CN104531504B - 一种利用层流和趋化作用分离细菌的微流控芯片装置 - Google Patents

Abstract

本发明属于微流控芯片领域，是一种利用层流和趋化作用分离细菌的微流控芯片装置。该装置包括分离细菌的微流控芯片和诱导试剂浓度控制***两部分。其中微流控芯片是一种集成了诱导试剂入口、细菌入口、细菌分离通道、细菌收集出口和废液出口的近似“X”型的PDMS‑玻璃芯片；诱导试剂浓度控制***由多组注射泵和注射器构成，可通过注射泵控制流量等参数，得到浓度随时间动态变化的诱导试剂。本发明，主要利用细菌在层流和化学诱导试剂作用下，趋向高吸引剂浓度和低驱斥剂浓度方向泳动的特性，以此实现从细菌混合液中分离感兴趣细菌的操作。本发明可用于食品安全、水质监测、制药工程、临床医学等领域的研究分析。

Description

一种利用层流和趋化作用分离细菌的微流控芯片装置

技术领域

本发明属于生物微流控芯片领域，具体涉及一种利用层流和趋化作用分离细菌的微流控芯片装置。

背景技术

细菌分离是指从细菌和细胞的混合物、或是多种细菌混合物中分离出感兴趣细菌的过程，它在食品工业、水质检测、生物工程、制药工业和临床医学上都有十分重要的意义。

传统的细菌分离是在琼脂培养基中进行的，培养条件苛刻、费时，且分离培养过程易受杂菌的污染，故基于这种方法的细菌分离培养常不能获得理想结果。近年来，微流控技术的发展使得细菌的快速分离成为可能。利用细菌在层流中的泳动和翻滚特性，人们建立了多种分离细菌的微流控芯片，然而这些细菌分离芯片的分离效率仍然偏低。因此，建立一种快速、高效的细菌分离方法显得尤为重要。

有运动能力的细菌，其膜表面存在各种具有专一性的化学受体，细菌可以通过它们感受周围化学诱导物浓度的变化，并通过胞内的信号传递***将感应到的化学信息转变成细胞内的信号，进而由这种信号控制细菌鞭毛的运动方向，产生相对应的趋化性运动，趋利避害。遇到化学吸引剂时，细菌向高浓度吸引剂的方向直线泳动。反之，遇到驱斥剂时，细菌立即产生翻滚运动并沿驱斥剂浓度梯度递减的方向泳动。当吸引剂或驱斥剂的浓度信号随时间发生变化时，细菌的运动还呈现出随信号强度和频率依赖的特性。细菌的这种化学趋向性行为使得应用微流控技术进行快速、高效的细菌分离成为可能。

基于此，本发明提出一种基于流体力学原理精确调控诱导物浓度梯度环境的微流控芯片装置，利用细菌在层流中的趋化性行为将细菌进行快速、高效的分离。

发明内容

本发明的设计目的在于提供一种快速、高效分离细菌的微流控芯片装置，设计中利用微流控技术对化学诱导试剂(吸引剂和驱斥剂)浓度的时间梯度和空间梯度进行定量控制，结合细菌在层流中的泳动、翻滚以及趋化特性，实现微尺寸下的细菌分离操作。

本发明中，该装置包括分离细菌的微流控芯片和诱导试剂浓度控制***两部分(图1)。其中，微流控芯片是一种集成了诱导试剂入口、细菌入口、细菌分离通道、细菌收集出口和废液出口的近似“X”型的PDMS-玻璃芯片(图2)。

本发明的技术方案如下：

一种利用层流和趋化作用分离细菌的微流控芯片装置，该微流控芯片装置包括：诱导试剂A入口，细菌入口，诱导试剂B入口，诱导试剂A注入通道，细菌注入通道，诱导试剂B注入通道，细菌分离通道，细菌输出通道，废液输出通道，细菌收集出口和废液出口。其中，细菌分离通道是一条横截面为矩形扁平通道，其高度H远小于宽度W和长度L并且尺寸在微米或毫米量级，入口与诱导试剂A注入通道、细菌注入通道和诱导试剂B注入通道相通，出口与细菌输出通道和废液输出通道相通。

诱导试剂入口、细菌入口、诱导试剂注入通道、细菌注入通道、细菌分离通道、细菌输出通道、废液输出通道、细菌收集出口和废液出口组成近似“X”型的PDMS-玻璃芯片(图2)。

本发明中(图2)，将诱导试剂A注入通道和诱导试剂B注入通道的宽度设计保持一致；另外，细菌注入通道宽度小于诱导试剂注入通道宽度，使得细菌能与诱导试剂充分的接触，从而提高分离的准确率。几何尺寸在微米和毫米量级的细菌分离通道中流体运动速度缓慢，呈现出层流特性，忽略流体在y轴方向的运动和变化，根据泊肃叶定律可得溶液在X型微通道内的流速为：

$V_x\left(z\right)=\frac{H^2}{8\mathrm{\μ}}[1-{\left(\frac{2z}{H}\right)}^2](-\frac{\∂p}{\∂x})---\left(1\right)$

其中p为压强，μ为溶液粘度系数。对上式沿z轴方向积分，可得到单位宽度的流量Q满足：

$\frac{Q}{W}=\frac{H^3}{12\mathrm{\μ}}(-\frac{\∂p}{\∂x})---\left(2\right)$

在假设诱导试剂A、诱导试剂B以及细菌混合液的粘度系数近似相等的情况下，诱导试剂A、诱导试剂B和细菌混合液在单位宽度上的流量相等，即：

$\frac{Q_A}{W_1}=\frac{Q_0}{W_2}=\frac{Q_B}{W_3}=\frac{H^3}{12\mathrm{\μ}}(-\frac{\∂p}{\∂x})---\left(3\right)$

其中Q_A、Q_B和Q₀分别表示诱导试剂A、诱导试剂B和细菌混合液的流量，W₁、W₂和W₃分别表示诱导试剂A、细菌混合液和诱导试剂B在细菌分离通道内所占的宽度。

由以上推导可知，在细菌分离通道内诱导试剂A、诱导试剂B和细菌混合液的流场分界线(图3中点划线)与诱导试剂A、诱导试剂B和细菌混合液的流量Q_A、Q_B和Q₀比例有关，控制该流量比即可改变流场分界线的位置。

基于上述流体的层流特性，诱导试剂A、诱导试剂B和细菌混合液进入细菌分离通道后将产生分层现象。如果没有化学诱导物存在时，有动力细菌将先平稳地直线泳动一段距离，然后突然翻滚一次改变运动方向，再向前泳动，再翻滚。根据不同细菌种类的翻滚特性宏观上将产生两种不同方向的泳动：一类细菌是趋于向流体流动的左侧游动，体现趋左游动特性；另一种则是具有趋右游动特性。这两类运动使得细菌在混合液和诱导试剂层流分界线附近产生宏观的扩散效应。一旦遇到化学诱导试剂时，细菌的这种自由泳动翻滚特性将被破坏。当遇到吸引剂时，细菌将向高浓度吸引剂的方向直线泳动，不出现翻滚现象，表现为正向趋化性；反之，遇到驱斥剂时，细菌会立即产生翻滚运动并沿驱斥剂浓度梯度递减的方向泳动，体现负向趋化性。显然，将诱导试剂A和诱导试剂B分别选择为合理的驱斥剂或吸引剂，能增强细菌的横向运动，进而提高细菌的分离效率。具体地，当细菌表现为趋左游动特性时，诱导试剂A选为吸引剂，诱导试剂B为驱斥剂；反之，当它具有趋右游动特性时，诱导试剂A则选择驱斥剂，诱导试剂B为吸引剂。这样，利用该微流控芯片可分离不同种类不同特性的细菌。

由于细菌容易适应诱导试剂浓度长期不变的环境，也可根据实际需要，利用诱导试剂浓度控制***动态改变吸引剂和驱斥剂浓度随时间的变化。诱导试剂浓度控制***包括：多组注射泵和注射器，注射器包括溶质注射器、溶剂注射器，注射器与注射泵相连，通过设置注射泵中的流量、速度等参数，进而控制注射器的注射状态。溶质注射器和溶剂注射器通过双通接口和硅胶管连接到三通接口，构成能生成动态浓度的装置，再将其通过双通接口、硅胶管连接到相应的微流控芯片入口处。通过设置不同的溶质、溶剂的流量、速度参数，得到不同浓度的诱导试剂溶液，即浓度可随时间动态变化的诱导试剂溶液。

下面以诱导试剂A溶液为例阐述生成浓度动态变化的诱导试剂溶液的原理。如图4所示，Q_A1(t)、Q_A2(t)和Q_A(t)分别表示诱导试剂A的溶质、溶剂和溶液的流量，φ_A1和φ_A(t)分别表示诱导试剂A的溶质和溶液中有效化学诱导物质浓度，φ_A1是常数，溶剂中不含有效化学诱导物质，根据质量守恒定律和流体连续性得：

$\begin{array}{c}{Q}_{A1}\left(t\right)+Q_{A2}\left(t\right)=Q_A\left(t\right)\\ Q_{A1}\left(t\right){\mathrm{\φ}}_{A1}=Q_A\left(t\right){\mathrm{\φ}}_A\left(t\right)\end{array}---\left(4\right)$

由式(4)得：

$Q_{A1}\left(t\right)=\frac{Q_A\left(t\right){\mathrm{\φ}}_A\left(t\right)}{{\mathrm{\φ}}_{A1}}---\left(5\right)$

$Q_{A2}\left(t\right)=Q_A\left(t\right)[1-\frac{{\mathrm{\φ}}_A\left(t\right)}{{\mathrm{\φ}}_{A1}}]---\left(6\right)$

因此在给定所需的诱导试剂A溶液的流量Q_A(t)、浓度φ_A(t)和溶质的浓度φ_A1，即可得到溶质和溶剂的流量Q_A1(t)和Q_A2(t)。这样，通过注射泵控制诱导试剂A溶质注射器和诱导试剂A溶剂注射器的流量，使得它们按照Q_A1(t)和Q_A2(t)变化，即可生成所需的浓度按φ_A(t)变化的诱导试剂A溶液。

本发明提供的用于分离细菌的微流控芯片装置，操作简单，应用层流和细菌的趋化特性，可成功从细菌混合液(细菌与细胞混合液或多种细菌混合液)中分离出感兴趣的细菌，用于食品安全、制药工程、临床医学等相关方面的细菌研究分析。

附图说明

图1是分离细菌的微流控芯片装置结构图。

图2是微流控芯片微通道示意图。

图3是近似“X”型通道示意图。

图4是诱导试剂A溶液产生原理图。

图5是实验***示意图。

图中：Ⅰ诱导试剂浓度控制***，Ⅱ细菌分离微流控芯片；Ⅲ微流控芯片微通道俯视图，Ⅳ微流控芯片微通道主视图；

1诱导试剂A溶质注射器，2诱导试剂A溶剂注射器，3细菌混合液注射器，4诱导试剂B溶质注射器，5诱导试剂B溶剂注射器，6诱导试剂A溶液，7细菌混合液，8诱导试剂B溶液，9微流控芯片微通道，10 PDMS-玻璃芯片，11细菌输出，12废液输出；13诱导试剂浓度控制***，14计算机显示***，15激光共聚焦或荧光显微镜，16细菌分离微流控芯片，17废液回收处理；

9-1诱导试剂A入口，9-3细菌入口，9-2诱导试剂B入口，9-4诱导试剂A注入通道，9-5细菌注入通道，9-6诱导试剂B注入通道，9-7细菌分离通道，9-8细菌输出通道，9-9废液输出通道，9-10细菌收集出口，9-11废液出口。

具体实施方式

以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。

图1所示为分离细菌的微流控芯片装置结构图，包括诱导试剂浓度控制***Ⅰ和细菌分离微流控芯片Ⅱ两部分。其中，诱导试剂浓度控制***Ⅰ由五组注射器和注射泵组合而成；细菌分离微流控芯片Ⅱ，包括：诱导试剂A入口9-1、细菌入口9-3、诱导试剂B入口9-2、诱导试剂A注入通道9-4、细菌注入通道9-5、诱导试剂B注入通道9-6、细菌分离通道9-7、细菌输出通道9-8、废液输出通道9-9、细菌收集出口9-10和废液出口9-11。其中，细菌分离通道9-7入口与诱导试剂A注入通道9-4、细菌注入通道9-5和诱导试剂B注入通道9-6相通，出口与细菌输出通道9-8和废液输出通道9-9相通。芯片所有通道结构采用标准化的微加工方法，用PDMS制作完成，并与洁净玻璃片键合密封，构成常见的玻璃-PDMS芯片。

本实施例中，该微流控芯片与可编程注射泵、激光共聚焦(或荧光)显微镜、计算机构成了完整的细胞分离***(图5)。一支装有幽门螺杆菌样本混合液的注射器3与芯片的细菌入口9-3连接，另外两种诱导试剂的注入分别由两组可编程注射泵和注射器连接实现，将两支分别装有1％血浆(吸引剂A)和溶剂的注射器1和注射器2，通过双通接口、硅胶管和三通接口连接到诱导试剂A入口9-1；再将装有2％胆汁(驱斥剂B)和溶剂的注射器4和注射器5，通过双通接口、硅胶管和三通接口连接到诱导试剂B入口9-2，并将所有注射器与可编程注射泵相连。通过控制注射泵的流量变化可得到浓度随时间变化的诱导试剂A和B，并注入到芯片中，实现对幽门螺杆菌的分离。

本实施例中，微流控芯片内部的所有通道高度均为30μm，诱导试剂A注入通道9-4和诱导试剂B注入通道9-6宽度保持一致，为210μm；细菌注入通道宽度为80μm；细菌分离通道是长为16mm，宽为500μm的矩形通道；两个输出通道，细菌输出通道9-8和废液输出通道9-9的宽度相同，等于200μm。

进一步，利用其他检测技术对分离后收集到的细菌进行检测，分析得到所收集细菌的纯度、活性等，用于后续研究分析。本发明可根据不同细菌的趋化性差异，选择不同的吸引剂和驱斥剂，并且依照需要使其浓度随时间发生动态变化，成功从细菌混合液(包括细菌和细胞混合液、多种细菌混合液)中快速、高效、高纯度的分离出感兴趣的细菌，用于食品安全、水质监测、制药工程、临床医学等领域的研究分析。

Claims (2)

1.一种利用层流和趋化作用分离细菌的微流控芯片装置，其特征在于，该微流控芯片装置包括：

三个样品入口：诱导试剂A入口、细菌入口和诱导试剂B入口；三条输入通道：诱导试剂A注入通道、细菌注入通道和诱导试剂B注入通道；

一条主通道：细菌分离通道；

两条输出通道：细菌输出通道和废液输出通道；

两个出口：细菌收集出口和废液出口；

诱导试剂入口、细菌入口、诱导试剂注入通道、细菌注入通道、细菌分离通道、细菌输出通道、废液输出通道、细菌收集出口和废液出口组成“X”型的PDMS-玻璃芯片；

细菌分离通道是一条横截面为矩形扁平通道，其高度H小于宽度W和长度L并且尺寸在微米或毫米量级，样品入口与诱导试剂A注入通道、细菌注入通道和诱导试剂B注入通道相通，两个出口分别与细菌输出通道和废液输出通道相通；

诱导试剂A注入通道和诱导试剂B注入通道的宽度保持一致，细菌注入通道宽度小于诱导试剂注入通道宽度，使得细菌能与诱导试剂充分的接触；

根据不同细菌不同的游动趋向选择不同的试剂，当所需分离的细菌具有趋左游动特性时，诱导试剂A为细菌吸引剂，诱导试剂B为驱斥剂；反之，当所需分离的细菌具有趋右游动特性时，诱导试剂A为驱斥剂，诱导试剂B为细菌吸引剂。

2.按照权利要求1所述的微流控芯片装置，其特征在于，通过注射泵控制诱导试剂溶质和溶剂的流量变化，得到所需的浓度随时间发生动态变化的诱导试剂。