胞保持室，由此产生包含定义的细胞组合的细胞保持室。
27.如权利要求26所述的方法，其中将两个、三个或四个细胞单独地运送至所述同一细胞保持室。
28.如权利要求27所述的方法，其中每个单独地运送的细胞在不同轮分隔中捕获。
29.如权利要求1所述的方法，其中流入所述第一微流通道的细胞是真核细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。
33.如权利要求1所述的方法，其中(a)中的包含多个单独的细胞(或细胞单元)的溶液包含来自两种不同真核物种的细胞。
34.如权利要求1所述的方法，其中(a)中的包含多个单独的细胞(或细胞单元)的溶液包含来自相同物种的两个不同个体或样本的细胞。
35.如权利要求1所述的方法，其中(a)中的多个单独的细胞(或细胞单元)包括稀有细胞和其他细胞，步骤(d)中运送至细胞保持室的至少一个细胞是稀有细胞，且所述溶液中所述其他细胞与所述稀有细胞的比大于100:1，有时大于1000:1，有时大于10,000:1，且有时大于100,000:1。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述稀有细胞是干细胞、肿瘤细胞，任选地循环肿瘤细胞、循环内皮细胞、或胎儿细胞。
37.如权利要求1所述的方法，其中在所述细胞保持室中培养细胞。
38.如权利要求37所述的方法，其中培养所述细胞约1小时至约4星期。
39.如权利要求38所述的方法，其中培养所述细胞约1小时至约24小时。
40.如权利要求37-39所述的方法，其中所述细胞***以产生后代。
41.如权利要求39所述的方法，其中在培养期间观察所述细胞。
42.如权利要求39所述的方法，其中在培养期间激发所述细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述激发包括将所述细胞暴露于试剂。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述试剂是药物、测试试剂、蛋白、核酸或小分子。
45.如权利要求37所述的方法，其中第一细胞或细胞的组合被培养至少一小时，且然后在所述设备中通过细胞捕获、表征、和运送获得的一个或更多个另外的细胞被引入所述细胞保持室。
46.如权利要求37所述的方法，其中在培养一段时间后，从细胞保持室收获有存活力的细胞。
47.如权利要求37所述的方法，其中在培养一段时间后，将细胞保持室中的细胞原位固定。
48.如权利要求37所述的方法，其中将试剂、溶液或物理刺激应用于在一个或更多个细胞保持室中的一个或多个细胞，并导致所述一个或多个细胞的裂解。
49.如权利要求48所述的方法，其中将从所述裂解的细胞释放的大分子运出至少一个细胞保持室。
50.如权利要求49所述的方法，其中收集大分子。
51.如权利要求49所述的方法，其中将从所述裂解的细胞释放的大分子运出所述细胞保持室进入相应微流室，其中所述相应微流室与所述细胞保持室流体连通且不与其他细胞保持室流体连通。
52.如权利要求50或51所述的方法，其中所述大分子是核酸，任选地扩增所述核酸(任选地逆转录)、且任选地所述核酸或相应扩增子在所述微流***中测定，其中所述步骤全部在流体回路内发生，其中任选地所述测定确定遗传特性或基因、RNA或蛋白表达模式。
53.一种微流设备中的室，所述微流设备中的室被配置用于接收并保持活细胞，所述室包括：
输入通道，其被配置使得有核的真核细胞可完整通过所述输入通道并进入所述室；
四个或更多个的多个排出通道，其被配置使得流体可以而有核的真核细胞不可以离开所述室；和
气体透性膜，其将所述室和供给通道分开，其中供给通道被配制为将气体混合物带至所述室，并且所述气体透性膜被配制为使得气体可在所述室和所述供给通道之间互相交换。
54.如权利要求53所述的室，其中将所述室或所述输入通道连接至试剂通道，所述试剂通道被配制以供应用于保持或处理所述室中的细胞的流体，所述流体包含一种或更多种试剂。
55.如权利要求54所述的室，其中将所述试剂通道连接至包含细胞营养物质的流体的供给。
56.如权利要求54所述的室，其中将所述试剂通道连接至在将所述流体递送进入所述室后裂解细胞的流体的供给。
57.如权利要求53所述的室，其中所述输入通道朝向所述室逐渐变细，由此引导细胞朝向所述室的中心。
58.如权利要求53所述的室，其中所述排出通道以允许流体从所述输入通道流入所述室并流出所述排出通道而不吸引所述室中的细胞朝向所述排出通道的方式围绕所述室分布。
59.如权利要求58所述的室，其中所述室具有基本上是环形或椭圆形的周界，且所述排出通道超过所述周界的180度分布。
60.如权利要求53所述的室，所述室包括十个或更多个排出通道。
61.如权利要求53所述的室，其中所述排出通道通过排出口连接至所述室，且所述输入通道通过输入口连接至所述通道，且所述排出口的直径小于所述输入口的直径的20％，由此抑制完整细胞通过进入所述排出通道。
62.如权利要求53所述的室，其中所述排出通道包含珠或过滤器，由此抑制完整细胞通过进入所述排出通道。
63.如权利要求53所述的室，所述室足够大以容纳至少3个真核细胞。
64.如权利要求63所述的室，所述室足够大以容纳至少10个真核细胞。
65.如权利要求53所述的室，跨其最窄处直径至少50微米。
66.如权利要求53所述的室，跨其最窄处直径至少200微米。
67.如权利要求53所述的室，所述室包含凸形下表面。
68.如权利要求53所述的室，所述室包含用促进细胞粘附的物质涂敷的下表面。
69.如权利要求68所述的室，其中所述物质是细胞外基质。
70.如权利要求68所述的室，其中所述物质是纤连蛋白。
71.如权利要求53至70的任一项所述的室，其中所述室、所述输入通道、和所述排出通道充满流体。
72.如权利要求53至71的任一项所述的室，所述室包含至少两个真核细胞。
73.根据权利要求53至71的任一项的四个或更多个的多个室，各具有它自己的单独的输入通道，其中所述输入通道的每个被配制为从共用源供给细胞。
74.根据权利要求73所述的多个室，其中所述单独的输入通道各具有可独立于其他输入通道中的阀门操作的阀门。
75.根据权利要求73所述的多个室，其中所述单独的输入通道是第一多路器的部分，且所述共用源是将所述第一多路器与第二多路器连接的连接通道，其中所述第二多路器被配制为将细胞从多个不同的源递送至所述连接通道。
76.根据权利要求75所述的多个室，其中所述不同的源是共同分隔通道的分隔的区域。
77.一种保持培养中的细胞的方法，所述方法包括递送细胞至根据权利要求53至70的任一项的室，通过所述输入通道或单独的试剂通道供给营养培养基进入所述室，并且通过所述供给通道供给气体至所述气体透性膜。
78.如权利要求77所述的方法，所述方法还包括从细胞混合物单独地选择递送至所述室的细胞。
79.一种从根据权利要求53至70的任一项的室中存在的一个或更多个细胞提取细胞内组分的方法，所述方法包括通过递送导致细胞裂解的流体进入所述室来裂解细胞，并从所述室回收裂解的产物。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述产物通过所述排出通道回收。
81.如权利要求79所述的方法，其中所述产物包括核酸。
82.如权利要求79所述的方法，所述方法还包括使所述产物经受化学或生化反应。
83.一种在微流设备中的通道和阀门的构造，所述构造包括：
(a)输入多路器，所述输入多路器包括：
(i)四个或更多个的多个输入通道；
(ii)多个输入阀门，其被配置和排列以控制所述输入通道使得所述输入通道中的任何一个中的流体可独立于其他输入通道中的流体流动；
(iii)一个或更多个合并通道，其被配置和排列以接收流过所述输入通道的任何一个或更多个的流体并通过单个连接通道运送所述流体；
(b)所述连接通道；和
(c)输出多路器，所述输出多路器包括：
(i)四个或更多个输出的多个通道；
(ii)多个输出阀门，其配置和排列以控制所述输出通道使得所述输出通道中的任何一个中的流体可独立于其他输出通道中的流体流动；
(iii)一个或更多个分配通道，其被配置和排列以接收流过所述连接通道的流体并依据所述输出阀门的操作通过所述输出通道的任何一个或更多个发送所述流体。
84.如权利要求83所述的构造，其中所述一个或更多个合并通道是歧管。
85.如权利要求83或84所述的构造，其中从任何一个所述输入通道通过所述合并通道至所述连接通道的路径长度相同。
86.如权利要求83或84的任一项所述的构造，其中所述一个或更多个分配通道是歧管。
87.如权利要求83或84的任一项所述的构造，其中从所述连接通道通过所述分配通道至任何一个所述输出通道的路径长度相同。
88.如权利要求83或84的任一项所述的构造，所述构造被配制使得真核细胞可通过任何一个所述输入通道并从任何一个输入通道，通过所述合并通道、通过所述连接通道、通过所述分配通道、和通过任何一个所述输出通道完整传送。
89.如权利要求83或84的任一项所述的构造，其中每个所述输入通道相连并被配置以从分隔通道的不同区域接收流体。
90.如权利要求89所述的构造，其中所述输入阀门放置在所述分隔通道和所述合并通道之间。
91.如权利要求89所述的构造，其中所述分隔通道放置在所述输入阀门和所述分隔通道之间。
92.如权利要求83所述的构造，其中多个所述输出通道各自连接至单独的保持室。
93.如权利要求92所述的构造，其中所述保持室被配制用于细胞培养。
94.如权利要求91至93的任一项所述的构造，其中所述输入歧管中的通道、所述连接通道、和所述输出歧管中的通道都充满流体。
95.一种装置，所述装置被配置以支撑和操作微流设备，所述装置包括：
(a)平台，所述平台包括：
(i)腔，所述腔的形状和大小能够接收并支撑微流设备；
(ii)玻璃视窗，所述玻璃视窗被放置在所述腔的上方，使得当细胞被所述腔中的设备处理时，所述细胞可通过所述玻璃视窗成像。
(iii)界面板，所述界面板包括多个开口，被配置以密封所述腔中的微流设备的控制通道并通过气动压力操作所述设备中的阀门；
(iv)整合加热构件，所述整合加热构件包围所述平台的平面中的腔，被配置以保持所述腔中的微流设备在适合于细胞培养的温度下；
(b)混合箱，所述混合箱包括：
(i)被配置以接收气体混合物的入口；
(ii)被配置以加湿所述气体混合物的加湿器；
(iii)被配置以加热所述气体混合物至适合于细胞培养的温度的加热器；和
(c)被配置使得通过所述混合箱中的加热器加热的气体可通过所述平台进入所述腔中的微流设备中的导管。
96.如权利要求95所述的装置，所述装置包括：
(d)被配置使得来自所述腔中的微流设备的废气可回传至混合箱并通过所述混合箱出来的导管；和
(e)被配置使得来自所述腔中的微流设备的废流体可回传至混合箱并通过所述混合箱出来的导管。
97.如权利要求95或96所述的装置，其中所述平台还包括：
(v)被配置以确定通入和/或流出所述腔中的微流设备的气体混合物的湿度的湿度传感器。
98.如权利要求95或96所述的装置，其中所述混合箱还包括：
(iv)被配置以连接所述入口至气体混合物的源的luer锁定连接器；和
(v)电插座。
99.如权利要求95或96所述的装置，其中所述整合加热构件从所述平台延伸至所述混合箱以同时加热所述腔中的微流设备和所述混合箱中的气体混合物。
100.如权利要求95或96所述的装置，其中所述整合加热构件包括聚酰胺。
101.如权利要求95或96所述的装置，其中所述玻璃视窗涂敷有抑制冷凝的涂层。
102.如权利要求101所述的装置，其中所述涂层包括铱和锡。
103.一种微流***，所述微流***包含根据权利要求95的支撑装置与所述腔中的微流设备。
104.如权利要求103所述的微流***，其中所述微流设备是如以上所述或要求保护的设备。
105.如权利要求103所述的微流***，所述微流***还包括用于在所述微流设备中培养细胞的气体混合物供给和营养培养基供给。
106.如权利要求103所述的微流***，所述微流***还包括被配置以捕获所述微流设备中的细胞的图像的成像装置。
107.如权利要求103所述的微流***，所述微流***还包括被配置并编程以控制所述微流设备的操作的计算机处理器。
108.如权利要求107所述的微流***，其中所述计算机处理器是专用处理器。
109.如权利要求107所述的微流***，其中所述计算机处理器是包括编码以控制所述微流设备的操作的应用程序(app)的便携式计算机***中的处理器。
110.如权利要求107至109所述的微流***，其中所述计算机处理器被配置和编程以显示所述微流设备中的细胞的图像。
111.如在此以前描述的微流设备中的分隔通道在细胞群的处理中的用途。
112.如以上描述的微流设备中的连接至输出多路器的输入多路器在细胞群的处理中的用途。
113.如以上描述的微流设备中的多个保持室在细胞群的处理中的用途。
114.如以上描述的微流设备中的支撑装置在细胞群的处理中的用途。
115.根据权利要求111所述的用途，其中所述处理包括从所述细胞群分离并分拣单独的细胞(或细胞单元)。
116.根据权利要求111所述的用途，其中所述处理包括单独地培养来自所述细胞群的单独的细胞(或细胞单元)。
117.根据权利要求111所述的用途，其中所述处理包括从所述细胞群中分离单独的细胞(或细胞单元)并将单独的细胞(或细胞单元)与从所述细胞群分离的其他单独的细胞(或细胞单元)合并。
118.根据权利要求111所述的用途，其中所述处理包括从所述群中单独地收集单独的细胞(或细胞单元)的内含物，并使每个细胞的内含物经受化学反应。
119.根据权利要求111所述的用途，其中所述化学反应是测定的一部分。
120.根据权利要求111所述的用途，其中所述处理包括单独地成像来自所述群中的单独的细胞(或细胞单元)。
121.一种确定细胞群的性质的方法，所述方法包括提供无细胞组分，所述无细胞组分包含来自确切的N个细胞的大分子，其中N＝2，其中所述N个细胞已一起培养至少2小时，以及对所述大分子进行分析步骤。
122.如权利要求121所述的方法，其中所述大分子是核酸，且所述分析步骤包括扩增、转录、逆转录、克隆或测序。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述大分子是蛋白，且所述分析步骤包括所述蛋白与抗体混合。
124.根据权利要求121、122或123所述的方法，不同的是其中N＝3、4、5、6、7、8、或小于10。
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