CN101643701A - 基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种属于微流控芯片技术领域的基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片及其在富集稀少细胞方面的应用。该芯片是在现有Y型微流控芯片基础上的改造，包括键合在一起的基片和盖片，所述基片上设有Y型微通道以及分别位于Y型微通道上部两个端点的样品池(1)和缓冲液池(2)、还有位于Y型微通道下部端点的废液池(3)，所述基片上还设有抗原抗体免疫反应室(4)，所述抗原抗体免疫反应室(4)位于Y型微通道交叉点(5)和废液池(3)之间的微通道上，且抗原抗体免疫反应室(4)的宽度为微通道宽度的2－5倍。本发明的芯片可使磁珠高效、快速的被固定，增大细胞的进样量，提高了分析通量，减少进样死体积、减少滞留和交叉感染。

Description

基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片及其应用
技术领域
本发明属于微流控芯片技术领域，具体涉及一种基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片及其应用。
背景技术
20世纪90年代初微全分析***(Miniaturized Total Analysis Systems，μ-TAS)概念的提出在分析仪器和生命科学领域产生了重大影响，引导化学分析设备向着微型化、自动化、快速化、集成化与便携化的趋势发展。以微机电加工技术(MicroElectromechanical Systems，MEMS)为基础，在芯片上制作微泵、微阀、微管道、微电极、微反应器、微流量传感器、微检测器等功能单元构成微型化学***，把整个化验室的功能，包括采样、稀释、加试剂、反应、分离、检测等全化学过程集成在方寸大小的芯片上来实现，可称之谓“芯片上的实验室”(Lab on a Chip，LOC)。微流控芯片具有分析速度快，分离效率高，减少了样品和试剂的消耗量，可实现细胞的高通量分析，并易与其他检测设备联用。
随着微流控芯片技术的发展，特别是检测灵敏度的提高，微流控芯片对单个细胞及胞内的微量物质的分析与检测日益受到重视。微流控芯片适合于细胞分析主要是因为具有以下几个重要特征：第一，微流控芯片的通道尺寸与典型哺乳类细胞的直径大小相适应，有利于细胞的操纵、分析；其次，芯片的多维网络结构形成相对封闭的环境，与生理状态下细胞的空间环境接近；第三，芯片通道微尺度下传热、传质较快，可以提供有利的细胞研究环境；第四，芯片可以满足高通量细胞分析的需要，可同时获取大量的生物学信息；第五，芯片上多种单元技术的灵活组合使集成化的细胞研究成为可能，诸如细胞进样、培养、分选、裂解和分离检测等过程可集成在一块芯片上完成。
细胞分选的常用技术以流式细胞仪(flow cytometry)为主，但其设备昂贵、体积庞大、需要专业人士操作，且细胞用量大，难以在实验室和医院得到广泛应用。微流控芯片技术在一定程度上克服了上述局限，可以实现类似仪器的小型化、集成化、自动化和便携化。目前，以微流控芯片为平台的细胞分选方法主要可分为两类，其一是根据所采集信号的有无或强弱变化进行分选，其二是根据细胞自身的一些差异在不同的驱动力作用下的特征变化进行分选。
荧光激发细胞分选(fluorescence activated cell sorter，FACS)是微流控芯片细胞分选中比较常用的一种方法，其原理与流式细胞仪类似。首先对细胞进行荧光标记，当细胞经过检测器时，根据激光激发出的荧光信号的有无或强弱来控制细胞的流向。Wolff等设计了集成有功能性结构的微流控芯片，采用荧光激活分选的方法对细胞进行了筛选，当检测到荧光信号时，废液通道的阀门关闭，细胞流入收集池从而达到了细胞分离的目的(WolffA.等，Lab Chip，2003，3，22-27)。Schwille等根据细胞光学特性的不同进行荧光激活细胞分选。使用由杂交的硅树脂橡胶玻璃芯片组成的微流控支流通道***使流体混合，然后共轴聚焦到一个薄的流动层，在这个薄的流动层进行荧光激活细胞检测。(Dittrich P.S.等，Anal.Chem.2003，75，5767-5774.)
此外，在微流控芯片上集成微电极，细胞在不均一交变电场中被诱导极化，由于介电特性、电导率、形状或大小等不同，极化程度不同的细胞或颗粒在电场中受到不同的介电力而分离。Cheng等通过固定于微流控通道表面的细胞释放出离子引起周围介质导电性能的变化来给细胞计数(Cheng X.等，Lab Chip，2007，7，746-755)。利用低电导、低渗的介质使固定的细胞溶解，用表面图案电极检测了阻抗的变化情况，从而量化细胞的数目。细胞溶解阻抗光谱的方法比较敏感，检测限能达到20cells μL-1。Li等设计了一个集成有注射、分离区域和两个出口的微流控设备，采用连续介电电泳的方法分离和纯化了悬浮的生物细胞样品。在鞘流和样品注射口，用水力聚焦的方法将细胞样品注射到通道中，在不均匀的电场中形成了介电电泳区域来分离细胞并收集到两个样品池中(Li Y.等，Lab Chip，2007，7，239-248)。
除上述方法以外，还有通过微机械加工技术，在芯片上刻蚀微米级的网络或通道作为细胞过滤器来实现细胞的分选。Wheeler等在T形通道底部制作了一个超微隔离室，通过水力聚焦将细胞引入两个缓冲流之间，一个细胞落入超微室后，由于空间限制其他细胞不能进入，从而在细胞悬浮液中迅速分离出单个细胞(Wheeler A.R.等，Anal.Chem.，2003，75，3581-3586)。方肇伦研究组在十字形通道芯片上结合流体重力和电驱动方法对单个细胞进行操纵和分析。应用流体重力驱动将单个血红细胞引入进样通道，并用电驱动把细胞引入分离通道。在分离通道上施加高压，并使用激光诱导荧光对细胞内的谷胱甘肽进行了分离检测(Gao J.等，Lab Chip，2004，4，47-52)。
微流控芯片结合免疫磁珠法分选细胞也受到了广泛的关注。其原理是特定的细胞表面抗原能与包被有抗体的磁珠进行免疫反应，在外加磁场的作用下，含有特异性抗原的细胞被吸附而滞留在磁场中，而无该种表面抗原的细胞不能与抗体结合，没有磁性，不停留在磁场中，从而使不同的细胞得到分离。Pamme等在微流控磁性分离设备中连续的分离了载有磁性纳米粒子的细胞(Pamme N.等，Lab Chip，2006，6，974-980)，细胞在流经微流控室时在磁场的作用下发生偏转从而分离。Inglis等采用连续流动的微流控芯片成功地从人全血中分离了被磁性微颗粒标记的白细胞(Lnglis D.W.等，Appl.Phys.Lett.，2004，85，5093-509)。在芯片通道中制作一排微磁条，当细胞连续的流过磁条时，磁条所产生的高磁场梯度捕获被磁性标记的细胞并改变细胞的流动方向，从而达到分离的目的。2003年Harrison研究小组采用免疫磁珠法将抗体包被在磁珠外，成功的捕获了细胞中稀少的细胞(Furdui V.I.等，J.Micromech.Microeng.，2003，13，S164-S170)。2004年该研究小组采用Y形微流控芯片通道，对血液中的T淋巴细胞进行了分离和浓缩。他们把表面修饰有CD3抗体的蛋白A磁珠引入芯片，通过CD3抗体蛋白与T淋巴细胞的特异结合，T淋巴细胞被吸附在两侧带有磁场的Y形通道中，使只含有万分之一的T细胞被捕获富集(Furdui V.I.等，Lab Chip，2004，4，614-618)。本发明的芯片是对上述Y形微流控芯片的改造，本发明与Furdui设计的Y形微流控芯片相比，在Y形通道上巧妙的设计了一个用于抗原抗体免疫反应的反应室，通过扩大Y形通道的局部截面积，减小了流体在此区域的线速度，这样目标细胞更容易被捕获，从而提高了细胞的捕获效率，此外还可以增加细胞分选的通量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片。
本发明的另一目的在于提供上述芯片在富集稀少细胞方面的应用。
一种基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片，该芯片是在现有Y型微流控芯片基础上的改造，包括键合在一起的基片和盖片，所述基片上设有Y型微通道以及分别位于Y型微通道上部两个端点的样品池(1)和缓冲液池(2)、还有位于Y型微通道下部端点的废液池(3)，其特征在于，所述基片上还设有抗原抗体免疫反应室(4)，所述抗原抗体免疫反应室(4)位于Y型微通道交叉点(5)和废液池(3)之间的微通道上，且抗原抗体免疫反应室(4)的宽度为微通道宽度的2-5倍。
所述抗原抗体免疫反应室(4)为一个圆角矩形槽，矩形长度为1.8-2mm，宽度为0.2-1.0mm，槽的深度与微通道深度相同。
所述圆角矩形槽的圆角由半径为0.9-1mm的圆的四分之一圆弧构成。
所述抗原抗体免疫反应室(4)的中心距离Y型微通道交叉点(5)为10-15mm。
所述微流控芯片的材料为玻璃、石英、和高聚物中的一种或两种。
所述高聚物为聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯和聚乙二醇中的一种或两种。
所述样品池(1)、缓冲液池(2)、废液池(3)均为圆柱形。
本发明芯片在富集稀少细胞方面的应用，其操作步骤如下：在抗原抗体免疫反应室(4)的上下两侧对称放上永磁铁，永磁铁的磁场强度范围在280-310mT，将表面结合有特定抗体的磁珠以6-10μL/min的速度从样品池(1)进样，以6-10μL/min的速度从缓冲液池(2)流入缓冲液，将残留在非免疫反应室微通道上的磁珠冲洗到抗原抗体免疫反应室(4)内，而后将待分离样品以0.1-0.5μL/min的流速从样品池(1)通入到芯片微通道中，最后用缓冲液以6-10μL/min的流速从缓冲液池(2)流入微通道进行冲洗3-5次，含有相应抗原的细胞被吸附在抗原抗体免疫反应室(4)，从而目标细胞得到分离。
在抗原抗体免疫反应室(4)上下两侧的磁场强度决定了结合有特定抗体的磁珠的进样速度，磁场强度大时，磁珠的进样速度可大，磁场强度小时，磁珠的进样速度要小，否则，磁珠不能100％在抗原抗体免疫反应室(4)中被捕获。
本发明芯片的检测原理：先将两块永磁铁对称地放在微流控芯片反应室的上下两侧，然后将表面结合有单克隆抗体的磁性微珠以稍大的流速通入到通道中，结合有单克隆抗体的磁性微珠在外加磁场的作用下被固定在反应室内，接着将细胞悬液以较小的流速通入到通道中，通过细胞表面的抗原与磁珠表面的抗体间的特异性免疫反应，含有特异性抗原的细胞被吸附而滞留在磁场中，而无该种表面抗原的细胞不能与抗体结合，没有磁性，不停留在磁场中，从而使不同的细胞得到分离，最后采用装备有CCD的倒置显微镜对分离出来的细胞进行拍照计数，如图4所示。
本发明芯片的制作方法：
1)芯片设计：在基片上设计掩膜，比如，以玻璃为基片制作芯片采用湿法刻蚀技术，以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为基片制作芯片采用光刻法，由于玻璃各向同性会使通道向两侧扩展，而PDMS通道的尺寸与设计的掩膜相比变化不大，因此前者设计的掩膜尺寸比后者稍小。
2)芯片的制作方法：
A)以玻璃为基片、PDMS为盖片的芯片制作方法：
a.将设计的微流控芯片图形制成掩膜，图形区为透明区，可透射光，非图形区为黑色区，吸光而不能透射光。
b.将掩膜覆盖在63mm×63mm×1.5mm的匀胶铬板(铬型：LRC；铬厚T：145nm胶类：正性感光胶；胶厚：570nm)上，在紫外线照射下曝光，感光胶发生光化学反应。
c.曝光后的铬板在0.5％的NaOH溶液中显影，以除去被曝光的正性感光胶，掩膜上的图形被复制到光胶层上。
d.室温下将曝光后的胶铬板放入铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50g∶15mL∶300mL)中腐蚀裸露的铬膜，同时保证非图形区的光胶层和铬膜不被破坏。高纯水冲洗干净后，烘干。光胶层上的微图形结构被转移到了玻璃基片上。
e.湿法刻蚀微通道。以0.5M HF/0.5M NH4F为刻蚀剂刻蚀微通道，速率约为10μm h-1，得横截面为梯形的凹微通道。再依次用丙酮和铬膜刻蚀液除去残存的光胶层和铬膜，用高纯水冲洗干净即得干净透明的基片。
f.在基片的进样口位置用微型台钻处打孔，作为芯片样品池。
g.将基片在丙酮和去离子水中超声5-10min后，放入H2SO4/H2O2(3/1，V/V)的混合溶液中加热煮沸半小时。待冷却后，将基片取出并用去离子水冲洗至玻璃片表面呈中性。
h.截取与基片同样尺寸的固化好的PDMS盖片，并与将玻璃基片一起放入氧等离子体真空管中，抽真空3分钟，打开高频电源，90秒后取出基片和盖片，立即键合。
B)以PDMS为基片，为玻璃盖片的制作方法
a.设计制作阳模板掩膜的基片：掩膜上黑色图形区为微流体通道，不透光。
b.在干净的硅片上甩涂一薄层SU-8光刻胶，采用不同类型、粘度的SU-8，胶层厚度可控制在1～300μm之间。紫外线通过光掩膜使光刻胶曝光，未曝光区域用显影液溶解。硅片及表面上剩下的凸起SU-8结构用作制作PDMS基片的阳模。
c.PDMS基片的制作：将PDMS单体(二甲基硅氧烷)与引发剂以10∶1的重量比例混合，脱气后浇铸于基片阳模板上，在80℃聚合1.5小时，冷却至室温，剥离模板，得无色透明PDMS基片。
d.将基片和干净的玻璃盖片裁剪成相同的尺寸(误差：0.2μm)。在基片的储液池位置处打孔，作为芯片储液池。
e.将玻璃基片一起放入氧等离子体真空管中，抽真空3分钟，打开高频电源，90秒后取出基片和盖片，立即键合。
本发明芯片的优点：本发明利用免疫磁性分离的技术，在Y型微流控芯片上设计抗原抗体免疫反应室(4)，实现目标细胞的简便、快速、高通量分离和检测。根据流体力学连续性原理可知，流管中截面积大处流速小，截面积小处流速大，将反应室(4)截面积设计成大于通道截面积，从而使磁珠高效、快速的被固定，同时细胞的进样速度增大，提高了分析通量，减少进样的死体积、减少滞留和交叉感染的几率。目标细胞通过抗原抗体免疫反应在反应室被捕获富集，从而与其他非目标细胞分离开来，整个分离检测过程中不需要使用昂贵的仪器，并且试剂的消耗量非常的小，该芯片不仅适用于富集稀少细胞达到快速高通量的细胞分离，而且还可利用免疫细胞化学分析与磁性细胞分选相结合进行癌细胞的临床检测，该微流控芯片制造成本低，易于批量生产，实现了细胞分离检测的微型化、集成化和简单化。
附图说明
图1为实施例2制作的以玻璃为基片，PDMS为盖片的微流控芯片的微通道的尺寸设计图；
图2为实施例3制作的以PDMS为基片，玻璃为盖片的微流控芯片的微通道的尺寸设计图；
图3为Y型PDMS微流控芯片示意图；
“A”为芯片PDMS基片，“B”为芯片玻璃盖片；
1：样品池，2：缓冲液池，3：废液池，4：抗原抗体免疫反应室，5：Y型微通道交叉点
图4为芯片上免疫磁性分离的步骤和原理；
图5为现有技术Y型微流控芯片的掩膜胶片上微通道的尺寸设计。
具体实施方式
实施例1本发明芯片的结构
本发明芯片包括键合在一起的基片和盖片，基片上设有Y型微通道以及分别位于Y型微通道上部两个端点的样品池(1)和缓冲液池(2)、还有位于Y型微通道下部端点的废液池(3)，在距离Y型微通道交叉点(5)10mm的微通道上设计有抗原抗体免疫反应室(4)，反应室(4)为一圆角矩形槽，宽度为微通道宽度的4倍，长度为2mm。在抗原抗体免疫反应室(4)的上下两侧对称放上永磁铁，将表面结合有特定抗体的磁珠从样品池(1)进样，然后缓冲液从缓冲液池(2)流入，将残留在非免疫反应室微通道上的磁珠冲洗到抗原抗体免疫反应室(4)内，而后将待分离样品从样品池(1)通入到芯片微通道中，最后用缓冲液从缓冲液池(2)流入微通道进行冲洗，含有相应抗原的细胞被吸附在抗原抗体免疫反应室(4)，废液流入废液池(3)，从而目标细胞得到分离。
实施例2以玻璃为基片，PDMS为盖片的本发明芯片制作
(1)玻璃基片的制作：掩膜胶片上微通道的尺寸设计见图1。将掩膜胶片置于63mm×63mm×1.5mm的匀胶铬板上，紫外线曝光7分钟(波长365nm)，显影液中显影100秒后，100℃下烘干半小时。在室温下用铬膜刻蚀液(硫酸铈∶高氯酸∶水＝50克∶15毫升∶300毫升)腐蚀铬膜，然后用高纯水冲洗干净，烘干。通过数码显微镜摄像，测得铬板上的通道尺寸均增大了大约30μm。用0.5M HF/0.5M NH4F刻蚀剂腐蚀裸露的硼硅玻璃，速率约为10μm min-1，刻蚀10分钟后，再依次用丙酮、铬膜刻蚀液除去残余光胶层和铬膜，即得基片。用微型台钻打孔，钻头为2mm的金刚钻头，孔的直径即为液池直径2mm。显微镜下测定微通道尺寸：微流体通道，上部宽110μm，下部宽60μm，深度20μm，抗原抗体免疫反应室的尺寸：上部宽440μm，下部宽240μm，深度20μm。
(2)盖片的制作：截取与基片同样尺寸的PDMS作为盖片。
(3)将基片与盖片依次在丙酮和去离子水中超声5分钟，在H2SO4/H2O2(3/1)溶液煮微沸30分钟，待冷却后用高纯水中冲洗至玻璃表面呈电中性，在超净台中吹干。然后将玻璃基片和PDMS盖片放入氧等离子体真空管中，抽真空3分钟，打开高频电源，90秒后取出基片和盖片，立即键合。
实施例3以PDMS为基片，玻璃为盖片的本发明芯片制作
(1)PDMS基片的制作：掩膜胶片上微通道的尺寸设计见图2。将硅片放入到浓H2SO4/H2O2(3/1)溶液煮微沸30分钟，待冷却后取出用去离子水冲洗至中性，丙酮超声5分钟后在加热板上加热30分钟。
(2)在硅片上甩涂一薄层SU-8光刻胶，通过控制甩胶速度使胶层厚度大约为50μm。紫外线通过光掩膜使光刻胶曝光，未曝光的部分用显影液溶解。硅片表面上凸起的SU-8结构作为PDMS基片的阳模。然后将硅阳模进行硅烷化1小时。
(3)PDMS预聚体(单体/固化剂＝10/1混合)浇注在硅阳模上并真空脱气，然后放入70℃烘箱中固化1小时左右，然后将PDMS从阳模剥离，作为微通道的基片。
(4)将PDMS基片与干净的玻璃盖片一起放到氧等离子体真空管中，抽真空3分钟，打开高频电源，90秒后取出基片和盖片，立即键合。
实施例4利用实施例2制得的芯片分离与检测艾滋病感染者CD4+T淋巴细胞
(1)将磁场强度为290mT的两块永磁铁对称地放在微流控芯片免疫反应室的上下两侧。
(2)将2μL、浓度为1.5×108beads/mL的抗CD4+免疫磁珠(购自美国Invitrogen公司)以6μL/min的速度从样品池(1)进样。
(3)然后用5μL含0.1％BSA的PBS缓冲溶液从缓冲液池(2)以6μL/min的速度通入，将残留在非免疫反应室微通道上的抗CD4+免疫磁珠冲洗到免疫反应室内。
(4)将1μL的细胞悬液以0.2μL/min的流速从样品池(1)通入到芯片微通道中。
(5)用含0.1％BSA的PBS缓冲溶液以6μL/min的流速从缓冲液池(2)流入微通道进行冲洗3次，含有CD4+的T淋巴细胞被吸附而滞留在磁场中，从而使目标细胞得到分离。
(6)采用装备有CCD的倒置显微镜对分离出来的细胞进行拍照计数。
上述细胞悬液的制备方法：无菌取出小鼠脾脏将其放入有PBS缓冲溶液的平皿中，用注射器芯研磨脾脏至脾呈白色絮状，然后置于300目无菌细胞筛网过滤，冲洗，以1000rpm离心5min，弃其上清，以RPMI-1640重悬细胞。
实施例5本发明实施例2制备的芯片与现有技术Y型微流控芯片在细胞分选方面的比较试验
现有技术中Y型微流控芯片的制作：按照实施例2的方法进行制作，其中，掩膜胶片上微通道的尺寸设计见图5。
按照实施例4的方法分别使用实施例2制得的芯片和上述现有技术Y型微流控芯片进行艾滋病感染者CD4+T淋巴细胞的分离，现有技术Y型微流控芯片对目标细胞的捕获效率为20％，而本发明的芯片对目标细胞的捕获率为90％。
参考文献
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Claims (8)

1、一种基于免疫磁性分离技术的细胞分选微流控芯片，包括键合在一起的基片和盖片，所述基片上设有Y型微通道以及分别位于Y型微通道上部两个端点的样品池(1)和缓冲液池(2)、还有位于Y型微通道下部端点的废液池(3)，其特征在于，所述基片上还设有抗原抗体免疫反应室(4)，所述抗原抗体免疫反应室(4)位于Y型微通道交叉点(5)和废液池(3)之间的微通道上，且抗原抗体免疫反应室(4)的宽度为微通道宽度的2-5倍。
2、根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述抗原抗体免疫反应室(4)为一个圆角矩形槽，矩形长度为1.8-2mm，宽度为0.2-1.0mm，槽的深度与微通道深度相同。
3、根据权利要求2所述的微流控芯片，其特征在于，所述圆角矩形槽的圆角由半径为0.9-1mm的圆的四分之一圆弧构成。
4、根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述抗原抗体免疫反应室(4)的中心距离Y型微通道交叉点(5)为10-15mm。
5、根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，所述微流控芯片的材料为玻璃、石英、和高聚物中的一种或两种。
6、根据权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述高聚物为聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯和聚乙二醇中的一种或两种。
7、权利要求1所述芯片在富集稀少细胞方面的应用。
8、根据权利要求7所述的应用，其特征在于，在抗原抗体免疫反应室(4)的上下两侧对称放上永磁铁，永磁铁的磁场强度范围在280-310mT，将表面结合有特定抗体的磁珠以6-10μL/min的速度从样品池(1)进样，以6-10μL/min的速度从缓冲液池(2)流入缓冲液，将残留在非免疫反应室微通道上的磁珠冲洗到抗原抗体免疫反应室(4)内，而后将待分离样品以0.1-0.5μL/min的流速从样品池(1)通入到芯片微通道中，最后用缓冲液以6-10μL/min的流速从缓冲液池(2)流入微通道进行冲洗3-5次，含有相应抗原的细胞被吸附在抗原抗体免疫反应室(4)，从而目标细胞得到分离。
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