CN107517589A - 提供骨、骨髓及软骨的诱导的因子和细胞 - Google Patents

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欧文·L·唔斯曼
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Abstract

本发明提供了用于产生功能性软骨细胞、骨骼细胞、骨髓基质细胞及其祖细胞的方法、组合物及试剂盒。这些方法、组合物及试剂盒可用于在体内或体外产生软骨细胞、成骨细胞、基质细胞及其祖细胞以用于移植、用于实验评价、作为谱系‑和细胞‑特异性产物的来源等，例如用于治疗软骨、骨及造血***的人类病症。在一些实施方案中，鉴别了蛋白因子的特定组合以用于将非骨骼细胞重编程为骨、造血基质及软骨细胞，其可在体外或体内提供。

Description

提供骨、骨髓及软骨的诱导的因子和细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年1月8日提交的美国临时专利申请序列号62/101,282的优先权，该申请的公开内容以引用的方式并入本文。
政府权利
本发明得到美国国立卫生研究院提供的合同号为HL058770的政府资助。政府对本发明享有一定权利。
背景技术
在美国，几乎每个家庭都受到涉及骨骼的疾病的影响。无数病因学，包括退化病状、肿瘤病状、创伤后病状及术后病状，影响了骨骼。这些疾患影响各个年龄、种族、人种及经济阶层的人们。美国医疗成本与效用项目(U.S.Health Cost&Utilization Project)最近报道归因于肌骨骼***疾病的生物医学负担每年超过470亿美元，并且该数字近年来以每年8.5％的估计速率继续增加。此外，因为北美及全球人口老龄化，可预期所以肌骨骼发病率同时增加。这种世代交替是目前在卫生保健***中操作的最强大的力量。必须开发治疗骨骼疾病的替代方法以加强和/或替代同期的措施。
骨的独特之处在于它具有在特定范围内再生的先天能力。另外，人体骨骼在婴儿期每年替换并且在成年时大约每5到6年替换，从而支持以下结论：在骨组织中存在活性干细胞和祖细胞，它们被用作出生后骨组织的生长、稳态及再生所需的新成骨细胞的来源。可通过透彻地理解骨骼如何发育并从干细胞角度进行维持来解决骨骼临床问题。
组织特异性成年干细胞存在于大部分主要器官***中并且已在许多组织中得到明确鉴定。与造血***相比，在骨骼***中的干细胞调控仍相对未被探索。Friedenstein等人的开创性研究确定在骨组织中存在集落形成性骨骼形成细胞，但最近才开始努力鉴定和分离骨、软骨及基质祖细胞以用于严格的功能表征。另外，骨髓也是来自***癌和乳腺癌的转移的优选位点，并且支持转移性干细胞生态位的骨基质的来源和特性基本上未被表征。由若干组鉴定的骨骼祖细胞的性质根据分离方法及使用的功能测定类型而变化。在组织再生中的另一个重要挑战是在自然界和实验室中(再)生成软骨的受限制的能力，其在许多疾病(例如骨关节炎、***病症)中是缺乏的。
对影响骨骼发育和软骨形成发育的细胞和因子的鉴别具有极大的临床和研究应用价值。本发明解决了这个问题。
出版物
目标出版物包括Tevlin等人(2014)J Vis Exp.(93),“Osteoclast derivationfrom mouse bone marrow”；McCardle等人(2014)Tissue Eng Part A.20(21-22):3031-40, “Positive Selection for Bone Morphogenetic Protein Receptor Type-IBPromotes Differentiation and Specification of Human Adipose-Derived StromalCells Toward an Osteogenic Lineage”；Chan等人(2013)Proc Natl Acad Sci U SA.110(31):12643-8, “Clonal precursor of bone,cartilage,and hematopoieticniche stromal cells”；和Levi等人(2012)Proc Natl Acad Sci U S A.109(50):20379-84,“In vivo directed differentiation of pluripotent stem cells for skeletalregeneration”.Chan等人(2009)Nature 1月22 日；457(7228):490-4.“Endochondralossification is required for hematopoietic stem cell niche formation”。
发明内容
本发明提供了用于产生功能性软骨细胞、骨骼细胞、骨髓基质细胞及其祖细胞的方法、组合物及试剂盒。这些方法、组合物及试剂盒可用于产生软骨细胞、成骨细胞、基质细胞及其祖细胞以用于移植、用于实验评价、作为谱系-和细胞-特异性产物的来源等，例如用于治疗软骨、骨及造血***的人类病症，并且用于老化或以其它方式损伤的软骨和骨的再生。
在一些实施方案中，提供用于指导哺乳动物骨骼干细胞的分化的组合物和方法，包括分化为成骨谱系、软骨形成谱系及基质谱系。在一些实施方案中，提供用于指导非骨骼细胞，例如多能干细胞、间充质干细胞(MSC)、脂肪衍生的干细胞(ASC)等分化为骨骼干细胞的组合物和方法。
对于体内使用，重编程因子可全身或以局部植入物形式提供，例如在基质胶或其它合适的基质中，并且任选地提供为具有有效剂量的细胞，例如ASC、SSC、MSC、定向软骨祖细胞(CCP)等。还提供了用于此类方法的细胞培养***。细胞可用于治疗方法，例如以提供用于骨骼或软骨形成替换疗法的细胞；筛选方法，等中。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人或小鼠细胞。
在一些实施方案中，在需要骨和/或软骨再生的位点处体内递送有效剂量的人ASC及有效剂量的可包括但不限于BMP2的重编程因子。ASC任选地从经治疗的个体分离。在其它实施方案中，ASC是同种异体的，例如，其可冷冻保存在库中。还提供了一种包装(例如，盒、瓶或瓶与盒)，其包括有效剂量的此类重编程因子和包装插页或标签，所述包装插页或标签表明所述因子有待连同有效剂量的人ASC一起向患者施用以用于骨和/或软骨的再生。所述包装任选还包括适用于人ASC的分离的试剂。hASC可从脂肪抽吸物中新近分离，并且任选地提供为具有对造血细胞有特异性的抗体，例如CD45、CD235 等，以便耗尽存在于脂肪抽吸物中的造血细胞。
在其它实施方案中，有效剂量的人SSC从成年骨中分离，包括但不限于股骨头骨，所述SSC可用于移植及如本文所述的其它治疗目的。
在一些实施方案中，鉴别了蛋白因子的特定组合以用于将非骨骼细胞重编程为骨、造血基质及软骨细胞，其可在体外或体内提供。BMP2可扩增SSC细胞，包括体外培养扩增。BMP2的局部高浓度触发主要骨骼形成途径的激活，从而造成非骨骼组织再特化为SSC。这些重编程SSC在功能上与骨分离的SSC相同并且能够分化为骨、软骨及基质。
在本发明的一些方面中，提供了用于治疗需要骨骼或软骨形成组织的细胞移植疗法的受试者的方法。在一些此类实施方案中，使用本发明的方法和组合物使受试者与因子及任选的细胞接触。在某些实施方案中，细胞来源于受试者。
在一些细胞移植实施方案中，提供了因子及因子的混合物用于将骨骼干细胞引导向软骨形成命运，所述因子可在体外或体内提供。显示抑制VEGF信号传导驱使SSC经历向软骨组织的分化。还显示，抑制TGF-β信号传导可驱使SSC经历向软骨组织的分化。在一些实施方案中，向个体提供有效剂量的VEGF抑制剂与有效剂量的SSC组合用于软骨再生。在其它实施方案中，向个体提供有效剂量的VEGF抑制剂与有效剂量的脂肪干细胞和BMP2的组合用于软骨再生。
在其它细胞移植实施方案中，提供了因子及因子的混合物用于将骨骼干细胞引导向成骨命运，所述因子可在体外或体内提供。暴露于wnt蛋白(包括但不限于Wnt3和Wnt5 蛋白)可增强SSC向骨的分化。在一些实施方案中，向个体提供有效剂量的Wnt 3或Wnt 5激动剂(例如包括但不限于人Wnt3、人Wnt3a、人Wnt5a、人Wnt5b蛋白、或其模拟物和衍生物)与有效剂量的SSC组合用于骨的再生。在其它实施方案中，向个体提供有效剂量的Wnt激动剂与有效剂量的脂肪干细胞和BMP2的组合用于骨的再生。
在一些实施方案中，向个体提供有效剂量的VEGF和/或TGFβ的抑制剂用于在所需位点处的软骨诱导。在一些此类实施方案中，有效剂量是以局部形式提供，例如作为植入物，包括可生物降解的植入物、显微针、贮库或本领域中已知用于局部递送活性剂的其它药物形式。在一些实施方案中，共同施用有效剂量的BMP2试剂，该剂量可有效驱使非骨骼细胞(包括但不限于间充质干细胞)朝向骨骼的命运。组合的制剂允许软骨从内源性非骨骼细胞再生。因子的组合可与有效剂量的细胞，例如ASC、SSC等一起递送。目标因子还包括驱使骨形成的因子，例如wnt蛋白。目标因子还包括VEGF。
在其它实施方案中，还提供有效剂量的再生细胞群(包括但不限于MSC，如脂肪衍生的MSC)作为用于软骨形成或造骨作用的细胞来源。此类实施方案包括但不限于在用来定位细胞和因子的基质中植入。在一些此类实施方案中，基质由以下组成：生物相容的及任选可生物降解的基质或晶格，例如由基质胶、聚乳酸、聚乙醇酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)；胶原、藻酸盐等形成，它们能够支持三维构型的软骨形成。
在一些此类实施方案中，将任选与再生细胞组合的所述因子引入需要软骨修复的组织中。此类位点包括但不限于分化细胞相关的疾病状态和创伤性损伤，包括但不限于：前十字韧带撕裂、全层关节软骨缺损、部分层的关节软骨缺损。
在一些实施方案中，提供了与哺乳动物骨骼干细胞(SSC)有关的组合物和方法。在本发明的一些实施方案中，提供了哺乳动物骨骼干细胞的组合物。在其它实施方案中，提供了骨骼谱系定向细胞的组合物，包括软骨定向细胞。
本发明的骨骼干细胞可被鉴定，并且通过细胞表面标记物的表型分析从细胞群中分离，或从非骨骼细胞诱导。用于分离SSC的目标细胞群包括骨样品，其一般包括骨髓，并且包括但不限于成年骨，例如股骨头骨；和间充质干细胞和祖细胞的来源，其已例如通过与有效剂量的BMP2接触被诱导分化为骨祖细胞。此类早期祖细胞的来源包括血液、脂肪组织、骨髓等。
本发明的祖细胞已在谱系中得到表征，如图2G所示。提供了用于分离并表征此类骨骼谱系细胞的方法和组合物。所述细胞可通过这些特异性细胞表面标记物的表达而与其它细胞分离。所述细胞可用于移植、用于实验评价、及作为谱系和细胞特异性产物的来源，包括可用于鉴定在这些细胞中特异性表达的基因的mRNA种类，以及作为用于发现可影响它们的因子或分子的靶标。人SSC细胞群一般对于CD45、CD235、Tie2及CD31 的表达呈阴性；并且阳性地表达平足蛋白(PDPN)。具有此标记物组合的细胞(例如从骨组织分离的细胞)群可称为[PDPN+/146-细胞。[PDPN+/146-]群可进一步再分成三个群：能够软骨形成的单能亚组[PDPN+CD146-CD73-CD164-]、能够骨发生的单能细胞亚群 [PDPN+CD146-CD73-CD164+]以及能够软骨内(骨和软骨)骨化的多能 [PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞。
在小鼠组织中，骨骼谱系被表征为CD45-、Ter119-、Tie2-、αv整合素+。SSC进一步被表征为Thy1-6C3-CD105-CD200+。定向软骨细胞祖细胞进一步被表征为Thy1+6C3- CD105+CD200+。
提供了用于骨骼谱系细胞的生长和分析(包括克隆分析)的体外和体内***。具体说来，发现在体内模型中，骨骼谱系细胞可例如通过包埋入基质中来定位并且将形成骨结构。在骨软骨祖细胞存在时，骨将形成支持造血细胞功能的功能性骨髓生态位。
还提供了用于针对将细胞转化为骨骼细胞、软骨细胞及其祖细胞的活性来筛选候选试剂的方法、组合物及试剂盒。
附图说明
图1.骨和软骨是衍生自克隆的、谱系限制的祖细胞。(A)在出生后第3天用他莫昔芬诱导之后的6周龄彩虹(Rainbow)肌动蛋白-Cre-ERT小鼠股骨的组织显微图。左：荧光显微术，其中倾斜角度矩形示出的插图具有更高放大率，该插图在图中心处由白色正方形表示，其示出了存在于股骨生长板处的克隆。中：五色染料(pentachrome)-染色的小鼠股骨的明视场图像，其中倾斜角度矩形示出的插图具有更高放大率，该插图在图中心处由白色正方形表示，其示出了股骨的生长板。右：冠状面小鼠股骨的照片。需要注意，黄色虚线描绘了股骨生长板，紫色虚线描绘了骨基质，且绿色虚线描绘了骨髓。所有图中的比例尺都等于500μM。(B)FACS曲线图，示出了通过机械消化和酶促消化从股骨生长板(水平上图)、冲洗的骨(中图)及骨髓(水平下图)分离的悬浮细胞的分布。在股骨的三个不同部分中，[AlphaV+]群在生长板中最常见(中间的水平上图)。DN＝双阴性，即对于Thy和6C3染色呈阴性；[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-]。(C)实验方案：将肌动蛋白-Cre-ERT转基因小鼠与彩虹报道基因小鼠杂交。在胚胎期第15天(E15)、出生后第3天(P3)及出生后第6周，通过他莫昔芬注射诱导后代的Cre重组。诱导后第6周采集股骨组织。(D)示出了存在不同数量的克隆的结果的图示，其横跨骨和软骨。6周追踪期之后，克隆区域可确定为单一颜色的均匀标记区(观察到7种独特上色的克隆，如在 x轴上由“颜色1-7”表示)。没有观察到用造血组织、脂肪组织或肌肉组织捕获骨、软骨及基质细胞的不同克隆区域，且因此，这些没有用图表表示。(E)用于分离八种不同骨骼组织亚群的FACS门控策略，所述亚群是由[AlphaV+]亚组获得，[AlphaV+]亚组是由出生后第3天的野生型C57Bl6小鼠的长骨、肋骨及胸骨处获得，所述门控策略是基于四种其它细胞表面标记物的差异表达：Thy、6C3、CD105及CD200。如FACS曲线图中描绘的细胞群(a-h)对应于由[AlphaV+]亚组获得的八种不同骨骼组织亚群：a＝BCSP，b＝BLSP，c＝6C3，d＝HEC，e＝mSSC，f＝前BCSP，g＝CCP，h＝Thy。(F)(上图)用Movat 五色染料染色的P3时的小鼠股骨的组织学分析，其含有骨(染黄色)、软骨(染蓝色/绿色) 及骨髓(染红色)。比例尺等于200μM。(下图)在肾囊下的细胞亚群移植之后组织移植物的五色染料染色的组织切片：20,000个来自P3时的八个骨骼组织亚群的高度纯化的细胞被注射到免疫受损小鼠的肾囊下并且在移植之后30天采集(图‘a’至‘h’表示[AlphaV+] 亚组内的八个细胞亚群，如图1E的FACS曲线图中所示)。每个移植物的五色染料染色的横切片表明骨、软骨及骨髓基质限制每个祖细胞亚群的细胞命运。群e [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)、f[CD45-Ter119- Tie2-AlphaV+CD105-Thy-6C3-CD200-](前BCSP)及a [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105+](BCSP)可重建整个骨环境，其是由骨、软骨及功能性骨髓腔组成。群b(BLSP)、c(6C3)、d(HEC)及h(Thy)仅仅形成骨。群g (CCP)除形成少量骨之外还形成软骨。比例尺等于200μM。(G)描绘了每一个取出的移植物的组织组成百分比的图(‘a’至‘h’表示[AlphaV+]亚组内的八个细胞亚群，对应于图1E 中的FACS曲线图和图1F中的移植组织)：在堆叠柱形图内，骨百分比由黄色表示，骨髓百分比由红色表示且软骨百分比由蓝色表示。(H)实验方案：在机械解离和酶促解离之后，将[AlphaV+]亚组内的八个亚群的20,000个细胞从P3时GFP标记的小鼠的长骨中分离。随后通过FACS将细胞分级分离到八个细胞亚群中，如上详述。然后在受体小鼠的肾囊下移植纯化的GFP+细胞。移植之后一个月，取出移植物用于分析。
图2.mSSC(小鼠骨骼干细胞)的鉴别.(A)实验方案：在机械解离和酶促解离之后，将[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](在图中表示为CD200+TN，即CD200+三阴性)细胞从P3时的GFP+小鼠的股骨中分离，抗体染色并且FACS分级分离。 (i)将纯化的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞接种于含有具有10％胎牛血清的MEMα培养基的培养板中。在培养的第0、11及25天，采集培养细胞用于FACS分析和分选以确定在培养中扩增后 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞亚群的构成性细胞。通过FACS重新分级分离细胞之后第25天，在受体小鼠的肾囊下移植每个亚组(mSSC、 BCSP、Thy、6C3)细胞的20,000个细胞。移植之后一个月，取出移植物用于分析。(ii) 还将纯化的GFP标记的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC) 细胞直接移植到受体小鼠的肾囊下(先前未在培养中扩增)。移植之后一个月，取出移植物用于通过FACS或组织学的分析。(B)在培养(i,ii)的第0、11及25天，培养的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)的FACS分析。在第25 天，对体外培养物进行FACS分选并且将四个亚群(mSSC [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]、BCSP[CD45- Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105+]、Thy+ [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy+6C3-CD105-]及6C3+ [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3+CD105+])移植到肾囊下以确定其内在潜能。(iii) mSSC形成骨、软骨及骨髓腔(红色框)。BCSP(绿色框)、Thy细胞(蓝色框)及6C3细胞(橙色框)仅形成骨，而不形成骨髓腔。比例尺等于(iii，上图)500μm、(iii，下图)200μm。(C) 植入之后一个月，取出的肾囊移植物的FACS分析，其中高度纯化的GFP标记的 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞群被移植到肾囊下。取出的移植物的(i),(ii)FACS分析揭示了取出的移植物由7个下游亚群(蓝色、红色及橙色框)组成。五色染料染色的外植体的明视场显微图((iii)最左边的下图)表明 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)亚群能够生成骨、软骨及骨髓。在延伸至图右侧的紫色框内示出了在下图的最左边的五色染料染色图的较高放大率的荧光图像。紫色框内的图显示mSSC能够生成表达Thy和6C3的细胞，如在免疫组织化学中所观察((iii)中图；在此Thy＝红色，6C3＝白色)。合并图在最右侧底部(iii，右下图)。在(iii)的最上左图的较低放大率图像中示出了GFP+移植物的荧光图像。比例尺等于：(iii，上图)500μm、(iii，下图)100μm、(iii，免疫荧光图像)50μm。(D)实验方案：在机械解离和酶促解离之后从RFP+P3小鼠的长骨中分离细胞。这些细胞不通过FACS 进行分级分离并且充当饲养细胞。在机械解离和酶促解离之后从P3GFP+小鼠的长骨中分离细胞并且在FACS之后获得[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] (mSSC)细胞。(i)将单一GFP标记的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy- 6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞与5,000个RFP(+)饲养细胞共同移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下。(ii).将单一纯化的GFP标记的 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞在96孔培养皿的每孔中涂铺。培养14天之后，对所形成的集落计数，采集，使用FACS重新分选并且将单一纯化的GFP标记的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞再次在96孔培养皿的每孔中涂铺并重复测定。(E)通过在96孔培养皿的每孔中涂铺单一[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞进行体外集落形成测定。(i)：在涂铺后14天时描绘原代集落的代表性相位显微图像。(ii)：原代集落的传代造成具有与原代集落相似形态的次生集落的形成(相位显微镜术)。(iii)在免疫荧光染色(荧光显微术)之后，原代集落针对抗胶原2型(紫色)、抗骨钙素(绿色)及DAPI(蓝色)呈阳性染色。(iv)最右侧的竖直图描绘了分离的(上)、及后续原代集落(中)、及次生集落细胞(下)的初始[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞的FACS分析。比例尺等于(i，ii)：500μm(iii)，100μm(F)从肾囊下取出的移植物的显微术(根据图2D(i))。来自GFP标记的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3- CD105-CD200+]mSSC的体内集落形成的范围在(i)、(iii)、(v)中由黄色虚线勾勒出且在 (ii)、(iv)、(vi)中由黑色虚线勾勒出。在(i)、(iii)、(iv)中使用荧光显微术，克隆扩增的、 GFP标记的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+](mSSC)细胞明显为绿色细胞。相应的明视场显微图描绘于图(ii)、(iv)、(vi)中。移植物横切片的荧光图像描绘于图(iii)和(v)中。五色染料染色切片的相应明视场显微图显示克隆扩增的细胞注定成为骨(黄色)和软骨(蓝色)(iv和vi)。(vii)中的图代表GFP或RFP细胞(每移植的细胞)对骨或软骨形成的贡献。比例尺等于(i-vi)：200μm。(G)骨骼干细胞谱系树的示意图。mSSC 占据分层树的顶端并且是多能的，能够自我更新并且分化为更多谱系限制的祖细胞(前 BCSP和BCSP)。mSSC、前BCSP及BCSP能够产生骨、软骨及造血支持基质。每个细胞的免疫表型在细胞旁边示出。注意，观察到VEGF拮抗作用促进软骨命运(以红色示出)，而Wnt激动作用可促进骨命运(以绿色示出)。
图3.mSSC生态位由其它骨骼谱系细胞组成。(A)实验方案：采集P3小鼠的长骨并且通过机械解离和酶促解离分离细胞。通过FACS分选细胞悬液以获得mSSC；BCSP； Thy(+)，其包括CCP、Thy和BLSP亚组；以及6C3(+)，其包括6C3和HEC。然后制备细胞亚群以用于单细胞RNA测序及后续分析。(B)来自四个骨骼干/祖细胞亚群的单细胞RNA测序数据的分层群聚显示在mSSC、BCSP、Thy(+)及6C3(+)之间有四种分子不同的单细胞转录表达模式。(C)成形素、受体或这两者在以下群的单细胞RNA测序上的转录表达百分比：(细胞顺序从左到右)mSSC、BCSP、Thy(+)、6C3(+)。成形素和同源受体在每行中从上到下的顺序：BMP2/BMPR1a、WNT/FRZ、TGFβ3/TGFβR2。文氏图(Venn diagram)显示了成形素的表达百分比(在每个文氏图中的左圆圈)及同源受体的表达百分比(在每个文氏图中的右圆圈)。成形素和配体共表达的百分比在文氏图的重叠中央部分中示出。注意，百分比表示每个测定的亚组(mSSC、BCSP、Thy(+)及6C3(+)) 内的细胞百分比，其表达相关基因序列。所展示的图案示出了对于自分泌(左下示意图) 和旁分泌信号传导(右下示意图)的潜能。(D)如使用Gene ExpressionCommons(GEXC) 分析平台所测定的骨骼群中Wnt相关基因的基因表达水平(按以下从上到下的顺序示出： mSSC、BCSP、Thy、6C3、BLSP及HEC)。在用CD200进一步细化之前进行这些实验，所研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。如使用GEXC所计算的转录表达范围通过在图最右侧所描绘的颜色变化示出 (即，深紫色与极高表达相关，而深蓝色与极低表达相关)。此热图示出了Wnt相关配体 (Wnt3a、Wnt4、Wnt5a)和受体(Fzd5-9)两者的高表达，表明Wnt信号传导途径可积极地参与骨骼祖细胞的功能。还在整个细胞群中看到了SFRP-2(分泌性Fzd相关蛋白2)的高表达。Fzd＝卷曲受体。(E)配体-受体相互作用图。从骨骼基质亚组(按以下从上到下的顺序示出：mSSC、BCSP、Thy、6C3、BLSP及HEC)中提取的微阵列数据的基因表达分析，其示出了左列的配体和右列的同源受体。因为这些实验在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。两个最上面的配体-受体相互作用图显示BMP-2和BMP-7(重要的骨骼形成基因) 及其同源受体在骨骼基质群中高度表达。下面的三个配体-受体相互作用图列举了 TGFβ3、GDF5和VCAM-1及相应受体的基因表达。配体-受体相互作用图显示骨骼基质细胞可充当其自身的生态位并且通过彼此信号传导以促进造骨作用。连接箭头指示可能的配体-受体相互作用途径。注意：GDF＝生长和分化因子，VCAM-1＝血管细胞粘附分子 -1。(F)示出了影响骨骼干/祖细胞活性的潜在信号传导途径的图。认为自分泌和旁分泌信号传导可出现在骨骼干细胞生态位中并且调节细胞活性和维持。(G)将5,000个新近分离的mSSC(由GFP标记的小鼠获得)与各种成形素(BMP2、TGFβ、TNFα)共培养。右边的荧光显微图示出了在与成形素补充无培养后的集落形态，左边的图示出了在不同条件(对照或用BMP2/TGFβ/TNFα补充)下培养14天之后存在的mSSC数量。此时，发现与对照、非补充培养基(荧光显微图的左上图)相比，mSSC与rhBMP-2补充物的培养与体外mSSC群的显著扩增(荧光显微图的左下图)有关(p<0.01，ANOVA)。用TGFβ或TNFα的补充造成集落形态的改变(如荧光显微图的右上及右下图所示)。这些结果显示生态位信号传导可影响mSSC增殖。比例尺等于200μm。(H)附图左边的图示出了重组生长因子BMP2滴定对培养中的mSSC增殖的作用。在此发现，最大增殖作用在50ng/mL的浓度下观察到。BMP-2的作用在以下各浓度下显著大于对照：50ng/mL(p<0.001， ANOVA)、500ng/mL(p<0.01，ANOVA)。右边的相位图像示出了来源于mSSC的细胞集落(在对照、50pg/mL、500pg/mL、5ng/mL中由箭头指示且在50ng/mL和500ng/mL 中由虚线指示)。比例尺等于500μM。(I)Foxa2的基因表达热图显示Foxa2基因在mSSC 中被上调。因为这些实验在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(J)针对抗Foxa2抗体染色(红色)的近端股骨生长板的荧光显微图呈现了mSSC 在生长板上的定位，它是由白色虚线划出。DAPI＝蓝色。比例尺等于500μM。(K)细胞内FACS信号显示Foxa2以蛋白质水平存在于mSSC中。黑色峰＝mSSC信号，红色峰＝同种型信号。(L)(左图)针对抗Foxa2抗体染色(红色)的P3小鼠的近端股骨的荧光显微图显示存在mSSC。抗6C3抗体(白色)和抗Thy1抗体(绿色)显示分别存在6C3和Thy 细胞；且DAPI(蓝色)示出了mSSC生态位。右边的合并图像显示mSSC主要驻留在生长板上，有明显的生态位细胞、6C3细胞(白色)和Thy细胞(绿色)围绕mSSC。比例尺等于 200μM(最左边)，500um(最右边)。
图4.软骨细胞谱系可由成骨细胞谱系诱导以经历骨发生。(A)实验方案：在机械消化和酶促消化之后，将BCSP从P3时的GFP+小鼠中分离并且将CCP(定向软骨祖细胞)细胞从RFP+成年小鼠的耳朵/胸骨中分离，且随后通过FACS分级分离。在有和没有分泌性卷曲受体2(SFRP-2)情况下，将纯化的GFP+BCSP和RFP+CCP共同移植到免疫受损的受体小鼠的肾囊下。RFP+CCP单独的移植体充当对照。移植之后一个月，取出所有移植物用于分析。(B)取出的移植物的显微术，其中将CCP祖细胞亚群的20,000 个RFP标记细胞移植到肾囊中并且在一个月后取出(如图4A详示)。白色虚线勾勒出所形成的移植物的范围。取出的移植物的荧光显微图显示存在RFP+移植物(左上)。相应的明视场显微图在右上图中示出。用Movat五色染料染色的横切片(其将骨染成黄色、软骨染成蓝色且骨髓染成红色)显示RFP标记的CCP细胞形成软骨，如由蓝染所示。(荧光显微图：左下，明视场显微图：右下)比例尺等于(上图)：500μm，(下图)200μm。(C) 取出的移植物的显微术，其中将20,000个RFP标记的CCP细胞与20,000个GFP标记的BCSP一起共同移植到肾囊下并且在一个月后取出(如图4A详示)。随后形成的移植物由白色虚线(指示移植物的RFP+部分)和黄色实线(指示移植物的GFP+部分)勾勒出(左上)。相应的明视场显微图在右上图中示出。Movat五色染料染色的横切片显示RFP标记的CCP和GFP标记的BCSP形成骨，如由黄染所示。(荧光显微图：左下，明视场显微图：右下)比例尺等于(上图)：500μm，(下图)200μm。(D)取出的移植物的显微术，其中将20,000个RFP标记的CCP与20,000个GFP标记的BCSP共同移植到肾囊下(如图4A详示)，所述GFP标记的BCSP是用108/109个单位的编码可溶性卷曲相关蛋白 2(SFRP-2)的表达的腺病毒载体预处理过的。示出了在一个月之后采集的所得移植物。荧光显微图(左上)勾勒出GFP+群(在黄色实线内)和RFP+群(在白色虚线内)。示出了相应的明视场显微图(右上)。横切片的显微图示于下图中。示出了移植物横切片的荧光显微图(左下)并且示出用Movat五色染料染色此切片的明视场显微图(右下)证明RFP标记的CCP 细胞形成软骨，如由蓝染所示，而GFP标记的BCSP形成骨，如由黄染所示。比例尺等于(上图)：500μm，(下图)200μm。
图5.mSSC中的软骨命运在微环境中在不存在VEGF/PlGF信号传导下得以促进。(A)实验方案：通过机械解离和酶促解离将mSSC从P3小鼠中分离且随后通过FACS 分级分离。然后，在有和没有VEGF/PlGF信号传导的全身抑制的情况下，将从E14.5 小鼠分离的完整前成骨股骨或20,000个mSSC移植到免疫缺陷的受体小鼠的肾囊下。为了研究VEGF/PlGF信号传导的抑制，在肾囊细胞移植之前24小时，向指定的受体小鼠静脉内递送编码可溶性VEGFR1胞外域(Ad sVEGFR1)的腺病毒载体，从而造成 VEGF/PlGF信号传导的这种有效拮抗剂在循环中的全身释放。对于阴性对照，使用编码免疫球蛋白Fc片段的Ad Fc。(B)VEGF/PlGF信号传导的全身抑制造成完整的前成骨胎骨或mSSC在体内的软骨形成分化。将完整胎骨或mSSC移植到已用Ad sVEGFR1预处理的免疫受损小鼠的肾囊下。一个月之后取出移植物。取出的移植物的明视场显微图在图上部的第一和第三行中示出(左图中对照、Ad Fc和右图中治疗的、Ad sVEGFR1)。在图上部的第二和第四行中示出了用Movat五色染料染色的代表性切片。(上面两行：完整胎骨，下面两行：mSSC)VEGF/PlGF信号传导的抑制造成软骨的形成(蓝色)(右)，其中Ad Fc组形成骨(黄色)(左)。比例尺等于：(完整胎骨，上图)：500μm；(完整胎骨，下图)：100μm；(mSSC，上图)：500μm；(mSSC，下图)：200μm。(C)(C)在Ad sVEGFR1(VEGF信号传导的拮抗作用)或Ad Fc对照存在下mSSC/胎骨移植体的命运的图示。在此发现在全身VEGF拮抗作用存在下软骨命运的促进。(D)使用GEXC，在六个骨骼祖细胞亚群(从上到下依次列出：mSSC、BCSP、Thy、6C3、BLSP及HEC)中测定VEGF信号传导途径。mSSC及其下游子代的基因表达分析揭示传统VEGF受体如 Flt1、Kdr及Flt4的少量表达，而相比之下，VEGF/PlGF受体同源物Nrp1和Nrp2的高表达。骨骼干/祖细胞不表达VEGFA或VEGFB，但表达VEGFC和PlGF。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括 CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(E)实验方案：将mSSC从P3C57BL6 野生型小鼠的长骨中分离。在重组蛋白存在下培养这些细胞。存在4个实验组和一个对照组。在移植到腹股沟脂肪垫的皮下脂肪中之前一周用以下可溶性重组蛋白处理实验组： (I)NRP1，(II)PlGF，(III)VEGF及(IV)VEGFR1。随后在三周时取出移植物用于组织学分析。(F)移植之后三周，取出如图5E的图例中所述的移植物用于组织学分析。样品从左到右列出：对照(无治疗)、PlGF、sNRP1、VEGFA、sVEGFR1。每个移植物的肉眼外观的照片示于上图中：注意，这些移植物每个都具有微红外观(再次：样品从左到右列出：对照、PlGF、sNRP1、VEGF、sVEGFR1)。用Movat五色染料染色的取出移植物的明视场图像(再次：样品从左到右列出：对照、PlGF、sNRP1、VEGF、sVEGFR1)。在此可见所有移植物都主要产生骨和骨髓。用PlGF、sNRP1、VEGF、sVEGFR1预处理的mSSC产生骨和骨髓，及少量软骨。比例尺等于：(上图)1mm；(下图)200μm。
图6.BMP途径的操控可诱导mSSC在骨骼外区域中的从头形成。(A)将含有3ug 冻干的重组BMP2的胶原海绵置于C57BL6野生型小鼠的骨骼外位点中，即在肾囊下或皮下到腹股沟脂肪垫中。一个月后，取出移植物用于分析。(左图)外植体的明视场图像，其中肾囊移植体在上面示出且皮下移植体在下面示出。(右图)用Movat五色染料染色的横切片显示诱导的骨质类骨质充满骨髓腔(如由红染表示)。比例尺等于：(左图)500μm；(右图)200μm。(B)通过骨骼外位点中的BMP2诱导形成的类骨质内存在的细胞的FACS 分析(水平下图)揭示了通过使SlamF1阳性HSC循环所得到的高水平植入(由FACS曲线图最右边的绿色群描绘)，类似于小鼠的“正常”成年股骨中的HSC植入的正常频率(由 FACS曲线图最右边的绿色群描绘)(水平上图)。(C)(左图)在置于骨骼外位点中后第10 天，移出有BMP2交织的胶原海绵之后，移植物内存在的构成性细胞群的FACS分析揭示mSSC(由FACS曲线图上的红色框描绘)和BCSP(由FACS曲线图上的绿色框描绘)容易在BMP2处理过的外植体中检测到。(右图)相比之下，在不存在BMP2下脂肪组织的 FACS分析没有检测到mSSC(由FACS曲线图上的红色框描绘)或BCSP(由FACS曲线图上的绿色框描绘)。比例尺等于500μm。(D)为了确定异位骨骼祖细胞是否通过BMP2 诱导的骨骼定向原位形成或者BMP2是否促进从骨组织中募集来的循环骨骼祖细胞的迁移，实施一种联体生物模型来确定BMP2植入物中骨骼祖细胞的来源。将GFP标记的小鼠与非荧光野生型小鼠配对且随后通过手术融合。手术之后两周，通过测量存在于野生型小鼠的循环血液中的GFP标记的外周血细胞的部分来验证生理嵌合体。将含有3ug冻干重组BMP2的胶原海绵移植到野生型小鼠的腹股沟脂肪垫中以诱导异位骨形成。植入之后十天，取出组织并进行机械解离和化学解离以分离异位骨组织的构成性细胞群。然后通过FACs分析来测定GFP标记的细胞对非GFP小鼠中的异位骨形成的贡献，如描绘FACS分析曲线图的水平上图中所示(即GFP+＝循环细胞，且非荧光＝局部细胞)。虽然在采集时的植入物中检测到大量GFP标记的细胞，但有助于移植物的GFP标记的细胞是唯一的CD45(+)造血细胞(最左图，上和下)，并且与骨骼祖细胞群不一致(水平上图，mSSC群以最右边的红色框示出)。存在于采集时取出的组织中的骨骼祖细胞群是完全GFP阴性的，提示循环骨骼祖细胞对BMP2诱导的异位骨没有帮助。[存在于最右边的FACS曲线图中的绿色细胞不代表GFP标记的细胞。](E)(左图)报道基因小鼠模型的图表明Tie2表达造成GFP表达。结果，Tie2+细胞变绿，而Tie2-细胞保持红色。(右图)实验方案：为了确定可在骨骼外位点中经历BMP-2介导的重编程为mSSC的细胞类型，实施Tie2Cre x MTMG报道基因小鼠并且将含有3μg冻干重组BMP2的胶原海绵放置于腹股沟脂肪垫的皮下脂肪中。一个月以后取出小骨用于组织学分析。(F)切片组织的荧光显微图显示BMP-2衍生的小骨(由黄色虚线描绘)明显掺有具有可见微管的 GFP+Tie2+衍生的骨细胞和Tie2-阴性RFP标记的骨细胞，由此提示Tie2-阳性谱系和 Tie2-阴性谱系都可经历BMP2诱导的骨骼重编程。由白线所表示的在最右边的框中以较高放大率示出，其显示在(RFP+)Tie2-细胞存在下(GFP+)Tie2+微管的存在。比例尺等于500μM(左)，50um(右)。
图7.BMP2和VEGF抑制剂的共同递送足以诱导软骨在脂肪组织中的从头形成。(A)实验方案：BMP2和可溶性VEGFR1向原位脂肪细胞的共同递送。除VEGF/PlGF信号传导的抑制之外，BMP2也造成脂肪组织的软骨分化。BMP2单独(即，没有VEGF/PlGF 的抑制)造成成骨分化。(B)无VEGFR阻断(左图)或有VEGF阻断(右图)下含有BMP2 的皮下胶原海绵植入物的命运。在有/无全身/局部VEGFR阻断下放置含有3ug冻干重组BMP2的胶原海绵之后一个月，取出移植物用于分析。在用Movat五色染料染色的代表性切片(右)旁示出了移植物的明视场图像(左)。BMP2和VEGFR的共同递送造成蓝染软骨的形成(最右图，上和下)。全身VEGF阻断之后的结果示于右上系列中，而局部VEGF 阻断的结果示于右下系列中。比例尺等于(图从右移到左)：(最右)1mm；(内右)200μm； (内左)1mm；(最左)200μm。(C)经诱导的软骨的构成性细胞(水平上图)(如图7A所示的实验方案)的FACS曲线图对比来自年龄匹配小鼠的耳软骨的新近分离细胞(水平下图)的 FACS曲线图分析表明诱导和天然软骨组织两者的大部分在CCP(定向软骨祖细胞)亚群内。(D)在脂肪形成群中与BMP2和VEGF/PlGF信号传导途径有关的配体和受体的基因表达(上：配体，下：受体)。(T+P+：CD45(-)Tie2(+)PDGFR<(+)，T-P+：CD45(-)Tie2(-)PDGFR<(+))(E)Sox9(骨形态发生蛋白-2诱导的软骨形成的转录因子)、Runx2(成骨细胞生成的关键转录因子)、Sp7(成骨细胞分化及骨形成所需的骨特异性转录因子)及Foxa2基因(右)在脂肪形成群中的基因表达。(T+P+：CD45(-)Tie2(+)PDGFR<(+)，T-P+：CD45(-)Tie2(-)PDGFR<(+))。
图8：出生后的克隆扩增只限于骨、软骨及基质命运。(A)彩虹量化方案：荧光图像示出了P3小鼠的股骨生长板。由白色虚线显示克隆(>/＝5个具有单色的一致细胞)。示出了5种颜色组合，在图像中编号1-5。在右下方示出了克隆的定义。比例尺等于100 μM。(B)实验方案：将肌动蛋白-Cre-ERT转基因小鼠与彩虹报道基因小鼠杂交。在胚胎期第15天(E15)、出生后第3天(P3)及出生后第6周，通过他莫昔芬注射诱导后代的 Cre重组。诱导后第6周采集股骨组织。(C)在不同时间点诱导(左边的竖直图(i)，(ii)：在E15时诱导；中图(iii)，(iv)：在P3时诱导；右边的竖直图(v)，(vi)：在第6周时诱导) 之后的股骨生长板的荧光显微图。箭头表明存在克隆。注意在第6周诱导之后克隆区有轻微减小。由白色虚线矩形示出的区域描绘的高放大率插图在相应附图的插图中示出：如所示的(ii)、(vi)及(iv)。比例尺等于500μm。(D)6周龄肌动蛋白-Cre/彩虹小鼠在出生后第3天(P3)用他莫昔芬诱导并且在第6周处死。(i)股骨近端段的低倍视图，其中区域对应于(a)生长板，(b)骨髓，(c)脂肪及(d)脉管***。代表性的较高放大率图描绘了股骨生长板(ii)，(iii)；骨髓(iv)，(v)，(vi)；脂肪(vii)，(viii)，(ix)；以及血管(x)，(xi)，(xii)，荧光显微图显示仅在一个位点-生长板(ii)-处的细胞的克隆区域，其中每个克隆表现为一堆相同颜色的细胞。不存在在骨髓基质(iv)、脂肪(vii)及脉管***(x)处示出的明显克隆区域(其被描绘为一堆相同颜色的细胞)。将组织切片中的HSC、血管及脂肪分别用抗CD45、抗CD31及抗周脂素A免疫染色，如图(vi)、(xii)及(ix)中所示。注意：图像(ii)、(iv)、(vii) 及(x)：荧光显微术；图像(iii)、(v)、(viii)、(xi)：五色染料染色之后切片的明视场显微术。比例尺等于(i)500μm；(ii-ix)50μm，(x，xi，xii)200μm。(E)肌动蛋白Cre/彩虹小鼠在P3时诱导且在6周以后采集。(i)胸骨的明视场图像(ii)荧光显微图示出了具有同样由一堆相同颜色的细胞所示的克隆的胸骨。(iii)由白色框表示的高放大率插图。比例尺等于：(i，ii)500μm，(iii-v)200μm。(F)肌动蛋白Cre/彩虹小鼠在P3时诱导且在6周以后采集。(i)肋骨的明视场图像(ii)荧光显微图示出了具有同样由一堆相同颜色的细胞所示的克隆的肋骨。(iii)由白色框表示的高放大率插图。比例尺等于：(i，ii)500μm， (iii)50μm。(G)肌动蛋白Cre/彩虹小鼠在P3时诱导且在6周以后采集。(i)整只爪的明视场图像(ii)荧光显微图示出了具有同样由一堆相同颜色的细胞所示的克隆的爪。 (iii)由白色框表示的趾骨的高放大率插图。比例尺等于(i，ii)1mm；(iii)200μm。
图9：损伤诱导局部mSSC扩增。(A)实验方案：在8周龄的野生型小鼠的右下肢中制造稳定的横向中骨干股骨骨折。随后在第3天/第1周/第3周采集股骨胼胝并且通过机械解离和酶促解离分离构成性细胞。然后对细胞染色并且通过FACS进行分级分离。左侧股骨没有受伤，而是用作未骨折的对照。然后将来自未受伤股骨和受伤股骨的mSSC 移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下并且在1个月后取出组织用于组织学分析。(B)示出了在不同时间点存在于未受伤的完整股骨和股骨胼胝中的mSSC的数量的条形图。这显示了在第1周mSSC数量的显著增加，随后在骨折愈合的后期(第3周)在骨折胼胝中回到基线mSSC数量。此观察结果支持响应于骨损伤而出现的mSSC的剧烈增殖。(p<0.01，t- 检验)。每个样品的每100,000个分析细胞的mSSC数量在x轴下方示出。(C)(左图)将 20,000个mSSC在骨折后一周从胼胝(上)中且从未受伤的股骨(下)中新近分离。在存在成骨分化培养基下培养细胞2周，然后经受茜素红染色。在此发现与由未受伤股骨分离的那些相比，由骨折微环境获得的mSSC有显著更强的茜素红染色，提示在损伤后mSSC 的成骨潜能提高(p<0.01，t-检验)。(右图)取出的移植物的明视场图像：(上)获自由骨折胼胝分离的mSSC的移植的组织，(下)获自由未受伤股骨分离的mSSC的移植的组织。比例尺等于：(左图，体外)500μm；(右图，体内)1mm。(D)示出了存在于以下样品中的 mSSC数量的条形图：(i)骨折后一周未受辐照的股骨，(ii)骨折后一周受辐照的股骨，(iii) 未受辐照的、未受伤股骨，(iv)受辐照的、未受伤股骨。这显示了与未受辐照的对照相比，辐照之后，在骨折后1周发现mSSC数量的显著减少(p<0.01，t-检验)。这还显示了与未受辐照的对照相比，辐照之后，在未受伤股骨中的mSSC数量有显著减少(p<0.01，t-检验)。这显示了辐照减少mSSC的扩增。
图10：mSSC子代为亲代mSSC转换***信号。(A)示出了BMP拮抗剂gremlin-2 和头蛋白(分别在右上和右下)的基因表达水平的配体-受体相互作用图，发现它们在 mSSC下游的祖细胞亚群(特别是Thy和BLSP亚群)上表达。还注意到全身激素瘦素和促甲状腺激素(TSH)的受体在下游祖细胞的相同亚群Thy和BLSP上的基因表达增加(左上图和左下图)，可见其表达BMP2途径的拮抗剂。同时参看左图和右图，配体-同源受体相互作用图显示通过全身激素瘦素和TSH受体的信号传导可通过BMP2拮抗作用(经由gremlin 2，头蛋白)产生mSSC扩增的抑制信号且随后在骨骼基质群中产生骨发生。箭头指示潜在的受体-配体相互作用。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(B)将10,000个mSSC在许多不同的条件下培养：常规培养基(对照)、来自用或不用重组瘦素蛋白(Thy CM+瘦素/Thy CM-瘦素)处理的Thy亚群的条件培养基(CM) 以及来自用和不用重组瘦素蛋白(BLSP CM+瘦素/BLSP CM-瘦素)处理的BLSP群的 CM。在此注意到，来自在无瘦素下培养的Thy和BLSP的CM与对照相比减少mSSC 的扩增。然而，来自在瘦素下培养的Thy和BLSP的CM与对照或来自未用瘦素处理的细胞的Thy/BLSP亚群CM相比进一步减少mSSC的扩增。因此，瘦素信号传导减小 mSSC在体外的生长潜能。(C)瘦素(左)及其受体(右)在骨骼基质群中的基因表达水平。配体的阴性表达但受体的高表达意味着瘦素是外部提供的。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/ 前BCSP的转录表达数据。(D)将10,000个新近分离的Thy细胞在补充有或无重组瘦素 (1μg/mL)的无血清培养基中体外培养，且随后在涂铺后14天采集细胞用于qRTPCR。头蛋白、Gremlin 2及瘦素受体在用或不用重组瘦素处理的Thy亚组中的相对基因表达水平示于图中。该图显示在瘦素存在下培养的Thy亚组造成头蛋白、Gremlin2及瘦素受体的转录表达上调，由此加强了我们的假设：在全身循环与骨骼祖细胞亚群之间可存在联系。(ii)在无瘦素补充下培养的Thy细胞的免疫组织化学。红染示出了Gremlin 2表达。(iii)在有瘦素补充下培养的Thy细胞的免疫组织化学。红染示出了Gremlin 2表达。在此可见在补充具有瘦素(1μg/mL)的培养基之后Gremlin2的表达增加。比例尺等于100 μm。(E)所提出的影响mSSC功能的途径的示意图。瘦素，一种循环全身因子，激活 Thy和BLSP细胞上存在的瘦素受体，由此造成Thy和BLSP细胞表达Gremlin 2和头蛋白(参见图3D)，这拮抗了BMP-2信号传导及随后的BMP2诱导的mSSC增殖。相反， mSSC增殖通过BMP-2得到促进。
图11：Tgfβ拮抗作用促进mSSC中的软骨形成。(A)实验方案：将mSSC从P3 C57BL6野生型小鼠的长骨中分离。在重组蛋白存在下培养这些细胞。存在2个实验组和一个对照组。在移植到腹股沟脂肪垫的皮下脂肪中之前一周用以下可溶性重组蛋白处理实验组：(I)TGFβ，(II)TGFβR。随后在三周时取出移植物用于组织学分析。(B)(左图)用TGFβ预处理的mSSC。如上，可见在移出时的移植物照片。如下：可见五色染料染色的组织样本，其未示出肉眼的骨或软骨形成。(右图)用TGFβR预处理的mSSC。如上，可见在取出时的移植物照片。如下：可见用五色染料染色的取出组织的明视场图像，其示出了主要包括软骨(蓝色)且几乎无骨形成的取出移植物。比例尺等于：(上图)1 mm；下图)200μm。
图12：骨骼亚组上的基因表达的热图。(A)支持造血作用所必需的C-Kit、IL-3 及IL-9配体在骨骼基质亚组上表达。图展示了骨骼基质与造血细胞之间的配体-同源受体相互作用。(注意MEP＝巨核细胞红系祖细胞，GMP＝粒细胞巨噬细胞祖细胞，CLP＝共同的淋巴样祖细胞)。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(B)骨骼生态位与造血生态位之间所提出的相互作用的图显示骨骼基质细胞分别分泌调控分子和细胞因子到局部生态位和造血生态位。那些信号传导分子参与了 mSSC和HSC两者的增殖与分化。
图13：Mx1Cre标记的细胞包括mSSC群。(A)实验方案：在E15时诱导 Mx1-Cre-ERT小鼠。在P3时采集股骨并且在机械解离和酶促解离之后分离细胞，随后进行FACS分级分离。(B)FACS门控策略显示mSSC存在于表达Mx1-Cre的细胞中。这表明Mx1标记的细胞是间充质祖细胞的非特异性标记物。在CD45+、Tie2+及[AlphaV+] 亚组内鉴定表达Mx1的细胞(GFP+)。[CD45(-)Ter119(-)Tie2(-)AlphaV(+)Thy(-)6C3(-)] 群(其包括mSSC)中12.6％的细胞是Mx1-CRE阳性的，其示于来自图示最右侧的第二 FACS曲线图的下图中。
图14：mSSC异质性反映了骨骼结构的差异。(A)小鼠骨骼解剖图显示了骨中的不同形状和大小。采集每个编号的骨，进行机械解离和酶促解离并且染色以用于FACS 分析以鉴定从每个骨亚组中分离的1百万个细胞中存在的mSSC的数量。(B)条形图示出了存在于来自每个分离骨的1百万个细胞中的mSSC数量。mSSC的相对数量在所有骨亚型中是不均匀的并且很可能在附肢骨骼的远端组分中增加。(C)表显示了从不同的小鼠骨中分离的mSSC的集落形成单位(CFU)的计数。将500个来自每个骨亚组的双重分选的mSSC涂铺于含有具有10％FBS的MEMα培养基的10cm组织培养皿上，并且在14天后对CFU计数。在此还可见，在不同骨亚型中集落形成的异质能力。(D)在培养14天之后，在40x下示出的所形成集落的相位显微图像。在由不同骨形成的集落形态中存在明显的严重异质性。比例尺等于200μm。(E)在涂铺后14天对CFU进行计数之后，将细胞染色并且通过FACS来分析以确定存在于集落中的构成性细胞。由每个骨亚组形成的集落的分析显示在mSSC的分化潜能上的异质性，这取决于由其分离的骨的类型。(F)在两个时间点下来自每个骨亚组的四个亚群(AlphaV+、Thy、6C3及双阴性(DN) ＝Thy-6C3-)的细胞计数意味着每个亚群的增殖速率还根据细胞来源而变化。
图15：影响mSSC及子代的所提出的信号传导途径(A)在三种不同实验条件 (BMP2(0.1μg/mL)/头蛋白(1μg/mL)/Gremlin 2(1μg/mL)补充有正常培养基)或对照(正常培养基：<MEM，10％FBS，1％青霉素-链霉素)下培养后一周的mSSC(在FACS之后初始涂铺的10,000个mSSC)的相位显微图像。在这些条件下，注意到以下：培养基的头蛋白和Gremlin 2补充与对照或BMP2补充(肥厚型软骨细胞区域的扩大)相比造成未处理的mSSC体外培养物所典型有的肥厚型软骨细胞(白色箭头)的增殖减少。比例尺等于 500μm。(B)(i)新近分选了10,000个mSSC并且在常规培养基(FACS曲线图的上列)或补充(2μg/mL)有Wnt3a的常规培养基(FACS曲线图的下列)中培养。一周以后，将细胞重新分离，用抗体染色并且经历FACS分级分离。在此注意到Thy亚群的增加(以红色框示出)，其是促成骨的。(ii)小骨的五色染料染色切片是由5000个细胞wnt处理对比非wnt 处理的SSC(移植到肾囊中一个月)形成。Wnt的处理似乎抑制SSC的软骨内骨化，如通过在Wnt处理的样品中骨髓腔形成的减少所证明。比例尺等于200μm。(C)mSSC及下游祖细胞(BCSP、Thy、6C3、BLSP、CCP)的Axin1表达的基因表达数据。在此可见与其它干/祖细胞相比CCP的Axin 1表达减少。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(D)为了确保[CD45+Ter 119+]或[Tie2+]亚群不含骨骼形成细胞的高频率亚群，通过机械消化和酶促消化将[CD45+Ter 119+]和[Tie2+]细胞群(先前在FACS分级分离上被排除)从P3GFP标记的小鼠的长骨中分离且随后进行FACS分级。然后将每个亚组的20,000个细胞移植到免疫缺陷RAG-2/γ(c)KO小鼠的肾囊下以评估其内在的骨骼形成潜能。不同于[AlphaV+]部分的八个亚群，没有发现CD45/Ter119+和Tie2+亚组在移植之后四周形成骨、软骨或基质。移植后4周存在的组织的明视场显微图示于左边的图中，其中荧光图像示于右边。移植的群在两行中以下列顺序(从上到下)示出：上 [CD45+Ter119+AlphaV-]、中[Tie2-AlphaV+]、下[Tie2+AlphaV-]。黄色虚线表示自荧光海绵支架，绿色虚线表示真正的GFP+组织。在[CD45+Ter119+AlphaV-]移植细胞的移植之后，不存在真正的绿色荧光且因此没有真正的组织植入，然而，在海绵中存在自身荧光(黄色虚线)。[Tie2-AlphaV+]群(红色框)的移植之后，发现存在骨组织形成，由绿色虚线表示。Tie2+AlphaV-群的移植之后，存在一定的绿色荧光组织，然而，这与骨组织不一致，而是形成纤维组织(高放大率插图)，存在管状结构(可能表示血管，在高放大率插图中由白色箭头指示)。左图，右图：比例尺等于1mm。(E)(i)瘦素(左)及其受体(右) 在骨骼基质群中的基因表达水平。配体的阴性表达但受体在Thy亚组中的高表达意味着瘦素是外部提供的。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。FPKM：每百万份定位的读段中每千碱基转录物的片段数。(E)(ii)下列细胞群的单细胞RNA测序：6C3(+)(包括6C3和HEC亚群)、Thy(+)(包括CCP、Thy及BLSP 亚群)、mSSC及BCSP。该图示出了通过mSSC及下游子代的瘦素受体的表达。这表明与下游子代(6C3-紫色，Thy-红色)相比不存在通过mSSC(绿色)和BCSP(青绿色)群的瘦素受体的表达。(F)(i)FoxA2在骨骼基质群中的基因表达水平。在此可见与下游子代相比FoxA2在mSSC中的显著表达。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(ii)下列细胞群的单细胞RNA测序：6C3(+)(包括6C3和HEC亚群)、Thy(+)(包括CCP、Thy及BLSP亚群)、mSSC及BCSP。该图示出了FoxA2在单细胞水平下的表达。与(i)一致，观察到Foxa2在mSSC上被显著上调，在CSP中的水平则低得多，且在下游子代上几乎不存在。G(i)Runx2在骨骼基质群中的基因表达水平。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/- 细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/前BCSP的转录表达数据。(ii)下列细胞群的单细胞RNA测序：6C3(+)(包括 6C3和HEC亚群)、Thy(+)(包括CCP、Thy及BLSP亚群)、mSSC及BCSP。该图示出了Runx2的表达。H(i)胶原2A在骨骼基质群中的基因表达水平。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了 mSSC/前BCSP的转录表达数据。(ii)下列细胞群的单细胞RNA测序：6C3(+)(包括6C3 和HEC亚群)、Thy(+)(包括CCP、Thy及BLSP亚群)、mSSC及BCSP。该图示出了胶原2A的表达。I(i)胶原10A在骨骼基质群中的基因表达水平。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了 mSSC/前BCSP的转录表达数据。ii)下列细胞群的单细胞RNA测序：6C3(+)(包括6C3 和HEC亚群)、Thy(+)(包括CCP、Thy及BLSP亚群)、mSSC及BCSP。该图示出了胶原10A的表达。J(i)Sox9在骨骼基质群中的基因表达水平。请注意，因为这些实验是在用CD200进一步细化之前进行，所以研究的*mSSC群代表了包括CD200+/-细胞群两者的三阴性细胞群[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-CD105-6C3-]，且由此示出了mSSC/ 前BCSP的转录表达数据。(ii)下列细胞群的单细胞RNA测序：6C3(+)(包括6C3和HEC 亚群)、Thy(+)(包括CCP、Thy及BLSP亚群)、mSSC及BCSP。该图示出了Sox9的表达。
图16.(A)用Movat五色染料染色的17周龄人胎股骨横切片，其示出了软骨(蓝色)和骨(黄色)区域。插图图片示出了其中发现高SSC频率的生长板区域。(B)人骨骼干/祖细胞的预期分离及次要表型的体内表征的实验方案。(C)来自17周龄人胎股骨的人骨骼干/祖细胞亚组的FACS门控策略，其指出产生软骨、骨和软骨、或骨和骨髓的限定的群。有色箭头指示肾脏中取出的人祖细胞衍生组织的五色染料染色切片(蓝色＝软骨；绿色＝骨+软骨；黄色＝骨)。(D)指出股骨头区域的图及其中人骨骼干/祖细胞亚组可被分离的成年股骨头区域的图片。(E)从成年股骨头组织中分离的人骨骼干/祖细胞亚组的FACS 门控策略。
图17.(A)hSSC和人骨骼祖细胞亚组的谱系进程的体外分析方案。(B)(上图和中图) 培养的hSSC向谱系限制亚组的分化，如通过FACS所测定。(下图)如通过茜素红染色所确定的各个人骨骼祖细胞亚组的不同成骨能力(hSSC＝人骨骼干细胞；BCSP＝骨、软骨及基质祖细胞；hCP＝人软骨形成祖细胞；hOP＝人成骨祖细胞)。最强的茜素红在hOP 中示出。(C)慢病毒标记的人骨骼干细胞(hSSC)的RGB病毒标记及体内克隆扩增的实验方案。(D)慢病毒标记的EGFP和RFP hSSC的克隆在体内分化为骨(黄色)和软骨(蓝色)，如在hSSC衍生的肾脏移植物的五色染料染色切片中所示。(E)(上图)分别来源于hSSC、 BCSP、hOP及hCP的培养物的集落的显微图。(下图)四个人骨骼干/祖细胞亚组的FACS 曲线图。
图18.hSSC(左)对比mSSC(右)的谱系图。(前)BCSP＝(前)骨、软骨和基质祖细胞；hCP＝人软骨形成祖细胞；hOP＝人成骨祖细胞。
图19.(A)(左图)示出了人骨骼祖细胞亚组在发育的骨中的定位的图，旁边是(右图) 描绘了骨骼生态位因子的范围的图(hSSC＝人骨骼干细胞；BCSP＝骨、软骨及基质祖细胞；hCP＝人软骨形成祖细胞；hOP＝人成骨祖细胞)。(B)hSSC生态位相互作用的图。 (C)来自代表性mSSC生态位因子的处理的hSSC扩增。(D)通过GEXC算法在人骨骼群中进行的生态位因子/同源受体相互作用的预测。(E)代表性SSC生态位因子BMP2、 VEGF、WNT1、WNT3在人骨骼祖细胞亚组中的归一化表达。(F)(左图)来自单细胞 mRNA序列的四个人骨骼祖细胞的热图。(右图)示出了BMP2或WNT配体和受体在单细胞水平下的共表达的文氏图。
图 20 （ A ） 表明对BMP信号传导的反应性。(FACS下曲线图)通过BMP2诱导由hASC形成hSSC。(B)hASC与重编程BMP2的共同递送方案。(C)(左图)来源于hASC与BMP2 的共同递送的皮下诱导小骨的肉眼照片。下图示出了上图中的矩形的3倍放大图像。(右图)用Movat五色染料染色的诱导小骨切片的显微图(骨＝黄色；软骨＝蓝绿色)。(D)使用BMP2与可溶性VEGF受体的组合从小鼠脂肪组织原位诱导骨或软骨形成的图。(E) VEGF信号传导可将BMP2诱导的mSSC向骨(左)或软骨命运(右)切换。
图21.下一代基于干细胞的骨骼再生医学
具体实施方式
在描述本发明方法和组合物前，应理解本发明不限于所描述的具体方法或组合物，因为这些方法和组合物当然可以变化。还应该理解，本文所用的术语仅仅是为了描述具体的实施方案，并不意味着限制，因为本发明的范围只受所附权利要求书的限制。
当提供一个数值范围时，应该理解的是还特别公开了介于该范围的上下限间的每一个中间值(除非文中另外清楚地指出，否则所述中间值是下限单位的十分之一)。在所述范围内的任何所述值或中间值和在该所述范围中的其它所述值或中间值之间的每一个更小范围均包括在本发明内。这些较小范围的上下限可独立地在该范围中被包括或排除，且其中任一界限、无一界限或两个界限都包括在较小范围内的每个范围也包括在本发明内，除非是在所述的范围内的任何特定排除的界限。当所述范围包括所述界限中的一个或两个时，排除了那些所包括的上下限中的一个或两个的范围也包括在本发明范围内。
除非另外定义，否则本文所用的全部技术和科学术语都具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然类似于或等价于本文所述的那些的任何方法和材料可用于实践或测试本发明，但现在描述一些潜在和优选的方法和材料。本文所提及的全部出版物以引用的方式并入本文，从而公开和描述了与出版物所引用的内容相关的方法和/或材料。应当理解，如果存在矛盾，本公开将取代并入的出版物的任何公开内容。
必须指出，除非文中另外清楚陈述，否则如本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个”及“所述”包括多个指示物。因此，例如，提及“细胞”包括多个此类细胞且提及“肽”包括提及本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等效物，例如多肽，诸如此类。
本文所讨论的出版物只提供在本申请的申请日之前的公开内容。本文中的任何内容都不能被解释为承认本发明无权使借助于在先发明的这种出版日期提前。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地确认。
定义
本发明提供了用于产生功能性软骨细胞、骨骼细胞、骨髓基质细胞及其祖细胞的方法、组合物及试剂盒。这些方法、组合物及试剂盒可用于产生软骨细胞、成骨细胞、基质细胞及其祖细胞以用于移植、用于实验评价、作为谱系-和细胞-特异性产物的来源等，例如用于治疗软骨、骨及造血***的人类病症。还提供了用于针对筛选候选试剂的将细胞转化为骨骼细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞及其祖细胞的活性的方法、组合物及试剂盒。
在一些实施方案中，提供用于指导哺乳动物骨骼干细胞的分化的组合物和方法，包括分化为成骨谱系、软骨形成谱系及基质谱系。在一些实施方案中，提供用于指导非骨骼细胞，例如多能干细胞、间充质干细胞(MSC)等分化为骨骼干细胞的组合物和方法。对于体内使用，重编程因子可全身或以局部植入物形式提供，并且任选地提供为具有有效剂量的细胞，例如SSC、MSC、定向软骨祖细胞(CCP)等。还提供了用于此类方法的细胞培养***。细胞可用于治疗方法，例如以提供用于骨骼或软骨形成替换疗法的细胞；筛选方法，等中。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人或小鼠细胞。
在阅读了如下更充分描述的本发明方法和组合物的细节之后，本领域技术人员将清楚本发明方法的这些及其它目标、优点及特征。
分子生物化学和细胞生物化学中的一般方法可见于如下的标准教科书中：Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版(Sambrook等人,Harbor LaboratoryPress 2001)；Short Protocols in Molecular Biology,第4版(Ausubel等人编著,JohnWiley &Sons 1999)；Protein Methods(Bollag等人,John Wiley&Sons 1996)；NonviralVectors for Gene Therapy(Wagner等人编著,Academic Press 1999)；Viral Vectors(Kaplift& Loewy编著,Academic Press 1995)；Immunology Methods Manual(I.Lefkovits编著, Academic Press 1997)；以及Cell and Tissue Culture:LaboratoryProcedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用的方式并入本文。用于本公开中提到的遗传操控的试剂、克隆载体及试剂盒可从如下的供应商处购得：BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich及ClonTech。
“增殖”意指通过有丝***进行***，即经历有丝***。“扩增的群”是已增殖(即经历有丝***)以使得扩增的群的细胞数目与最初的群相比增加(即更大数目的细胞)的细胞群。
术语“外植体”是指取自身体并在人工培养基中培养的器官或其中组织的一部分。“离体”生长的细胞是以此方式取自身体、临时体外培养并回到体内的细胞。
术语“原代培养物”表示来自器官或器官内的组织的细胞的混合细胞群。词语“原代”采用其在组织培养领域中通常的含义。
术语“组织”是指一组或一层相似的特化细胞，其共同行使某些特殊功能。
术语“器官”是指两种或更多种相邻的组织层，所述组织层维持一些形式的细胞-细胞和/或细胞-基质的相互作用以形成一种微结构。
术语“个体”、“受试者”、“宿主”以及“患者”在本文中可互换使用，并且是指需要诊断、治疗或疗法的任何哺乳动物受试者，尤其是人类。
本文使用的术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”、“治疗(treat)”等通常是指获得一种需要的药理和/或生理效果。该效果根据完全或部分地预防疾病或其症状可以是预防性的，和/或根据疾病和/或可归因于该疾病的副作用的部分或完全稳定或治愈可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”包括在哺乳动物，特别是在人中的疾病的任何治疗，并且包括：(a)预防疾病或症状在可能易患该疾病或症状但尚未被诊断为患上该疾病的受试者中出现；(b)抑制疾病症状，即阻止其发展；或(c)减轻疾病症状，即造成疾病或症状的消退。
“共同施用”意指彼此联合、共同、协调地施用，包括同时或依次施用两种或更多种试剂。
“包含”意指但无其它限制地包括指示物，必然不限定或排除可包括在内的任何其它物质。例如，“包含x和y的组合物”包括含有x和y的任何组合物，无论什么其它组分也可存在于该组合物中。同样，“包括步骤x的方法”包括其中进行x的任何方法，无论 x是该方法中的唯一步骤或其仅为众多步骤中的一个，不管可存在多少其它步骤并且不管与它们相比x是多么简单或复杂。“由……构成”及使用词根“包含(comprise)”的类似字句在本文中用作“包含(comprising)”的同义词并且具有相同含义。本发明方法还包括由所需因子组成或基本上由所需因子组成的因子组合的使用。
“有效量”一般意指提供所需局部或全身作用的量。例如，有效量是足以实现有益或所需临床结果的量。有效量可在单次施用中一次性或以在若干次施用中提供有效量的分次的量提供。考虑有效量的精确判定可基于每个受试者的个性化因素，包括其个头、年龄、损伤、和/或所治疗的疾病或损伤、以及自从损伤出现或疾病开始起的时间量。本领域技术人员将能基于本领域中常规的这些考量来确定一位给定受试者的有效量。如本文所用，“有效剂量”意指与“有效量”相同。
软骨是具有占其重量70％至80％的水的超水化结构。剩余20％至30％包括II型胶原和蛋白多糖。胶原通常占软骨干重的70％。蛋白多糖由中心蛋白芯及由该芯延伸来的多糖长链组成。这些多糖(称为粘多糖)包括：软骨素-4-硫酸、软骨素-6-硫酸及硫酸角质素。软骨具有由分散在内源性产生和分泌的细胞外基质内的软骨形成细胞组成的特征性结构组成。含有软骨细胞的基质中的空腔被称作软骨陷窝。与骨不一样，软骨既无神经分布支配，也没有血管或淋巴***穿入。
哺乳动物中存在三种类型的软骨并且包括：透明软骨；纤维软骨及弹性软骨。透明软骨由具有稳固的、弹性一致性的软骨块组成，是半透明的并且颜色呈珍珠蓝。透明软骨主要见于关节接合的关节表面上。其还见于骨骺板、肋软骨、气管软骨、支气管软骨及鼻柱骨中。纤维软骨基本上与透明软骨相同，例外的是其含有I型胶原原纤维，这为软骨增加了抗拉强度。胶原纤维成束排列，其中软骨细胞位于各束之间。纤维软骨通常见于椎间盘的环纤维、肌腱和韧带附着处、半月板、耻骨联合以及关节囊的附着处。弹性软骨也类似于透明软骨，除了其含有弹性蛋白纤维之外。其比透明软骨更不透明并且更有柔性和韧性。这些特征部分地通过包埋于软骨基质中的弹性纤维来定义。通常，弹性软骨存在于耳朵的耳廓、会厌及喉中。
哺乳动物关节中的关节骨的表面被关节软骨覆盖。关节软骨防止相对骨表面的直接接触并且允许关节骨相对于彼此的接近无摩擦的移动。两种类型的关节软骨缺损通常在哺乳动物中观察到并且包括全层和部分层缺损。两种类型的缺损不仅在物理损伤的程度上不同，而且在每类病变引发的修复反应的性质上不同。
全层关节软骨缺损包括对关节软骨、下层软骨下骨组织以及位于关节软骨与软骨下骨之间的钙化软骨层的损伤。全层缺损通常在关节严重损伤期间或退行性关节疾病的晚期(例如骨关节炎期间)出现。因为软骨下骨组织受神经分布支配并且被血管化，所以该组织的损伤常常较为疼痛。由软骨下骨损伤所诱发的修复反应通常造成在全层缺损位点处的纤维软骨形成。然而，纤维软骨缺乏关节软骨的生物力学性质且不能在关节中长期持续存在。
部分层的关节软骨缺损只限于软骨组织本身。这些缺损通常包括在软骨的关节表面中的裂痕或裂口。部分层的缺损是由关节的机械排列引起，这继而诱导软骨组织在关节内的耐磨性。在神经分布和脉管***不存在下，部分层的缺损不会引发修复反应且因此不倾向于愈合。尽管是无痛的，但部分层的缺损常常恶化为全层缺损。
术语“骨骼干细胞”是指多能的且自我更新的细胞，其能够生成骨髓基质细胞、骨骼细胞及软骨形成细胞。自我更新意指当其经历有丝***时，产生至少一个为骨骼干细胞的子细胞。多能意指其能够产生祖细胞(骨骼祖细胞)，而祖细胞又产生骨骼***的所有细胞类型。它们不是多能性的，也就是说，它们不能在体内产生其它器官的细胞。
骨骼干细胞也是由非骨骼细胞重编程而来，包括但不限于间充质干细胞及含有此类细胞的脂肪组织。重编程细胞可被称为诱发的骨骼干细胞或iSSC。“iSSC”通过实验操控由非骨骼细胞产生。诱发的骨骼细胞具有源于自然的功能性SSC的特征，也就是说，它们可产生相同谱系。
人SSC细胞群对于CD45、CD235、Tie2及CD31的表达呈阴性；并且阳性地表达平足蛋白(PDPN)。具有此标记物组合的细胞(例如从骨组织分离的细胞)群可称为 [PDPN+/146-]细胞。[PDPN+/146-]群可进一步再分成三个群：能够软骨形成的单能亚组 [PDPN+CD146-CD73-CD164-]、能够骨发生的单能细胞亚群[PDPN+CD146-CD73-CD164+] 以及能够软骨内(骨和软骨)骨化的多能[PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞。用于本发明方法中的目标细胞群可相对于CD45、CD235、Tie2及CD31和PDPN从骨中分离。其它目标细胞群是[PDPN+CD146-CD73-CD164-]细胞；[PDPN+CD146-CD73-CD164+]细胞；以及[PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞。
小鼠骨骼谱系被表征为CD45-、Ter119-、Tie2-、αv整合素+。SSC进一步被表征为Thy1-6C3-CD105-CD200+。
脂肪衍生的干细胞。脂肪衍生的干细胞或“脂肪衍生的基质细胞”是指来源于脂肪组织的细胞。“脂肪”意指任何脂肪组织。脂肪组织可为棕色或白色脂肪组织，来源于皮下、网膜/内脏、***、性腺或其它脂肪组织部位。优选地，脂肪是皮下白色脂肪组织。此类细胞可以原代细胞培养物或永生化细胞系形式提供。脂肪组织可来自任何具有脂肪组织的生物体。优选地，脂肪组织为哺乳动物，最优选地，脂肪组织为人。脂肪组织的适宜来源来自于脂肪去除术，然而，脂肪组织的来源或分离脂肪组织的方法不是本发明的关键。
脂肪组织为组织工程应用提供了许多实用的优点。脂肪组织是大量的并且可以实现对于患者具有最小风险的采集方法。据估计每克脂肪组织有超过10.sup.4个干细胞(Sen等人2001,Journal of Cellular Biochemistry 81:312-319)，这些细胞可立即使用或冷冻保存以用于未来的自体或同种异体应用。
已经报道了用于分离、扩增及分化人脂肪组织衍生的细胞的方法。参见，例如Burris 等人1999,Mol Endocrinol 13:410-7；Erickson等人2002,Biochem Biophys ResCommun.2002年1月18日；290(2):763-9；Gronthos等人2001,Journal of CellularPhysiology,189:54-63；Halvorsen等人2001,Metabolism 50:407-413；Halvorsen等人2001,Tissue Eng.7(6):729-41；Harp等人2001,Biochem Biophys Res Commun 281:907-912；Saladin等人1999,Cell Growth&Diff 10:43-48；Sen等人2001,Journal of CellularBiochemistry 81:312-319；Zhou等人1999,Biotechnol.Techniques 13:513-517。脂肪组织衍生的基质细胞可通过胶原酶消化和差速离心由切碎的人脂肪组织获得 [Halvorsen等人2001,Metabolism 50:407-413；Hauner等人1989,J Clin Invest 84:1663-1670；Rodbell等人1966,.J Biol Chem 241:130-139]。
据报道脂肪组织衍生的干细胞表达包括以下的标记物：CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166、醛脱氢酶(ALDH)及ABCG2。脂肪组织衍生的干细胞可以是从能够在培养中增殖超过1个月的脂肪组织中提取的纯化的单核细胞群。
为了从组织中分离细胞，可以用合适的溶液进行分散或悬浮。这种溶液一般为平衡盐溶液(例如生理盐水、PBS、汉克斯平衡盐溶液(Hank's balanced salt solution)等)，方便地补充有胎牛血清或其它天然存在的因子，结合可接受的低浓度缓冲剂，一般为5-25mM。适宜的缓冲剂包括HEPES、磷酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂等。
细胞群可立即使用。或者，细胞群可在液氮温度下冷冻并长时间保存，解冻并且能够再使用。在这种情况下，细胞通常被冷冻在10％DMSO、50％血清、40％缓冲培养基中，或在如本领域中通常使用的一些其它这种溶液中以在所述冷冻温度下保存细胞，并且如本领域中已知用于解冻冷冻的培养细胞的方式进行解冻。
脂肪细胞可在不同的培养条件下体外培养。培养基可为液体或半固体，例如含有琼脂、甲基纤维素等。细胞群可方便地悬浮于合适的营养培养基如伊斯科夫改良的DMEM 或RPMI-1640(Iscove's modified DMEM or RPMI-1640)中，通常补充有胎牛血清(约 5-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)及抗生素(例如青霉素和链霉素)。在本发明的一个实施方案中，将脂肪细胞保持在饲养层细胞不存在下，即在血清等不存在下在培养中。培养可含有细胞对其有反应性的生长因子。如本文所定义的生长因子是在培养中或在完整组织中能够通过对跨膜受体的特异性作用促进细胞的存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。
术语“重编程的效率”、“重编程效率”、“转化的效率”或“转化效率”在本文中可互换使用并且指的是一个细胞谱系中的细胞当与合适的重编程***接触时诱发另一细胞谱系的细胞的能力，例如，脂肪组织细胞当与高剂量的BMP2接触时产生iSSC的能力。换言之，细胞与未接触的群相比产生约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约6倍、约8 倍、约10倍、约20倍、约30倍、约50倍、约100倍、约200倍或更多的诱发细胞数量(例如iSSC)。
除重编程之外，细胞还可朝向沿特异性路径进行分化。例如，在没有干预的情况下， SSC在体内产生非常少的软骨细胞，但可通过分化因子(其在本文中可称为软骨形成因子) 朝向软骨形成。
如本文所用，术语“BMP-2”是指来源于任何物种的2型骨形态发生蛋白家族并且可包括其模拟物和变体。在本文中提及BMP-2应理解为是提及目前所鉴定形式中的任一种，包括BMP-2A和BMP-2B以及未来将要鉴定的BMP-2物质。术语“BMP-2”还包括来源于任何已知BMP-2的序列的多肽，该已知BMP-2的成熟序列与成熟的人BMP-的序列至少约75％同源，该参考序列可见于Genbank登录号NP_001191中。
BMP-2经由在细胞表面处作为同聚和异聚复合体表达的两种类型受体(BRI和BRII) 进行信号传导。在配体结合之前，较低但可测量水平的BMP-受体见于预先形成的异源寡聚复合体中。受体的主要部分只是在配体添加以后被募集到异源寡聚复合体中。为此，BMP-2首先结合至高亲和力受体BRI，然后将BRII募集到信号传导复合体中。然而，配体结合至由BRII和BRI组成的预先形成的复合体仍是信号传导所需的，提示其可介导激活构象变化。通过BMP-2与预先形成的受体复合体的结合诱导的信号激活Smad途径，而BMP-2诱导的受体募集激活不同的Smad非依赖性途径，从而造成经由p38MAPK 诱导碱性磷酸酶活性。
在一些实施方案中，一剂量的BMP2提供于植入物中，例如用于因子的局部递送的基质或支架，其中BMP2以BMP2蛋白或其活性片段形式提供。有效剂量可基于特定的组织、从植入物释放的速率、植入物的大小等来确定，并且可由本领域技术人员凭经验确定。剂量可提供等于1μg BMP2蛋白、10μg、100μg、1mg、5mg、10mg、25mg、 50mg、75mg、100mg、250mg、500mg、750mg、1g BMP2蛋白的生物活性。剂量可在单个时间点施用，例如作为单个植入物；或可经分级分离，例如以微针配置来递送。剂量可根据需要施用一次、两次、三次、4次、5次、10次或更多次以实现预期效果，并且施用可为每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或更久。
“BMP2模拟物”包括通过如上所述结合并激活其受体而在功能上类似于BMP2的分子。可用作BMP2模拟物的分子包括天然存在的BMP2的衍生物、变体及生物活性片段。“变体”多肽意指具有小于100％的与天然序列多肽的序列同一性的如下所定义的生物活性多肽。此类变体包括多肽，其中一个或多个氨基酸残基在天然序列的N端或C端处或在天然序列内添加；约1至40个氨基酸残基缺失，且任选被一个或多个氨基酸残基取代；以及上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基已被共价修饰以使得所得产物具有非天然存在的氨基酸。通常，生物活性变体将具有与天然序列多肽具有至少约90％氨基酸序列同一性的氨基酸序列，优选至少约95％、更优选至少约99％。变体多肽可被天然或非天然地糖基化，即，多肽具有的糖基化模式不同于见于相应的天然存在的蛋白质中的糖基化模式。变体多肽可具有未见于天然BMP2蛋白上的翻译后修饰。
目标是可溶性BMP2的片段，特别是生物活性片段和/或对应于功能域的片段。目标片段的长度通常将为至少约10aa至至少约15aa，通常长度为至少约50aa，但长度通常不超过约142aa，其中片段将具有与BMP2相同的一段氨基酸。“长度至少20aa”的片段例如意图包括20个或更多个来自例如由BMP2的cDNA编码的多肽的连续氨基酸。在本上下文中，“约”包括特别陈述的值或多几个或少几个(5、4、3、2或1)氨基酸的值。本文所述的蛋白质变体是由在本发明范围内的多核苷酸编码。遗传密码可用于选择合适的密码子来构建相应变体。多核苷酸可用于产生多肽，并且这些多肽可用于通过已知方法产生抗体。
“融合”多肽为包含融合或键合至异源多肽的多肽或其部分(例如，一个或多个结构域) 的多肽。融合BMP2蛋白例如将享有与天然BMP2多肽相同的至少一种生物学性质。融合多肽的实例包括如上所述的免疫粘附素，其将BMP2多肽的一部分与免疫球蛋白序列组合；和表位标签多肽，其包含融合至“标签多肽”的BMP2多肽或其部分。标签多肽具有足够的残基以提供表位(抗体可针对该表位而产生)，但也足够短以使得其不会干扰 BMP2多肽的生物活性。合适的标签多肽一般具有至少六个氨基酸残基且通常为约6-60 个氨基酸残基。
天然序列多肽的“功能衍生物”是具有同天然序列多肽一样的定性生物学性质的化合物。“功能衍生物”包括但不限于天然序列的片段和天然序列多肽的衍生物及其片段，只要它们具有同相应的天然序列多肽一样的生物活性。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体及其共价修饰。可溶性BMP2的衍生物和融合物可用作BMP2模拟分子。
稳定的血浆蛋白是通常具有约30至2,000个残基的蛋白质，其在其天然环境中展现延长的循环半衰期，即大于约20个小时。合适的稳定血浆蛋白的实例为免疫球蛋白、白蛋白、脂蛋白、载脂蛋白及转铁蛋白。BMP2的细胞外区域通常在血浆蛋白或其能够赋予可溶性BMP2以延长的半衰期的片段的N端处融合至血浆蛋白。可溶性BMP2的血浆半衰期的大于约100％的增加是令人满意的。
合适的BMP2模拟物和/或融合蛋白可通过化合物筛选来鉴定，所述化合物筛选通过检测试剂模拟BMP2的生物活性的能力进行，例如，增加非骨骼细胞上的一个群中的骨骼干细胞数量，例如增加了至少10％、20％、30％、405、50％、60％、70％、80％、 90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、100倍或更多。
VEGF是与血小板衍生生长因子(“PDGF”)有关的二聚的、二硫化物连接的46-kDa糖蛋白。其由正常细胞系和肿瘤细胞系产生；是内皮细胞选择性***素；显示在体内测试***(例如兔角膜)中的血管生成活性；对内皮细胞和单核细胞有趋化性；并且在内皮细胞中诱导纤溶酶原激活物，其参与了毛细血管形成期间细胞外基质的蛋白水解降解。许多VEGF同工型是已知的，虽然它们显示相当的生物活性，但在分泌它们的细胞类型及其肝素结合能力方面不同。另外，存在VEGF家族的其它成员，如胎盘生长因子(“PGF”) 和VEGF-C。
VEGF的细胞受体(VEGFR)是跨膜受体酪氨酸激酶。它们的特征是具有七个免疫球蛋白样结构域的细胞外结构域和细胞内酪氨酸激酶结构域。已表征了各种类型的VEGF 受体，包括VEGFR-1(也称为flt-1)、VEGFR-2(也称为KDR)及VEGFR-3。
如本文所用的“VEGF抑制剂”是任何减弱通过VEGF-VEGFR途径的信号传导的物质。VEGF抑制剂可为仅举数例：小分子、肽、多肽、蛋白质、更具体地包括抗体，包括抗VEGF抗体、抗VEGFR抗体、胞内抗体、巨型抗体、微型抗体、双抗体、Fc融合蛋白如肽体、受体抗体、可溶性VEGF受体蛋白和片段、以及多种其它物质。许多VEGF 抑制剂通过结合至VEGF或VEGF受体发挥作用。其它更间接地通过结合至因子发挥作用，所述因子结合至VEGF或VEGF受体或VEGF信号传导途径的其它组分。还有其它VEGF抑制剂通过改变调控的翻译后修饰起作用，所述修饰调节VEGF途径信号传导。根据本发明的VEGF抑制剂还可通过更间接的机制起作用。无论涉及何种机制，如本文所用，VEGF抑制剂在给定情形下与在抑制剂不存在下在相同情形中将出现的相比都会降低VEGF信号传导途径的有效活性。
在一些实施方案中，一个剂量的VEGF抑制剂提供于植入物中，例如用于因子(facto) 的局部递送的基质或支架。效剂量可基于特定的组织、从植入物释放的速率、植入物的大小等来确定，并且可由本领域技术人员凭经验确定。剂量可提供等于1μg可溶性VEGF受体、10μg、100μg、1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、250mg、 500mg、750mg、1g可溶性VEGF受体的生物活性。剂量可在单个时间点施用，例如作为单个植入物；或可经分级分离，例如以微针配置来递送。剂量可根据需要施用一次、两次、三次、4次、5次、10次或更多次以实现预期效果，并且施用可为每天一次、每2 天一次、每3天一次、每4天一次、每周一次、每两周一次、每月一次或更久。
大量VEGF抑制剂已在文献中有所描述。除在下文进一步详述的那些之外，VEGF 抑制剂还在以下专利文献中描述：US 2003/0105091、US2006/0241115、US 5,521,184、US 5,770,599、US 5,990,141、US 6,235,764、US 6,258,812、US 6,515,004、US 6,630,500、 US6,713,485、WO2005/070891、WO 01/32651、WO 02/68406、WO 02/66470、WO 02/55501、WO04/05279、WO 04/07481、WO 04/07458、WO 04/09784、WO 02/59110、 WO 99/450029、WO 00/59509、WO 99/61422、WO 00/12089、WO 00/02871及WO 01/37820，特别是部分涉及VEGF抑制剂。
特定的VEGF抑制剂是下列：ABT-869(Abbott)，包括经口施用且密切相关的VEGF抑制剂的制剂；AEE-788(Novartis)(也称为AE-788和NVP-AEE-788等)，包括经口施用且密切相关的VEGF抑制剂的制剂；AG-13736(Pfizer)(也称为AG-013736)，包括经口施用且密切相关的VEGF抑制剂的制剂；AG-028262(Pfizer)和密切相关的VEGF抑制剂；血管抑素(EntreMed)(也称为CAS登记号86090-08-6、K1-4及rhu血管抑素等)和密切相关的抑制剂，如尤其美国专利号5,792,825和6,025,688中所述，尤其涉及血管抑素和密切相关的VEGF抑制剂、其结构和性质、及其制备和使用方法的部分中所述；AvastinTM (Genentech)(也称为贝伐珠单抗、R-435、rhuMAB-VEGF及CAS登记号216974-75-3 等)和密切相关的VEGF抑制剂；AVE-8062(Ajinomoto Co.和Sanofi-aventis)(也称为 AC-7700和康普瑞汀A4类似物等)和密切相关的VEGF抑制剂；AZD-2171(AstraZeneca) 和密切相关的VEGF抑制剂；(Bayer AG和Onyx)(也称为CAS登记号284461-73-0、BAY-43-9006、raf激酶抑制剂、索拉非尼、索拉非尼类似物及IDDBCP150446 等)和密切相关的VEGF抑制剂；BMS-387032(Sunesis和Bristol-Myers Squibb)(也称为 SNS-032和CAS登记号345627-80-7等)和密切相关的VEGF抑制剂；CEP-7055(瑟法隆和Sanofi-aventis)(也称为CEP-11981和SSR-106462等)和密切相关的VEGF抑制剂； CHIR-258(Chiron)(也称为CAS登记号405169-16-6、GFKI及GFKI-258等)和密切相关的VEGF抑制剂；CP-547632(OSI Pharmaceuticals和Pfizer)(也称为CAS登记号 252003-65-9等)和密切相关的VEGF抑制剂，例如像CP-564959；E-7080(Eisai Co.)(也称为CAS登记号417716-92-8和ER-203492-00等)和密切相关的VEGF抑制剂；786034(GlaxoSmithKline)和密切相关的VEGF抑制剂；GW-654652(GlaxoSmithKline)和密切相关的吲唑基嘧啶Kdr抑制剂；IMC-1C11(ImClone)(也称为DC-101和c-p1C11等)和密切相关的VEGF抑制剂；KRN-951(Kirin Brewery Co.)和其它密切相关的喹啉-脲 VEGF抑制剂；PKC-412(Novartis)(也称为CAS登记号120685-11-2、苯甲酰星形孢菌素、CGP-41251、米哚妥林及STI-412等)和密切相关的VEGF抑制剂；PTK-787(Novartis 和Schering)(也称为CAS登记号212141-54-3和212142-18-2、PTK/ZK、 PTK-787/ZK-222584、ZK-22584、VEGF-TKI、VEGF-RKI、PTK-787A、DE-00268、 CGP-79787、CGP-79787D、瓦他拉尼、ZK-222584等)和密切相关的苯胺基酞嗪衍生物 VEGF抑制剂；SU11248(Sugen和Pfizer)(也称为SU-11248、SU-011248、SU-11248J、及苹果酸舒尼替尼等)和密切相关的VEGF抑制剂；SU-5416(Sugen和Pfizer/Pharmacia)(也称为CAS登记号194413-58-6、司马沙尼、204005-46-9等)和密切相关的VEGF抑制剂；SU-6668(Sugen和Taiho)(也称为CAS登记号252916-29-3、 SU-006668及TSU-68等)和密切相关的VEGF抑制剂，如尤其在WO-09948868、 WO-09961422及WO-00038519中所述，尤其涉及SU-6668和密切相关的VEGF抑制剂、其结构和性质、及其制备和使用方法的部分中所述；VEGF Trap(Regeneron和 Sanofi-aventis)(也称为AVE-0005和全身VEGFTrap等)和密切相关的VEGF抑制剂，尤其描述于WO-2004110490中，尤其涉及VEGF Trap和密切相关的VEGF抑制剂、其结构和性质、及其制备和使用方法的部分中所述；沙利度胺(Celgene)(也称为CAS登记号50-35-1、昔诺韦、沙利度胺Pharmion及反应停等)和密切相关的VEGF抑制剂；XL-647 (Exelixis)(也称为EXEL-7647等)和密切相关的VEGF抑制剂；XL-999(Exelixis)(也称为EXEL-0999等)和密切相关的VEGF抑制剂；XL-880(Exelixis)(也称为EXEL-2880 等)和密切相关的VEGF抑制剂；ZD-6474(AstraZeneca)(也称为CAS登记号443913-73-3、凡德他尼及AZD-6474等)和密切相关的苯苯胺基喹唑啉VEGF抑制剂；以及ZK-304709(Schering)(也称为CDK抑制剂(靛玉红衍生物)、ZK-CDK、MTGI及多靶标肿瘤生长抑制剂等)及其它密切相关的化合物，包括靛玉红衍生物VEGF抑制剂，描述于WO-00234717、WO-02074742、WO-02100401、WO-00244148、WO-02096888、 WO-03029223、WO-02092079及WO-02094814中，尤其涉及这些和密切相关的VEGF 抑制剂、其结构和性质、及其制备和使用方法的部分中所述。
VEGF抑制剂可以适合于该抑制剂性质的方式递送，例如作为蛋白质、小分子、核酸等，根据需要包括但不限于合适的媒介物和载体。
转化生长因子-β(TGF-β)表示蛋白质家族TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，它们是细胞生长和分化、胚胎和骨发育、细胞外基质形成、造血作用、免疫及炎性反应的多效性调节剂(Roberts和Sporn Handbook of Experimental Pharmacology(1990)95:419-58；Massague等人Ann Rev Cell Biol(1990)6:597-646)。TGF-β引发细胞内信号传导途径，最终导致基因的表达，这些基因调节细胞周期、控制增殖反应、或涉及介导外向内的细胞信号传导、细胞粘附、迁移及细胞间通讯的细胞外基质蛋白。
TGF-β通过受体***发挥其生物活性，该受体***包括具有细胞内丝氨酸-苏氨酸激酶结构域的I型和II型单一跨膜TGF-β受体(也称为受体亚单位)，其通过转录调节物的Smad家族进行信号传导。TGF-β与II型受体的细胞外结构域的结合诱导II型受体 (TGFβ-R2)对I型受体(TGFβ-R1)的磷酸化和激活。
TGFβ抑制剂是指分子，例如诱饵受体、抗体或其衍生物、非肽小分子等，其特异性地结合至具有抑制天然TGF-β分子的生物功能的能力的TGFβ-R1受体。
Wnt蛋白形成高度保守的分泌性信号传导分子家族，这些分子调节胚胎发生期间的细胞-细胞相互作用。术语“Wnt”或“Wnt基因产物”或“Wnt蛋白”或“Wnt多肽”可互换使用并且包括天然序列Wnt多肽、Wnt多肽变体、Wnt多肽片段及嵌合Wnt多肽。这些多肽是wnt激动剂，该术语还包括如本领域中已知的激动wnt功能的小分子、模拟物(例如肽模拟物)、激动剂抗体、以及蛋白质。“天然序列”多肽是具有与来源于自然的Wnt 多肽相同的氨基酸序列的多肽，不考虑用于产生其的方法。这种天然序列多肽可从产生内源性Wnt蛋白的细胞中分离或可通过重组或合成手段产生。因此，天然序列多肽可具有例如天然存在的人多肽、鼠多肽或来自任何其它哺乳动物物种或来自非哺乳动物物种 (例如果蝇(Drosophila)、秀丽线虫(C.elegans)等)的多肽的氨基酸序列。
合适的Wnt多肽(即Wnt蛋白)包括但决不限于人Wnt多肽。在本申请中目标人 Wnt蛋白包括下列(登录号是针对编码相关Wnt蛋白的mRNA)：Wnt-1(GenBank登录号NM_005430)；Wnt-2(GenBank登录号NM_003391)；Wnt-2B(Wnt-13)(GenBank登录号NM_004185(同工型1)、NM_024494.2(同工型2))；Wnt-3(RefSeq.:NM_030753)； Wnt3a(GenBank登录号NM_033131)；Wnt-4(GenBank登录号NM_030761)；Wnt-5A (GenBank登录号NM_003392)；Wnt-5B(GenBank登录号NM_032642)；Wnt-6(GenBank 登录号NM_006522)；Wnt-7A(GenBank登录号NM_004625)；Wnt-7B(GenBank登录号NM_058238)；Wnt-8A(GenBank登录号NM_058244)；Wnt-8B(GenBank登录号 NM_003393)；Wnt-9A(Wnt-14)(GenBank登录号NM_003395)；Wnt-9B(Wnt-15) (GenBank登录号NM_003396)；Wnt-10A(GenBank登录号NM_025216)；Wnt-10B(GenBank登录号NM_003394)；Wnt-11(GenBank登录号NM_004626)；Wnt-16 (GenBank登录号NM_016087))。虽然每个成员与该家族具有不同程度的序列同一性，但所有都编码小的(即39-46kD)、酰化的、棕榈酰化的分泌性糖蛋白，其含有23-24个保守半胱氨酸残基，这些残基的间距是高度保守的(McMahon,AP等人,Trends Genet.1992；8:236-242；Miller,JR.Genome Biol.2002；3(1):3001.1-3001.15)。在本发明中其它目标Wnt多肽包括来自任何哺乳动物的上述直向同源物，包括家养动物和农场动物、以及动物园动物、实验室动物或宠物动物，狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠、蛙、斑马鱼、果蝇、蠕虫等。
术语“天然序列Wnt多肽”包括但不限于人和鼠Wnt多肽。人Wnt蛋白包括下列：Wnt1，Genbank参考NP005421.1；Wnt2，Genbank参考NP003382.1，其在大脑内的丘脑、胎肺和成年肺以及胎盘中表达；Wnt2B的两种同工型，Genbank参考NP004176.2 和NP078613.1。同工型1在成年心、脑、胎盘、肺、***、睾丸、卵巢、小肠及结肠中表达。在成年脑中，其主要见于尾状核、底丘脑核及丘脑中。还在胎脑、肺及肾中检测到。同工型2在胎脑、胎肺、胎肾、尾状核、睾丸及癌细胞系中表达。Wnt 3和Wnt3A 在发育神经管的形态发生期间的细胞-细胞信号传导中发挥不同的作用，并且分别具有 Genbank参考NP11 0380.1和X56842(Swiss-Prot P56704)。
天然的人Wnt3A氨基酸序列具有Genbank参考NP_149122.1。Wnt 4具有Genbank 参考NP11 0388.2。Wnt 5A和Wnt 5B具有Genbank参考NP003383.1和AK013218。 Wnt 6具有Genbank参考NP006513.1；Wnt 7A具有Genbank参考NP004616.2。Wnt 7B 具有Genbank参考NP478679.1。Wnt 8A具有两个替代转录物，Genbank参考NP114139.1 和NP490645.1。Wnt 8B具有Genbank参考NP003384.1。Wnt 10A具有Genbank参考 NP079492.2。Wnt 10B具有Genbank参考NP003385.2。Wnt 11具有Genbank参考 NP004617.2。Wnt 14具有Genbank参考NP003386.1。Wnt 15具有Genbank参考 NP003387.1。Wnt 16具有通过可替代剪接产生的两个同工型，即Wnt-16a和Wnt-16b， Genbank参考是NP057171.2和NP476509.1。所有的GenBank、SwissProt及所列的其它数据库序列明确地以引用的方式并入本文。
Wnt蛋白的有效剂量可取决于来源、纯度、制备方法等。出于本发明的目的，目标Wnt蛋白包括增强骨骼干细胞的骨发生的人Wnt3和Wnt5蛋白。当Wnt蛋白为Wnt3、 Wnt3A、Wnt5A、Wnt5B，例如这些蛋白质的人对应物时，有效剂量通常为至少0.1μg/ml、至少0.5μg/ml、至少1μg/ml、至少2.5μg/ml、至少5μg/ml、至少7.5μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml，且可为至少25μg/ml、至少50μg/ml或至少100μg/ml。
Wnt激动剂为任何分子(例如，化学化合物；非编码核酸，例如非编码RNA；多肽；编码多肽的核酸等)，其造成来自Wnt信号传导途径的输出量增加(即，靶基因表达增加)。例如，Wnt激动剂可通过稳定化途径的正调控组分、增加途径的正调控组分的表达或增强正调控组分的功能，或者通过去稳定化途径的负调控组分、减少途径的负调控组分的表达或抑制负调控组分的功能来发挥作用。因此，Wnt激动剂可为途径的正调控组分(例如Wnt蛋白)或编码途径的一种或多种正调控组分的核酸。Wnt激动剂还可为使途径的正调控组分在mRNA或蛋白质水平下稳定的小分子或核酸。
在一些实施方案中，Wnt激动剂通过使β-连环蛋白稳定来发挥作用，由此允许β-连环蛋白的核水平升高。β-连环蛋白可以多种不同方式稳定化。由于Wnt信号传导途径的多种不同负调控组分通过促进β-连环蛋白的降解来发挥作用，所以Wnt激动剂可为途径的负调控组分的小分子或核酸抑制剂(例如，微RNA、shRNA等)(在mRNA或蛋白质水平下起作用)。例如，在一些实施方案中，Wnt激动剂为GSK-3β的抑制剂。在一些此类实施方案中，GSK-3β的抑制剂为小分子化学化合物(例如TWS119、BIO、CHIR-99021、 SB 216763、SB 415286、CHIR-98014等)。
TWS119：3-(6-(3-氨基苯基)-7H-吡咯并[2,3d]嘧啶-4-基氧基)苯酚由Ding等人,Proc Natl Acad Sci U S A.2003年6月24日；100(13):7632-7描述。BIO：6-溴-3-[(3E)-1,3-二氢-3-(肟基)-2H-吲哚-2-亚基]-1,3-二氢-(3Z)-2H-吲哚-2-酮或(2'Z,3'E)-6-溴靛玉红-3'-肟由 Meijer等人,Chem Biol.2003年12月；10(12):1255-66描述。CHIR-99021：6-[[2-[[4-(2,4- 二氯苯基)-5-(5-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-吡啶甲腈由Bennett等人,J Biol Chem.2002年8月23日；277(34):30998-1004描述。SB216763：3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮由Cross等人,JNeurochem.2001年4 月；77(1):94-102描述。SB 415286：3-(3-氯-4-羟基苯基氨基)-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯-2,5- 二酮由Cross等人,J Neurochem.2001年4月；77(1):94-102描述。CHIR-98014： N2-(2-(4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶-2-基氨基)乙基)-5硝基吡啶-2,6-二胺由 Ring等人,Diabetes.2003年3月；52(3):588-95描述。每个参考文献明确地以引用的方式并入本文。
Wnt激动剂的有效剂量可为至少0.1μM、至少1μM、至少2.5μM、至少5μM，且通常不超过500μM、不超过250μM、不超过100μM或不超过50μM。
组织工程学采用细胞、工程化和材料方法的组合以及合适的生物化学因子和物理化学因子来改善或替代生物功能。细胞可植入或‘接种’到能够支持三维组织形成的人工结构中。这些结构(在本文中称为基质或支架)允许细胞连接和迁移、递送和保持细胞及生物化学因子、使生命细胞营养素和表达产物能够扩散。高孔隙率和足够大的孔径是促进细胞在整个细胞和营养素的整体结构中接种和扩散所必需的。可生物降解性通常是一个因素，因为支架可被周围组织所吸收，而不必进行手术移除。降解发生的速率应尽可能与组织形成速率一致：这意味着虽然细胞制造了围绕自身的其自己的天然基质结构，但支架能够提供体内的结构完整性且最终其将分解掉，留下新组织，也就是接管机械负载的新形成的组织。对于临床使用来说可注射性同样重要。
已经研究了许多不同的材料(天然和合成的、可生物降解和永久性的)，例如Puramatrix、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)及聚己酸内酯(PCL)及其组合。支架也可由天然材料来构建，例如蛋白质，如胶原、纤维蛋白等；多糖材料，如壳聚糖；藻酸盐、粘多糖(GAG)如透明质酸等。支架的官能化基团可用于将小分子(药物)递送到特定组织。研究中的另一种形式的支架为去细胞化的组织提取物，由此剩余的细胞残余物/细胞外基质充当支架。
供药物使用的***(即具有细胞和/或因子的支架或植入物)可根据所需制剂包括药学上可接受的无毒稀释剂载体，其被定义为通常用于配制供动物或人施用的药物组合物的媒介物。选择稀释剂以便不会影响组合的生物活性。这种稀释剂的实例为蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格氏溶液(Ringer's solution)、葡萄糖溶液及汉克斯溶液(Hank'ssolution)。另外，NR药物组合物或制剂可包含其它载体、佐剂或无毒的非治疗性非免疫原性稳定剂、赋形剂等。所述组合物还可包含接近生理条件的额外物质，如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂及去污剂。
组合物还可包含多种稳定剂中的任一种，例如像抗氧化剂。当药物组合物包含多肽时，所述多肽可与各种公知化合物复合，这些化合物提高多肽的体内稳定性或另外增强其药理学性质(例如，延长多肽的半衰期、降低其毒性、增强溶解性或摄取)。这种修饰或复合剂的实例包括硫酸盐、葡糖酸盐、柠檬酸盐及磷酸盐。组合物的多肽还可与增强其体内属性的分子复合。此类分子包括例如碳水化合物、多胺、氨基酸、其它肽、离子(例如钠、钾、钙、镁、锰)及脂质。
关于适用于各种类型施用的制剂的指导可见于Remington's PharmaceuticalSciences,Mace Publishing Company,Philadelphia,Pa.,第17版(1985)中。关于药物递送方法的简要综述，参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)。
药物组合物，即因子和/或细胞的组合，可为了预防性和/或治疗性治疗而施用。活性成分的毒性和治疗功效可在细胞培养物和/或实验动物中根据标准药物程序来测定，包括例如测定LD50(50％群体致死的剂量)和ED50(50％群体治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比率为治疗指数并且其可表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的化合物是优选的。
获自细胞培养和/或动物研究的数据可用于配制用于人的剂量范围。活性成分的剂量通常在循环浓度范围内，包括具有低毒性的ED50。剂量可取决于所采用的剂型和利用的施用途径在此范围内变化。
用于配制药物组合物的组分优选具有高纯度且基本上不含潜在有害的污染物(例如，至少国家食品(NF)级，一般至少分析级，且更通常至少药物级)。此外，意图体内使用的组合物通常是无菌的。就给定的化合物必须在使用之前合成而言，所生成的产物通常基本上不含任何潜在毒性试剂，特别是任何内毒素，其可存在于合成或纯化过程期间。供肠胃外(parental)施用的组合物也是无菌的、基本上等渗的且在GMP条件下制得。
有待给予具体患者的治疗组合物的有效量将取决于多种因素，其中若干因素在患者间是不同的。胜任的临床医师将能确定施用于患者的治疗剂的有效量以便根据需要停止或逆转疾病状况的进展。利用LD50动物数据及可针对试剂获得的其它信息，临床医师可根据施用途径为个体确定最大的安全剂量。例如，静脉内施用的剂量可超过鞘内施用的剂量，只要是更多体液进入治疗组合物正被施用的区域。类似地，快速从身体中清除的组合物可以更高剂量施用，或以重复剂量，以便保持治疗浓度。利用常规技术，胜任的临床医师将能在常规临床试验过程中优化具体治疗剂的剂量。
可用本方法治疗的哺乳动物物种包括狗科动物和猫科动物；马科动物；牛科动物；绵羊类动物等，以及灵长类动物，特别是人。动物模型，特别是小型哺乳动物，例如鼠科动物、兔类等可用于实验研究。
更具体地说，本发明可用于治疗需要骨或软骨替换疗法的受试者，如人患者。这种受试者的实例将为患有与软骨损失有关的疾患(例如骨关节炎、遗传缺陷、疾病等)的受试者。患有特征为这种疾患的疾病和病症的患者将极大地受益于未决的要求保护的本发明的治疗方案。
本发明药物组合物的有效量是将造成植入物的位点处的软骨细胞、骨骼细胞的数量、软骨或骨质量增加和/或将造成体内疾病进展速度有可测量的减慢的量。例如，药物组合物的有效量与适当的对照相比将骨或软骨的质量增加了至少约5％、至少约10％、至少约20％、优选约20％至约50％、且甚至更优选大于50％(例如，约50％至约100％)，所述对照通常是不用所述组合物治疗的受试者。
本发明方法还可用于组合疗法中，例如，与本领域中已知的疗法组合以提供与上述疾病、病症及疾患有关的症状的减轻。本发明药物组合物与这些其它试剂的组合使用可具有的优点在于，个体所需的药物剂量较低，且不同药物的作用互补。
在一些实施方案中，有效剂量的脂肪基质细胞，优选脂肪衍生干细胞提供于植入物或支架中用于骨骼或软骨组织的再生。有效细胞剂量可取决于群的纯度。在一些实施方案中，有效剂量递送一个剂量的脂肪衍生干细胞，为至少约102、约103、约104、约105、约106、约107、108、109个或更多个细胞，所述干细胞可以下列浓度存在于细胞群中：约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约 80％、约90％或更大。
本发明提供用于将非骨骼细胞(包括脂肪组织衍生的基质细胞)分化为软骨细胞的方法和组合物。通过本发明方法产生的细胞可用于提供充分分化的功能细胞的来源用于组织工程产物的研究、移植和开发，所述组织工程产生可用于治疗人疾病和创伤性损伤修复。
“软骨细胞(Chondrocyte/cartilage cell)”是指以下细胞：能够表达软骨细胞的特征性生物化学标记物，包括但不限于II型胶原、硫酸软骨素、硫酸角蛋白；且能够表达平滑肌的特征性形态标记物，包括但不限于在培养中所观察到的圆形形态，且能分泌II型胶原，包括但不限于体外生成具有软骨的血液动力学性质的组织或基质。
本发明方法
本发明部分涉及重编程并指导细胞分化为所需骨骼谱系细胞的方法。具体实施方案包括使骨骼干细胞向软骨细胞的分化偏向；以及将脂肪组织细胞，包括但不限于脂肪组织基质细胞或脂肪组织衍生的干细胞，重编程为骨骼干细胞。在一些实施方案中，将这两种方法组合以提供软骨来源。在一些实施方案中，包括具有重编程和/或软骨形成因子的非骨骼细胞群。
在一些实施方案中，以下描述集中于通过使非骨骼体细胞与有效剂量的BMP2或其变体或模拟物接触将所述非骨骼体细胞重编程(即转化)为SSC。在其它实施方案中，该描述包括通过与有效剂量的VEGF抑制剂与TGFβ抑制剂中的一者或两者接触使SSC 向软骨的分化偏向的方法；及其在组织修复中的用途。可通过本发明方法生成的骨骼细胞的其它实例包括骨骼干细胞(SSC)、前-骨软骨和基质祖细胞(前BCSP)、BCSP、定向软骨祖细胞(CCP)、骨祖细胞、B细胞淋巴细胞基质祖细胞(BLSP)；6C3基质、肝性白血病因子表达基质细胞(HEC)；及其子代。
如果提供作为多肽，那么用于诱导软骨形成和重编程的因子可使用如本领域中已知的常规方法，通过体外合成来制备。可获得各种商用合成装置，例如，AppliedBiosystems, Inc.,Beckman的自动合成器等。通过使用合成器，天然存在的氨基酸可被非天然氨基酸取代。具体的序列及制备方法将由便利性、经济性、所需纯度等来决定。在无细胞***中制备多肽的其它方法包括例如美国申请序列号61/271,000中所教导的那些方法，该申请以引用的方式并入本文。
也可根据常规的重组合成方法分离并纯化多肽。裂解物可由表达宿主制备并且使用 HPLC、排阻色谱法、凝胶电泳、亲和色谱法或其它纯化技术来纯化裂解物。多数情况下，与同产物制备及其纯化方法有关的污染物相比，所用的组合物将包含至少20重量％的所需产物，更通常至少约75重量％、优选至少约95重量％，并且出于治疗目的，通常至少约99.5重量％。通常，百分比将基于总蛋白。多肽不仅可直接重组产生，而且可以与异源多肽的融合多肽形式产生，例如在成熟蛋白质或多肽的N端处具有特定裂解位点的多肽。
在其它实施方案中，提供用于重编程或诱导软骨形成的因子作为编码多肽的核酸。用于向本发明细胞提供这种核酸的载体通常将包含适用于驱使核酸表达(亦即转录激活) 的启动子。这可包括泛作用的启动子，例如CMV-β肌动蛋白启动子；或诱导型启动子，如在具体的细胞群中有活性或响应于药物如四环素的存在的启动子。通过转录激活，预期转录将增加超过靶细胞中的基础水平，增加至少约10倍、至少约100倍，更通常至少约1000倍。核酸可直接提供或在以下载体中提供，例如如本领域中所知的病毒、例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等。
当提供一种以上因子时，例如，当有效剂量的BMP2与有效剂量的VEGF抑制剂、 wnt多肽等组合时，所述因子可单独地或作为因子的单一组合物提供，也就是作为预混合组合物。所述因子可同时或在不同时间依次添加到本发明细胞中。所述因子可以相同的摩尔比或不同的摩尔比提供。所述因子可在治疗过程中一次或多次提供。例如，包含细胞和因子的植入物可提供给个体，并且在治疗过程中提供额外的因子和/或细胞。
本发明祖细胞和/或因子的组合可提供用于体内细胞溶液中，其中水合溶液、混悬液或其它流体含有能够分化为骨或软骨的骨祖细胞或因子。
可提供骨或软骨移植物装置和组合物，在组成、生物活性、孔隙率、孔径、蛋白结合潜能、降解性或用于承重和非承重软骨或骨移植应用的强度的一个或多个方面对其进行优化。优选地，配制移植材料以使得它们促进参与骨或软骨愈合的一个或多个过程：软骨形成、骨发生、骨诱导及骨传导，它们可在施用单个移植材料时发生。软骨形成是新软骨结构的形成。骨发生是通过移植物内所含的细胞造成的新骨形成。骨诱导是一个化学过程，其中移植物内所含的分子(例如骨形态发生蛋白和TGF-.β.)将患者的或其它骨祖细胞转化为能够形成骨的细胞。骨传导是一个物理效应，移植物的基质借此形成支架，受体中的骨形成细胞能够在该支架上形成新骨。
本发明的因子和/或细胞的纳入可用于促进软骨或骨材料在现有结构中和周围的替换和填充。在一些实施方案中，细胞首先产生软骨细胞，接着是胞外基质的沉积和骨形成。骨移植物可提供包含磷酸钙陶瓷的骨引导支架，其为植入的祖细胞和局部骨细胞提供一个框架以便分化为骨形成细胞并沉积新骨。磷酸钙陶瓷的使用可提供陶瓷的缓慢降解，这产生用于骨形成的钙和磷酸盐的局部来源。因此，新骨可在缺损位点周围的宿主骨在没有钙和磷酸盐丢失的情况下形成。磷酸钙陶瓷在化学上与骨组织的矿物组分相容。这种磷酸钙陶瓷的实例包括磷酸钙化合物和盐、及其组合。
在一些实施方案中，细胞和/或因子被制备为可注射糊剂。可将细胞混悬液添加到一种或多种粉末状前体细胞中以形成可注射水合糊剂。糊剂可注射到植入位点中。在一些实施方案中，糊剂可在植入之前制备和/或将糊剂在低于环境温度下储存在注射器中直到需要。在一些实施方案中，通过注射施加复合物可类似骨接合剂，骨接合剂可用于连接和保持骨片段在适当的位置或改善例如髋关节假体的粘附以用于关节中受伤软骨的替换等。也可在非开放的手术环境中进行植入。
在其它实施方案中，细胞和/或因子被制备成可成形油灰。细胞混悬液可添加到一种或多种粉状矿物质中以形成油灰样水合移植复合物。水合的移植物油灰可被制备并模制成近似任何植入形状。随后可将油灰压制到适当位置处以填充软骨、骨、齿槽或其它位点中的空隙。在一些实施方案中，移植物油灰可用于修复非连接骨或如下所述其它情况中的缺损，其中有待填充的骨折、孔隙或空隙较大并且在植入材料中需要一定程度的机械完整性以填充空隙并保持其形状。
本发明提供治疗人或其它动物受试者中的软骨或骨病变或损伤的方法，所述方法包括向所述位点施用包含本发明的细胞和/或因子的组合物，所述组合物可以与接合剂、因子、凝胶等组合的形式提供。如本文所提及，这种病变包括任何涉及骨骼(包括软骨)组织的疾患，其对生理或美容目的来说不恰当。这种缺损包括先天性的、由疾病或损伤造成的、以及继发于手术或其它医疗操作的。这种缺损包括例如由损伤造成的骨缺损、以下情况引起的缺损：手术过程期间、骨关节炎、骨质疏松症、感染、恶性肿瘤、发育畸形以及骨折，如简单骨折、复合骨折、横向骨折、病理骨折、撕脱骨折、青枝骨折及粉碎性骨折。在一些实施方案中，骨缺损是在骨中的空隙，其需要被骨祖细胞组合物充满。
本发明的细胞还可在遗传上发生改变以增强其参与组织再生或向施用位点递送治疗基因的能力。使用所需基因的已知编码序列设计一种载体，将其与在分化细胞类型中有泛特异性或特异活性的启动子可操作连接。特别关注在遗传上发生改变以表达骨形态发生蛋白如BMP-2或BMP-4的细胞。参见WO 99/39724。在施用位点处产生这些或其它生长因子可增强所施用细胞的有益作用或增加邻近治疗位点的宿主细胞的增殖或活性。
体外转化方法及体外转化细胞的使用
在一些实施方案中，将细胞，例如脂肪组织干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞等、或本文所定义的任何骨骼干细胞和祖细胞在体外与重编程和/或软骨形成因子接触。本发明细胞可来自任何哺乳动物，包括人、灵长类动物、家养动物和农场动物、以及动物园动物、实验室动物或宠物动物，如狗、猫、牛、马、绵羊、猪、山羊、兔、大鼠、小鼠等。它们可为确定的细胞系或它们可为原代细胞，其中“原代细胞”、“原代细胞系”及“原代培养”在本文中可互换使用且指的是来源于受试者且允许在体外生长有限代数的细胞或细胞培养物。
本发明细胞可从新鲜或冷冻细胞中分离，其可来自婴儿、少年或成年，并且来自以下组织，包括皮肤、肌肉、骨髓、外周血、脐带血、脾、肝、胰、肺、肠、胃、脂肪及其它分化组织。组织可通过活组织检查或无耐受力(aphoresis)从活的供体获得，或由已死亡的供体或死亡约48小时内的死亡供体、或新近冷冻组织、死亡约12小时内冷冻并保持在低于约-20℃，通常在约液氮温度(-190℃)下无限期的组织获得。为了从组织中分离细胞，可以用合适的溶液进行分散或悬浮。这种溶液一般为平衡盐溶液，例如生理盐水、PBS、汉克斯平衡盐溶液等，方便地补充有胎牛血清或其它天然存在的因子，结合可接受的低浓度缓冲剂，一般为5-25mM。适宜的缓冲剂包括HEPES、磷酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂等。
在体外与本文所定义的因子(即，促进重编程和/或促进软骨细胞的生长和/或分化等的因子)接触的细胞可在一种或多种试剂存在下孵育约30分钟至约24小时，例如1小时、 1.5小时、2小时、2.5小时、3小时、3.5小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、12小时、16小时、18小时、20小时或介于约30分钟至约24小时之间的任何其它时间段，这可以约每天至约每4天的频率重复，例如每1.5天、每2天、每3天或介于约每天至约每4天之间的任何其它频率。所述一种或多种试剂可向受试者细胞提供一次或多次，例如一次、两次、三次或三次以上，并且允许细胞与所述试剂一起孵育持续每次接触事件之后一定时间，例如16-24小时，在此之后用新鲜培养基更换培养基并且进一步培养细胞。
在细胞与因子接触之后，可培养接触细胞以便促进本文所定义的骨骼干细胞、软骨细胞或祖细胞群的存活和分化。用于培养细胞的方法和试剂是本领域中公知的，其任一种皆可用于本发明中以使细胞生长和分离。例如，可将细胞(在与因子接触前或接触后) 涂铺于基质胶或如本领域中已知的其它底物上。细胞可在补充有因子的培养基中培养。或者，接触的细胞可在液氮温度下冷冻并长时间保存，能够在解冻后使用。如果冷冻的话，细胞通常将保存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。一旦解冻，细胞便可通过利用与骨骼存活和分化有关的生长因子和/或基质细胞得到扩增。
通过上述体外方法产生的诱导骨骼细胞或软骨形成细胞可在治疗疾病的细胞替换或细胞移植疗法中使用。具体地说，细胞可转移到患有具有骨骼或软骨组分的多种疾病或病症的受试者中。
在一些情况下，目标细胞或细胞亚群可在转移到受试者之前从细胞培养物的其余部分中纯化或分离。换言之，可进行一个或多个步骤以富集细胞或细胞亚群，即以提供富集的细胞群或细胞亚群。在一些情况下，将一种或多种对骨骼/软骨形成谱系的细胞标记物或骨骼谱系的细胞亚群的标记物有特异性的抗体与细胞群孵育并且分离那些结合的细胞。在其它情况下，细胞或细胞亚群表达标记物，该标记物是报道基因，例如EGFP、 dsRED、lacz等，其在特异性启动子的控制下，随后所述标记物用于纯化或分离细胞或其亚群。
“标记物”意指在包含已被重编程以变为骨骼/软骨形成细胞的细胞的培养物中，标记物仅由培养的细胞表达，这些细胞将发育、正在发育和/或已经发育为骨骼/软骨形成细胞。本领域技术人员应理解，所述表达水平反映了标记物蛋白在细胞上或中的可检测量。对染色呈阴性(标记物特异性试剂的结合水平并非可检测地不同于同种型匹配的对照)的细胞仍可表达较少量的标记物。且虽然本领域中常常称细胞对特定的标记物呈“阳性”或“阴性”，但实际的表达水平是数量性状。细胞表面上的分子数量可变化几个对数，但仍可表征为“阳性”。
目标细胞，即表达所选标记物的细胞可通过本领域中公知的许多方法富集，也就是说与细胞群的其余部分分离。举例来说，流式细胞术，例如荧光激活细胞分选(FACS)可用于基于标记物的内在荧光、或标记物与特异性荧光试剂的结合(例如荧光体-缀合抗体) 以及其它参数如细胞大小和光散射来分离细胞群。换言之，细胞的选择可通过流式细胞术实现。虽然染色的绝对水平可与具体的荧光染料和试剂制备不同，但数据可关于对照进行归一化。为了相对于对照来归一化分布，每个细胞被记录为具有特定染色强度的数据点。这些数据点可根据对数标度来显示，其中测量单位是任意染色强度。在一个实例中，样品中最亮染色的细胞可比未染色细胞强差不多4个对数。当以此方式显示时，很明显落在最高对数染色强度中的细胞是亮的，而在最低强度中的那些是阴性的。“低”阳性染色细胞具有超过同种型匹配的对照亮度的染色水平，但强度不及通常见于群中的最亮染色的细胞。可替代的对照可利用在其表面上具有所定义的标记物密度的底物，例如制造的珠粒或细胞系，其提供强度的阳性对照。
其它分离方法，即基于标记物可实现细胞选择的方法，包括例如磁性激活细胞分选 (MACS)、免疫淘选及激光捕获显微切割。
细胞群的富集可在细胞与本发明因子接触之后约3天或更久进行，例如在体细胞与因子接触之后3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天或21天。通过关于一种或多种标记物的表达进行选择而富集的群通常将具有至少约80％具有所选表型的细胞，更通常至少90％细胞并且可为95％或更多具有所选表型的细胞。
除如上所述的移植方法之外，从组织分离或通过如上所述的方法体外诱导的细胞还可用作基础研究或药物发现工具，例如以便评价遗传疾病的表型，例如以便更透彻地了解疾病的病因、鉴定用于治疗性治疗的靶蛋白、鉴定具有疾病缓解活性的候选试剂，例如鉴定将有效治疗受试者的试剂。举例来说，候选试剂可添加到包含来源于受试者非骨骼细胞的iSSC或本文所述的任何骨骼祖细胞和软骨形成祖细胞的细胞培养物中，并且通过监测输出参数如存活率、形成骨或软骨的能力等，通过本文和本领域中所述的方法来评估候选试剂的效果。
参数是细胞的可量化组分，特别是可被精确测量的组分，理想地在高通量***中。参数可为任何细胞组分或细胞产物，包括细胞表面决定簇、受体、蛋白质或其构象或翻译后修饰、脂质、碳水化合物、有机或无机分子、核酸(例如mRNA、DNA等)或衍生自所述细胞组分的一部分或其组合。虽然大部分参数将提供定量读出，但在一些情况下，半定量或定性结果将是可接受的。读出可包括单次测定值，或者可包括平均值、中值或方差等。特征性参数读出值范围将为来自多个相同测定的每个参数获得。可变性是预期的并且将使用标准统计方法获得每一组测试参数值的范围，其中常见的统计方法用于提供单个值。
用于筛选目标候选试剂包括已知和未知的化合物，包括众多化学类别，主要是有机分子，可包括有机金属分子、无机分子、基因序列等。本发明的一个重要方面是评价候选药物，包括毒性测试；等。
候选试剂包括包含为结构相互作用(特别是氢键合)所必需的官能团的有机分子，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，常常包括至少两个化学官能团。候选试剂常常包含被一个或多个以上官能团取代的环状碳或杂环结构和/或芳族或多环芳族结构。还在生物分子之中发现候选试剂，包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、类固醇、嘌呤、嘧啶、其衍生物、结构类似物或组合。包括药理学活性药物、遗传活性分子等。目标化合物包括化疗剂、激素或激素拮抗剂等。适用于本发明的药物试剂的实例为在以下文献中所述的那些："ThePharmacological Basis of Therapeutics,"Goodman和Gilman, McGraw-Hill,New York,N.Y.,(1996),第9版。
化合物(包括候选试剂)是从广泛多种来源处获得，包括合成或天然化合物的文库。举例来说，众多手段可用于广泛多种有机化合物(包括生物分子)的随机和定向合成，包括随机化的寡核苷酸和寡肽的表达。或者，呈细菌、真菌、植物及动物提取物形式的天然化合物的文库可活动或容易产生。另外，天然或合成产生的文库及化合物容易通过常规的化学、物理及生物化学手段进行修饰，并且可用于产生组合文库。已知的药理试剂可经受定向或随机化学修饰，如酰化、烷基化、酯化、酰胺化(amidification)等以产生结构类似物。
通过向一个或多个细胞样品中添加试剂，通常连同缺乏试剂的细胞一起，对候选试剂进行生物活性筛选。测量响应于试剂的参数变化，并且通过例如在试剂存在和不存在下与由其它试剂获得的参考培养物等相比来评价结果。
试剂适宜以溶液形式或容易溶解的形式添加到培养中的细胞培养基中。试剂可在流通***中以间歇或连续的物流形式添加，或可替代地，将团注化合物单独或增量地添加到另外静态的溶液中。在一个流通***中，使用双流体，其中一个是生理中性溶液，且另一个是添加有测试化合物的相同溶液。第一流体通过细胞，接着是第二流体。在单溶液方法中，将团注的测试化合物添加到细胞周围的培养基体积中。培养基组分的总体浓度在添加团注后或在流通方法中的两种溶液之间不应显著变化。
可以不同的试剂浓度平行进行多个分析以获得针对各种浓度的差异反应。如本领域中已知，确定试剂的有效浓度通常使用由1:10或其它对数标度的稀释液产生的浓度范围。必要时，浓度可进一步用第二系列的稀释液来细化。通常，这些浓度中的一个充当阴性对照，即，在零浓度或低于试剂的检测水平下或者在等于或低于不给出表型中的可检测变化的试剂的浓度下。
本文所述的方法还提供一种用于筛选候选试剂的调节细胞转化为骨骼谱系细胞或软骨形成谱系细胞(例如软骨细胞、成骨细胞或其祖细胞)的活性的有用***。在生物活性剂的筛选测定中，将细胞(通常是细胞培养物)在细胞重编程或分化***或不完全的细胞重编程或分化***存在下与目标候选试剂接触，并且候选试剂的效果是通过监测输出参数如本领域中已知对所需细胞类型有特异性的基因表达水平或如本领域中已知被诱导以像所需细胞类型一样起作用的细胞的能力来评估的。
骨/软骨形成/基质祖细胞的分离
通过富集具有所述特征的细胞的技术将本发明的受试者骨祖细胞从细胞的复杂混合物中分离。本发明的祖细胞已在谱系中进行了表征，如图2G中所列出。尽管对小鼠细胞进行了初始表征，人细胞可用标记物的功能同系物来表征，例如CD200、6C3、PDPN、 CD105、CD90、CD45、Tie2及αv整联蛋白。提供了用于分离并表征此类骨祖细胞的方法和组合物。所述细胞可通过这些特异性细胞表面标记物的表达而与其它细胞分离。
为了从组织中分离细胞，可以用合适的溶液进行分散或悬浮。这种溶液一般为平衡盐溶液，例如生理盐水、PBS、汉克斯平衡盐溶液等，方便地补充有胎牛血清或其它天然存在的因子，结合可接受的低浓度缓冲剂，一般为5-25mM。适宜的缓冲剂包括 HEPES、磷酸盐缓冲剂、乳酸盐缓冲剂等。组织可被酶促解离和/或机械解离。在一些实施方案中，将骨组织用温和的蛋白酶(例如分散酶等)处理一段足以解离细胞的时间段，然后温和地进行机械解离。
初始分离可通过本领域中已知的各种方法针对细胞选出，包括淘析、Ficoll-Hypaque 或流式细胞术，使用前向和钝角散射的参数。
本发明细胞群的分离然后将使用亲和力分离以提供基本上纯的群。用于亲和力分离的技术可包括使用抗体包被的磁珠的磁力分离、亲和色谱法、连接到单克隆抗体或与单克隆抗体联合使用的细胞毒性剂(例如补体和细胞毒素)、及用连接到固体基质(例如板)上的抗体的“淘选”或其它便利的技术。提供精确分离的技术包括激发荧光细胞分选器，其可具有不同的复杂程度，如多个彩色通道、小角度和钝角光散射检测通道、阻抗通道等。细胞可通过采用与死细胞有关的染料(碘化丙啶，7-AAD)针对死细胞进行选择。不会过分损害所选细胞的活力的任何技术均可使用。
亲和力试剂可为针对如上所述的细胞表面分子有特异性的受体或配体。尤其关注抗体作为亲和力试剂的用途。制备抗体的细节及其用作特异性结合成员的适用性是本领域技术人员公知的。取决于有待选出的特定细胞群，将对CD105和CD90有特异性的抗体与初始细胞群接触。任选地，还包括对CD45、Tie2及αv整联蛋白有特异性的试剂。
如本领域中所知，将选择对相关物质具有特异性的抗体，即对人标记物有特异性的抗体用于选择人细胞；对小鼠标记物有特异性的抗体用于选择小鼠细胞等。
适宜地，将这些抗体与用于分离的标记缀合。标记包括磁珠，其允许指导直接分离；生物素，其可用结合至载体上的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素除去；荧光染料，其可与激发荧光细胞分选器一起使用，等，以便于分离具体的细胞类型。可用的荧光染料包括藻胆蛋白，例如藻红蛋白和别藻蓝蛋白、荧光素及德克萨斯红。经常用不同荧光染料标记每种抗体，以允许每种标记物的非依赖性分选。
抗体被添加到细胞混悬液中，并且孵育一段足以结合可利用的细胞表面抗原的时间。孵育通常将为至少约5分钟且通常小于约30分钟。在反应混合物中需要具有足够的抗体浓度，以使得分离的效率不因缺乏抗体而受到限制。通过滴定测定适当的浓度。其中分离细胞的培养基将为保持细胞活力的任何培养基。优选培养基是含有0.1至0.5％ BSA的磷酸盐缓冲盐水。各种培养基均可商购获得并且可根据细胞性质来使用，包括杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbeccos Modified Eagle Medium)(dMEM)、汉克斯碱性盐溶液(Hank's BasicSalt Solution)(HBSS)、杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水(Dulbeccos phosphate bufferedsaline)(dPBS)、RPMI、伊斯科夫培养基、具有5mM EDTA的PBS等，经常补充有胎牛血清、BSA、HSA等。
然后关于如上所述的表型分离标记细胞。分离的细胞可在任何适当的培养基中收集，所述培养基保持细胞的活力，通常在收集管的底部具有血清垫。各种培养基均可商购获得并且可根据细胞的性质使用，包括dMEM、HBSS、dPBS、RPMI、伊斯科夫培养基等，经常补充有胎牛血清。
以此方式实现为骨祖细胞活性而高富集的组合物。本发明群将在或约50％或更多的细胞组合物下，且通常在或约90％或更多的细胞组合物，并且可为差不多约95％或更多的活细胞群。富集的细胞群可立即使用，或可在液氮温度下冷冻并且长时间保存，解冻并能够再使用。细胞通常将保存在10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。一旦解冻，细胞可通过利用生长因子和/或基质细胞用于增殖和分化得到扩增。
本方法可用于开发骨功能的体外或体内模型并且还可用于基因疗法的实验和人工器官的构建。发育中的骨充当新型生长因子和药物的有价值来源并且用于生产病毒或疫苗、用于药物和工业化合物的体外毒性和代谢测试、用于基因疗法实验、用于构建人工可移植骨以及用于骨诱变和致癌作用
本发明的特征和优点在参考以下实施例后将得到更透彻地理解，这些实施例不应被视为限制本发明。
实验
实施例1
成骨祖细胞和软骨形成祖细胞的可互换的命运是由多能骨骼干细胞的广泛谱系图来揭示。
骨、软骨和骨髓基质是骨骼的主要组分，但出生后骨骼组织的来源仍不清楚。在此描绘了骨和软骨从高纯度的、出生后的骨骼干细胞(小鼠骨骼干细胞，mSSC)群以及其下游不同的骨、软骨及基质组织的祖细胞的发育。然后确定mSSC谱系与其子代的关系。研究干/祖细胞的转录物组的独特的基因表达模式，这可指示mSSC谱系定向的可能的内在和外部调节物。这些分析揭示由mSSC生成的支持基质反射性调节mSSC的分化并且还调节造血作用。证明一些mSSC生态位因子可为骨骼再生的有效诱导物，并且重组 mSSC生态位因子的若干特定组合可原位激活mSSC遗传程序，甚至在非骨骼组织中，从而引起软骨或骨以及骨髓基质的从头形成。
通过采用“彩虹小鼠(Rainbow Mouse)”***，将非造血基质细胞从骨组织的克隆源性区域***地分离并且分析其在异位移植体环境中体内分化为骨骼组织的能力。然后通过FACS分级分离和转录分析鉴定八个祖细胞亚群。在这些亚群之中发现能够生成骨、软骨及骨髓的小鼠骨骼干细胞(mSSC)。随后，鉴定此mSSC和其它七个亚群之间的直系关系以开发骨骼生成祖细胞的谱系图。然后将注意力转向生态位中调节mSSC增殖和向特定谱系(特别是向软骨发育)分化的机制和/或因子。通过操控所鉴定的在保持骨骼生态位微环境方面很重要的成形素，可以诱导脂肪组织中的异位骨发生。还可通过进一步操控所鉴定有助于确定骨骼干细胞和祖细胞命运的生态位因子使从骨质向软骨形成组织的谱系确定偏向。因此，通过区分可被翻译用于治疗性骨骼再生的特定的骨骼生成生态位因子，证明了此谱系图的效用，及所鉴定的mSSC与其子代之间的关系。
骨骼干细胞、其子代及其谱系关系的鉴别骨和软骨是衍生自克隆的、谱系限制的祖细胞。在纯化新组织祖细胞中的主要挑战是鉴别可以精确地将这些罕见细胞与其环境区分开的分子标记物。研究表明所选择的骨骼生成祖细胞群可在转基因小鼠中被遗传追踪，所述转基因小鼠经工程化以在驱使特定基因如Nestin或Mx1表达的启动子的调节控制下表达GFP或Cre重组酶。然而，因为Nestin和Mx1广泛地在多种组织和细胞类型中表达，所以这些标记物在不同细胞中的表达可能不一定意味着它们具有共同的谱系。因此，使用“彩虹小鼠”模型来体内评价克隆-谱系关系以确定在包括基质、脂肪、骨、软骨及肌肉的骨中的间充质组织是否具有共同的祖细胞。
彩虹小鼠***是多色彩Cre依赖性标记物***，其载有四个颜色报道基因构建体(红色、黄色、绿色、蓝色：参见实验方法部分)。为了可视化所有组织内的克隆模式，将‘彩虹’小鼠与载有他莫昔芬诱导型普遍表达的Cre的小鼠在肌动蛋白基因启动子(肌动蛋白 -Cre-ERT)下杂交(图1C)。然后通过在以下不同的发育时间点进行他莫昔芬注射来诱导子代中的Cre表达，包括胚胎期第15天(E15)、出生后第3天(P3)及第6周(年轻成年)(图 1C)。Cre重组酶活性的诱导触发包括干细胞在内的所有细胞中RFP、GFP、CFP及YFP 的高达16种不同的随机排列的组成型表达。此重组酶激活之后六周，克隆区可被检测为不同颜色的均匀标记区(图8A、B)。
使用此***，在所有时间点(在E15、P3及出生后第6周进行诱导)观察了在包括骨、软骨及基质组织的骨(特别是生长板)而不是造血组织、脂肪组织或肌肉组织中的克隆区(图1A、C、D，图8D)。这些数据表明骨、软骨及基质组织是在体内克隆衍生自谱系限制的干细胞和祖细胞，这些细胞至少在所检查的时间点时(从E15至出生后第6周)不会也产生肌肉和脂肪(图8D)。
在出生后第6周时诱导的小鼠的股骨生长板中的骨骼克隆活性有轻度降低，这可能反映了出生后生长的逐渐下降(图8C，箭头指示在(ii)-(iv)的插图中的克隆区)。还观察了掌骨和跖骨中及中轴骨骼(即胸骨和肋骨)的骨中的克隆区(图8E-G)。纯化的软骨、骨及基质祖细胞是异质性和谱系限制的。
在确定骨、软骨及基质组织是体内克隆衍生自谱系限制的干细胞和祖细胞之后，设法通过使用荧光激活细胞分选(FACS)进行预期分离来纯化特异性克隆骨骼生成群。因为已在‘彩虹小鼠’克隆分析期间在生长板中观察到高频率的克隆区，所以通过酶促解离和机械解离将细胞从股骨的生长板中分离并且通过FACS分析它们的CD45、Ter119、Tie2 及AlphaV整联蛋白的差异表达。这些表面标记物对应于造血(CD45、Ter119)、血管和造血(Tie2)及成骨(AlphaV整联蛋白)细胞上存在的那些。
发现生长板具有高频率的CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+细胞，下文称为[AlphaV+]细胞。基于显示CD105、Thy、6C3及CD200的差异表达的[AlphaV+]群的后续微阵列分析，将此群分级分离为八个亚群(图1B和E)。为了评价八个亚群生成骨骼组织的内在能力，将每个亚群的20,000个细胞从GFP+小鼠的长骨(股骨、胫骨、肱骨、桡骨)、肋骨及胸骨中分离(图1E)并且将它们移植到免疫受损的RAG-2/γ(c)KO小鼠的肾囊下(图 1H)。
先前已确定肾囊下位置是供移植的骨骼生成细胞植入的理想的骨骼外位点。移植之后四周，取出GFP标记的肾移植物并且处理组织用于组织学分析以确定其发育结果(图1F)。八个亚群展现不同的发育命运(图1F-G)：三个遵循软骨内骨化模式，生成由骨、软骨及骨髓组成的移植物(图1F-G：群a、e、f)；四个主要生成骨，有极少软骨且无骨髓(图 1F-G：群b、c、d、h)；并且一个主要生成软骨组织，有极少骨且无骨髓(图1F-G：群 g)。这些结果表明骨骼生成祖细胞是多样化的，具有不同的细胞表面标记物分布和骨骼组织命运，类似于生成各种终末分化的血细胞的多种造血祖细胞。为了确保[CD45+Ter 119+]或[Tie2+]亚群不含骨骼生成细胞的亚群，通过机械和酶促消化将[CD45+Ter 119+] 和[Tie2+]细胞群(其先前已在FACS分级分离上排除)从P3GFP标记的小鼠的长骨中分离且随后进行FACS分级分离。
然后将每个亚组的20,000个细胞移植到免疫缺陷的RAG-2/γ(c)KO小鼠的肾囊下以评估其内在骨骼生成潜能。与[AlphaV+]级分的八个亚群不同，在移植之后四周没有发现CD45/Ter119+和Tie2+亚组形成骨、软骨或基质(图15D)，进一步强调了骨、软骨及基质组织的不同祖细胞在小鼠骨骼中的存在。
出生后骨骼干细胞的鉴别。假设造骨作用可通过如造血作用中所见的谱系限制的祖细胞的发育分层进行，它是已最彻底列举的器官发生***。因此，基于[AlphaV+]群中的CD105、CD200、Thy及6C3细胞表面标记物的差异表达再次将八个细胞亚群从股骨生长板中分离。
接着试图测定每个亚群的分化能力并且鉴定可能存在于亚群之中的谱系关系。观察到[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]亚群通过体外和体内的一系列阶段直系地生成所有其它(七个)亚群，从生成两个多能祖细胞类型开始：首先 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200-]细胞群，下文称为前BCSP(针对前骨软骨和基质祖细胞)；和[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105+]细胞群，先前描述为BCSP；针对骨、软骨及基质祖细胞。
[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]亚群以直系方式在体外和体内生成所有其它(七个)亚群。在体外，培养新近分选的细胞持续25天的时间，此时通过FACS对其进行重新分级分离(图2A(i)，图2B(i)、(ii))，且随后移植到肾囊下(图2A(i)，图2B(iii))。在体内，将纯化的细胞移植到肾囊下并且一个月以后取出用于解离和FACS 分析(图2A(ii)，图2C(i)、(ii))或免疫组织化学(图2C(iii))。
这些数据显示[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]亚群以直系方式在体外和体内生成所有其它(七个)亚群。来自 [CD45-Ter119-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]亚群的单一分选细胞也以直系方式在体外和体内生成所有其它亚群(图2D，图2E)。
体外：将各个[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]细胞涂铺并培养14天(图2D(ii))。所得的主要集落的FACS分析显示它们含有原始细胞的克隆以及[AlphaV+]群的所有其它(七个)亚群(图2E(iv)：中图FACS曲线图)。当通过免疫组织化学检查时，这些集落含有胶原2(+)软骨和骨钙素(+)骨组织(图2E(iii))。此外，当将从原代集落分离的单个新近分选的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]细胞再次涂铺并培养14天时，所得的次生集落在FACS分析(图2E(iv)：下图FACS曲线图)上含有原始细胞的克隆还有所有其它亚群(图2E(ii))。这些结果证明单个 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]细胞的体外自我更新保持新近分离的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]细胞的骨骼生成性质。
体内：当单独移植时，[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]细胞不能有效地植入肾囊下，或许反映了它们需要支持性微环境-即骨骼干细胞生态位。因此，将各个GFP标记的[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]细胞与从P3 小鼠长骨分离的五千个未分选的RFP标记细胞共同移植以模拟骨骼干细胞生态位(图 2D(i))。移植之后两周，取出移植物用于连续切片和免疫组织化学分析。GFP标记的移植细胞在体内分化为阿尔新蓝染色的软骨细胞和藏红花染色的骨细胞(图2F(iv)、(vi))，与其体外性质一致(图2E(iii))。这些数据表明 [CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+]群具有明确的干细胞样自我更新特征和多能性特征。因此，推断[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+] 细胞群代表了出生后骨骼组织中的小鼠骨骼干细胞(mSSC)群(图2G)，并且[AlphaV+]群的七个其它亚群是mSSC子代。
通过这些标准鉴别的mSSC还在骨骼的其它区域中检测到，包括尾骨、脊骨、肋骨、骨盆、神经颅(neural cranium)、下颌骨和趾骨，表明mSSC对于这些骨的出生后维持同样重要。(图14)突显了mSSC的潜在再生能力，已经发现mSSC的量在骨折股骨的胼胝中比在对侧未受伤股骨中显著更高；此差异在骨折后7天最大(图9A-B)。
另外，已见到三个其它现象，这突出了mSSC在损伤后再生中的作用。首先观察到从骨折胼胝中分离的mSSC当在成骨分化培养基中体外培养时具有增强的成骨能力(与从未受伤股骨分离的那些细胞相比)，表明与从未受伤股骨分离的mSSC相比茜素红染色的显著更大摄取(图9C左图)。其次，当将10,000个从骨折胼胝或未受伤骨中分离的mSSC 移植到肾囊下并在一个月以后取出移植物时，可见虽然两个组的细胞产生与骨和骨髓一致的移植物，但由从骨折环境获得的mSSC产生的移植物产生比由从未受伤骨分离的 mSSC产生的那些显著更大的移植物，突出了在损伤存在下mSSC的活性的内在改变(图 9C：右图)。最后，众所周知辐照造成骨量减少并减少骨折愈合，然后检查响应于辐照后损伤的mSSC活性。此时可见，当骨折诱导之前12小时辐照小鼠时，发现在骨折后一周与骨折后1周的未受辐照股骨相比在mSSC扩增方面有显著减少(图9D)。
这些数据因此突出了mSSC的功能性再生能力。基于上述分析，定义了骨骼干/祖细胞的谱系树(图2G)。mSSC通过产生越来越命运限制的祖细胞的分层而引发造骨作用，类似于HSC。多能且自我更新的mSSC首先产生多能祖细胞、前骨软骨基质祖细胞(前 BCSP)及骨软骨基质祖细胞(BCSP)。然后这些细胞类型中的两个产生以下寡谱系祖细胞：定向软骨祖细胞(CCP)[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy+6C3-CD105+CD200+]；Thy亚群，[CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy+6C3-CD105+]下文称为Thy；B细胞淋巴细胞基质祖细胞，BLSP[CD45-Ter119-AlphaV+Thy+6C3-CD105-]；6C3亚群， [CD45-Ter119-AlphaV+Thy-6C3+CD105-]下文称为6C3；以及肝性白血病因子表达细胞，HEC[CD45-Ter119-AlphaV+Thy-6C3+CD105-](图2G)。mSSC衍生的谱系包括先前已表征的细胞类型，如Thy、BLSP及6C3亚群，其具有不同的造血支持性能力(图12A、 B)。
调节骨骼干细胞和祖细胞活性及分化的因子的鉴别。mSSC生态位由调节mSSC 活性的其它骨骼谱系细胞组成。在初始实验中，注意到来自胎儿肢体的最早骨骼生成群是Thy、6C3及CD105三阴性的([CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-]，下文被统称为为TN，三重阴性细胞)。TN细胞在体外和体内生成CD105+、Thy+及6C3+/- 细胞，且TN细胞还能在体外自我更新。因此，TN细胞是最早形式的富集mSSC的群。这是当进行微阵列分析时使用的相同的群(描述为*mSSC；图3)。
*mSSC群的微阵列分析揭示一组标记物，其可甚至进一步潜在地富集mSSC。在若干可能的候选物当中，观察到CD200似乎显著增强TN细胞的集落形成单位活性。因此，包括最近的单细胞RNA测序的所有后续实验都针对具有图2G所述的免疫表型 ([CD45-Ter119-Tie2-AlphaV+Thy-6C3-CD105-CD200+])的mSSC进行。类似地，定向软骨祖细胞(CCP)的免疫表型进一步通过观察CD200在骨骼生成干/祖细胞的进一步细分级分离中的重要性来细化(图2G)。
一旦已经分离mSSC，便将注意力转移到鉴别构成mSSC生态位(支持并调节干细胞活性的微环境)的细胞类型上。首先进行新近分选的mSSC纯群及其五个祖细胞群的微阵列基因表达分析：(i)BCSP；(ii)Thy；(iii)6C3；(iv)BLSP；及(v)HEC。这些基因表达分析的目的是鉴别可调节mSSC及其子代的活性的信号传导途径的受体(图3D-E)。
为了说明这些细胞的基因表达谱，使用Gene Expression Commons，即一个将微阵列数据针对可从美国国家生物技术信息基因表达综合数据库中心(National Center forBiotechnology Information Gene Expression Omnibus)(NCBI GEO)公开获得的微阵列数据大集合(n＝11,939)进行归一化的平台。因此，生成代表基因表达倍数变化的热图并用独创性途径分析软件(Ingenuity Pathway Analysis Software)(QIAGEN Redwood City)进行途径统计分析。
*mSSC及其子代差异性地表达转化生长因子(TGF)β(具体地说，骨形态发生蛋白(BMP))和WNT信号传导途径中涉及的许多受体以及这些途径的同源成形素，包括 BMP2、TGF-β3及Wnt3a(图3D-E)。这些结果提示mSSC*及其子代中的自分泌和/或旁分泌信号传导可正调节其自身的扩增(图3F)。此外，单细胞RNA测序揭示了BMP2及其受体(BMPR1a)(图3A-C)在mSSC中的共表达，示出了mSSC中自分泌信号传导的潜能。
支持转录数据，外源性重组BMP2向培养基中的添加快速地诱导分离的mSSC的扩增，而用外源性重组TGFβ或TNFα对培养基的补充则不会(图3G、3H)。另外，mSSC 的体外增殖通过向培养基中添加重组gremlin 2蛋白(即，BMP2信号传导的拮抗剂)与对照相比得到显著抑制(图15A)。mSSC的子代表达BMP2信号传导途径的拮抗剂，如 Gremlin 2和头蛋白(图10A，右图)，提示由更多分化的骨骼谱系控制mSSC增殖的潜在负反馈机制的存在。具体地说，Thy表达Gremlin 2，且Thy和BLSP都表达头蛋白。因此，据推测Thy和BLSP亚群可在负反馈环中起作用以抑制BMP-2诱导的mSSC增殖，进一步提示自分泌和旁分泌信号传导可在mSSC中发生且其子代可调节其自身的扩增。假设全身内分泌调节以及自分泌和旁分泌调节在调节mSSC及其子代中可为重要的。全身激素、瘦素及促甲状腺激素(TSH)的同源受体的转录表达在从P3小鼠分离的成熟Thy 和BLSP亚组上选择性上调，而不是在BCSP或*mSSC群上(图10A)。此外，单细胞RNA 测序显示瘦素受体仅在从P3小鼠分离的Thy/BLSP亚组上在单细胞水平下表达(图15E (ii))。相比之下，所有这些亚群都具有这些瘦素或TSH受体的相应配体的极小转录表达 (图10C)。这些研究结果提示下游子代可充当全身内分泌信号与mSSC之间的中介物(图 10A、E)。发现对此假说的额外支持在于用重组瘦素生长激素(1μg/mL)培养Thy亚组与头蛋白和Gremlin-2(BMP-2信号传导途径的拮抗剂)的上调有关(图10D)。相应地，来自瘦素处理的Thy亚组的条件培养基抑制mSSC的增殖(图10B)。另外，在补充有重组瘦素生长激素(1μg/mL)的培养基中培养Thy细胞造成gremlin 2的表达增加，如通过免疫荧光染色所观察到(图10D(ii)-(iii))。此研究结果进一步表明下游祖细胞可充当全身内分泌信号与mSSC之间的中介物，将内分泌转化为旁分泌信号(图10E)。Thy和6C3细胞与由Foxa2标记的mSSC共定位并且可有助于由Foxa2标记的mSSC的生态位。由于已证明Thy和6C3亚组表达调节mSSC活性的信号环境的组分，所以假设Thy和6C3 亚群不仅像mSSC的子代而且像支持性生态位细胞一样发挥作用。
为了检验这一假说，设法确定Thy和6C3亚组是否与mSSC一起在体内共定位。然而，这需要找出独特的标记物，该标记物可通过免疫荧光-组织学将mSSC与这些亚群区分。因此，使用如上所述的Gene Expression Commons平台并且将Foxa2鉴别为一种细胞内因子，该细胞内因子由mSSC在最高水平下显著表达，由CSP显著较低表达，而不由任何下游骨骼祖细胞(图3I)、造血细胞或内皮细胞表达。一致的是，通过单细胞RNA 测序观察到Foxa2在mSSC上显著上调，在BCSP中则以低得多的水平，且在下游子代上几乎不存在(图15F(ii))。为了验证Foxa2在蛋白质水平下的mSSC表达，在透化的 mSSC中使用针对Foxa2的特异性抗体进行细胞内FACS，再次证实了mSSC亚组高表达Foxa2(图3K)。股骨切片的免疫荧光染色表明Foxa2+细胞定位于生长板中，与通过来自这些亚区域的解离组织的FACS分析检测这些区域中的mSSC一致(图1B)。在股骨生长板中，通过免疫荧光染色的Thy和6C3亚群定位于Foxa2+细胞附近，提示Thy和6C3 亚群作为mSSC的支持性生态位细胞的潜在作用(图3J、L)。软骨命运可偏向骨形成。在确定mSSC的构成性祖细胞形成mSSC的支持性基质生态位的一部分后，寻问mSSC衍生基质是否可能影响骨骼祖细胞的命运定向(图2G)。
观察到从RFP+小鼠中分离的CD200(+)骨骼亚组[CD45-Ter119-AlphaV+Thy+6C3-CD105+CD200+](图1F，群g)当在分离后移植到非荧光受体小鼠的肾囊下时主要被导向软骨形成；因此，将此细胞命名为定向软骨祖细胞 (CCP)(图4A和B)。然而，当RFP标记的CCP细胞(图2G)与GFP标记的BCSP共同移植时，它们分化为骨组织而不是软骨(图4C)。mSSC衍生谱系(包括BCSP、Thy、6C3、 BLSP及HEC)的基因表达分析显示mSSC及其大部分子代表达高水平的WNT3A、WNT4 及WNT5a(图3D)。
相比之下，CCP当单独移植时经历软骨形成分化，表达低水平的Axin1，表现出抑制的WNT信号传导。因此假设激活的WNT信号传导可参与软骨形成祖细胞向成骨命运的转变中。为了测试此可能性，再次将20,000个RFP标记的CCP细胞与20,000个 GFP标记的BCSP一起共同移植到肾囊下，所述BCSP具有局部Wnt卷曲受体介导的典型WNT信号抑制(通过用108-109个MOI单位的编码分泌型卷曲受体-2[SFRP-2]的慢病毒载体事先转导)(图4A)。因为当它们单独移植时，CCP细胞经历软骨形成分化、抑制骨发生，由此显示BCSP的成骨影响是WNT介导的(图4D)。这些结果提示WNT 相关的信号传导活动的梯度是确定骨骼祖细胞中的命运定向的可能机制(图2G)。
骨命运可通过VEGF阻断偏向软骨形成。在观察到BCSP和WNT信号传导可使注定为软骨的细胞转向骨形成后，接下来设法鉴别可能逆向选择性促进mSSC向软骨形成而非骨命运的因子。基于以下结果，假设VEGF信号传导在此命运决定中是关键的。通过比较纯化的mSSC的转录物组与定向骨骼祖细胞的转录物组，发现mSSC表达与软骨形成有关的许多关键基因，包括Runx2、Sox9、胶原2及胶原10，提示mSSC已被激发朝向软骨命运。单细胞RNA测序证实了mSSC中的此发现，显示高表达水平的Sox9和胶原2及低表达水平的Runx2和胶原10。纯化的mSSC当移植时最初还形成肥大软骨，之后通过软骨内骨化朝向骨和骨髓形成发展。
在骨关节炎模型中出现的证据表明HIF2信号传导失调造成VEGF表达增加，可能促使静息软骨细胞再进入肥大状态并恢复软骨内骨化。在体外用VEGF处理间充质基质细胞还促进培养的骨髓衍生的间充质基质细胞的钙化以及早期骨形成标记物如碱性磷酸酶的表达。因此，确定VEGF信号传导的抑制是否可通过阻断VEGF依赖性骨化促进移植mSSC的软骨形成分化(图5A)。在这些实验中，使用胎儿(E14.5)和出生后mSSC。前者的包含允许集中于一段时间的胚胎骨骼发育，其中VEGF信号传导在血管化中发挥关键作用，使得软骨能够钙化形成骨。通过静脉内注射施用109个噬斑形成单位(pfu)单位的编码VEGFR1受体(AdsVEGFR1)的可溶性配体结合胞外域(ECD)的腺病毒载体，造成可溶性VEGFR1ECD的肝脏转导和肝脏分泌到循环中并产生有效的全身VEGF拮抗作用。编码对照免疫球蛋白IgG2〈Fc结构域的腺病毒充当对照治疗。一天以后，将移植的完整E14.5前成骨胎儿股骨移植到这些小鼠的肾囊下，然后在3周以后取出组织(图 5A)。
来自Ad sVEGFR1处理的小鼠的移植物似乎能存活，但呈现(肉眼上)为淡色并且主要含有软骨组织(图5B：右边最上面两幅图；图5C)。相比之下，来自对照Ad Fc动物的移植物肉眼呈淡红色并且组织学检查显示软骨内骨化和由皮层骨包围的骨髓腔的形成 (图5B：左边最上面两幅图；图5C)。这些结果表明VEGF阻断可以骨发生为代价促进软骨形成，或许在mSSC定向的水平下。
为了测试VEGF抑制是否以骨形成为代价在mSSC谱系定向水平下促进软骨形成，如先前所述将mSSC从新生P3小鼠的肢体中分离，并且将这些中的20,000个移植到Ad sVEGFR1治疗的小鼠的肾囊下(图5A)。移植后三周，取出肾，并且进行用Movat五色染料染色的切片mSSC衍生组织的组织学分析。再次，如在胎儿全骨股骨移植体环境中，在用VEGF阻断处理的小鼠中的mSSC形成软骨而不是骨或骨髓(图5B：右边最下面两幅图；图5C)。相比之下，移植到对照小鼠中的mSSC经历软骨内骨化，形成骨和骨髓(图 5B：左边最下面两幅图；图5C)。
鉴于在胎儿股骨和mSSC移植体测定中VEGF阻断对骨发生的显著作用，惊人地发现VEGF受体(VEGFR；包括VEGFR1、2、3)以及配体VEGFA和VEGFB的表达在 mSSC及其子代(BCSP、Thy、6C3、BLSP、HEC亚组)中是极低至不可检测的(图5D：左图)。然而，VEGFC在祖细胞亚群中以高水平表达(图5D：左图)。另外，mSSC及其衍生物谱系表达高水平的神经纤毛蛋白1和2，神经纤毛蛋白用作某种形式的VEGF的受体，包括胎盘生长因子(PlGF)并且可溶性VEGFR1拮抗PlGF对NRP1的激活(图5D：右图)。因此，VEGF阻断可通过NRP1拮抗作用、而不是VEGF信号传导的直接抑制来影响mSSC及其子代(造成软骨形成，而不是骨)(图5A-C)。
由于全身VEGF阻断显著地刺激移植的胎儿原基及mSSC中的软骨形成，探讨软骨形成是否通过mSSC中的VEGF拮抗作用的间接或直接效应来介导。因此，探究在 NRP1/VEGFR1的(直接)外源性激活或失活之后，何种命运受到促进(软骨或骨形成)。将从GFP标记的小鼠新近分离的mSSC涂铺以便用sVEGFR1-Fc融合蛋白(5μg/mL)、可溶性NRP1胞外域(2.5μg/mL)及PlGF(0.5μg/mL)进行体外治疗。体外治疗一周后，将 20,000个mSSC移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下(图5E)。移植后三周，取出移植物并且注意到体外VEGF和PlGF信号传导的激动和拮抗作用都没有显著改变mSSC体内分化为骨的潜能，表明造成软骨形成命运促进的VEGFR拮抗作用的机制间接地通过环境、而非对mSSC的直接作用发生(图5F)。
然后探讨软骨形成的促进是否可在TGFβ信号传导的激活或抑制之后发生，据报道TGFβ信号传导参与了出生后软骨内成骨形成。通过机械解离和酶促解离及后续的FACS 将mSSC从GFP标记的小鼠中分离。然后在TGFβ(250ng/mL)或相反可溶性TGFβ受体(5μg/mL)存在下将这些细胞涂铺一周，之后移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下。移植后三周，取出这些移植物用于组织学分析。直接抑制TGFβ之后，发现这些移植物形成软骨和少量骨，反映了TGFβ信号传导的直接拮抗造成mSSC中软骨命运的促进。
BMP途径的操控可诱导mSSC在骨骼外位置中的从头形成。因为确定骨骼组织中的骨、软骨及基质群是衍生自mSSC及其子代，接下来探究其它组织类型是否含有骨诱导型细胞或载有静息mSSC的细胞，所述静息mSSC可被激活以经历骨发生。测试BMP2 作为可诱导这种骨发生的试剂。虽然BMP2的成骨性质是已知的并且其在临床整形外科手术中经批准以刺激骨发生，但BMP2介导成骨诱导的潜在生物机制尚未确定。观察到 BMP2可体外扩增mSSC，如上所详述(图3G、H)。
为了更透彻地理解BMP2的成骨作用，将含有3μg冻干重组BMP2的胶原海绵置于骨骼外位点中，皮下置于腹股沟脂肪垫中或置于肾囊下。放置之后4周对胶原海绵的采集揭示了大量骨质类骨质充满来自肾和皮下组织中的位点的骨髓(图6A-C)。此外，类骨质的骨髓内细胞的FACS分析揭示HSC的频率(图6B，末行)类似于“正常”成年股骨中所见的(图6B，首行)。这些数据显示BMP2诱导的骨在功能上类似于正常的骨(图6B)。通过FACS分析确定mSSC通常在皮下脂肪组织中不可检测到或极其稀少(图6C：右图)。相比之下，在植入后10天，在BMP2诱导的类骨质中见到大量的mSSC，而骨化仍在进行(图6C，左图)。
由于已确定mSSC及下游骨骼祖细胞在“正常”皮下脂肪组织中极其稀少，所以探寻有助于BMP2诱导的异位骨形成的骨骼祖细胞的来源。为了确定BMP2是否诱导原位细胞的骨骼转化或从骨组织中募集的循环骨骼祖细胞的迁移，采用一种联体生物模型(图 6D)。通过手术将肌动蛋白-GFP转基因小鼠与非GFP同类系小鼠融合以使得它们通过血管出芽及在连接区域中吻合而建立共用的循环***。联体生活后两周，在联体生物之间的共同循环已通过FACS分析证实之后，将含有3μg冻干重组BMP2(如上所述)的胶原海绵置于非GFP联体生物的腹股沟脂肪垫中。植入之后十天，取出海绵及周围组织并进行机械解离和化学解离以分离构成性细胞群。
通过FACs分析测定非GFP小鼠中GFP标记的细胞对异位骨形成的贡献，以便确定循环细胞是否有助于异位骨的发育。外植体的组织在采集时含有大量GFP标记的细胞，但FACS分析揭示移植物中的GFP标记的细胞仅为CD45(+)造血细胞(图6D，左图，上和下)，而不是骨骼祖细胞(图6D，FACS曲线图，mSSC细胞群在最右边示出)。存在于取出组织中的骨骼祖细胞群是完全GFP阴性的，提示循环骨骼祖细胞不有助于BMP2 诱导的异位骨(图6D，FACS曲线图，mSSC细胞群在最右边示出)。
这些数据表明BMP2诱导的骨发生涉及局部细胞反应，该反应足以诱导皮下脂肪垫中原始mSSC骨骼祖细胞的形成，从而造成可支持造血作用的异位骨的形成。由于已经证实BMP2可在皮下和肾囊下诱导异位骨形成，所以希望确定何种细胞类型可能经历这些骨骼外位点中BMP2介导的向mSSC的重编程。因此，进行从肾及皮下脂肪组织分离的悬浮细胞的FACS分析并且寻找能够区分为这些骨骼外器官所共有的细胞类型的标记物。发现肾脏和脂肪组织都含有大量表达Tie2和PDGFRα的细胞。Tie2表达已在内皮干细胞亚组、外膜细胞干细胞亚组及造血干细胞亚组中检测到，而PDGFR〈则在各种组织中表达。使用用GFP遗传标记表达Tie2的细胞且用RFP标记其它细胞的特定 Tie2Cre x MTMG报道基因小鼠，再次将含有3μg冻干重组BMP2的胶原海绵***腹股沟脂肪垫中并且在32天后采集植入的组织(图6E)。FACS分析揭示BMP2衍生的小骨明显掺有具有可见微管的GFP阳性Tie2衍生的骨细胞(图6F，高放大率插图)和Tie2阴性 RFP标记的骨细胞(图6F)。此研究结果提示Tie2阳性和Tie2阴性谱系都经历了BMP2 诱导的骨骼重编程。与这些观察一致，皮下Tie2(+)PDGFR〈(+)和Tie2(-)PDGFR〈(+) 细胞表达高水平的BMPR1a，BMPR1a是BMP2信号传导的主要受体(图7D)。
这些数据提示多种细胞类型可被BMP2诱导以引发mSSC的形成。BMP2与VEGF 抑制剂的共同递送足以诱导关节软骨在脂肪组织中的从头形成。虽然骨本身具有再生能力，但在其它类型的骨骼组织如软骨中再生的能力极低。如上所述，VEGF阻断间接地刺激mSSC形成软骨(图5A-C)。由于BMP2诱导可刺激mSSC扩增和形成(图3G-H，图 6C)，所以推测BMP2的mSSC诱导能力可与VEGF阻断联合以指导软骨从头形成。
为了测试此可能性，将BMP2处理的胶原海绵植入到小鼠的脂肪组织中，该小鼠已较早通过静脉内递送Ad sVEGFR1处理24小时(如图5中)或直接在胶原海绵中掺入可溶性VEGFR1ECD(50μg)(图7A)。一个月以后，取出海绵及周围组织。BMP2单独生成具有造血活性的骨组织(图7B：左图)。然而，具有全身或局部VEGF抑制的BMP2主要造成软骨形成(图7B：右图)。像在小鼠耳朵中的天然软骨一样，这诱导软骨含有高频率的 CCP，如通过FACS所检测(图7C)。此软骨可能来源于脂肪组织从头重编程为软骨形成命运，因为天然脂肪组织通常表达极低至不可检测水平的与软骨形成有关的基因，如 Sox9或Runx2(图7E)。
对用于维持骨骼组织的胚后期干/祖细胞所必需的遗传途径以及它们在干细胞水平下协调以保持骨骼生长和再生期间的骨骼模式的机制知之甚少。让情况更加复杂的是，关于骨骼祖细胞的来源和身份及其与原型间充质干细胞的直系关系仍有相当大的不确定性，已提出原型间充质干细胞为多种间充质组织类型(包括骨、肌肉、软骨及脂肪)的普遍存在的祖细胞。使用供体内遗传追踪克隆衍生组织的转基因“彩虹小鼠”模型，发现骨、软骨及基质组织实际上是克隆相关的。相反，几乎没有证据表明它们与脂肪、血管或骨骼肌组织共有相同的克隆来源，意味着这些组织可能在胚胎发生之后由其自身不同的干/ 祖细胞产生。
鉴别出生后骨骼干/祖细胞并且定义骨骼干细胞谱系树。在鉴别生成骨骼(骨、软骨及基质)组织的克隆群的存在之后，编译具有骨骼生成潜能的预先分离的干/祖细胞的谱系图以帮助解决关于骨骼干细胞和祖细胞中的谱系关系的不确定性(图2G)。此谱系图是由八个不同的细胞亚群组成，这些亚群具有不同的骨骼生成性质。这些亚群中的一些具有通过遗传谱系追踪所鉴别的近来描述的骨骼生成细胞类型的特征(参见Park等人 (2012)Cell stem cell 10,259-272；Mendez-Ferrer等人(1998)Radiographics:a reviewpublication of the Radiological Society of North America,Inc 18,1125-1136；Zhou等人 (2014)Cell stem cell 15,154-168)。
举例来说，Thy亚型选择性地表达高水平的CXCL12、瘦素受体及巢蛋白，其分别具有富含CXCL12的网状细胞、表达瘦素受体的细胞(LepR+)及表达巢蛋白的间充质干细胞的特点。与成年骨髓中的LepR+细胞是出生后骨和脂肪组织的主要来源的近期报道相反，我们的结果显示新生mSSC不表达LepR。此外，注意到mSSC及其子代仅生成骨骼而不生成脂肪组织。还发现Nestin-cre和MX1-cre标记的群与mSSC群重叠。
此研究代表了出生后骨骼干细胞及其下游祖细胞的首份报告。从机理上看，mSSC扩增和自我更新必须得到严格控制，通过信号传导分子的众多同源受体的表达所证明，这些信号传导分子属于大多数已知的信号传导途径，包括Hedgehog、BMP、FGF、TGF、 Notch等。特别是BMP2足以扩增培养中的mSSC。BMP2和4是由mSSC及大多数mSSC 衍生的亚组表达，其中它们可能经由自分泌和旁分泌循环介导存活和扩增。相反，mSSC 的下游子代如Thy和BLSP群还表达头蛋白和/或gremlin-2，其拮抗BMP信号传导。这表明mSSC及其一些子代形成其自身生态位的一部分，保持临界水平的促存活因子如 BMP2，而且还通过拮抗BMP信号传导保持骨骼生长在控制中。这些抑制信号可在损伤后受到阻抑，例如，观察到在诱导股骨骨折之后SSC数量、显著扩增，这在骨折愈合的最初阶段最明显。
指导mSSC从骨向软骨的命运决定。mSSC衍生的骨骼亚组之间的拮抗信号传导也似乎是骨骼亚群谱系定向为特别是骨或软骨命运的关键机理。当在早期骨骼祖细胞中拮抗VEGF信号传导时，骨命运受到抑制，而偏向于软骨命运。然而没有观察到VEGF 或VEGF受体在mSSC或下游骨骼亚组中的显著表达。相反，可见它们分别表达VEGF 和VEGFR同系物PlGF及神经纤毛蛋白。
指导骨骼祖细胞从软骨向骨WNT信号传导的命运决定也可在确定骨对比软骨形成中起作用，特别是偏向于骨。改变具体亚群中的WNT信号传导可指导微环境中其它亚群的骨骼命运。举例来说，有证据表明在与CCP(即，定向软骨祖细胞)共同移植的BCSP 中的WNT信号传导导致当置于肾囊下时CCP形成骨而非软骨。软骨命运可受到WNT 拮抗作用的促进并且这可由mSSC、BCSP及6C3+亚群介导，其表达高水平的SFRP-2，即典型的WNT信号传导的内源性拮抗剂(图3D)。
涉及软骨组织钙化的病理性疾患如骨关节炎可由mSSC生态位中的缺陷引起，这可能是由于WNT信号传导的激活和所带来的骨发生的促进。
进行多个高度纯化的造血干细胞和祖细胞亚组(包括HSC)以及主要造血谱系的定向祖细胞的基因表达分析，并且发现造血祖细胞表达与造骨作用有关的无数因子，包括BMP2、BMP7、TGFb1及Wnt3a(表1)。
表1：由骨骼祖细胞表达造血因子*
*括号中的数字代表按等级1-10的表达水平，其中10为最高水平。
这些因子的同源受体是由mSSC及骨骼衍生的祖细胞高度表达(图3D-E)。有趣的是，虽然mSSC生成的子代如Thy和BLSP选择性地表达循环全身激素(如瘦素、***、饥饿素及促甲状腺激素)的受体，但这些受体没有在HSC或造血亚组中高度表达(表2)。
表2：由造血祖细胞表达骨骼形成因子*
*括号中的数字代表按等级1-10的表达水平，其中10为最高水平。
因此，mSSC衍生的基质细胞构成连接全身内分泌调节与骨骼***和造血***的细胞界面。
mSSC的活性和命运决定取决于骨骼来源。我们的分析建立了用于询问基因回路的框架，该基因回路指导干细胞水平下的出生后骨骼发育。mSSC的任务在于保持生长及损伤后其恢复期间骨骼***的形状。mSSC活性的差异可能引起骨骼形状的许多差异。与此可能性一致，发现mSSC在功能上有异质性，并且在mSSC频率、集落形成潜能及谱系潜能方面存在相当大的差异，这取决于其所采集来的骨类型(图14)。
改变骨骼外生态位信号传导以诱导骨发生和软骨形成。由于大部分器官是多个组织类型的复合物，所以干细胞生态位可协调不同组织特异性驻留祖细胞的活性。调节生态位信号传导可通过诱导干细胞增殖刺激组织生长，如现在已在骨骼干细胞下观察到的并且在造血***中有所描述。生态位相互作用也可在保持谱系定向中发挥重要作用，例如，高水平的BMP2信号传导可支配局部脂肪微环境信号传导并且重新指定驻留的 Tie2(+)和Tie2(-)亚组经历骨发生。生态位相互作用也可决定mSSC的命运。通过与可溶性VEGF受体的全身或局部施加同时植入BMP2处理的胶原海绵，证明软骨可被诱导以完全通过操控骨骼外组织中的局部信号传导途径形成。
用可溶性因子诱导mSSC形成且随后调节mSSC生态位以控制其向骨、软骨或基质细胞的分化代表了在骨骼组织的治疗性再生中的范例转变。这种治疗模式还可扩展至共依赖性造血***，即使当驻留水平的内源性mSSC已被疾病或衰老所耗尽。
实验程序。除非另有说明，否则所有实验一式三份进行。动物实验包括每个实验组中一群组至少三只动物及至少三个对照受试者。对于移植体实验，针对每个mSSC/祖细胞移植体采集7-10只P3小鼠(例如，采集7-10只小鼠以获得20,000个干/祖细胞用于如下所详述的后续移植)。
小鼠。将小鼠根据斯坦福动物护理与使用委员会和美国国家卫生研究院(Stanford Animal Care and Use Committee and National Institutes of Health)指南饲养于斯坦福大学实验室动物机构(Stanford University Laboratory AnimalFacility)中。对 C57BL/Ka-Thy1.1-CD45.1(HZ)、C57BL/Ka-Thy1.1-CD45.1(BA)、 C57BL/Ka-Thy1.2-CD45.1(Ly5.2)及C57BL/Ka-Thy1.2-CD45.1(B6)、Rag-2/γ(c)KO、 C57BL/6-Tg(CAGEGFP)1Osb/J、Mx1Cre进行衍生并维持在实验室中。Rosa-Tomato Red RFP和Tie2Cre小鼠从杰克森实验室(Jackson Labs)获得并且建立繁殖集落。mTmG 小鼠获赠于Liqun Luo。将小鼠圈养在无菌微隔离器中并且不限量给予水和啮齿动物食物。
彩虹小鼠***。利用“彩虹小鼠”模型作为评价体内克隆-谱系关系以确定在包括基质、脂肪、骨、软骨及肌肉的骨中的间充质组织是否具有共同的祖细胞的手段。彩虹报道基因(R26VT2/GK3)小鼠使得我们能够在体内长时间追踪肢体中骨骼组织的各个细胞，该小鼠是多色Cre依赖性标记物***，其在ROSA基因座内载有四色(绿、蓝、黄、红) 报道基因构建体。重组之后，用四种颜色中之一随机地并永久地(遗传地)标记每个细胞，从而在组织内产生马赛克荧光图案。子细胞维持与来源细胞相同的颜色，以便克隆***产物被可视化为单一颜色的扩增区。将彩虹小鼠与普遍存在的ActinCreER驱动子杂交以便在施用他莫昔芬之后普遍标记并克隆追踪骨骼组织内的所有细胞。尽管两个相邻细胞有机会是相似颜色的，但我们实验室及其它组发现长时间的谱系追踪揭示了使用组织特异性或干细胞特异性报道基因所观察到的可靠的细胞读出。此外，因为这个测定可广泛用于追踪所有细胞类型，所以其允许甚至稀少且尚未鉴别的组织干细胞的克隆分析，所述干细胞可在胚胎/出生后发育期间被激活，这不会使用现有干细胞报道基因被揭示。
为了精确对克隆计数，利用Image J软件分析平台(National Institute ofHealth, Bethesda)。在洛基干细胞研究所(Lokey Stem Cell Institute)的共享FACS设备中的FACS Aria II上进行荧光激活细胞分选(FACS)流式细胞术，分选分布的细节在下文中详述并且示于图1B、图1E、图6B、图6D、图7C及图13中。
成年和胎儿骨骼祖细胞的分离和移植。将骨骼组织从P3GFP标记的小鼠切下并通过机械解离和酶促解离进行解离。具体地说，将组织置于补充有DNA酶的胶原酶消化缓冲液中并且在37℃下在持续搅动下培育40分钟。胶原酶消化和中和之后，通过重复吸吹轻轻地研磨未消化的材料。将总的解离细胞经由40m尼龙网过滤，在4℃下在200g 下沉淀，再悬浮于染色培养基(2％在PBS中的胎牛血清)中，用大鼠IgG阻断并用针对 CD45、Tie2、AlphaV整联蛋白、CD105、Thy1.1、Thy 1.2、6C3及CD200的荧光染料缀合的抗体染色以便通过荧光激活细胞分选进行分级分离。
将分选和未分选的骨骼祖细胞沉淀，再悬浮于2ml基质胶中，然后注射到8-12周龄麻醉的免疫受损的Rag-2/γ(c)KO小鼠的肾囊下。将GFP标记的6周龄成年小鼠的骨切下，通过研钵和杵轻轻地压碎，且随后在37℃下，在持续搅动下于含有DNA酶的胶原酶缓冲液中消化40分钟。胶原酶处理之后，通过重复吸吹轻轻地研磨未消化的材料。将总的解离细胞经由40μm尼龙网过滤，在4℃下在200g下沉淀，再悬浮于染色培养基(2％在PBS中的胎牛血清)中，用大鼠IgG阻断并用针对CD45(Biolegend,San Diego, CA)、Tie2(eBioscience,SanDiego,CA)、AlphaV整联蛋白(eBioscience,San Diego,CA)、 CD105(eBioscience,SanDiego,CA)、Thy1.1(eBioscience,San Diego,CA)、Thy 1.2 (eBioscience)、6C3(Biolegend,San Diego,CA)及CD200(Biolegend,San Diego,CA)的荧光染料缀合的抗体染色以便通过流式细胞术分选进行纯化。
将用于BCSP共移植实验的CCP从其以最高频率存在的胸骨和耳朵中分离。CD200用于富集用于大部分这些实验的CCP。将分选和未分选的骨骼祖细胞沉淀并且再悬浮于2ml基质胶中，然后注射到8-12周龄麻醉的Rag-2/γ(c)KO小鼠的肾囊下。在初始实验中，注意到来自胎儿肢体的最早的骨骼生成群是Thy、6C3和CD105三阴性的。“三阴性”(TN)细胞在体外和体内生成CD105+、及Thy和6C3+/-细胞，并且还至少在体外自我更新。因此，TN群是我们最早针对mSSC命名的并且这些结果以微阵列转录数据示出。观察到CD200似乎细化TN的集落形成单位活性且因此，对具有图2G中所述的免疫表型的mSSC进行包括单细胞RNA测序的近期实验。类似地，定向软骨祖细胞(CCP) 的免疫表型进一步通过观察CD200在骨骼生成干/祖细胞的进一步细分级分离中的重要性来细化。
转录表达图谱。对mSSC、BCSP、Thy(+)、6C3(+)、HEC的高度纯化的二次分选群以及骨髓间充质基质细胞的B细胞淋巴细胞刺激群(BLSP)及HSC、MEP、GMP和 CLP进行微阵列分析。使用从出生后3天的小鼠中分离的细胞以非依赖性分选形式分选每个群。根据制造商说明书，用RNeasy微型试剂盒(RNeasy Micro Kit)(Qiagen, Germantown,MD)分离RNA。用RiboAmp RNA扩增试剂盒(Arcturus Engineering, Mountain View,CA)扩增RNA两次。将扩增的cRNA经链霉亲和素标记，片段化，并且如制造商(Affymetrix,Santa Clara)所推荐与Affymetrix 430-2.0阵列杂交。用运行GCOS 1.1.1.软件的Gene Chip Scanner 3000(Affymetrix)扫描阵列。将原始微阵列数据提交给 Gene Expression Commons，其中数据归一化是针对通用参考(Common Reference)来计算，该通用参考是可从美国国家生物技术信息基因表达综合数据库中心(NCBI GEO)公开获得的微阵列数据大集合(n＝11,939)。通用参考的Meta分析还提供在阵列上每个探针组的动态范围，并且在同一基因存在多个探针组的情况下，将具有最宽动态范围的探针组用于分析。Affymetrix小鼠基因组430 2.0阵列包括45,101个探针组，其中17,872个注释基因是可测量的。表示基因表达倍数变化的热图在Gene Expression Commons中生成。使用Ingenuity Pathway Analysis软件(IPA,Ingenuity Systems,Qiagen,Redwood City, CA)进行途径水平统计比较。
软骨内骨化的组织学分析。将切下的样本在4℃下固定于2％PFA中过夜，然后在 4℃下在0.4M的于PBS(pH 7.2)中的EDTA中脱钙2周。接着处理样本以包埋于石蜡(通过在乙醇或二甲苯中脱水)或OCT(通过在蔗糖中低温保护)中并切片。根据各个实验，用新近制备的苏木精和曙红、Movat改良的五色染料或茜素红染料染色代表性切片。
免疫荧光术。根据制造商说明书，使用M.O.M.免疫检测试剂盒(VectorLaboratories, Burlingame,CA)在冷冻保存的异位类骨质本上进行免疫荧光术。简言之，将样本用阻断试剂处理，接着在4℃下用单克隆抗体探测过夜。然后将样本用PBS洗涤，用alexa-染料缀合的抗体探测，洗涤，加上盖玻片，并用Leica DMI6000B倒置显微镜***成像。根据制造商说明书，使用M.O.M.免疫检测试剂盒(Vector Laboratories,Burlingame,CA) 类似于冷冻保存样本在组织培养的细胞样本上进行免疫荧光术。简言之，将在96孔培养板的6孔中培养的细胞用PBS洗涤并在4℃下固定于2％PFA中过夜。将样本用阻断试剂处理，接着在4℃下用单克隆抗体探测过夜。然后将样本用PBS洗涤，用alexa-染料缀合的抗体探测，洗涤，浸没于PBS中并用Leica DMI6000B倒置显微镜***成像。
以下小鼠抗原的单克隆抗体是从许多供应商(其中每个相应供应商列在抗原之后的括号中)获得的：小鼠胶原II(Abcam,Cambridge,MA)、骨钙素(Abcam,Cambridge, MA)、周脂素A(Chemicon/EMD Millipore,Billerica,MA,USA)、CD31(Abcam, Cambridge,MA)、CD45(Biolegend,San Diego,CA)、瘦素受体(R&D,Minneapolis,MN)、gremlin 2(Biorbyt LLC,San Francisco,CA)、Foxa2(Abcam,Cambridge,MA)、6C3 (Abcam,Cambridge,MA)、Thy(Abcam,Cambridge,MA)、DAPI(Abcam,Cambridge, MA)以及CD31(Abcam,Cambridge,MA)。Alexa-染料缀合的二抗购自Molecular Probes (Molecular Probes,Eugene,Oregon)。
细胞培养。将骨骼祖细胞在低O2(2％大气氧、7.5％C O2)条件下在含有10％FCS、1％青霉素-链霉素的MEMα培养基中体外培养。首先将培养容器用0.1％明胶包被。提取出培养细胞用于分析或通过用具有2mg/ml胶原酶II的M199(Sigma-Aldrich,St. Louis,Missouri)孵育进行传代。对于mSSC集落形成测定，将单个细胞分选到96孔板的各孔中并培养2周。此时，在相差显微术下检查样本并且将克隆环用于量化。随后提取出细胞用于染色和FACS分析。
联体生活。如所述进行联体生活。简言之，将年龄和性别匹配的GFP小鼠与相同B6/Ka背景的非GFP小鼠选出用于联体生活。用吸入式麻醉使小鼠麻醉。在联体生物的右侧与伴侣的左侧，从前腿基部到后腿基部在皮肤中制造一个切口。将前腿与后腿在关节处缝合在一起，而将皮瓣的背侧-背侧与腹侧-腹侧皱褶钉在一起。手术后施用镇痛。在两周联体生活之后，从尾部收集外周样品并且通过FACS评估联体生物血细胞嵌合状态。在外周血细胞嵌合状态达到1:1的比率(表明联体生物之间循环***完全融合)之后第三周将BMP2-胶原植入物移植到腹股沟脂肪垫的皮下脂肪中。
用BMP2进行的体内骨诱导。将10μg rhBMP2(R&D Systems,Minneapolis,MN) 重新悬浮于30μl无菌过滤的缓冲液(30mM谷氨酸钠、2.5％甘氨酸、0.5％蔗糖、 0.01％Tween80，pH4.5)中，然后施加于尺寸为3x 1.5x 1.5cm的胶原海绵(Helistat, Integra LifeSciences,Plainsboro,NJ)。将海绵冻干并移植到麻醉小鼠的皮肤下、到肾囊中或到大腿后面的肌肉中。
体外培养(TGFβ、BMP-2、TNFα)补充测定。将五千个mSSC(来源于GFP标记的小鼠)与常规培养基[具有10％FCS、1％青霉素-链霉素的MEMα培养基]或补充有TGFβ(5 ng/mL)、BMP-2(100ng/mL)或TNFα(10ng/mL)的常规培养基在低O2(2％大气氧、 7.5％CO2)条件下共培养。培养后14天，使用胶原酶消化缓冲液(如前所述)提取出细胞用于染色和FACS分析。
由瘦素处理的Thy(+),BLSP群生成条件培养基。将1万个新近分离的Thy(+)和BLSP细胞在常规培养基中培养三天直到实现80％细胞汇合。在此阶段，将培养基更换为补充有以下三种重组生长因子的无血清培养基：IGF(125ng/mL)、FGF2(100ng/mL) 及硫酸肝素(10U/mL)，其补充有或没有重组瘦素(1μg/mL)。随后培养细胞14天，此时收集条件培养基。接着将10,000个新近分选的mSSC在不同条件下涂铺：(i)对照常规培养基；(ii)来自用瘦素处理的Thy(+)亚组的条件培养基；(iii)来自用无血清培养基处理的 Thy(+)亚组的条件培养基；(iv)来自用瘦素处理的BLSP亚组的条件培养基以及(v)来自用无血清培养基处理的BLSP亚组的条件培养基。然后收集这些细胞用于FACS分析以测定在实验/对照培养基中培养之后存在的mSSC数量。
定量逆转录聚合酶链式反应。根据制造商方案，使用RNeasy迷你试剂盒(RNeasyMini Kit)(Qiagen,Valencia,CA)提取来自培养细胞的RNA。进行逆转录并且通过定量实时聚合酶链式反应(qRT-PCR)，使用施加的Applied Biosystems Prism 7900HT序列检测***(Applied Biosystems,Foster City,CA)和SYBR Green PCR Master Mix(AppliedBiosystems)检查基因表达。使用外部GAPDH标准曲线和LightCycler软件计算PCR产物的量。所有值都是基于相应样品中的GAPDH表达来归一化。用于所检查的基因(头蛋白、Gremlin 2、瘦素受体)的特异性引物基于其PrimerBank序列。
VEGF信号传导的抑制。(i)全身VEGF抑制.为了研究VEGF信号传导的全身抑制，在移植之前24小时，向指定的受体小鼠静脉内注射109pfu单位的编码可溶性鼠VEGFR1 胞外域(Ad sVEGFR1)的腺病毒载体，造成了肝脏感染和VEGF/PlGF信号传导的此有效拮抗剂向循环中的分泌。对于阴性对照，使用编码鼠IgG2〈Fc免疫球蛋白片段的腺病毒(Ad Fc)。这些试剂在别处描述。(ii)局部VEGF抑制为了研究VEGF信号传导的局部抑制，将50μg可溶性VEGFR1(R&D Systems,Minneapolis,MN)连同含有3μg冻干重组BMP2的胶原海绵一起置于小鼠腹股沟脂肪垫的皮下脂肪中。
股骨骨折。从腹股沟褶痕到右股骨的膝盖处制造一个切口。手动髌骨脱位之后，将髓内杆***麻醉的8周龄C57BL6野生型小鼠的股骨中。使用直微剪制造双皮层横向骨干中骨折。手动重新定位髌骨并且放置缝合线以防止后续脱位。用尼龙缝合线闭合皮肤切口并且使小鼠接受手术后镇痛。在骨折放置后第3天、第7天及第21天处死小鼠。采集胼胝并且通过机械解离和酶促解离及后续的FACS分级分离分离构成性细胞，如上文所详述。未受伤的左股骨充当对照未受伤股骨。后肢辐照将8周龄C57BL6小鼠置于放射屏蔽中，以使得仅后肢暴露于放射。小鼠双侧后肢接受单剂量的800rads(8Gy)。辐照后12小时进行骨折的手术放置(如上所述)。
单细胞RNA测序。如先前所述进行单细胞RNA测序。
实施例2
人SSC
如实施例1中所论述，使用转基因“彩虹小鼠”模型(对于克隆衍生组织的体内追踪)，发现骨、软骨及基质组织在小鼠中是克隆相关的。相反，无证据表明它们与脂肪、血管或骨骼肌组织共有相同的克隆来源，意味着骨、软骨及基质组织在胚胎发生之后由其自身不同的干/祖细胞产生。我们的人骨骼干/祖细胞数据显示在胎儿及成年骨骼组织中存在hSSC及其下游祖细胞。
分析包括对从胎儿及成年人组织新近分离的原代细胞进行的基因组研究、分化潜能、谱系追踪。已确定肾内囊下位置是供移植的骨骼生成细胞植入的新的骨骼外位点。结合此项技术定义用于在小鼠研究中检查干/祖细胞的特定预先分离的细胞亚组的命运潜力的功能测定。细胞的囊下肾囊移植先前已使得能够鉴别(i)支持成年HSC所需的骨髓生态位的最少细胞组分及(ii)具有引发全功能HSC生态位形成能力的来自小鼠胎儿肢骨的细胞亚组。优化条件以便用慢病毒载体转导新近分离的胎儿及成年骨骼祖细胞，使得能够监视异种移植物模型中的细胞亚组并且使用敲低和过度表达方法评估关键遗传途径，这些技术知识是人细胞分析的一部分。
人骨骼干细胞(hSSC)及其下游谱系限制的祖细胞的鉴别。实施例1中所述的策略用于通过使用FACS的预期分离从人胎骨骼组织中纯化特定的骨骼生成群。通过机械解离和酶促解离从17周人胎股骨的生长板中分离细胞并且分析它们对应于血管谱系和造血(CD45、CD235、Tie2、CD31)谱系上存在的那些表面标记物的表面标记物(图16a-c)。通过将解离的人胎骨骼细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊中，证实了当体内移植时仅对 CD45、CD235、Tie2及CD31呈阴性的细胞具有内在骨骼生成活性(图16c右图)。
对[CD45(-)CD31(-)Tie2(-)CD235(-)]解离的胎儿骨骼细胞的基因表达分析鉴别了额外的标记物，包括CD146、PDPN、CD73及CD164，其进一步将人胎股骨细胞分离到不同群中，然后将其移植到肾囊中以测定其内在的骨骼生成潜力(图16b-c)。发现生长板具有高频率的[CD45-CD235-Tie2-CD31-PDPN+CD146-]细胞(下文称为[PDPN+/146-]细胞)，其显示出CD164和CD73的差异表达。这些标记物的差异表达进一步使得我们能够将[PDPN+/146-]群细分级分离为三个群：一个能够软骨形成的单能亚组 [PDPN+CD146-CD73-CD164-]、一个能够骨发生的单能细胞亚群 [PDPN+CD146-CD73-CD164+]及一个能够软骨内(骨和软骨)骨化的多能 [PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞。
在所检查的不同群中，[PDPN+CD146-CD73+CD164+]亚组选择性地产生最高频率的集落形成单位(CFU)。另外，在体外集落形成测定之后，发现从这些集落重新分离的 [PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞具有连续的CFU形成能力。因此，数据显示 [PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞具有干细胞在体外自我更新的标志能力。
重要的是，发现[PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞可从38-73岁患者的髋关节置换术之后收集的成年股骨头样本中分离。由于髋关节置换术非常常见并且在全球大多数主要医疗中心常规进行，所以股骨头样本构成了容易获得的材料来源以便参与到SSC研究中和供临床使用(图16d和e)。胎儿和成年衍生的[PDPN+CD146-CD73+CD164+]细胞能够在体外生成所有其它骨骼亚组(图17a-b)。
进一步在体内追踪[PDPN+CD146-CD73+CD164+]hSSC的克隆骨骼生成活性。追踪从hSSC的体内克隆形成，这些hSSC是用编码红色、绿色或蓝色(RGB)荧光蛋白的慢病毒基因本体(LeGO)载体进行转导。根据附加颜色模型，各个RGB标记的细胞展现出各种各样独特且高度特异性的颜色。颜色编码在细胞***之后保持稳定，且由此促进体内和体外的克隆追踪(图17c)。数据证明hSSC在慢病毒转导之后可在体外和体内形成克隆(图17d-e)。
来自胎儿和成年组织的人数据指示骨、软骨及基质(hSSC，hSSC)体外的自我更新克隆前体，由以下免疫表型[PDPN+CD146-CD73+CD164+]定义。结果表明人骨骼生成祖细胞是多样化的，具有不同的表面标记物分布和骨骼命运，如在造血作用中。成年及胎儿衍生的hSSC被预先分离用于通过移植到肾囊中的功能分析以便测定其内在骨骼生成潜力，并且还移植到免疫缺陷小鼠的股骨腔中以便重新评价其在正常骨骼生成微环境中的分化潜能。
Gene Expression Commons平台将RNA微阵列数据针对通用参考进行归一化，该通用参考是可从美国国家生物技术信息基因表达综合数据库中心公开获得的微阵列数据大集合(n＝11,939)。此创新的算法***使得能够鉴别额外的细胞表面标记物以将成骨相关基因、软骨形成相关基因或纤维母细胞相关基因与特异性表面标记物蛋白相关联。这些标记物可以解析具有特征性集落形成能力和发育命运的不同祖细胞亚组。在人SSC谱系图中新近解析的骨骼生成祖细胞在体内分化为骨骼组织的发育命运通过将其移植到小鼠异种移植物模型中的肾囊下来决定。用慢病毒载体转导新近分离的骨骼干/祖细胞并且在体内遵循每个移植细胞的克隆性(图17d)。
预测hSSC[PDPN+CD146-CD73+CD164+]通过一系列体外和体内阶段直系生成所有祖细胞亚群(图18)。为了评价各个人骨骼祖细胞亚组生成下游亚型的比较潜能，将来自17周妊娠的股骨和成年股骨头的FACS纯化的、慢病毒标记的干细胞和祖细胞在(i) 体外和(ii)体内测试。
体外：将各个慢病毒标记的、新近分选的hSSC移植(连同5,000个作为饲养细胞的非标记解离的胎骨细胞一起)到肾囊中持续14天时间，这时将其取出，通过FACS重新分级分离且随后重新移植到肾囊下用于功能读出。数据显示hSSC在连续集落形成测定上自我更新并分化(图17d和e)。在单细胞涂铺之后，hSSC预期(i)直系地生成下游祖细胞及(ii)在连续集落形成测定上自我更新并分化，与干细胞特征一致。
体内：将2,000个新近分离的胎儿和成年hSSC移植到RAGγ小鼠的肾囊中，然后在移植后2/4/8周或6个月取出植入的祖细胞用于分析。数据表明原始异种移植的人骨骼祖细胞在移植到肾囊下4周内可以生成成熟的骨、软骨及基质细胞，这些细胞能够支持 HSC。使用区分骨、软骨及基质组织的Movat五色染料染色，通过组织学分析展示人移植物的发育命运(图16c)。为了更好地将移植细胞的表型结果与不同的FACS定义的骨骼亚组的外观相关联，解离取出的移植组织并且通过FACS进行分析。
实验方法：
使用荧光激活细胞分选(FACS)分离人胎骨骼祖细胞：17周妊娠的人胎组织购自StemExpress(Placerville,CA,USA)。将人胎肢骨切下，在37℃下在连续搅动下在补充有DNA酶的胶原酶消化缓冲液中连续消化40分钟并且将总的解离细胞经由40mm尼龙网过滤，在4℃下在200g下沉淀，再悬浮于染色培养基(2％在PBS中的胎牛血清)中，并且用针对CD45、CD235ab、Tie2、CD31、CD146、PDPN、CD73、CD164的荧光染料缀合的抗体染色以便在FACS Aria II仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上使用70μm 喷嘴进行FACS分析。
使用荧光激活细胞分选(FACS)分离成年骨骼祖细胞：从髋关节置换术丢弃的股骨头组织由斯坦福大学矫形外科服务处(Stanford’s Orthopedic Surgery Service)获得。将骨骼组织从股骨头的不同区域(包括骨髓腔)处以机械方式移走，然后在37℃下在持续搅动下在补充有DNA酶的胶原酶消化缓冲液中连续消化40分钟并且将总的解离细胞经由40mm尼龙网过滤，在4℃下在200g下沉淀，再悬浮于染色培养基(2％在PBS中的胎牛血清)中，并且用针对CD45、CD235ab、Tie2、CD31、CD146、PDPN、CD73、CD164的荧光染料缀合的抗体染色以便在FACS Aria II仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上使用100μm喷嘴进行FACS分析。
细胞培养：将骨骼祖细胞在低O2(2％大气氧，7.5％CO2)条件下在预包被(0.1％明胶)的培养容器上的具有20％FCS的MEMα培养基内体外培养。将细胞提取用于分析/ 通过用胶原酶消化缓冲液孵育进行传代，接着用染色培养基中和胶原酶促活性并最终离心。
体外集落形成测定：如上所述，在单细胞培养之前对hSSC群进行FACS分选。使用在40x放大率下的倒置显微镜鉴别hSSC集落形成单位。评估集落的尺寸和细胞形态。
人骨骼祖细胞的高度纯化群的微阵列分析：通过FACS从17周妊娠的人胎肢体或成年股骨头获得每个细胞亚群用于供微阵列分析的RNA萃取，使用由我们实验室公开的技术并且一式三份(三种不同样品)重复进行以确保最大的精确度。根据制造商说明书，用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)分离RNA。使用二循环靶标记***进行mRNA扩增以供 3’体外转录，与人基因组U133加上2.0阵列杂交，并且根据制造商方案(Affymetrix)扫描。使用标准多芯片平均算法进行本底校正和信号归一化。
使用Gene Expression Commons(GEXC)的微阵列分析：将从微阵列分析获得的原始数据上传到GEXC，GEXC是为我们实验室创建自己数据集的***。GEXC平台将RNA 微阵列数据针对通用参考进行归一化，(可从美国国家生物技术信息中心公开获得的微阵列数据大集合(n＝11,939))并且生成表示基因表达倍数变化的热图。GEXC分析还提供进行差异表达分析以鉴别在一个群中而非另一个群中选择性上调的基因的直观的用户友好界面
将胎儿细胞和成年细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下：如先前所公开进行肾囊移植。简言之，在全身麻醉下进行钝性解剖以鉴别免疫受损的RAGγ小鼠的肾。RAGγ小鼠由于为成熟B、T及NK细胞形成所必需的Rag2聚合酶和IL2受体的纯合缺失而是免疫缺陷的。使用25号针的小型肾囊切开术允许钝头注射套管的***并且将2,000个悬浮于基质胶中的细胞置于肾囊下。肾实质与肾囊之间形成可见大疱以及缺乏显著出血或注射细胞的肾外漏出是成功注射的标准。然后缝合肾上方的上层组织与皮肤以便闭合。在放置后2/4/8周或6个月使用解剖显微镜取出移植物，并且在细胞的酶促消化及后续机械解离之后或通过组织学分析之后通过FACS进行分析。
体外骨骼祖细胞分化测定：如所述用慢病毒载体荧光标记新近分离的骨骼祖细胞。此过程利用靶细胞的同时转导，这些靶细胞具有编码红色、绿色或蓝色(RGB)荧光蛋白的三个慢病毒基因本体(LeGO)载体。根据附加颜色模型，各个RGB标记的细胞展现出各种各样独特且高度特异性的颜色。颜色编码在细胞***之后保持稳定，且由此促进体内和体外的克隆追踪(图17c-d)。转导8小时之后，将不同的转导群通过FACS分离，然后与单独的未分选/未标记的总祖细胞群或与不同的FACS分离的级分一起在MEMα培养基中共培养。
体内骨骼祖细胞分化测定：转导之后，将FACS分离的群包埋入基质胶(Corning,NY) 中并且如上移植到肾囊下。基质胶将移植细胞定位在肾囊下。移植之后一个月，将移植物从受体小鼠肾脏中取出，并且(酶促和机械)解离以用于FACS分析。固定取出的移植物部分并且为组织学分析做准备
组织学分析：将切下的样本固定，脱钙并且包埋入石蜡或OCT中用于切片并且使用Movat五色染料染色针对软骨内骨化进行染色。通过用分别针对脂肪细胞和纤维细胞的特异性分化标记物(如脂联素和平滑肌肌动蛋白)进行免疫染色来评价通过移植纯化群产生的潜在非骨骼命运。
实施例3
干细胞命运受特殊的微环境或其中驻留细胞的“生态位”的影响(图19a-b)。调节生态位信号传导可通过诱导干细胞增殖刺激组织生长，如在mSSC下所观察到的。生态位相互作用还可在维持谱系定向中发挥重要作用；举例来说，增强的局部BMP2信号传导可促进小鼠SSC的扩增和存活。关于hSSC的微阵列数据显示所观察到的参与BMP、WNT 及VEGF信号传导中的基因保守性还参与mSSC的存活、增殖及分化(图19c-e)。因此，在hSSC的生态位微环境中的自分泌和旁分泌信号传导***调节其扩增、活性及分化(图 19b)。特定的外源性成形素如BMP2、WNT及VEGFA的应用可以模拟生态位信号传导，造成hSSC在最小条件下的存活和/或增殖。或者，BMP2、WNT或VEGF的其它组合可促进SSC向特定的骨骼命运如骨、软骨或基质的分化。
对FACS纯化的人骨骼干/祖细胞的比较微阵列分析鉴别了在hSSC及粗的祖细胞群中明显上调的特定基因。数据显示BMP2在hSSC中的高转录表达，反映了我们的小鼠研究中所见的(图19d)。另外，参与WNT和VEGF依赖性信号传导途径的基因的高转录表达见于hSSC及其下游衍生的祖细胞中，类似于在小鼠骨骼祖细胞中的研究结果(图 19e)。相反，在hCP(人软骨形成祖细胞亚组)中观察到减少的VEGF表达。这与VEGF 拮抗作用通过内源性和诱导的小鼠SSC促进软骨细胞分化的观察结果一致(图20e)。 BMP2、WNT及VEGF途径高度参与调节小鼠和人SSC的扩增、形成及分化(图19f)。
确定人祖细胞亚组是否可维持hSSC在最小条件下的存活与增殖。体外：将慢病毒荧光(例如GFP)标记的基质亚组与已用不同颜色(例如RFP)标记的新近采集的hSSC在无血清条件下共培养。共培养两周时间之后，通过FACS测定hSSC的相对百分比以确定具体的基质亚组维持人骨骼干/祖细胞在最小条件下的存活与增殖的能力。体内：不同基质级分影响hSSC活性的能力是通过以下操作直接在体内测试的：将100-200个差异性荧光蛋白标记的hSSC与不同基质亚组共同移植到RAGγ小鼠的肾囊下，然后在一个月以后取出植入的组织以用于解离和通过FACS/组织学进行分析。在此测定中移植了 100-200个hSSC。不同祖细胞亚型的全身分布允许最小体内条件的鉴别，该条件是人干 /祖细胞的存活/增殖所需的。不同的人骨骼祖细胞亚组维持hSSC在最小条件下的存活与增殖。
BMP2、WNT3A及VEGF单独或以组合形式调节人胎儿与成年骨骼干/祖细胞在体外和体内于最小条件下的维持、扩增及分化的作用。不同hSSC生态位途径的作用是使用可商购获得的纯化重组因子(BMP2、WNT及VEGF)，通过将其作为单个试剂或匹配其在hSSC上特异性同源受体的表现的特定组合施用于培养(在无血清培养基中)中的 hSSC来直接评价，如通过GEXC的微阵列分析所示。使用单细胞RNA测序来验证参与 BMP2、WNT及VEGF途径中的关键基因的表达(图19f)。
体内：通过将hSSC与BMP2、WNT及VEGF的贮库直接组合来移植，在hSSC 上测试这些因子的组合。为了评价BMP2、WNT及VEGF候选组合的原位活性以及完整hSSC环境作为骨骼基质的潜在改良效果的作用，将在完整胎肢原基(例如趾骨)移植之后建立的完整异种移植的人胎骨用连接到可植入的渗透泵的小导管皮下植入，该渗透泵以速率受控制的每日递送量施用BMP2、WNT及VEGF或溶剂/PBS对照(而非超生理贮库递送，其可导致成形素的突释)。测定治疗的和未治疗的人胎儿肢体的大体形态并且通过组织学测定或解离以供FACS分析来测定hSSC及下游骨骼亚组的相对丰度的转变。
使用在基质细胞或其在hSSC中的相应受体中慢病毒介导的信号传导配体表达的沉默来进一步评价在具体的hSSC-生态位相互作用中的关键信号传导途径。
实验方法：
用于在体外和体内与基质亚组的共培养的hSSC的慢病毒标记：通过用(GFP、RFP或CFP)慢病毒转染对hSSC进行荧光标记。转导8小时之后，通过FACS分离不同的GFP、RFP或CFP转导群。这使得能够观察hSSC与基质群之间在体外和体内的功能相互作用。
高度纯化的人骨骼祖细胞群的微阵列分析：进行微阵列分析并且使用GEXC分析数据。使用hSSC与骨骼生态位其它细胞组分之间的GEXC细胞-细胞相互作用作图。鉴别表达配体或参与BMP、WNT及VEGF信号传导的基质细胞。
通过单细胞RNA测序进行的单细胞基因表达分析：为了确定BMP2、WNT及VEGF 途径基因在单细胞水平下的表达模式，经分离纯化的hSSC利用C1微流体***(Fluidigm) 捕获单个细胞/孔。C1***使用微流体回路来捕获单个细胞，接着以全自动方式进行细胞裂解，RNA分离、cDNA制备及cDNA扩增。使用Nextera-XT试剂盒(Illumina)，使用从各个细胞扩增的cDNA制备文库并且使用Nextseq-500平台(Illumina)测序以获得～10,000,000-15,000,000个2×150碱基对的配对末端读段/细胞。
hSSC与基质亚组的共培养：将慢病毒转导的差异性荧光标记的基质亚群与新鲜采集的hSSC在无血清条件下共培养。共培养一周之后，通过FACS测定hSSC的相对百分比以确定具体的基质亚组维持hSSC在最小条件下存活与增殖的能力。
在基质亚组存在下hSSC性能的FACS分析：在(差异性荧光标记的hSSC与不同基质祖细胞)共培养一周之后，通过FACS分析测定hSSC的相对百分比，然后分选并体内移植以便确定特定的基质细胞亚型是否可以在体内维持、扩增或将hSSC分化为具体的骨骼谱系。
将细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下：直接共移植测定：将100-200个hSSC与当体外测定时发现影响hSSC的基质亚组直接在体内共移植。取出移植物并且通过FACS 来分析。
使用细胞因子以在体外评估基因功能并在体内操控细胞功能：为了体外评估基因功能并评估所鉴别的关键调控基因的作用，将hSSC在细胞因子生长因子(例如BMP2、 WNT及VEGF)存在下共培养。根据每批生长因子所测量的活性水平，按照制造商推荐来确定这些细胞因子生长因子的最佳浓度。集落形成测定允许测量BMP2、WNT及 VEGF的特定组合调节hSSC扩增、分化及存活的效果。
使用慢病毒的在hSSC和基质亚组中的基因沉默：为了评估差异性调节并为调节hSSC与生态位细胞组分之间的相互作用中的生态位所必需的特定基因的作用，使用 shRNA慢病毒介导的基因抑制使参与BMP2、WNT及VEGF信号传导的基因沉默。使用在基质细胞或其在hSSC中的相应受体中慢病毒介导的信号传导配体表达的沉默来评价在具体的hSSC生态位相互作用中的关键信号传导途径。
用重组成形素体外和体内操控hSSC：使用如上所述的微阵列分析鉴别控制hSSC分化命运的关键调节途径的鉴别。这允许鉴别细胞因子生长因子如BMP2、WNT及 VEGF的组合以便用hSSC进行体外和体内分析。将细胞与重组BMP2、WNT及VEGF 共培养且两周以后，将细胞(i)使用FACS进行分析或(ii)移植到免疫缺陷小鼠的肾囊下。一个月后，取出这些移植物以便使用组织学与免疫荧光术的组合评估细胞因子对hSSC 分化与增殖的作用。通过将成形素贮库与hSSC共同移植(例如，通过植入缓慢释放 BMP2、WNT及VEGF的水凝胶)，在体内测试重组成形素对hSSC的作用。
胎儿肢体原基的移植：将胎肢原基从10-12周妊娠的人胎趾骨中分离。在麻醉下，将原基移植到RAGγ小鼠的背侧皮下间隙中。1个月之后，取出原基并且使用组织学评估形态。
在体内向胎儿原基的细胞因子递送：通过使用皮下渗透泵局部递送细胞因子生长因子(例如BMP2、WNT及VEGF)来操控异种移植的人胎肢原基的模式和生长。泵购自 Alzet(Cupertino,CA)。为了建立皮下人胎骨异种移植物，将人骨原基从购自 StemExpress(Placerville,CA,USA)的10-12周胎龄的人胎组织上切下。将切下的原基皮下移植并且用单根缝线固定在适当的位置。将渗透泵的导管置于移植物旁并且还使用单根缝线固定。一个月的治疗之后，取出原基以便通过组织学和免疫荧光术进行分析。通过与未用细胞因子治疗的原基相比在功能上评估细胞因子治疗的效果。
组织学&免疫荧光术(IF)：如先前所述，使用来自Vector Laboratories(CA)的M.O.M. 免疫检测试剂盒对冷冻保存的异位骨样本进行IF。简言之，将样本用阻断试剂处理；在 4℃下用单克隆抗体探测过夜；用PBS洗涤；用alexa染料缀合的抗体探测；洗涤；加上盖玻片；并用Leica DMI6000B倒置显微镜***成像。类似于用于冷冻保存样本的操作对组织培养细胞样本进行IF。(图像分析：共焦显微术，Zeiss 780共焦***)。
血管信号传导的全身抑制：为了研究VEGF抑制对骨骼生态位调节且具体来说对软骨形成命运促进的作用，在移植之前24小时，向指定的受体小鼠静脉内注射109pfu单位的编码可溶性鼠VEGFR1胞外域(Ad sVEGFR1)的腺病毒载体，造成了肝脏感染和 VEGF信号传导的此有效拮抗剂向循环中的分泌。对于阴性对照，使用编码鼠IgG2αFc 免疫球蛋白片段的腺病毒(Ad Fc)。移植后3周取出移植物。
实施例4
用于人脂肪组织有效原位重编程为骨、软骨或骨髓基质的条件.用可溶性因子诱导 SSC形成且随后调节SSC生态位以指定其向骨、软骨或基质细胞的分化代表了在骨骼组织的治疗性再生中的范例转变。SSC形成的原位诱导在小鼠脂肪组织中是可能的，并且BMP2可以触发人脂肪组织中SSC形成的原位诱导(图20a-c)。这种治疗模式扩展了治疗骨骼缺损或退化的能力，即使当驻留水平的内源性SSC已被疾病或衰老所耗尽。脂肪是天然丰富的并且提供可被重编程为骨骼祖细胞的间充质细胞的容易获得的来源。这个策略具有用于骨骼疾病如骨关节炎和骨质疏松症的巨大转化潜力(图21)。
特定浓度的BMP2可触发驻留在脂肪组织中的非骨骼间充质细胞中的骨骼生成转录程序，如小鼠中所示。这些脂肪衍生诱导的SSC(iSSC)可接着用额外因子(WNT、VEGF) 指导朝向特定的骨骼命运(例如骨、软骨或骨髓基质)以用于原位骨骼组织治疗性再生。脂肪衍生的基质细胞与SSC诱导的BMP2和SSC指定的生态位因子如(WNT和VEGF) 的组合的递送将最大化损伤位点处诱导的骨骼组织形成。
人脂肪衍生基质表达BMPR1B，表明它们响应于BMP2信号传导(图20a，上)。当在Ragγ小鼠中用0.3mg/ml BMP2皮下移植时，未分选的造血耗尽的人脂肪基质细胞 (hASC)有效地形成骨(图20c)。这些数据支持使用BMP2来诱导脂肪衍生的细胞中的 hSSC。
RhBMP2蛋白可(i)在小鼠中原位或(ii)当hASC与BMP2共移植时诱导脂肪组织中的SSC形成(图20c)。测定hASC中诱导hSSC形成所必需的BMP2的最佳浓度：通过磁性激活细胞分选耗尽造血细胞之后，将106个新近分离的hASC再悬浮于含有增加浓度(从1μg/ml至1mg/ml)的rhBMP2的基质胶中，最终总体积为20μl，以供皮下移植到RAGγ肌动蛋白-CFP转基因小鼠中。每隔一周取出移植物用于通过Movat五色染料的组织学分析和针对人骨骼祖细胞的FACS。BMP2诱导的mSSC经历软骨内骨化，从而在第一周内造成软骨形成且到第四周造成骨/骨髓形成。每隔一周取出移植物以测定每测定浓度的BMP2诱导骨形成的速度。在测定BMP2诱导骨的最佳浓度之后，将每批 100x活性单位与其它骨骼调控因子(例如VEGFR、WNT)共同注射以确定进行BMP2诱导的软骨形成或骨的能力(图20d和e)。
脂肪组织中的多种不同细胞类型可能能够经历BMP2诱导的造骨作用。分辨在人脂肪组织中这些细胞类型的身份可阐明BMP2介导的骨诱导的机制并且揭示对此反应工程化以使患病或损伤的骨骼组织再生的新方向。不同的hASC亚组表达BMPR，表明它们对BMP介导的信号传导有反应。在用BMP2补充培养基之后，hASC被诱导以表达在 hSSC及下游祖细胞(hBCSP)亚组(包括PDPN和CD146)上鉴别的若干限定的标记物(图 20a)。为了确定BMPR是否限定细胞能够经历造骨作用，将BMPR表达亚组的不同群通过FACS分离并且与基质胶中的BMP2一起共同皮下移植到RAGγCFP小鼠中。移植之后四周取出移植物，因为这对应于当BMP2诱导的造骨作用在体内达到其峰值的时刻。通过五色染料染色对样品进行组织学分析。通过CFP表达确定鼠对比人组织。用人核抗原的染色可以代替阴性CFP表达以根据需要标记人组织。预期BMP2诱导的造骨作用与 BMPR表达程度有关。
实验方法：
hASC的分离：将hASC从来自健康患者的脂肪抽吸物中新近分离，所述健康患者经历了腹部、胁腹和/或大腿区域的选择性吸脂，如先前所述。
磁性激活的细胞分选术：将hASC与缀合至磁珠(Miltenyi Biotech,San Diego,CA) 的CD45和CD235抗体一起在4℃下在连续旋转下孵育20分钟。使细胞通过磁体以耗尽造血细胞的hASC。此程序为基质细胞富集新鲜的脂肪抽吸物组织，之后通过FACS进一步分离。
用rhBMP2体外补充hASC：如上分离hASC并且在从1μg/ml至1mg/ml的增加浓度的rhBMP2存在下培养。
用增加浓度的rhBMP2皮下移植hASC：将新近耗尽的hASC(106)再悬浮于具有浓度从1μg/ml增至1mg/ml的rhBMP2的基质胶中，总体积为20μl，以供后续皮下移植到RAGγ肌动蛋白-CFP转基因小鼠的腹股沟脂肪垫中。每隔一周取出移植物用于通过 Movat五色染料的组织学分析和针对人骨骼祖细胞的FACS。
表达BMPR1a、BMPR1b、BMPR2的hASC的分离：将hASC如上进行分离并且再悬浮于染色培养基(2％在PBS中的胎牛血清)中，并且用针对BMPR1a/BMPR1b/BMPR2 的荧光染料缀合抗体染色以便在FACS Aria II仪器(BD Biosciences,San Jose,CA)上进行FACS分析。

Claims (27)

1.一种用于使软骨或骨再生的方法，所述方法包括：
向个体施用有效剂量的骨骼干细胞；或非骨骼干细胞和有效剂量的重编程因子；在需要骨或软骨再生的位点处。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞于基质中提供。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人的。
4.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是所述个体自体的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是所述个体同种异体的。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述细胞是脂肪衍生的干细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞被提供为具有一定剂量的将所述细胞有效重编程为骨骼干细胞的BMP2。
8.如权利要求6或权利要求7所述的方法，其中所述细胞是从脂肪抽吸物中新近分离的。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是骨骼干细胞。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述细胞选自表型对于CD45、CD235、Tie2及CD31的表达呈阴性的骨组织；以及表型对于平足蛋白(PDPN)的表达呈阳性的骨组织。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述细胞经进一步选择以用于CD73和CD164的表达。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是[PDPN+CD146-CD73-CD164-]且被植入以使软骨再生。
13.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是[PDPN+CD146-CD73-CD164+]且被植入以使骨再生。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述细胞是[PDPN+CD146-CD73+CD164+]且被植入用于软骨内再生。
15.如权利要求10-14中任一项所述的方法，其中所述骨组织包括骨髓。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述骨组织是髋骨组织。
17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述细胞是从成年组织获得的。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其还包括施用有效剂量的wnt激动剂、VEGF激动剂或拮抗剂、或TGF-β激动剂或拮抗剂。
19.如权利要求18所述的方法，其中施用有效剂量的VEGF抑制剂以在所述细胞中诱导软骨形成命运。
20.如权利要求18所述的方法，其中施用有效剂量的Wnt激动剂以在所述细胞中诱导成骨命运。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述Wnt激动剂是Wnt蛋白。
22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述Wnt是Wnt3或Wnt3a。
23.如权利要求20或21所述的方法，其中所述Wnt是Wnt5a或Wnt 5b。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述细胞是以支架、糊剂或植入物形式提供的，且其中软骨或骨在所述植入物的位点处形成。
25.一种组合物，其用于实践根据权利要求1-24中任一项所述的方法。
26.一种生成骨骼、基质或软骨组织的方法，所述方法将根据权利要求25所述的组合物或选自以下的经分离的细胞群引入个体中：骨骼干细胞、前BCSP细胞、BCSP细胞、CCP细胞、BLSP细胞、6C3细胞或HEC细胞。
27.一种经分离的细胞群，其选自以下：骨骼干细胞、前BCSP细胞、BCSP细胞、CCP细胞、BLSP细胞、6C3细胞或HEC细胞。
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