CN117545507A - 生化激活功能障碍骨骼干细胞以实现骨骼再生 - Google Patents

Abstract

本发明通过给予骨形态发生蛋白(BMP)和CSF1抑制剂组合，靶向老化骨骼干细胞以实现再激活，其中，可向靶骨骼部位局部给予因子组合。在一些实施例中，所述局部给药包括放置植入物(例如基质、凝胶、支架等)，从而在靶骨骼部位局部递送因子。

Description

生化激活功能障碍骨骼干细胞以实现骨骼再生

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2021年4月26日递交的第63/179,686号美国临时专利申请的利益和优先权，所述第63/179,686号美国临时专利申请的全部内容通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。

有关联邦资助研究的声明

本发明根据美国国立卫生研究院授予的合同AG049958在美国政府支持下完成。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

衰老身体的进行性逐渐退化是最耳熟能详又最值得探讨的医学挑战之一。对于衰老在细胞、分子和遗传方面的许多根本原因，以及众多年龄相关疾病的病因，我们仍然知之甚少。衰老的一些方面显然根源于细胞内在变化。另外，秀丽隐杆线虫等多细胞生物研究表明，老化表型的启动和进展与细胞外在因素(例如***信号传导变化)相关。许多多细胞生物具有组织驻留、自我更新的干/祖细胞，此类细胞不断产生用于组织构建和再生的新细胞，一些物种甚至因其干细胞***持续补充成体组织而不会衰老。鉴于脊椎动物的大部分成体组织也包含干细胞，令人失望的是，我们仍然无法逃避衰老过程。这可能是因为再生干细胞及其支持性生态位环境会受到衰老的消极影响。

在小鼠造血干细胞(HSC)中已经详细表征了干细胞衰老，而HSC会产生成熟血液谱系的所有祖细胞。在小鼠和人类的衰老过程中，HSC的频率出乎意料地增加。老化HSC丰度较高，但在发育输出方面偏斜，导致骨髓谱系频率升高，淋巴祖细胞数量显著减少。转录组和表观遗传分析表明，这些变化与基因表达和调节模式的变化相对应，但此类偏差与HSC衰老的关联机制尚不明确。由于HSC通常驻留在成年骨髓生态位中，HSC和造血***的衰老可能与骨和骨骼组织的衰老相关。

骨和软骨的年龄相关变化众所周知，会导致骨关节炎和骨质疏松症等病症，对快速老龄化的全球人口造成重大的生物医学负担。在本发明中，我们利用新型模型***从干细胞角度认识骨衰老的起源。由于缺乏纯化真实骨骼干细胞的研究，阻碍了骨驻留干细胞临床潜能发掘方面的进展。在最新的研究工作中，我们近期已将小鼠和人类的骨和软骨组织起源追溯到骨骼干细胞(SSC)。此外，源自SSC的下游谱系细胞群产生不同类型的支持性基质细胞，该细胞能够维持特定种类的造血祖细胞(包括HSC)的存活。从干细胞角度分析骨骼衰老，可以针对局部干细胞生态位层面的衰老机制以及全身多器官生理衰老方面，提供重要的新发现，最终开辟治疗上逆转骨骼衰老影响的新途径。

治疗上逆转衰老对骨骼组织再生的影响的方法具有医学和经济重要性，本发明将对此进行说明。

发明内容

本发明表明，老年哺乳动物骨再生不足由骨骼干细胞层面的功能缺陷导致。这些干细胞降低了骨形成潜能，还产生大量的促炎基质，促炎基质通过作用于造血破骨细胞增强骨吸收。本发明提供了用于逆转上述缺陷的方法，即通过局部施用组合疗法，再激活老化SSC，同时减少有利于炎性环境的造血细胞串扰。此疗法可扩大老化SSC池，降低破骨细胞活性，促进骨愈合。

在一些实施例中，通过给予有效剂量的骨形态发生蛋白(BMP)和CSF1抑制剂组合，靶向老化骨骼干细胞以实现再激活。在一些实施例中，向靶骨骼部位局部给予因子组合。所述靶骨骼部位可以是骨骼损伤部位、骨骼植入部位等。在一些实施例中，所述局部给药包括放置植入物(例如基质、凝胶、支架等)，从而在靶骨骼部位局部递送因子。在一些实施例中，所述靶骨骼部位是骨折部位。在一些实施例中，所述再激活的SSC在靶骨骼部位形成骨质。在一些实施例中，提供了用于使SSC偏斜以在靶骨骼部位形成软骨的附加因子，例如，给予VEGF抑制剂。在一些实施例中，在没有外源性细胞的情况下提供因子。

在一些实施例中，提供了一种用于靶向老化骨骼干细胞以实现再激活的药物组合物。所述组合物的活性剂包含或基本包含有效剂量的骨形态发生蛋白(BMP)和CSF1抑制剂。可将因子组合配制到植入物递送器械(例如基质、凝胶、支架等)中，从而在靶骨骼部位局部递送因子。在一些实施例中，提供了用于使SSC偏斜以在靶骨骼部位形成软骨的附加因子，例如，包含VEGF抑制剂。在一些实施例中，提供了用于激活糖尿病SSC的附加因子，例如，包含刺猬剂。

在一些实施例中，所述药物组合物是植入物，所述植入物是可生物降解的支架或基质。在一些实施例中，可生物降解的基质是水凝胶。各种水凝胶在本领域中已知并经常使用，包括但不限于包含聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙二醇等聚合物或共聚物的水凝胶。所述植入物的尺寸适用于所治疗的骨病变。

在一些实施例中，一种用于向靶骨骼部位局部给药的药物组合物包含有效剂量的BMP蛋白和CSF1抑制剂组合。在一些实施例中，所述BMP蛋白是BMP2。在一些实施例中，所述BMP蛋白是重组人BMP2。在用于小鼠模型的植入物中，以单位剂量提供的BMP2的剂量可以为约1μg；约2.5μg；约5μg；约7.5μg；约10μg；约12.5μg；约15μg；且不超过约25μg；不超过约20μg；不超过约15μg。用于人类(例如老年人)时相应的单位剂量更高，可以为至少约50μg；至少约100μg；至少约250μg；至少约500μg；至少约750μg；至少约1mg；且不超过约10mg、不超过约5mg、不超过约1mg。

优选地，所述药物组合物包含一种用于与BMP蛋白联合给药的CSF1抑制剂。在用于小鼠模型的组合物(例如植入物)中，以单位剂量提供的抗CSF1的剂量取决于特定抑制剂，但抗体的剂量可以为约0.5μg；约1μg；约1.5μg；约2μg；约2.5μg；且不超过约5μg；不超过约4μg；不超过约2.5μg。用于人类(例如老年人)时相应的单位剂量更高，可以为至少约20μg；至少约25μg；至少约50μg；至少约75μg；至少约100μg；且至多约10mg、至多约5mg、至多约1mg、至多约500μg、至多约250μg、至多约150μg。其他抗CSF1剂(例如CSF1R小分子和抗体抑制剂)的剂量可以以经过适当比例调整与上述抗CSF1抗体水平相当的单位剂量提供。

在一些实施例中，提供了一种用于结合骨形态发生蛋白(BMP)和CSF1抑制剂通过向患者给予治疗有效量的刺猬剂促进老年个体糖尿病患者骨愈合的方法。在一些实施例中，所述刺猬剂是刺猬蛋白。所述刺猬蛋白可以是人蛋白或其变体或活性片段。在一些实施例中，所述刺猬蛋白是人音猬因子。在一些实施例中，所述刺猬蛋白是人印度刺猬因子。在其他实施例中，所述刺猬剂是刺猬信号传导的小分子激动剂。

在一些实施例中，所述药物组合物(例如植入物)位于靶骨骼部位，以便与骨骼病变完全接触。例如，如果病变为骨折，植入物可“包围”长骨，使病变的所有表面均靠近植入物释放的因子。

附图说明

结合附图阅读时，可以根据以下具体实施方式获得对本发明的最佳理解。需要强调的是，按照惯例，附图的各种特征并非等比例特征。相反，为了清楚起见，各种特征的尺寸经过任意扩大或缩小。附图包括以下各图。

图1A-1O。年龄相关骨质流失与骨骼干细胞功能变化同时发生。(a)在‘2-mo’(‘2-mo’)和‘24-mo’(‘24-mo’)小鼠中研究Actin-CreERT Rainbow小鼠骨折克隆活性的实验装置的示意图(dpi：损伤后天数)。(b-c)显示‘2-mo’和‘24-mo’小鼠第10天骨折骨痂(左上)、进行Movat Pentachrome染色时放大的外部骨痂区(左下)以及荧光克隆(右)的典型总体图像。FC：骨折骨痂。(d)‘2-mo’和‘24-mo’小鼠骨折骨痂的克隆尺寸定量。对每个年龄组中两只小鼠的六个不同骨痂区进行计数(每个切片5-19个克隆)。(e)稳态条件下‘2-mo’和‘24-mo’小鼠每个股骨的SSC和BCSP频率的流式细胞术定量(n＝7-15)。(f-g)‘2-mo’和‘24-mo’动物骨折损伤后不同天数的SSC和BCSP患病率—Fx：断裂。(n＝3-11)。(h)未受伤(uninj.)和断裂(fx；第10天)条件下‘2-mo’和‘24-mo’动物的CD49f表达表型SSC和BCSP的流式细胞术分析(n＝4)。(i)通过掺入EdU在骨折后第10天测得的SSC和BCSP内增殖活性的评估(n＝6-7)。(j)通过Annexin V染色在骨折后第10天测得的SSC和BCSP内细胞凋亡活性的评估(n＝3-4)。(k)培养六天后新鲜分离的‘2-mo’和‘24-mo’SSC的谱系输出的流式细胞术分析(n＝3)。(l)分别通过茜素红S和阿尔新蓝染色测定的‘2-mo’(2-mo)和‘24-mo’(24-mo)SSC和BCSP的体外成骨(上)和成软骨(下)能力。对成骨(右上)和成软骨染色(右下)进行定量(n＝3)。(m)移植源自‘2-mo’和‘24-mo’小鼠第10天骨折的GFP标记SSC后4周切除的移植物的肾小囊移植结果。典型总体图像(上方三组图像)显示了肾脏以及进行明视野镜检时使用GFP信号放大的移植物，每组图像均涉及‘2-mo’(左)和‘24-mo’(右)小鼠源性细胞。用MovatPentachrome染色的切片移植物显示在下方。白色和黄色箭头指向不属于移植物的自发荧光胶原海绵。(n)源自‘2-mo’或‘24-mo’SSC的移植肾的典型μCT图像(上)和定量(下)(n＝4-5)。(o)源自移植肾的切片中破骨细胞表面的TRAP染色图像(上)和定量(下)(n＝4)。通过非配对学生t检验，全面比较‘2-mo’组与‘24-mo’组，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。数据显示为平均值+SEM。比例尺＝50μm。

图2A-2O。SSC谱系导致年龄相关造血谱系偏斜。(a)异种共生实验的实验装置的示意图。生成等时‘2-mo’(IY)对、包含一只‘2-mo’(HY)和一只‘24-mo’(HA)动物的异时对以及等时‘24-mo’(IA)对，使其在干预前共用血液循环四周。(b)异种共生手术后四周的骨矿物质密度(BMD)(n＝4-6)。(c)异种共生四周时通过流式细胞术评估的SSC和BCSP频率(n＝3-6)。(d)在异种共生小鼠骨折后第10天评估的BMD(n＝3-6)。(e)骨折后第10天从异种共生小鼠中分离的SSC的体外成骨分化潜能，其中上图为典型染色，下图为定量(n＝3)。(f)相同细胞的SSC的体外成软骨分化潜能(n＝3)。采用Tukey事后检验对所有比较结果进行单因素ANOVA分析，从而进行统计检验。(g)移植到照射的受体小鼠体内的异种共生生物HSC的骨髓(My.)和淋巴(Ly.)重建百分比(n＝4)。(h)移植实验示意图。将‘2-mo’小鼠骨髓中的GFP标记HSC移植到致死性照射的‘2-mo’或‘24-mo’小鼠体内。(i)造血重建后6周和12周(wks)的外周血分析。图谱显示了按GFP+细胞、淋巴(B和T细胞)、骨髓(Gr1+)部分评估的总体嵌合状态(n＝5-6)。采用Bonferroni事后检验进行双因素ANOVA。(j)供体源性GFP+Lin-cKit+Sca1+Flt3-Cd34-骨髓HSC中的CD150/Slam表达。(k)移植后12周通过流式细胞术对供体源性(GFP+)造血细胞群进行的骨髓分析(n＝5-6)。通过非配对学生t检验，全面比较‘2-mo’组与‘24-mo’组，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。(l)SSC-HSC共培养实验示意图。(m)6天共培养物中淋巴和骨髓细胞类型的流式细胞术分析(n＝3-4)。采用Tukey事后检验进行单因素ANOVA。(n)用共培养的造血细胞进行造血重建后6周和12周(wks)的外周血分析。图谱显示了按GFP+细胞、淋巴(B和T细胞)、骨髓(Gr1+)部分评估的总体嵌合状态(n＝3-4)。采用Bonferroni事后检验进行双因素ANOVA。(o)通过流式细胞术对共培养的供体源性(GFP+)造血细胞群进行的骨髓分析(n＝3-4)。采用Tukey事后检验进行单因素ANOVA。数据显示为平均值+SEM。比例尺＝50μm。

图3A-3Q。促炎老化骨骼谱系通过Csf1增强破骨细胞活性。(a)显示了SmartSeq2单细胞RNA测序后组合(出生后第3天；‘0-mo’)、‘2-mo’和‘24-mo’单个SSC的Leiden簇分布的UMAP图。Chondro：成软骨；Osteo：成骨；pos：阳性。(b)相同UMAP图按年龄的聚类(下)，显示了经SmartSeq2测序的单细胞按年龄在Leiden簇(上)内的分布。(c)显示了各个Leiden簇的标志基因的点阵图。(d)UMAP图中的Velocyto轨迹推断分析，其中细胞由Leiden簇标记。(e)纯化骨骼谱系群体的促炎和促骨髓/促破骨细胞基因表达的批量微阵列数据的热图。每个细胞群反映了三到五只小鼠的合并样本的表达。(f)源自‘2-mo’和‘24-mo’骨髓的破骨细胞数量的体外定量(n＝16-18，每个视野的数量，每个年龄组三只小鼠)。(g)每个衍生破骨细胞的细胞核数量(n＝14)。(h)体外衍生破骨细胞的典型明视野镜检图像。(i)来自‘2-mo’和‘24-mo’小鼠骨髓的骨髓源性破骨细胞的体外吸收活性定量(n＝5个孔，细胞来自每个年龄的两只不同小鼠)。(j)相同实验的典型明视野镜检图像(右)(n＝5)。须状图显示了最小值至最大值。(k)‘2-mo’/‘24-mo’SSC谱系和造血谱系中相应的配体(Csf1)和受体(Csf1r)微阵列批量基因表达(以％为单位)。如果基因表达水平超过+25％，则假设存在潜在相互作用，绘制两个细胞类型之间的连接线。(l)‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的SSC和BCSP培养物上清液中Csf1的Luminex蛋白数据(n＝4)。(m)第10天骨折骨痂‘2-mo’、‘12-mo’和‘24-mo’SSC的RNA测序数据中的Csf1表达(n＝3)。采用单尾学生t检验，将‘12-mo’组和‘24-mo’组与‘2-mo’组进行比较。(n)用PBS或5μg重组Csf1局部处理的第10天骨折骨痂的骨体积/总体积(BV/TV)MicroCT分析(rCsf1；n＝4)。(o)15-mo单倍不足Csf1-KO与WT小鼠的未受伤股骨的机械强度(n＝4)。(p)第21天骨折骨痂组织的Movat Pentachrome染色以及(q)该骨痂的机械强度(n＝4-6)。通过非配对学生t检验，进行全面统计检验，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。数据显示为平均值+SEM。比例尺＝150μm。

图4A-4M。通过组合靶向‘24-mo’骨骼形成生态位，可以将骨折再生恢复到年轻水平。(a)实验装置的示意图。将采用不同重组因子组合的水凝胶放置在新鲜诱导的‘24-mo’小鼠骨折处，在第10天和第21天评估愈合结果。以接受包含PBS的水凝胶治疗的‘2-mo’小鼠作为对照组。(b)显示了第10天断裂股骨(上)和第21天骨痂μCT重建(中)及相应切片MovatPentachrome(MP)染色(下)的射线照相图像。(c)诱导骨折并施用因子后第10天的骨痂指数(Bmp2：5μg；Csf1^低：2μg；Csf1^高：5μg)(n＝5-9)。(d)第10天的SSC和BCSP频率(n＝6-9)。(e)第21天的断裂骨机械强度测试(MST)(n＝6-13)。(f)第10天从经‘2-mo-PBS’、‘24-mo-PBS’和‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’处理的骨折骨痂中分离的SSC的CFU-F能力(n＝5-6)。(g)第10天从经‘2-mo-PBS’、‘24-mo-PBS’和‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’处理的骨折骨痂中分离的SSC的体外成骨能力(n＝4)。数据显示为平均值+SEM。通过在‘2-mo PBS’与每个‘24-mo’组之间进行学生t检验，计算统计显著性，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)或不等方差(Welch’s检验)进行调整(n.s.：不显著)。(h)显示了骨软骨形成基因表达的点阵图，通过对‘24-mo-PBS’和‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’骨折骨痂子集进行10X单细胞RNA测序实验获得，适用于非造血细胞。(i)‘24-mo-PBS’和‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’骨折骨痂的10X单细胞RNA测序实验的Leiden聚类，适用于造血基因表达丰富的细胞部分。(j)相同UMAP图，其中细胞由治疗组标记。(k)每个Leiden簇的治疗组细胞部分百分比。(l)造血细胞部分的Csf1r表达。(m)显示了早期和晚期破骨细胞基因表达的点阵图，通过对‘24-mo-PBS’和‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’骨折骨痂子集进行10X单细胞RNA测序实验获得，适用于OC簇。比例尺＝50μm。

图5A-5I。衰老会改变小鼠的骨生理学和骨折愈合水平。(a)‘2-mo’(月)、‘24-mo中期’和‘24-mo’小鼠近端股骨的典型苏木精和伊红(H&E)染色。(b)‘2-mo’、‘24-mo中期’和‘24-mo’小鼠股骨质量的三维μCT重建。(c)在三个年龄组中通过μCT测量对骨参数进行的定量(n＝3)。(d)在‘2-mo’和‘24-mo’小鼠中通过钙黄绿素标记进行的骨形成率(BFR)评估。MS：矿化表面；BS：骨表面；MAR：矿物质沉积率；BFR：骨形成率(n＝3)。(e)损伤后第10天和第21天骨折骨痂的射线照相、μCT和Movat Pentachrome染色图像。(f)‘2-mo’和‘24-mo’股骨骨折后第10天和第21天的骨痂指数测量(n＝3-5)。(g)骨折后第21天骨折骨痂的机械强度测试(n＝8-10)。(h)损伤后第10天和第21天‘2-mo’、‘24-mo中期’和‘24-mo’小鼠股骨骨折骨痂的MicroCT图像。(i)在三个年龄组中通过μCT测量对骨折骨痂参数进行的定量(n＝3-6)。比例尺＝150μm。散点图数据显示为平均值+SEM。须状图显示了最小值至最大值。通过单尾非配对学生t检验，将各组与‘2-mo’进行全面比较均进行，如适当，根据非正态性(Mann-Whitney检验)或不等方差(Welch’s检验)进行调整。

图6A-6F。在‘24-mo’小鼠体内存在表型SSC。(a)小鼠骨骼干细胞谱系。自我更新的骨骼干细胞(SSC)产生多能骨-软骨-基质祖细胞(BCSP)，而BCSP是专能软骨、骨和基质谱系的前体。(b)分析高纯度‘2-mo’和‘24-mo’SSC谱系细胞内在特征的实验策略的示意图。(c)用于分离小鼠SSC谱系细胞的FACS门控策略。‘2-mo’和‘24-mo’动物的典型FACS谱如图所示。(d)‘2-mo’(蓝色)和‘24-mo’(红色)小鼠SSC门控细胞的CD200表达。荧光减一(FMO)对照组以灰色显示。(e)损伤后第10天‘2-mo’和‘24-mo’小鼠骨折后Thy1+和6C3+下游细胞群频率的流式细胞术定量(n＝4)。(f)培养六天后新鲜分离的‘2-mo’和‘24-mo’BCSP的谱系输出的流式细胞术分析(n＝3)。比例尺＝50μm。数据显示为平均值+SEM。通过非配对学生t检验，比较‘2-mo’和‘24-mo’年龄组，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。

图7A-7F。SSC/BCSP在体外和体内均表现出功能降低。(a)长骨‘2-mo’和‘24-mo’SSC源性细胞群的成纤维细胞集落形成单位(CFU-F)能力(n＝6-10，三项独立实验)。采用Bonferroni事后检验进行双因素ANOVA。(b)源自未受伤骨和第10天断裂骨的细胞的SSC和BCSP源性集落尺寸(n＝7-120)。通过非配对学生t检验或Mann-Whitney非正态性检验在年龄组之间进行统计检验。(c)用结晶紫染色的集落的典型图像。(d)通过油红O染色测定的‘2-mo’和‘24-mo’SSC和BCSP的体外成脂能力(代表n＝3个生物重复样本)。(e)移植源自‘2-mo’和‘24-mo’小鼠未受伤长骨的GFP标记SSC后4周切除的移植物的肾小囊移植结果。典型总体图像(上方四组图像)显示了肾脏以及进行明视野镜检时使用GFP信号放大的移植物，每组图像均涉及‘2-mo’(左)和‘24-mo’(右)小鼠源性细胞。用Movat Pentachrome染色的切片移植物显示在下方。白色和黄色箭头指向不属于移植物的自发荧光胶原海绵。(f)从‘2-mo’和‘24-mo’小鼠未受伤长骨或第10天股骨骨折中分离的BCSP的相同肾小囊实验及结果。数据显示为平均值+SEM。

图8A-8S。暴露于年轻循环无法使SSC谱系恢复活力。(a)结合后两周GFP+和GFP-异种共生生物血液的FACS分析结果，证实了二者共用循环(n＝3)。(b)异种共生四周时通过流式细胞术评估的Thy1+和6C3+频率(n＝3-6)。(c)骨折损伤后第10天(n＝5-9)和第21天异种共生小鼠的骨痂指数(骨痂的最大宽度除以骨折附近的骨干宽度)(n＝3-5)。采用Bonferroni事后检验进行双因素ANOVA，从而进行统计检验。(d)异种共生生物组股骨骨折骨痂的典型总体图像。(e)异种共生生物骨折(Fx)后第10天通过流式细胞术评估的SSC谱系频率(n＝3-6)。采用Tukey事后检验对所有比较结果进行单因素ANOVA分析，从而进行统计检验。(f)HA和HY小鼠纯化SSC的基于微阵列的炎性基因表达水平。(g)4周异种共生生物循环中Rankl的血清浓度(n＝4)。(h)4周异种共生生物循环中CTX1的血清浓度(n＝2)。(i)异种共生生物骨折骨痂TRAP染色的典型图像。(j)异种共生生物骨折骨痂TRAP染色的定量(n＝3-4)。采用Tukey事后检验对所有比较结果进行单因素ANOVA分析，从而进行统计检验。(k)将从胎肝或‘24-mo’小鼠中新鲜分离的HSC移植到致死性照射‘2-mo’或‘24-mo’小鼠体内的实验方法的示意图。(l)造血重建八周后接受胎肝HSC或‘24-mo’小鼠HSC移植的致死性照射‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的BMD(n＝5-6)。(m)在移植后八周时间点诱导骨折后第14天受体小鼠的骨痂指数(n＝4-5)。(n)用GFP供体HSC进行造血重建后外周血中骨髓(Gr1+)和淋巴(B细胞和T细胞)细胞的典型FACS门控策略(通过Ter119-进行门控，活细胞)。(o)造血谱系树群体的GFP+供体源性细胞的典型骨髓FACS门控策略。(p)通过流式细胞术对供体源性(GFP+)HSC、MPP1和MPP2细胞群进行的骨髓分析(n＝5-6)。(q)用GFP标记2-mo HSC重建的2-mo和24-mo小鼠第10天骨折骨痂的典型TRAP染色和GFP荧光图像(相同切片)。(r)每个年龄组三只小鼠的骨折骨痂切片中TRAP⁺GFP⁺区的总面积定量(n＝3)。(s)通过流式细胞术对共培养的供体源性(GFP+)HSC、MPP1和MPP2细胞群进行的骨髓分析(n＝3-4)。数据显示为平均值+SEM。通过非配对学生t检验，全面比较‘2-mo’组与‘24-mo’组，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。

图9A-9M。不同年龄的SSC具有各异的转录组特征。(a)按Leiden簇划分的各个年龄组中前150个差异表达基因的热图。(b)按年龄分组的小提琴图(左)和UMAP图中每个单细胞的基因计数。通过Mann-Whitney检验进行统计检验。(c)显示了按年龄分组的单细胞数据中细胞凋亡相关基因表达的热图。(d)显示了按年龄分组的单细胞数据中衰老相关基因表达的热图。(e)显示了2-mo和24-mo小鼠新鲜纯化SSC中端粒酶表达的电泳凝胶。(f)显示了按年龄分组的单细胞数据中组织消化和应激相关应答基因表达的热图。(g)显示了按Leiden簇分组的单细胞数据中组织消化和应激相关应答基因表达的热图。(h)UMAP图中每个单细胞的测序片段总计数。(i)UMAP图所示单细胞的细胞周期状态。(j)每个年龄组的细胞周期状态比例。(k)按Leiden簇分组的单个SSC的CytoTrace评分。(l)涉及骨质流失增加和破骨细胞形成支持的选定年龄相关基因的单细胞数据，显示为按年龄分组的小提琴图。(m)24-mo SSC与0-mo/2-mo SSC差异表达基因的EnrichR基因本体分析，以及通过GO生物过程测定的该基因与细胞功能的关系。通过学生t检验在年龄组之间进行统计检验。

图10A-10G。随着年龄的增长，骨骼谱系源性Csf1促进骨吸收。(a)破骨细胞功能文献所述的SSC谱系源性Csf1作用模型。(b-c)‘2-mo’和‘24-mo’SSC谱系和造血谱系中相应的配体(Csf2/3)和受体(Csf2/3r)批量微阵列基因表达(％)。(d)‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的SSC和BCSP培养物上清液中Eotaxin1和Tgfβ的Luminex蛋白数据(n＝4)。(e)‘2-mo’和‘24-mo’小鼠血液中选定炎性标志物的血清浓度(n＝4-5)。(f)‘2-mo’和‘24-mo’小鼠循环中Csf1、Eotaxin1和Tgfβ的血清浓度(n＝5)。通过非配对学生t检验，进行统计检验，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。(g)第10天骨折骨痂‘2-mo’、‘12-mo’和‘24-mo’SSC的批量RNA测序数据中促造血/促破骨和促成骨基因的基因表达(n＝3)。与‘2-mo’对比进行单尾非配对学生t检验，如适当，针对不等方差进行Welch’s校正。散点图中所有数据均显示为平均值+SEM。

图11A-11G。Csf1水平控制骨骼维持和修复。(a)手术时第10天骨折骨痂的典型μCT图像，以包含重组Csf1(5μg)或PBS的水凝胶作为对照组。(b)经过或未经重组Csf1处理的第10天骨折骨痂的BMD(n＝4-5)。(c)第10天通过FACS评估的SSC和BCSP总数。(d)未受伤野生型或单倍不足Csf1-KO(Csf1-KO^+/-)15-mo雌性和雄性小鼠的股骨的典型μCT重建。(e)雌性和雄性WT和Csf1-KO 15-mo股骨的小梁BMD(上)和皮质总矿物质密度(TMD；下)(n＝4)。(f)未受伤15-mo WT和Csf1-KO雌性和雄性小鼠通过μCT定量的骨参数(n＝4)。(g)15-mo WT和Csf1-KO雌性小鼠第21天骨折骨痂通过μCT定量的骨参数(n＝4)。数据显示为平均值+SEM。通过非配对学生t检验，全面比较‘2-mo’组与‘24-mo’组，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)和不等方差(Welch’s校正)进行调整。

图12A-12B。通过靶向SSC谱系，可以操纵‘24-mo’骨折愈合。(a)诱导骨折并施用因子后第10天‘24-mo’小鼠的BCSP、Thy1和6C3+频率(Bmp2：5μg；Csf1^低：2μg；Csf1^高：5μg)(n＝5-9)。(b)第21天经处理骨折骨痂新形成的矿化骨体积的MicroCT分析(n＝6-12)。数据显示为平均值+SEM。通过在‘2-mo’与每个‘24-mo’组之间进行学生t检验，计算统计显著性，如适当，针对非正态性(Mann-Whitney检验)或不等方差(Welch’s检验)进行调整。

图13A-13G。接受不同治疗的老年小鼠骨折骨痂的组分和转录组变化。(a)17230个‘24-mo-PBS’和‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’骨折骨痂细胞的10X单细胞RNA测序实验的Leiden聚类。(b)显示了Leiden簇选定标志基因表达的UMAP图。(c)显示了各治疗组细胞分布的UMAP图。红色：‘24-mo-PBS’；灰色：‘24-mo-aCsf1^低+Bmp2’。(d)每个Leiden簇的治疗组细胞部分百分比。(e)显示了用于鉴定SSC的阳性和阴性标志物的热图。(f)显示了10X数据集缺少淋巴基因表达的点阵图。(g)显示了10X数据集子集中选定标志基因表达的UMAP图，适用于造血基因表达丰富的细胞。

图14.SSC介导的骨骼衰老的抽象图。随着年龄的增长由骨形成减少和骨吸收增加导致的骨骼完整性丧失与SSC频率和活性降低相关。‘24-mo’骨骼具有骨质流失增加、再生障碍以及SSC谱系向破骨细胞支持性基质偏斜的特征。通过同时施用重组Bmp2以及阻断Csf1作用的低剂量抗体，可以使骨骼再生恢复活力。

具体实施方式

在进一步说明本发明所述的方法或组合物之前，应理解，本发明不限于所述特定方法或组合物，当然，也可能有所不同。还应理解，由于本发明的范围仅受所附权利要求的限制，所以本发明中的术语仅用于描述特定实施例，而非旨在限制特定实施例。

在提供数值范围的情况下，应理解，本发明具体公开了此范围上限与下限之间的每个居中值(除非上下文另有明确规定，否则精确到下限单位的十分之一)。在所述范围内的任何所述值或居中值与在所述范围内的任何其他所述值或居中值之间的每个较小范围均包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可独立包括在该范围内或排除在该范围外，并且在较小范围内包括任何一个限值、两个限值或两个限值都不包括的每个范围也包含在本发明中，但受规定范围内任何具体排除限值的限制。如果标注的范围包括一个或两个限值，本发明还包括排除这些任一或两个限值的范围。

除非另有定义，否则本发明中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但一些潜在和优选方法和材料如下所述。本发明提及的所有出版物通过引用成为本发明的一部分，用于公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。应理解，本公开与其所含出版物的任何公开内容如有矛盾，以本公开为准。

必须注意的是，除非上下文另有明确规定，否则本发明和所附权利要求中使用的单数形式“一种(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”也包括复数指称对象。因此，例如，用语“一种细胞”也包括多种此类细胞，用语“所述肽”包括本领域技术人员已知的一种或多种肽及其等同物，例如多肽，以此类推。

本发明所讨论的出版物仅供在本申请递交日期之前公开之用。本发明的任何内容均不应解释为承认由于先前的发明，本发明无权先于此类出版物出版。此外，提供的出版日期可能与实际出版日期不同，后者可能需要单独确认。

本发明提供了用于在体内靶部位再生骨骼组织的方法、药物组合物和套件。在特定实施例中，提供了用于通过生化刺激再激活老化哺乳动物骨骼干细胞的组合物和方法。所述生化因子可以是局部植入物。在一些实施例中，未提供外源性细胞，即仅激活驻留SSC。可选地，通过提供外源性细胞，例如SSC或非骨骼干细胞，可以扩增驻留SSC。在一些实施例中，所述因子是单位剂量的药物递送植入物，所述药物递送植入物位于靶部位，例如，完全接触靶骨骼病变。

阅读以下有关主题方法和组合物详细信息的更全面说明后，本领域技术人员可以轻松获知本发明的上述及其他目的、优势和特征。

分子和细胞生化领域的一般方法参见标准教科书，例如《分子克隆：实验室手册》，第3版(Sambrook等人，Harbor实验室出版社，2001)；《精编分子生物学》，第4版(Ausubel等人编辑，约翰·威利父子出版公司，1999)；《蛋白方法》(Bollag等人，约翰·威利父子出版公司，1996)；《基因治疗的非病毒载体》(Wagner等人编辑，学术出版社，1999)；《病毒载体》(Kaplift和Loewy编辑，学术出版社，1995)；《免疫学方法手册》(I.Lefkovits编辑，学术出版社，1997)；以及《细胞和组织培养：生物技术实验室程序》(Doyle和Griffiths，约翰·威利父子出版公司，1998)，这些出版物的公开内容通过本发明的引用，成为本发明的一部分。本公开所述用于遗传操纵的试剂、克隆载体和试剂盒可从商业供应商获得，例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech。

术语“多肽”、“肽”或“蛋白”在本发明中可互换使用，系指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于氨基酸聚合物(其中一个或多个氨基酸残基是相应天然氨基酸的人工化学模拟物)，以及天然氨基酸聚合物和非天然氨基酸聚合物。

本发明中提及多肽或DNA序列时使用的术语“序列同一性”系指两个分子之间的亚基序列同一性。两个分子中的亚基位置由相同的单体亚基(例如相同的氨基酸残基或核苷酸)占据时，该位置的分子相同。两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性与相同位置的数量直接相关。通常，通过比对序列，可以实现最高阶的匹配。如有必要，计算同一性时可采用已发表的技术和广泛可用的计算机程序，例如GCS程序包(Devereux等人，《核酸研究》12:387，1984)、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul等人，《分子生物学杂志》215:403，1990)。

本发明中的“蛋白变体”或“变体蛋白”或“变体多肽”系指由于具有至少一个氨基酸修饰而与野生型蛋白不同的蛋白。亲本多肽可以是天然或野生型(WT)多肽，或者WT多肽的修饰版本。变体多肽可指多肽本身、包含多肽的组合物或编码多肽的氨基酸序列。优选地，与亲本多肽相比，变体多肽具有至少一个氨基酸修饰，例如，与亲本多肽相比，具有约一个-约十个氨基酸修饰，优选地，具有约一个-约五个氨基酸修饰。

本发明所述“亲本多肽”、“亲本蛋白”、“前体多肽”或“前体蛋白”系指未经修饰的多肽，其后期经修饰产生变体。亲本多肽可以是野生型(或天然)多肽，或者野生型多肽的变体或工程化版本。亲本多肽可指多肽本身、包含多肽的组合物或编码多肽的氨基酸序列。

术语“氨基酸”系指天然和合成氨基酸，以及通过与天然氨基酸相似的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后期被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”系指基本化学结构与天然氨基酸相同的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基结合的α-碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰R基(例如正亮氨酸)或修饰肽主链，但保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”系指结构与氨基酸一般化学结构不同但发挥作用的方式与天然氨基酸相似的化合物。

本发明公开的氨基酸修饰可包括氨基酸取代、缺失和***，特别是氨基酸取代。变体蛋白还可包括细胞因子和/或受体的其他位置(例如未参与亲和工程的位置)的保守修饰和取代。此类保守取代包括Dayhoff在“蛋白序列和结构图谱”5(1978)中以及Argos在《恩博杂志》8:779-785(1989)中描述的保守取代。例如，以下任一组氨基酸均表现出保守变化：第I组：Ala、Pro、Gly、Gln、Asn、Ser、Thr；第II组：Cys、Ser、Tyr、Thr；第III组：Val、Ile、Leu、Met、Ala、Phe；第IV组：Lys、Arg、His；第V组：Phe、Tyr、Trp、His；第VI组：Asp、Glu。进一步地，可采用保守变化来替换使用指定氨基酸进行的氨基酸取代。

术语“分离”系指分子基本脱离其天然环境。例如，分离蛋白基本不含细胞物质或其他来自其细胞或组织来源的蛋白。此术语描述制剂时，分离蛋白的纯度足以作为治疗组合物进行给药，或者其纯度为至少70％-80％(w/w)、更优选至少80％-90％(w/w)、再优选90-95％、最优选至少95％、96％、97％、98％、99％或100％(w/w)。“分离”化合物系指从化合物所在样本的至少一种组分的至少90％部分中去除的化合物。本发明所述的任何化合物都可以是分离化合物。

术语“受试者”、“个体”和“患者”在本发明中可互换使用，系指正在接受治疗评估和/或正在接受治疗的哺乳动物。在一些实施例中，所述哺乳动物是人类。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患病个体。受试者可以是人类，还包括其他哺乳动物，特别是可用作人类疾病实验室模型的哺乳动物，例如小鼠、大鼠等。

涉及患者的术语“样本”包括血液等其他生物源液体样本、活检标本等固体组织样本或衍生组织培养物或细胞及其后代。此术语还包括在获得后经过以下任何操纵的样本：例如，用试剂处理；洗涤；或富集某些细胞群，例如患病细胞。该定义还包括富含核酸、多肽等特定分子类型的样本。术语“生物样本”涵盖临床样本，以及通过手术切除获得的组织、通过活检获得的组织、培养的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、组织样本、器官、骨髓、血液、血浆、血清等。“生物样本”包括从患者患病细胞中获得的样本，例如从患者患病细胞中获得的包含多核苷酸和/或多肽的样本(例如包含多核苷酸和/或多肽的细胞裂解物或其他细胞提取物)；以及包含患者患病细胞的样本。包含患者患病细胞的生物样本还可包括非患病细胞。

本发明中使用的术语“诊断”系指鉴定受试者、个体或患者的分子或病理状态、疾病或病症。

本发明中使用的术语“预后”系指预测受试者、个体或患者发生死亡或疾病进展(包括复发、扩散和耐药)的可能性。本发明中使用的术语“预测”系指根据观察、经验或科学推理，预测或估计受试者、个体或患者经历特定事件或临床结果的可能性。

本发明中使用的“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”等术语系指为了在受试者、个体或患者体表或体内获得效果而给予药剂或执行程序。所述效果在完全或部分预防疾病或其症状方面可以是预防性作用，并且/或者在部分或完全治愈疾病和/或其症状方面可以是治疗性作用。本发明所述的“治疗”可包括治疗哺乳动物(特别是人类)的骨病变(例如骨折)，还包括：促进靶部位的骨再生。

治疗可指任何表明病症得到成功治疗、改善或预防的指标，包括任何客观或主观参数，例如消退；缓解；减轻症状或让患者更能忍受病情；减缓退化或衰退速率；或者改进退化终点的衰弱度。症状的治疗或改善可基于客观或主观参数；包括医生检查结果。

例如，年龄相关骨质流失和再生能力下降与骨骼干细胞池缩减和谱系输出偏斜同时发生。老化骨骼表型与骨构造的明显变化相关，此类变化包括生长板衰减、骨矿物质密度(BMD)降低、小梁骨质量减少，以及通过钙黄绿素标记、体内骨形成测量和重塑观察到的活性基质矿化水平下降。老化骨形成的骨痂明显更小，机械强度测试表明，与年轻骨骼相比，这些骨痂更容易再次骨折，体积更小，矿化水平明显更低。老化骨骼表型具有稳态和再生骨形成能力均下降的特征。

监测治疗的有效性时，可通过机械测试测定愈合后骨强度，测定骨痂尺寸，通过钙黄绿素标记测定基质矿化水平等。在老年个体中，相对于未经治疗情况下的骨修复，有效治疗可将一个或多个上述指标增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％或以上。

本发明所述“治疗有效量”系指足以治疗或管理疾病或紊乱的治疗剂用量。治疗有效量可指如上所述足以促进骨再生的治疗剂用量。治疗有效量还可指在老年骨折及其他病变治疗或管理方面提供疗效的治疗剂的用量。进一步地，本发明所述治疗剂的治疗有效量系指单独或结合其他疗法在老年骨再生治疗或管理方面提供疗效的治疗剂的用量。

本发明中使用的术语“给药方案”系指单独向受试者单次或多次给药，如果进行多次给药，可间隔一段时间。在一些实施例中，给定治疗剂的推荐给药方案可涉及一次或多次给药。在一些实施例中，给药方案包括多次给药，所述给药彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施例中，给药方案包括多次给药，所述给药间隔至少两个不同的时间段。在一些实施例中，给药方案内的所有给药采用相同的单位剂量。在一些实施例中，给药方案内的不同给药采用不同的用量。在一些实施例中，给药方案包括以第一剂量进行第一给药，然后以与第一剂量不同的第二剂量进行一次或多次附加给药。在一些实施例中，给药方案包括以第一剂量进行第一给药，然后以与第一剂量相同的第二剂量进行一次或多次附加给药。在一些实施例中，给药方案在相关群体中给药时与预期或有益结果相关(即，是治疗性给药方案)。

在某些实施例中，“组合”、“组合疗法”和“组合产品”系指结合附加疗法向患者同时给予本发明所述的因子。进行组合给药时，可同时或在不同时间点以任何顺序依次给予各组分。因此，可单独但在时间上足够接近地给予各组分，以实现预期治疗效果。

“联合给药”系指给予一种或多种组分，例如工程化蛋白和细胞、已知治疗剂等，使组合产生治疗效果。此类联合给药可涉及同时、先前或随后给予组分。本领域普通技术人员能够轻松确定适当的给药时间、顺序和剂量。在本发明的一些实施例中，在植入物中共配制活性剂，用于同时给药。

使用术语“组合”不限制向患有紊乱的受试者给予预防剂和/或治疗剂的顺序。可在向患有紊乱的受试者给予第二预防剂或治疗剂之前(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周前)、之时或之后(例如5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周后)给予第一预防剂或治疗剂。

老化。本发明中使用的术语“老化”系指年龄增长的影响或特征，尤其涉及损伤、患病和正常使用后成体组织再生能力减弱。因此，衰老的一个迹象是生物无法为成体干细胞的激活提供合适的信号。本发明表明，此类信号是可溶性因子；因此可凭经验测量，例如，通过功能检测，检测组织损伤后患者血液中可溶性因子诱导干细胞激活的能力；等等。

可替代地，可根据一般生理特征来定义衰老。衰老速率在很大程度上因物种而异，其中人类的年龄可超过约50岁；啮齿动物的年龄为约2岁。通常，身体***的自然进行性衰退从成年早期开始，但在数十年后最明显。一种更精确定义人类老年的任意方式是，从传统退休年龄开始，即超过60岁左右、超过65岁左右。另一种定义将衰老参数设定为与生殖能力丧失同时发生，即45岁左右，在人类中更常见的是50岁左右，但因个体而异。本公开所述老年人的年龄可大于约50岁、大于约55岁、大于约60岁、大于约65岁、大于约70岁、大于约75岁。

抗体。在本发明的一些实施例中，骨再生剂是抗体，包括抗CSF1抗体等。给定结构与其特定表位的特异性或选择性配合有时称为“锁钥”配合。原型抗体分子是免疫球蛋白，来自所有来源(例如人类、啮齿动物、兔、牛、羊、猪、狗及其他哺乳动物、鸡及其他鸟类)的所有类型的免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等)均属于“抗体”。本发明可使用多克隆抗体，但优选采用单克隆抗体，这是因为此类抗体可通过细胞培养或重组实现复制，并且修饰后抗原性更低。

可采用标准方案，通过向生产动物注射如上所述配制的抗原组合物，产生多克隆抗体。例如，参见：Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室，1988。在一项此类技术中，首先将包含靶多肽抗原部分的抗原注射到多种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)中任何一种动物体内。采用全部或较大部分蛋白时，可用蛋白和合适的佐剂(例如，弗氏、弗氏完全、水包油乳剂等)使生产动物免疫，从而产生抗体。采用较小的肽时，有利做法是将肽与较大的分子缀合，制备免疫刺激缀合物。市面上常用于此类用途的缀合蛋白包括牛血清白蛋白(BSA)和钥孔血蓝蛋白(KLH)。为了产生针对特定表位的抗体，可采用源自完整序列的肽。可替代地，为了产生针对脑肿瘤蛋白靶标较短肽部分的抗体，如果将多肽与载体蛋白(例如卵清蛋白、BSA或KLH)接合，可以引发更强的免疫应答。优选地，根据包含一次或多次加强免疫的预定时间表，将肽缀合物注射到动物宿主体内，并定期给动物放血。然后，可使用与合适固相支持体偶联的多肽，通过亲和色谱法等方法，从此类抗血清中纯化对多肽具有特异性的多克隆抗体。

可替代地，对于单克隆抗体，通过分离受刺激的免疫细胞(例如来自被接种动物脾的此类细胞)，可以形成杂交瘤。然后，将这些细胞与能够在细胞培养过程中无限复制以产生永生免疫球蛋白分泌细胞系的永生化细胞(例如骨髓瘤细胞或转化细胞)融合。

此外，可通过基因工程产生抗体或抗原结合片段。在该技术中，与标准杂交瘤程序一样，抗体产生细胞对预期抗原或免疫原敏感。从免疫脾细胞或杂交瘤中分离的信使RNA用作模板，通过PCR扩增制备cDNA。通过将扩增免疫球蛋白cDNA的适当部分***到表达载体中，可以产生载体文库，其中每个载体均包含一种重链基因和一种轻链基因，保留初始抗原特异性。将重链基因文库与轻链基因文库相结合，即可构建组合文库，从而形成共表达重链和轻链(类似于抗体分子的Fab片段或抗原结合片段)的克隆文库。将携带上述基因的载体共转染到宿主(例如细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞或其他合适的蛋白生产宿主细胞)中。在转染宿主中诱导抗体基因合成时，重链和轻链蛋白自组装，产生可通过抗原或免疫原筛查检测到的活性抗体。

本发明优选采用在人类体内诱导强烈或不利免疫应答(例如过敏性休克)的倾向性较低且引发免疫应答(防止抗体治疗剂或显像剂重复给药)的倾向性较低的抗体。因此，向人类给药时，本发明优选采用产生较少免疫应答的人源化、嵌合或异种人类抗体。

在本发明中，除包含铰链和Fc区序列(或其重组对应物)的全长免疫球蛋白以外，包含表位结合位点的免疫球蛋白片段(例如，Fab'、F(ab')₂或其他片段)也可用作抗体部分。可通过胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其他蛋白酶切割从完整免疫球蛋白中生成此类抗体片段。可利用重组免疫球蛋白技术设计“片段”或微型免疫球蛋白。例如，通过肽连接子(例如聚甘氨酸或其他不会形成α螺旋或β片层基序的序列)将可变轻链区连接到可变重链区，即可产生用于本发明的“Fv”免疫球蛋白。Fv片段是可变重链结构域(VH)和可变轻链结构域(VL)的异二聚体。例如，整个IgG中重链和轻链结构域的异二聚体通过二硫键连接。VH和VL通过肽连接子连接时，重组Fv通常具有稳定性，参见：Huston等人，《美国国家科学院院刊》85:5879-5883(1988)；以及Bird等人，《科学》242:423-426(1988)，两者均通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。此类Fv是单链Fv，研究表明其保留特异性和亲和力，可用于肿瘤成像以及制备肿瘤治疗所需的重组免疫毒素。然而，研究人员发现，一些单链Fv对抗原的亲和力较低，并且肽连接子会干扰结合。研究人员还制备了改良Fv，制备过程包括将V.sub.H区与V.sub.L区之间的二硫键稳定化，参见第6,147,203号美国专利，所述专利通过本发明的整体引用，成为本发明的一部分。本发明可采用以上任何一种微型抗体，本发明的实施例优选采用经人源化可避免HAMA反应的抗体。

可通过多种方法测试候选抗体的活性。第一次筛选时，可测试抗体是否与目标CSF1蛋白结合。确定与靶标选择性结合后，可在体内模型(例如适当的细胞系或动物模型)中测试候选抗体的活性是否适当。可在功能方面检测抗体，例如，诱导干细胞进入细胞周期；干细胞增殖，从干细胞中产生分化细胞；等等，对此可通过培养或在动物***中进行评估。

CSF1。集落刺激因子1(CSF1)，也称为巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，是一种分泌细胞因子。蛋白在细胞外的活性形式为二硫化物连接的同二聚体，通过膜结合前体的蛋白水解切割产生。研究发现该基因涉及编码三个不同亚型的四种转录本变体。M-CSF的作用不仅限于单核细胞/巨噬细胞谱系。M-CSF还通过与其膜受体(由c-fms原癌基因编码的CSF1R或M-CSF-R)相互作用，调控早期造血祖细胞的增殖，并影响免疫、代谢、生育和妊娠方面的众多生理过程。成骨细胞释放的M-CSF对破骨细胞产生旁分泌作用。

人CSF1抑制剂在本领域中已知并经常使用。例如，CSF1抑制剂可以是小分子、肽、多肽、蛋白，更具体地包括：抗体，包括抗CSF1抗体、抗CSF1R抗体、胞内抗体、巨型抗体、微型抗体、双抗体；Fc融合蛋白，例如肽抗体、受体抗体、可溶性CSF1受体蛋白和片段以及各种其他蛋白。根据本发明所述的CSF1抑制剂包括靶向受体CSF1R或配体CSF1的小分子和抗体。例如，当前临床试验中用于此目的的抗体和小分子包括：

其他抗人CSF1抗体包括但不限于人抗CSF1重组抗体(克隆100)；scFv片段(货号：HPAB-0749-WJ-S(P)，Creative Biolabs)；拮抗CSF-1R单克隆抗体卡比利珠单抗(BMS-986227)；以及抗CSF1单克隆抗体PD-0360324。可替代地，可为此目的生成合适的抗体。

在用于小鼠模型的组合物(例如植入物)中，以单位剂量提供的抗CSF1的剂量取决于特定抑制剂，但抗体的剂量可以为约0.5μg；约1μg；约1.5μg；约2μg；约2.5μg；且不超过约5μg；不超过约4μg；不超过约2.5μg。用于人类(例如老年人)时相应的单位剂量更高，可以为至少约20μg；至少约25μg；至少约50μg；至少约75μg；至少约100μg；且至多约10mg、至多约5mg、至多约1mg、至多约500μg、至多约250μg、至多约150μg。其他抗CSF1剂(例如CSF1R小分子和抗体抑制剂)的剂量可以以经过适当比例调整与上述抗CSF1抗体水平相当的单位剂量提供。

本发明中使用的术语“BMP-2”系指源自任何物种的2型骨形态发生蛋白家族，可包括其模拟物和变体。应理解，本发明所述BMP2涉及任何一种目前确定的形式，包括BMP2A和BMP2B，以及未来确定的BMP2种类。术语“BMP2”还包括源自任何已知BMP2序列的多肽，其成熟序列与成熟人BMP2序列至少约75％同源，可通过Genbank(入藏号：NP_001191)获得参考序列。

BMP2通过在细胞表面表达为同聚和异聚络合物的两类受体(BRI和BRII)传导信号。配体结合前，预制异源寡聚络合物中BMP受体的含量较低，但可测出。配体加入后，受体的主要部分才被募集到异源寡聚络合物中。为此，BMP2先与高亲和力受体BRI结合，再将BRII募集到信号传导络合物中。然而，在信号传导过程中，配体仍然需要与由BRII和BRI组成的预制络合物结合，这表明其可能介导激活构象变化。BMP2与预制受体络合物结合所诱导的信号激活Smad通路，而BMP2诱导的受体募集现象激活与Smad无关的不同通路，从而通过p38 MAPK诱导碱性磷酸酶活性。

“BMP2剂”包括如上所述通过结合和激活其受体而发挥与BMP2相似作用的分子。可用作BMP2剂的分子包括天然BMP2的衍生物、变体和生物活性片段。“变体”多肽系指以下定义的生物活性多肽，其与天然序列多肽的序列同一性小于100％。此类变体包括具有以下特征的多肽：在天然序列N端或C端或内部加入一个或多个氨基酸残基；约一个-四十个氨基酸残基缺失，可选地，被一个或多个氨基酸残基取代；以及上述多肽的衍生物，其中氨基酸残基经过共价修饰，所得产物具有非天然氨基酸。通常，生物活性变体具有氨基酸序列，其与天然序列多肽的氨基酸序列同一性为至少约90％、优选至少约95％、更优选至少约99％。变体多肽可经过天然或非天然糖基化，即，多肽具有与相应天然蛋白不同的糖基化模式。变体多肽可具有在天然BMP2蛋白上未发现的翻译后修饰。

可溶性BMP2的片段和融合蛋白，特别是生物活性片段和/或与功能结构域相对应的片段值得关注。目标片段具有一段与BMP2相同的氨基酸时，其长度一般为至少约10aa-至少约15aa，通常为至少约50aa，但通常不超过约142aa。例如，“长度为至少20aa”的片段旨在包括来自由BMP2 cDNA编码的多肽来源的20个或更多连续氨基酸。在此语境下，“约”包括以若干(5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸具体列举的值，或者更大或更小的值。由本发明范围内的多核苷酸编码本发明所述的蛋白变体。可使用遗传密码选择合适的密码子，从而构建相应的变体。可使用多核苷酸产生多肽，并使用多肽通过已知方法产生抗体。

在一些实施例中，在植入物(例如用于局部递送因子的基质或支架)中提供一定剂量的BMP2，其中BMP2为BMP2蛋白或其活性片段。可根据特定组织、植入物释放速率、植入物尺寸等信息确定有效剂量，也可由本领域技术人员凭经验确定有效剂量。此剂量可提供相当于1μg、10μg、100μg、1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、250mg、500mg、750mg、1gBMP2蛋白的生物活性。此剂量可在单个时间点给药(例如，作为单个植入物时)；或者可分次给药(例如，以微针配置交付时)。此剂量可根据需要给药1次、2次、3次、4次、5次、10次或多次，以达到预期效果，并且可每天、每2天、每3天、每4天、每周、每两周、每月或每隔更长时间给药一次。

VEGF是二硫化物连接的二聚46kDa糖蛋白，与血小板源性生长因子(“PDGF”)相关。其由正常细胞系和肿瘤细胞系产生；是一种内皮细胞选择性有丝***原；在体内测试***(例如兔角膜)中体现血管生成活性；对内皮细胞和单核细胞具有趋化性；并且在参与毛细血管形成期间细胞外基质蛋白水解降解的内皮细胞中诱导纤溶酶原激活因子。

本发明所述“VEGF抑制剂”系指任何削弱VEGF-VEGFR通路信号传导的物质。例如，VEGF抑制剂可以是小分子、肽、多肽、蛋白，更具体包括：抗体，包括抗VEGF抗体、抗VEGFR抗体、胞内抗体、巨型抗体、微型抗体、双抗体；Fc融合蛋白，例如肽抗体、受体抗体、可溶性VEGF受体蛋白和片段以及各种其他蛋白。许多VEGF抑制剂通过与VEGF或VEGF受体结合发挥作用。一些VEGF抑制剂通过与因子(与VEGF或VEGF受体或VEGF信号传导通路其他部分结合)的结合更间接地发挥作用。还有一些VEGF抑制剂通过改变调控VEGF通路信号传导的调节性翻译后修饰发挥作用。根据本发明所述的VEGF抑制剂还可通过更间接的机制发挥作用。无论涉及何种机制，与缺少抑制剂的相同情况相比，本发明所述VEGF抑制剂都会在给定情况下降低VEGF信号传导通路的有效活性。

在一些实施例中，在植入物(例如用于局部递送因子的基质或支架)中提供一定剂量的VEGF抑制剂。可根据特定组织、植入物释放速率、植入物尺寸等信息确定有效剂量，也可由本领域技术人员凭经验确定有效剂量。此剂量可提供相当于1μg、10μg、100μg、1mg、5mg、10mg、25mg、50mg、75mg、100mg、250mg、500mg、750mg、1g可溶性VEGF受体的生物活性。此剂量可在单个时间点给药(例如，作为单个植入物时)；或者可分次给药(例如，以微针配置交付时)。此剂量可根据需要给药1次、2次、3次、4次、5次、10次或多次，以达到预期效果，并且可每天、每2天、每3天、每4天、每周、每两周、每月或每隔更长时间给药一次。

文献描述了众多VEGF抑制剂。除下面进一步详述的VEGF抑制剂以外，其他VEGF抑制剂参见以下专利文件：US2003/0105091、US2006/0241115、US 5,521,184、US 5,770,599、US 5,990,141、US 6,235,764、US 6,258,812、US 6,515,004、US 6,630,500、US 6,713,485、WO 2005/070891、WO 01/32651、WO 02/68406、WO 02/66470、WO 02/55501、WO 04/05279、WO 04/07481、WO 04/07458、WO 04/09784、WO 02/59110、WO 99/450029、WO 00/59509、WO 99/61422、WO 00/12089、WO 00/02871和WO 01/37820，特别是涉及VEGF抑制剂的部分。

以下是一些特定VEGF抑制剂：ABT-869(Abbott)，包括口服制剂及密切相关的VEGF抑制剂；AEE-788(Novartis)(也称为AE-788和NVP-AEE-788等)，包括口服制剂及密切相关的VEGF抑制剂；AG-13736(Pfizer)(也称为AG-013736)，包括口服制剂及密切相关的VEGF抑制剂；AG-028262(Pfizer)及密切相关的VEGF抑制剂；Angiostatin(EntreMed)(CAS登记号：86090-08-6，也称为K1-4和rhuAngiostatin等)及密切相关的抑制剂，参见第5,792,825号和第6,025,688号美国专利等，特别是涉及Angiostatin及密切相关的VEGF抑制剂及其结构和特性、制备和使用方法的部分；Avastin^TM(Genentech)(也称为贝伐珠单抗、R-435、rhuMAB-VEGF，CAS登记号：216974-75-3等)及密切相关的VEGF抑制剂；AVE-8062(AjinomotoCo.和Sanofi-aventis)(也称为AC-7700和康普瑞汀A4类似物等)及密切相关的VEGF抑制剂；AZD-2171(AstraZeneca)及密切相关的VEGF抑制剂；(Bayer AG和Onyx)(CAS登记号：284461-73-0，也称为BAY-43-9006、raf激酶抑制剂、索拉非尼、索拉非尼类似物和IDDBCP150446等)及密切相关的VEGF抑制剂；BMS-387032(Sunesis和Bristol-MyersSquibb)(也称为SNS-032，CAS登记号：345627-80-7等)及密切相关的VEGF抑制剂；CEP-7055(Cephalon和Sanofi-aventis)(也称为CEP-11981和SSR-106462等)及密切相关的VEGF抑制剂；CHIR-258(Chiron)(CAS登记号：405169-16-6，也称为GFKI和GFKI-258等)及密切相关的VEGF抑制剂；CP-547632(OSIPharmaceuticals和Pfizer)(CAS登记号：252003-65-9等)及密切相关的VEGF抑制剂，例如CP-564959；E-7080(EisaiCo.)(CAS登记号：417716-92-8，也称为ER-203492-00等)及密切相关的VEGF抑制剂；786034(GlaxoSmithKline)及密切相关的VEGF抑制剂；GW-654652(GlaxoSmithKline)及密切相关的吲唑嘧啶Kdr抑制剂；IMC-1C11(ImClone)(也称为DC-101和c-p1C11等)及密切相关的VEGF抑制剂；KRN-951(KirinBrewery Co.)及其他密切相关的喹啉-尿素VEGF抑制剂；PKC-412(Novartis)(CAS登记号：120685-11-2，也称为苯甲酰星形孢菌素、CGP-41251、米哚妥林和STI-412等)及密切相关的VEGF抑制剂；PTK-787(Novartis和Schering)(CAS登记号：212141-54-3和212142-18-2，也称为PTK/ZK、PTK-787/ZK-222584、ZK-22584、VEGF-TKI、VEGF-RKI、PTK-787A、DE-00268、CGP-79787、CGP-79787D、瓦他拉尼碱、ZK-222584等)及密切相关的苯胺酞嗪衍生物VEGF抑制剂；SU11248(Sugen和Pfizer)(也称为SU-11248、SU-011248、SU-11248J、/>和苹果酸舒尼替尼等)及密切相关的VEGF抑制剂；SU-5416(Sugen和Pfizer/Pharmacia)(CAS登记号：194413-58-6，也称为司马尼布、204005-46-9等)及密切相关的VEGF抑制剂；SU-6668(Sugen和Taiho)(CAS登记号：252916-29-3，也称为SU-006668和TSU-68等)及密切相关的VEGF抑制剂，参见WO-09948868、WO-09961422和WO-00038519等，特别是涉及SU-6668及密切相关的VEGF抑制剂及其结构和特性、制备和使用方法的部分；VEGF Trap(Regeneron和Sanofi-aventis)(也称为AVE-0005和Systemic VEGF Trap等)及密切相关的VEGF抑制剂，参见WO-2004110490等，特别是涉及VEGF Trap及密切相关的VEGF抑制剂及其结构和特性、制备和使用方法的部分；沙利度胺(Celgene)(CAS登记号：50-35-1，也称为昔诺韦、Thalidomide Pharmion和泰洛米等)及密切相关的VEGF抑制剂；XL-647(Exelixis)(也称为EXEL-7647等)及密切相关的VEGF抑制剂；XL-999(Exelixis)(也称为EXEL-0999等)及密切相关的VEGF抑制剂；XL-880(Exelixis)(也称为EXEL-2880等)及密切相关的VEGF抑制剂；ZD-6474(AstraZeneca)(CAS登记号：443913-73-3，也称为Zactima和AZD-6474等)及密切相关的苯胺喹唑啉VEGF抑制剂；以及ZK-304709(Schering)(也称为CDK抑制剂(靛玉红衍生物)、ZK-CDK、MTGI和多靶点肿瘤生长抑制剂等)及其他密切相关的化合物，包括WO-00234717、WO-02074742、WO-02100401、WO-00244148、WO-02096888、WO-03029223、WO-02092079和WO-02094814所述的靛玉红衍生物VEGF抑制剂，特别是涉及上述及密切相关的VEGF抑制剂及其结构和特性、制备和使用方法的部分。

VEGF抑制剂可根据需要采用适合抑制剂性质的递送方式，例如，作为蛋白、小分子、核酸等，包括但不限于适当的溶媒和载体。

刺猬剂。本发明中使用的术语“刺猬剂”或“提供刺猬活性的药剂”系指任何在信号传导通路中提供与相应同源关联受体上天然刺猬蛋白相同的活性的药剂，例如，药剂可具有天然蛋白活性的至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％，或者可具有比天然蛋白更高的活性，例如2倍、3倍、5倍、10倍或更高活性。通过评估Ci靶基因转录、Ci加工等方式，可以确定活性水平。刺猬(Hh)蛋白是无脊椎动物和脊椎动物的多个发育过程所必需的分泌形态发生素。分泌活性Hh片段可调节近处和远处细胞的细胞活性。

Hh靶细胞在细胞表面表达Hh信号传导***的两种组分：12次跨膜蛋白Patched(Ptc)和7次跨膜蛋白Smoothened(Smo)。在没有Hh的情况下，Ptc抑制Smo的活性，使下游锌指转录因子Cubitus intereptus(Ci)在其C端进行蛋白水解加工，形成转录抑制因子。Hh与Ptc结合时解除Ptc对Smo的抑制，激活Smo使完整的Ci稳定下来，然后Ci作为转录激活因子，刺激靶基因的转录。哺乳动物有两种Ptc同源物，两者以相似的亲和力结合Hh蛋白，均可与哺乳动物Smo相互作用。Ptc1在整个小鼠胚胎中广泛表达，作为多种Hh蛋白的细胞外受体，本身通过Hh信号传导被上调。Ptc2在皮肤和***细胞中高水平表达。

脊椎动物有三种Hh蛋白：沙漠刺猬因子(Dhh)、音猬因子(Shh)和印度刺猬因子(Ihh)。这些蛋白在不同发育过程的调节方面都具有各种独特的功能。Dhh对于周围神经发育和***发生至关重要。Shh参与侧向不对称性、前后肢体轴线的建立以及中枢神经***的发育。Ihh是软骨内骨发育的主导调节因子。

刺猬蛋白最初合成为46kDa前体，具有两个不同的结构域：C端“hog”结构域在内质网内进行蛋白水解切割，随后N端“hedge”结构域被加工成19kDa片段(Hh-N)。C端作为胆固醇转移酶，将胆固醇基团共价连接到Hh氨基端片段Hh-N的羧基端。通过后期在Cys-24处加入棕榈酰基团，可以进一步修饰新生的Hh-N，产生称为Hh-Np的超疏水分子，从而实现对Hh-N的加工。Hh-N的加工发生在分泌通路中，由棕榈酰基转移酶介导，棕榈酰基转移酶由Skinny刺猬基因(Ski/Skn)编码。棕榈酰基的加入对于SHH功能至关重要。加入胆固醇和棕榈酸酯可提高SHH-Np的功效，而在N端加入亲水加合物可降低SHH的活性。

Genbank公开提供人刺猬蛋白等示例性刺猬蛋白的蛋白序列。本发明包括音猬蛋白亚型1(入藏号：NP_000184.1)；音猬蛋白亚型2(入藏号：NP_001297391.1)；印度刺猬蛋白(入藏号：NP_002172)；和沙漠刺猬蛋白(入藏号：NP_066382)，由此确定的各个序列通过本发明的具体引用，成为本发明的一部分。

与人patched或smoothened特异性结合的抗体在本领域中已知，或者可通过常规方法产生。可筛查此类抗体是否具有用于本发明所述方法的激动剂活性。可替代地，小分子激动剂在本领域中已知，参见：Frank-Kamenetsky等人(2002)《生物学杂志》1(2):10，所述出版物通过本发明的具体引用，成为本发明的一部分。特定目标激动剂包括但不限于N-甲基-N′-(3-吡啶基苄基)-N′-(3-氯苯并[b]噻吩-2-羰基)-1,4-二氨基环己烷、SAG1.1、SAG1.3、嘌***胺等，参见：Das等人(2013)《科学转化医学》5(201):201ra120；Carney和Ingham，《BMC生物学》201311:37等。

术语“骨骼干细胞”系指能够产生骨髓基质细胞、骨骼细胞和成软骨细胞的多能自我更新细胞。自我更新表示在有丝***过程中产生至少一个子细胞，即骨骼干细胞。多能表示能够产生祖细胞(骨骼祖细胞)，再由祖细胞产生骨骼***的所有细胞类型。非多能表示不能在体内产生其他器官的细胞。

通过非骨骼细胞，包括但不限于间充质干细胞以及包含此类细胞的脂肪组织，例如人脂肪干细胞(hAASC)，可以重新编程骨骼干细胞。诱导骨骼细胞具有天然功能性SSC的特征，即能够产生相同的谱系。人SSC具有第11,083,755号美国专利公开的表型，所述专利通过本发明的具体引用，成为本发明的一部分。

虽然本领域技术人员应理解，无需为了实现有效刺激而表征SSC的内源性群体，但可采用其细胞表面标志物表征人SSC细胞群。人SSC的CD45、CD235、Tie2和CD31表达呈阴性；平足蛋白(PDPN)表达呈阳性。一群具有该标志物组合的细胞，例如从骨组织分离的细胞，可称为[PDPN⁺/146^-]细胞。[PDPN⁺/146^-]群体可进一步细分为三个群体：能够成软骨的单能子集[PDPN⁺CD146^-CD73^-CD164^-]、能够成骨的单能细胞亚群[PDPN⁺CD146^-CD73^-CD164⁺]和能够进行软骨内(骨和软骨)骨化的多能[PDPN⁺CD146^-CD73⁺CD164⁺]细胞。对于CD45、CD235、Tie2和CD31以及PDPN，可从骨中分离用于本发明所述方法的目标细胞群。其他目标细胞群包括[PDPN⁺CD146^-CD73^-CD164^-]细胞；[PDPN⁺CD146^-CD73^-CD164⁺]细胞；以及[PDPN⁺CD146^-CD73⁺CD164⁺]细胞。

小鼠骨骼谱系表征为CD45-、Ter119-、Tie2-、αv整合素+。SSC进一步表征为Thy1-6C3-CD105-CD200+。

脂肪源性干细胞。脂肪源性干细胞或“脂肪源性基质细胞”系指源自脂肪组织的细胞。“脂肪”表示任何脂肪组织。脂肪组织可以是源自皮下、网膜/内脏、乳腺、性腺或其他脂肪组织部位的棕色或白色脂肪组织。优选地，脂肪是皮下白色脂肪组织。此类细胞可以是原代细胞培养物或永生化细胞系。脂肪组织可来自任何具有脂肪组织的生物。优选地，脂肪组织来自哺乳动物，最优选地，脂肪组织来自人类。脂肪组织的便利来源是吸脂手术，但脂肪组织来源或脂肪组织分离方法对于本发明而言并不重要。

脂肪组织富足，并且易于通过具有极低患者风险的收获方法获得。据估计，每克脂肪组织包含超过10⁴个干细胞(Sen等人，2001，《细胞生物化学杂志》81:312-319)，所述细胞可立即使用或冻存，用于将来自体或同种异体应用。

已有文献报告了人脂肪组织源性细胞的分离、扩增和分化方法。例如，参见：Burris等人，1999，《分子内分泌学》13:410-7；Erickson等人，2002，《生物化学与生物物理研究通讯》，2002年1月18日，290(2):763-9；Gronthos等人，2001，《细胞生理学杂志》189:54-63；Halvorsen等人，2001，《代谢》50:407-413；Halvorsen等人，2001，《组织工程》7(6):729-41；Harp等人，2001，《生物化学与生物物理研究通讯》281:907-912；Saladin等，1999，《细胞生长与分化》10:43-48；Sen等人，2001，《细胞生物化学杂志》81:312-319；Zhou等人，1999，《生物技术工艺》13:513-517。可通过胶原酶消化和差速离心从切碎的人脂肪组织中获得脂肪组织源性基质细胞[Halvorsen等人，2001，《代谢》50:407-413；Hauner等人，1989，《临床研究杂志》84:1663-1670；Rodbell等人，1966，《生物化学杂志》241:130-139]。

据报道，脂肪组织源性干细胞表达的标志物包括：CD13、CD29、CD44、CD63、CD73、CD90、CD166、乙醛脱氢酶(ALDH)和ABCG2。脂肪组织源性干细胞可以是从能够通过1个月以上培养增殖的脂肪组织中提取的纯化单核细胞群。

为了从组织中分离细胞，可使用适当的溶液进行分散或悬浮。此类溶液一般是平衡盐溶液，例如生理盐水、PBS、Hank's平衡盐溶液等，便利地包含胎牛血清或其他天然因子，与低浓度(一般为5-25mM)的可接受缓冲液组合使用。便利的缓冲液包括HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸缓冲液等。

可立即使用细胞群。可替代地，可在液氮温度下冷冻并长期保存细胞群，解冻后能够重复使用。在此类情况下，通常将细胞冷冻在10％ DMSO、50％血清、40％缓冲培养基或本领域通常用于以此类冷冻温度保存细胞的一些其他此类溶液中，并通过本领域公认用于解冻冷冻培养细胞的方式解冻。

可在各种培养条件下对脂肪细胞进行体外培养。培养基可以是液体或半固体，例如，包含琼脂、甲基纤维素等。细胞群可便利地悬浮在通常包含胎牛血清(约5-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)以及青霉素和链霉素等抗生素的适当营养培养基(例如Iscove's改良DMEM或RPMI-1640)中。在本发明的一个实施例中，在没有饲养层细胞(即没有血清等)的情况下持续培养脂肪细胞。培养物可包含细胞应答的生长因子。本发明定义的生长因子系指能够通过对跨膜受体产生特异性作用促进培养物或完整组织中细胞存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。

术语“再激活的效率”和“再激活效率”在本发明中可互换使用，系指细胞对生长和分化因子的应答能力，例如，脂肪组织细胞接触高剂量BMP2时产生iSSC的能力。换言之，与未发生接触的群体相比，细胞产生约1.5倍、约2倍、约3倍、约4倍、约6倍、约8倍、约10倍、约20倍、约30倍、约50倍、约100倍、约200倍或更多诱导细胞(例如iSSC)。

可采用所述方法治疗的哺乳动物物种包括犬科动物和猫科动物；马；牛；绵羊；等等，以及灵长类，特别是人类。实验研究可采用动物模型，特别是小型哺乳动物，例如鼠类、兔类等。

更具体地，本发明可用于治疗需要骨再生治疗的受试者，例如人类患者。此类受试者的示例包括患有骨折及其他病变的受试者，特别是老年人。其他病症包括骨关节炎、遗传缺陷、疾病等。患有以此类病症为特征的疾病和紊乱的患者将极大地受益于所述要求保护的未决发明的治疗方案。

本发明所述药物组合物的有效量系指具有以下作用的用量：在植入部位促进驻留SSC激活；提高已愈合骨骼的矿化水平和机械强度，增大正在愈合的骨痂，等等。例如，与适当的对照组相比，有效量的药物组合物将病变处的骨质量或矿化水平增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、优选约20％-约50％、更优选50％以上(例如约50％-约100％)，所述对照组通常为未经组合物治疗的受试者。

本发明所述的方法还可用于组合疗法，例如，与本领域已知疗法组合，用于缓解与前述疾病、紊乱和病症相关的症状。例如，旨在增加骨密度的疗法包括给予抗吸收药物和合成代谢药物，例如本领域已知的阿仑膦酸盐、利塞膦酸盐、伊班膦酸盐、唑来膦酸等。本发明所述的药物组合物与上述其他药剂的组合用药可提供以下优势：单个药物所需的剂量较低，并且不同药物的效果互补。

在一些实施例中，可选在植入物或支架中提供有效剂量的间充质干细胞(例如脂肪基质细胞，优选脂肪源性干细胞)以实现组织再生。有效的细胞剂量可取决于群体的纯度。在一些实施例中，有效剂量提供的脂肪源性干细胞剂量为至少约10²、约10³、约10⁴、约10⁵、约10⁶、约10⁷、约10⁸、约10⁹或以上，所述干细胞在细胞群中的浓度可以为约1％、约5％、约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或以上。

药物递送器械包括可植入并在靶部位释放活性剂(例如BMP2和CSF1抑制剂)的结构。植入式药物递送器械大致可分为两大类：被动植入物和主动植入物。第一类包括两个主要类型：可生物降解的植入物和不可生物降解的植入物。主动***依靠能源依赖性方法提供控制药物释放的驱动力。第二类包括渗透压梯度和机电驱动等器械。

被动聚合物植入物通常为相对简单的器械，不含活动件，依靠被动扩散来释放药物。其一般通过将药物包裹在生物相容性聚合物分子内制成。为了控制释放谱，可修改多个参数，例如：药物类型/浓度、聚合物类型、植入物设计和表面特性。被动植入物可分为两大类：不可生物降解的***和可生物降解的***。

不可生物降解的植入物通常由聚合物(例如硅酮、聚氨酯、聚丙烯酸酯)或共聚物(例如聚乙烯醋酸乙烯酯)制成。聚乙烯醋酸乙烯酯(PEVA)是乙烯和醋酸乙烯酯的热塑性共聚物。聚硅氧烷或硅酮是由硅和氧原子组成的有机硅聚合物材料。侧基可以是甲基、乙烯基或苯基。这些基团会影响聚合物的特性。聚硅氧烷因其热稳定性、生物相容性、化学惰性和弹性体特性的独特组合，广泛应用于医学领域。常用于医疗器械的硅酮经过室温下硫化处理。其采用催化剂(铂基化合物)由双组分聚二甲基硅氧烷(PDMS)制成。最终材料通过硅氢加成反应形成。另一种获得医疗应用硅酮的方法是使用包含羟基端基团的线性PDMS。该线性聚合物通过辛酸亚锡催化剂与低分子量四(烷氧基硅烷)交联。

此类器械可以是整体型或储存型植入物。整体型植入物通过将药物均匀分散在聚合物基质中制成。而储存型植入物包含覆有不可生物降解的渗透膜的致密药物核心。膜的厚度以及药物对膜的渗透性会影响释放动力学。

可生物降解的植入物由可分解成更小碎片而后被身体排出或吸收的聚合物或嵌段共聚物制成。其通常由胶原、PEG、甲壳质、聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)等聚合物制成。也可采用许多其他可生物降解的聚合物进行药物递送，包括：聚酰胺、聚酸酐、聚磷腈和聚二氧环己酮。聚酸酐因其低水解稳定性导致高降解速率，适用于短期受控递送***。对于聚磷腈，通过特定化学基团的适当取代，可以微调降解速率，并且研究表明此类聚合物可用于骨骼组织再生和药物递送。与PCL相似，聚二氧环己酮也是一种聚内酯，已用于药物递送和组织工程等用途。其会被患者身体降解，因此植入后无需取出。可将其制造为整体型植入物和储存型植入物。除生物聚合物(例如上述PLA)以外，一些天然聚合物也具有广泛的应用前景，包括用于植入式器械。此类天然聚合物包括胶原、透明质酸、纤维素、壳聚糖、蚕丝及其他天然蛋白，以及胶原蛋白、明胶、白蛋白、弹性蛋白和乳蛋白。这些材料因与传统材料(金属和陶瓷)或合成聚合物相比具有一定的优势，例如生物相容性、生物降解性和非细胞毒性，成为植入式药物递送器械应用的理想之选。

动态或活性聚合物植入物具有控制药物从器械中释放的积极驱动力。此类植入物大多是由金属材料制成的电子***。动态药物递送植入物主要是泵式植入物。聚合物活性植入物的主要类型是渗透泵。此类器械主要由包围储药器的半透膜形成。膜应设有允许药物释放的孔口。在渗透梯度下，流体稳定地流入植入物内。这一过程导致植入物内的压力增加，使药物通过孔口释放。这种设计实现了持续药物释放(零级动力学)。此类器械的释放速率良好，但载药量有限。

在一些实施例中，将因子制备为可注射的糊剂。可将糊剂注射到植入部位。在一些实施例中，可在植入前制备糊剂和/或在需要使用前将糊剂以低于环境温度的温度储存在注射器中。在一些实施例中，与骨粘固剂的用途相似，通过注射给予合成物，可以将骨碎片连接并固定到位，或者提高用于代替关节中受损软骨的髋假体等器械的粘附力。也可在非开放手术环境中进行植入。

在其他实施例中，将因子制备为可成型的油灰。可将水合移植油灰制备并模制成与任何植入物相似的形状。然后，可将油灰压入到位，以填充软骨、骨、牙槽或其他部位的空隙。在一些实施例中，移植油灰可用于修复不愈合骨的缺陷或用于下述其他情况：待填充的裂缝、孔洞或空隙很大，植入材料需要具有一定程度的机械完整性，才能在填充间隙的同时保持其形状不变。

用于药物用途的***，即包含因子的药物递送器械，根据预期制剂可包括药学上可接受的无毒稀释剂载体，即通常用于针对动物或人类给药配制药物组合物的溶媒。选用的稀释剂不影响组合的生物活性。此类稀释剂的示例包括蒸馏水、缓冲水、生理盐水、PBS、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank's溶液。此外，NR药物组合物或制剂可包括其他载体、佐剂或无毒的非治疗性、非免疫原性稳定剂、辅料等。所述组合物还可包括为了接近生理条件而附加的物质，例如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂和去污剂。

所述组合物还可包括多种稳定剂中的任何一种稳定剂，例如抗氧化剂。药物组合物包含多肽时，多肽可与各种众所周知的提高多肽体内稳定性或以其他方式增强其药理学特性(例如，延长半衰期，降低毒性，提高可溶性或吸收量)的化合物络合。此类修饰或络合剂的示例包括硫酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐。组合物的多肽还可与增强其体内特性的分子络合。此类分子包括碳水化合物、多胺、氨基酸、其他肽、离子(例如钠、钾、钙、镁、锰)和脂质等。

有关适合各种给药类型的制剂的进一步指导，参见：《雷氏药学大全》，马克出版公司，宾夕法尼亚州费城，第17版(1985)。有关药物递送方法的简要综述，参见：Langer，《科学》249:1527-1533(1990)。

药物组合物，即因子和/或细胞组合，经给药可用于预防性和/或治疗性治疗。可在细胞培养物和/或实验动物中根据标准制药程序测定活性成分的毒性和治疗功效，包括测定LD50(致死群体50％的剂量)和ED50(有效治疗群体50％的剂量)等。毒性作用与治疗作用的剂量比即为治疗指数，可用比率LD50/ED50表示。本发明优选采用具有较大治疗指数的化合物。

可使用通过细胞培养和/或动物研究获得的数据制定适用于人类的剂量范围。活性成分的剂量通常在包含ED50的低毒性循环浓度范围内。在该范围内，剂量可因所用剂型和给药途径而异。

用于配制药物组合物的组分优选具有高纯度且基本不含潜在有害污染物(例如，至少国家食品(NF)级，通常至少分析级，更通常至少医药级)。此外，在体内使用的组合物通常无菌。如果必须在使用前合成给定化合物，所得产物通常基本不含任何潜在有毒物质，特别是合成或纯化过程中可能存在的任何内毒素。用于非消化道给药的组合物也无菌、基本等渗且在GMP条件下制成。

向特定患者给予的治疗组合物的有效量取决于多种因素，其中一些因素因患者而异。称职的临床医生能够根据需要确定为了阻止或逆转病情进展而向患者给予的治疗剂有效量。利用LD50动物数据以及药剂的其他可用信息，临床医生可根据给药途径针对个体确定最大安全剂量。例如，考虑到鞘内给药的流量更大，治疗组合物的静脉给药剂量可大于鞘内给药剂量。同理，从体内快速清除的组合物可按较高剂量给药，或者为了保持治疗浓度，可重复给药。称职的临床医生能够运用普通技能在常规临床试验过程中优化特定治疗剂的剂量。

治疗方法

本发明提供了为老年人或其他动物受试者治疗骨病变或其他损伤(需要使骨生长)的方法，包括向相应部位施用包含本公开所述因子组合的组合物，例如BMP2和CSF1抑制剂组合。所述因子可与粘固剂、凝胶等物质相结合。如本发明所述，此类病变包括任何不适合生理或美容目的的骨骼组织相关病症。此类缺陷包括先天性缺陷、疾病或创伤造成的缺陷以及手术或其他医疗程序造成的缺陷。例如，此类缺陷包括由手术过程、种植牙、骨关节炎、骨质疏松症、感染、恶性肿瘤、发育畸形等因素造成的缺陷。

可采用本发明所述的方法治疗有骨骼再生需求的个体。骨再生治疗可用于各种部位，包括但不限于肋骨、长骨、指骨、面骨、膝关节、肘关节、指骨中的关节、肩关节、髋关节、腕关节、踝关节等。个体可以是成年人，例如壮年人，也可以是老年人，例如年龄在55岁以上、60岁以上、65岁以上、70岁以上的人，等等。

损伤发生时，植入或以其他方式放置药物递送器械，以提供有效剂量的药剂组合。可单独提供或以单一组合物(即因子预混组合物)的形式提供因子。可按相同摩尔比或不同摩尔比提供因子，例如，其中BMP2蛋白与抗CSF1之比为约1:20、1:10、1:5、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、5:1、10:1、20:1等(重量比)。可在治疗过程中一次或多次提供因子。例如，可向个体提供包含因子的植入物，并在治疗过程中提供附加因子和/或细胞。

在许多情况下内源性SSC足以实现再生，但可选在局部急性损伤部位提供外源性细胞。细胞可以是SSC或非SSC，例如间充质干细胞、脂肪干细胞等。细胞可以是自体或同种异体细胞。细胞可与生长因子联合提供(例如同时、之前不久、之后不久等)，并且可与生长因子并入单个植入物中，作为单独的植入物或注射剂等。

实验性示例

以下示例旨在向本领域普通技术人员全面公开和说明如何制作并使用本发明，而非限制发明人认定的发明范围，亦不代表以下实验是所进行的全部或唯一实验。本发明已尽最大努力确保所用数字(例如数量、温度等)的准确性，但读者仍应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份数，分子量为重量平均分子量，温度单位为摄氏度，压力为大气压力或接近大气压力。

示例1

老化骨骼干细胞会产生损害骨骼完整性的炎性生态位。

骨骼衰老和疾病与负责维持骨组织完整性的成骨细胞和破骨细胞的相反作用失衡相关。在本发明中，我们通过详细的功能和单细胞基因组研究表明，真实小鼠骨骼干细胞(SSC)的内在衰老会改变骨髓生态位信号传导，使骨骼和血液谱系分化偏斜，导致易碎骨再生不良。老化SSC降低了骨和软骨形成潜能，但会产生更高频率的基质谱系，表达高水平的促炎和促吸收细胞因子。单细胞转录组研究将功能丧失与老年小鼠SSC转录组多样性减少联系起来，从而有助于骨髓生态位的转化。通过异时异种共生使全身暴露于年轻循环，减少了炎症和成髓，但无法逆转老化SSC骨软骨形成活性的减弱，并且不足以改进老年小鼠的骨质量和骨骼愈合参数。使用年轻造血干细胞(HSC)对老年小鼠进行造血重建，也未能改善骨完整性和修复。相反，老化SSC谱系促使骨髓偏斜，这表明SSC源性细胞是造血衰老的单向驱动因素。我们发现，只有通过局部施用组合疗法，再激活老化SSC，同时减少有利于炎性环境的造血细胞串扰，才能逆转老年小鼠骨再生不足。该疗法扩大功能性SSC池，调节破骨细胞形成，将骨愈合能力提高到年轻水平。我们的研究结果为骨骼衰老背后复杂的多因素机制提供了深入见解，并在恢复老化骨骼***活力方面开拓了新的前景。

结果

年龄相关骨质流失和再生能力下降与骨骼干细胞池缩减和谱系输出偏斜同时发 生。与先前报告一致，我们在2月龄(‘2-mo’)和24月龄(‘24-mo’)C57BL/6J雄性小鼠之间观察到年龄依赖性骨骼稳态衰退。老化骨骼表型与骨构造的明显变化相关，包括生长板衰减、骨矿物质密度(BMD)降低和小梁骨质量减少(图5a-c)。此外，通过钙黄绿素标记、体内骨形成测量和重塑，我们发现活性基质矿化水平显著下降(图5d)。利用横向股骨干中段骨折模型，我们还观察到衰老小鼠骨骼再生能力差异。愈合股骨的射线照相和组织学分析表明，‘24-mo’小鼠形成的骨痂明显更小，并且机械强度测试表明，这些骨痂在骨折后第21天更容易再次骨折(图5e-g)。骨折后多个时间点的显微CT测量证实，‘24-mo’骨痂的体积较小，矿化水平明显较低(图5h-i)。总而言之，上述数据显示，老化骨骼表型的特征为稳态和再生骨形成能力均下降。

出生后许多器官由组织驻留干细胞维持和修复，新出现的证据表明，年龄相关组织功能衰退的原因是干细胞活性损失。为了确定干细胞活性(包括增殖和分化能力)下降是否可能导致小鼠骨骼表型老化，我们接下来重点研究骨形成细胞类型的细胞起源。在先前研究中，我们介绍了自我更新的纯化小鼠和人骨骼干细胞(SSC)，其通过多能骨-软骨-基质祖细胞(BCSP)，产生骨、软骨和基质的专能谱系细胞，但不产生脂肪(图6a-c)。基质细胞群进一步分为在体外支持短期造血祖细胞和骨髓细胞群的Thy1+子集，以及维持淋巴细胞形成和造血干细胞(HSC)的6C3+子集。我们还观察到，与胚胎SSC相比，成年SSC谱系中所有CD51⁺Thy1^-6C3^-CD105^-细胞的CD200均呈阳性，无法进一步分离成SSC和前BCSP(图6d)。鉴于早期报告表明SSC在骨骼维持和再生方面发挥作用，似乎可以合理地推断SSC活性下降是骨骼表型老化的原因。

我们先前使用在Actin启动子作用下具有他莫昔芬诱导型泛表达Cre的Actin-Cre^ERT Rainbow(“Rainbow”)小鼠，在出生后第3天长骨的生长板中证实了克隆骨骼发生位置，该位置符合SSC的荧光激活细胞分选(FACS)检测结果和干细胞活性的存在性。在本发明中，我们在骨骼再生环境中使用Rainbow模型(已知可刺激SSC活性)比较‘2-mo’与‘24-mo’骨痂的克隆活性。我们对小鼠诱导股骨横向骨折，在损伤后第3天和第5天使用他莫昔芬治疗小鼠，以激活Cre重组酶(图1a)。我们发现，在骨折后第10天，与‘24-mo’小鼠相比，2-mo小鼠愈合骨痂的克隆活性显著增加，并且克隆包含更多后代(每个克隆≥5个细胞)(图1b-d)。

然后，我们利用FACS从未受伤骨和断裂骨中分离SSC和BCSP，观察到细胞总数随着年龄的增长而相应地减少(图1e-g)。此外，24-mo骨痂中CD49f表达SSC和BCSP的患病率和克隆活性显著降低，研究表明与稳态相比SSC和BCSP具有更强的成骨能力(图1h)。这些变化与增殖率显著降低相关，而细胞凋亡率通常较低，但在‘24-mo’小鼠中略有升高(图1i-j)。最后，流式细胞术分析表明，在体外培养过程中以及体内骨折损伤的诱导下，‘24-mo’小鼠的下游SSC谱系输出转向促骨髓Thy1+，远离6C3+基质(图1k和图6e-f)。总而言之，上述数据显示，骨骼表型老化与小鼠体内SSC活性降低和SSC谱系输出转变相对应。

小鼠SSC表现出内在衰老。接下来，我们从‘2-mo’和‘24-mo’小鼠中分离SSC和BCSP，比较其在体外和体内生成骨骼组织的内在能力。无论年龄如何，SSC和BCSP的集落形成能力均明显高于下游细胞群，这表明SSC/BCSP的表面标志物谱在‘24-mo’小鼠中得以保留(图7a)。与我们在Rainbow小鼠中观察到的结果一致(图1a-d)，从24-mo骨中分离的SSC和BCSP在体外产生的集落更少、更小(图7b-c)。另外，其成骨能力降低，体外成软骨能力也显著降低，这符合先前报告，即长骨SSC通过软骨中间体形成骨(图1l)。值得注意的是，我们还观察到，即使在体外高度成脂诱导条件下，年轻和老化SSC也都不会经历成脂分化(图7d)。

为了研究体内内在骨骼形成潜能，我们利用FACS从患有或未患有骨折的‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的骨骼中纯化3,000个GFP标记SSC和BCSP，将其移植到‘2-mo’免疫低下NSG小鼠的肾小囊下方。四周后，组织学和μCT分析表明，‘2-mo’SSC和BCSP形成了具有异位骨髓腔的坚固移植骨。相比之下，‘24-mo’SSC和BCSP形成的移植物更小，矿化水平更低(图1m-n和图7e-f)。与先前研究一致，与未受伤骨相比，从断裂骨中分离的SSC和BCSP形成的小骨看起来更大(图7e-f)。然而，即使离开骨折环境，衰老也会降低SSC的骨骼形成潜能。更进一步地，通过用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)对移植物进行破骨细胞活性染色发现，老化移植物的骨吸收更强，这意味着老化SSC产生的移植物会刺激破骨细胞活性提高(图1o)。综上所述，将老化SSC和BCSP移植到青年小鼠体内未能提高其骨骼形成潜能，这表明其功能衰退由细胞自主变化导致，而且老化骨骼谱系会产生增强骨吸收的因子。

暴露于年轻血液无法恢复SSC功能和骨骼参数。先前研究表明，暴露于年轻血液可以逆转骨骼肌、心脏和脑组织的年龄相关变化。由于向年轻宿主体内进行异位移植未能恢复老化SSC活性，我们想知道通过异时异种共生暴露于年轻体循环是否可以使SSC在其内源性微环境中复原。我们先前已证明SSC不会全身迁移；因此，异种共生生物之间的骨骼形成活性差异很可能是由于循环因子的影响。为了检验这一假设，我们通过手术连接‘2-mo’和‘24-mo’小鼠，生成异时对，并建立‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的等时对，以便进行比较(图2a)。经确认，两周异种共生生物出现外周血嵌合现象(图8a)。在异种共生的第四周，μCT测量结果表明，与等时青年(IY)小鼠相比，异时老年(HA)小鼠的股骨BMD仍然明显更低(图2b)。相反，与IY对照组相比，暴露于老化血液显著降低了异时年轻(HY)股骨的BMD。与IY对照组相比，异时异种共生还显著降低了两种异种共生生物的骨骼谱系细胞频率，而在异时小鼠与IA小鼠之间未观察到骨骼谱系细胞频率的显著差异(图2c和图8b)。

接下来，为了测试异时异种共生对骨骼再生的影响，在异种共生四周后，我们对每个异种共生生物诱导股骨横向骨折。我们发现，骨痂尺寸(愈合应答指标)最初在HA异种共生生物中增大，在HY异种共生生物中减小，但在损伤后第21天未观察到显著变化(图8c-d)。更进一步地，与IA对照组相比，从HA小鼠中收获的愈合骨痂的BMD并未改善(图2d)。与等时对照组相比，HA异种共生生物愈合股骨的SSC/BCSP频率也未显著改善(图8e)。此外，从HA骨痂中分离的SSC的体外成骨和成软骨潜能仍然与IA源性SSC相似，并且与IY SSC相比显著降低(图2e-f)。值得关注的是，暴露于老化血液未影响从HY小鼠中收获的愈合股骨骨痂的BMD和SSC活性，这与我们在未受伤HY股骨中的发现相反(图2d-f和图8e)。总体上，这些结果表明，在稳态异时异种共生过程中，老年小鼠循环中的因子可对年轻SSC谱系产生消极影响。因此，SSC衰老的起因可能是预激事件形成一种内在老化状态，导致此类细胞此后对生理浓度的血液传播因子不敏感。

骨髓谱系过度生成是HSC衰老的标志，已被归因于年龄相关促炎细胞因子过量。在异时异种共生情况下，两个年龄组中纯化SSC的促炎标志基因的表达均较低(图8f)。与IA小鼠相比，HA促肌原性、破骨细胞Rankl和骨吸收标志物Ctx1的血清含量降低，但与IY小鼠相比，HY骨折部位的破骨细胞活性升高(图8g-j)，这表明局部微环境可能发生改变，至少通过SSC谱系成分的变化和Rankl以外因子的参与而发生部分改变。令人惊讶的是，来自每个异种共生生物的表型HSC在移植到致死性照射的年轻受体体内后均表现出IY、HY和HA源性细胞的平衡谱系输出，而IAHSC主要产生骨髓谱系(图2g)。这些发现表明，虽然无法排除HA小鼠体内存在年轻HSC循环，但是与SSC不同，暴露于年轻血液传播因子能够对老化HSC重新编程，使其像年轻HSC一样发挥作用。

老化SSC谱系细胞促进骨髓偏向HSC输出。根据上述发现，我们接下来测试了从SSC到HSC谱系细胞的单向串扰的可能性。与骨髓偏向24-mo小鼠HSC的移植相比，淋巴偏向胎肝源性HSC的移植未能改善‘2-mo’或‘24-mo’受体的BMD或骨折愈合(图8k-m)。可替代地，使用‘2-mo’GFP标记HSC重建的致死性照射‘2-mo’或‘24-mo’小鼠在第12周表现出相当的嵌合状态，但其供体源性外周血成分存在显著差异。特别是，‘24-mo’小鼠表现出骨髓偏向性，但淋巴输出减少(图2h-i和图8n)。骨髓分析表明，与‘2-mo’小鼠相比，‘24-mo’小鼠的供体源性Lin-Sca1+ckit+Flt3-CD34-HSC包含更大比例的骨髓偏向CD150/Slam^高表达细胞(图2j和图8o-p)⁹。与此观察结果一致，在第12周，‘24-mo’小鼠体内移植骨髓细胞的频率明显从产生共同淋巴祖细胞(CLP)转向产生骨髓谱系，包括巨核细胞-红细胞祖细胞(MEP)、粒细胞-单核细胞祖细胞(GMP)和CD11b表达单核细胞(图2k和图8p)。我们发现，如果在相同动物中诱导双皮质骨折，则与2-mo小鼠相比，在24-mo小鼠第10天的骨痂部位观察到明显更多的供体源性TRAP阳性破骨细胞区域，这证实了上述结果(图8q-r)。为了研究骨骼和造血谱系之间的串扰，我们通过FACS从2-mo和24-mo小鼠中分离SSC，将其扩增到融汇状态，使用1,000个纯化GFP标记HSC共培养各组(图2l)。共培养六天后，我们分析GFP阳性细胞，发现与‘2-mo’SSC相比，‘24-mo’SSC主要通过共培养的HSC产生骨髓输出。值得注意的是，单独培养的HSC在很大程度上仍然保持非专能性(图2l)。随后将这些共培养物移植到致死性照射的2-mo受体小鼠体内时，原先暴露于‘24-mo’SSC的造血细胞继续促进外周血中的骨髓扩增(图2n)，并以CLP群体为代价提高CMP、GMP、MEP和CD11b+输出(图2o和图8s)。总而言之，上述发现表明，年轻造血干细胞无法重建年轻骨骼生理机能，而老化SSC谱系细胞直接导致造血***的年龄相关功能变化。

单细胞转录组分析揭示了SSC衰老的分子基础。我们认为，多种组织的年龄依赖性生理衰退在干细胞层面注定会发生。HSC研究证实了这一范式，同时表明可利用靶向特定年龄相关干细胞程序的重新编程技术逆转衰老。为了确定SSC衰老是否也与特征性转录变化相关，我们通过FACS从出生后第3天(‘0-mo’)、‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的长骨中纯化表型SSC，以便进行全长SmartSeq2单细胞RNA测序(scRNAseq)。通过分析经过过滤的高质量单细胞，我们发现24-mo SSC的总基因计数明显较低，但不同年龄组的SSC之间最高表达基因的转录组相似性很高(图3a-b和图9a-b)。细胞分析表明，所有细胞中与细胞凋亡或衰老相关的基因均未显著表达，这与2-mo和24-mo SSC之间端粒酶活性保持不变相符(图9c-e)。值得注意的是，如组织解离方案所述，我们在单个SSC中观察到应激诱导的基因表达，但仅限于来自‘2-mo’小鼠的细胞(图9f)。这可能表明‘2-mo’SSC的环境感知更敏感，反之至少在某种程度上解释了该组在异种共生实验过程中暴露于老化血液时的强烈应答。

为了探索SSC的异质性，我们进行了Leiden聚类(图3a-b和补充表1)。应激相关基因的表达、每个细胞的测序片段总计数和细胞周期状态对簇分布均未产生显著影响(图9g-j)。我们鉴定了八个亚群，其转录组图谱存在细微差异，代表不同SSC子集的潜在预激阶段(图3c)。根据经过富集的基因，我们将簇注释为：成软骨‘Chondro’(Col2a1、Chad、Itm2a)群体；成骨，分为‘Early-Osteo’(Sox9、Nid2、Sp7)、‘Osteo-1’(Ptn、Postn、Igf1)和‘Osteo-2’(Bglap、Cadm1、Car3)细胞类型；以及基质，包括细胞外基质基因表达‘Stromal-1’(Gne、Ace、Epcam)和促造血‘Stromal-2’(Gas6、Cxcl12、Csf1)细胞，以及未来有必要进一步研究的‘Gabra2-阳性’(Gabra2)群体(图3a-c)。通过进行CytoTrace分析来检测分化状态和Velocyto的变化以推断其轨迹，我们可以将其余簇注释为潜在SSC‘Root’(Prg4、Cytl1、Mn1)(图3d和图9k)。相应地，所有年龄组的SSC均出现在‘Root’簇中。年轻‘0-mo’和‘2-mo’SSC存在于每个簇中，但对‘Chondro’、‘Osteo-1’和‘Stromal-1’具有特异性，这意味着青年时期涉及多种不同的命运决定程序。相比之下，‘24-mo’SSC在促造血‘Stromal-2’簇中最丰富，这总体表明衰老过程中转录决定的谱系动态经过转变和限制，例如，解释了成软骨分化和体内小骨形成能力的大幅下降(图1l-n)。总而言之，上述结果表明，老化SSC的功能衰退与转录组多样性丧失相关，从而限制发育潜能。

进一步探讨衰老所引起的特定基因表达差异时，我们发现24-mo SSC富含与骨形成减少(Lrp4、Ecm1)和骨吸收增加(B2m、Rarres2、Marcks、Csf1)相关的基因(图9l)。基于24-mo组与青年组之间差异表达的生物过程基因本体分析还表明，基因富集与单核细胞/巨噬细胞趋化性增加相关，这证实了在功能实验中观察到的促骨髓轴线(图2和图9m)。总而言之，上述发现提供了一种分子基础，通过该分子基础，老化SSC丧失骨骼形成潜能，同时增加与造血区室的相互作用，最终有助于提高破骨细胞形成水平。

老化SSC谱系通过Csf1表达产生促破骨细胞生态位。由于干细胞相对罕见，并且基于干细胞的缺陷很可能由其后代遗传，我们推断下游SSC谱系中存在类似的基因表达变化。因此，我们将转录组分析扩展到‘0-mo’、‘2-mo’和‘24-mo’SSC、BCSP、Thy1+和6C3+细胞的详细全基因组微阵列数据。根据证实炎性破骨细胞形成的图谱，结果确实表明所有谱系群体均出现明显的年龄相关转变(图3e)。值得关注的是，Rank1和Csf1作为破骨细胞成熟的充分必要因子⁴⁰，具有特定的表达模式(图10a)。Rankl在‘2-mo’和‘24-mo’时表达水平相对较高，但Csf1在24-mo小鼠的所有四个亚群中均表现出明显的提升。为了在功能上测试老化骨骼是否对这两种促破骨因子更敏感，我们在体外向‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的全骨髓中加入Rankl和Csf1。我们发现‘24-mo’骨髓产生更多且更大的破骨细胞，并且这些破骨细胞与从‘2-mo’骨髓分化而来的破骨细胞相比具有更强的吸收活性(图3f-j)。我们还发现SSC谱系特异性Csf1表达与GMP和单核细胞上强大的Csf1r相匹配，老化SSC与HSC共培养时，造血细胞类型的频率增加(图2n-o、图3k和图10b-c)。上述综合观察结果和先前报告表明，通过中和Csf1，可以预防卵巢切除术诱导的骨质流失，我们认为Csf1是对抗老化SSC谱系促骨髓分泌组的特定治疗靶标。

然后，我们在体外对FACS纯化SSC和BCSP的Csf1分泌进行定量，并通过Luminex检测进行测定，发现24-mo细胞Csf1分泌水平升高(图3l)。我们还发现‘24-mo’细胞分泌更多的促炎Ccl11(Eotaxin1)和更少的促骨软骨形成Tgfβ(图10d)。接下来，我们通过Luminex检测研究‘2-mo’和‘24-mo’小鼠的全身炎性状态，发现老年小鼠血清中炎性因子(例如Il1b、Il10、Tnfa)普遍增加(图10e)。然而，Csf1、Ccl11和Tgfβ的全身水平在‘2-mo’和‘24-mo’小鼠之间没有显著差异，这表明SSC谱系的蛋白分泌仅限于局部生态位环境内(图10f)。此外，‘2-mo’、‘12-mo’和‘24-mo’小鼠骨折骨痂SSC的批量RNA测序基因表达谱证实了我们的稳态SSC转录组分析结果，包括促造血细胞和促骨髓因子的年龄依赖性上调以及促骨骼形成基因的下调(图10g)。具体地，Csf1的表达在24-mo骨折源性SSC中保持高水平(图3m)。

我们还测试了Csf1的增加是否影响骨维持和再生。我们采用所定义的释放动力学对‘2-mo’小鼠股骨骨折施用包含重组Csf1的水凝胶，并通过μCT和流式细胞术进行测量，发现愈合受到影响，而SSC频率保持不变(图3n和图11a-c)。我们还发现，无论性别如何，15月龄单倍不足Csf1小鼠的股骨具有更高的机械强度，以及更大的BMD、骨体积和小梁厚度(图3o和图11d-f)。然而，出乎意料的是，与野生型对照组相比，骨折后第21天从转基因小鼠中收获的股骨具有更大的BMD和相似的骨痂体积，但其机械强度降低(图3p-q和图11g)。这类似于增加骨骼脆弱性的骨硬化症状态，表明在支持健康骨重塑方面需要严格控制Csf1水平。总而言之，SSC谱系源性Csf1可能通过刺激破骨细胞活性升高来加强骨吸收，并且需要维持和精细平衡该活性才能适当保持骨健康。

通过组合靶向老化SSC分化缺陷和促吸收信号传导，可以将骨再生恢复到年轻水 平。我们的研究结果表明，老化SSC不仅丧失骨软骨形成活性，还通过产生炎性促破骨细胞生态位增强骨吸收。我们假设通过局部靶向每个上述通路，可以恢复老年小鼠骨再生。为了检验这一假设，我们制备了包含强效骨诱导剂Bmp2(5μg)、Csf1拮抗剂(“aCsf1”；2μg“低”水平或5μg“高”水平)、这两种因子的组合或PBS的水凝胶。我们向‘24-mo’小鼠的股骨横向骨折施用这些水凝胶，评估骨折后第10天和第21天的愈合情况(图4a)。接受含PBS水凝胶治疗的‘2-mo’小鼠作为对照组。‘24-mo’小鼠接受组合治疗时，骨折后第10天的骨痂指数仅与‘2-mo’对照组保持相似(图4b-c)。与‘2-mo’对照组相比，单独使用Bmp2治疗的‘24-mo’小鼠的骨痂明显更小，但这些骨痂的流式细胞术表明Bmp2将SSC和BCSP频率提高到年轻水平。这种SSC和BCSP频率增加在采用低水平aCsf1的组合治疗组中也明确可见(图4d和图12a)。尽管如此，在骨折后第21天，所有‘24-mo’Bmp2和aCsf1治疗组形成的矿化组织数量均与‘2-mo’对照动物相当(图12b)。据我们观察，Csf1的遗传消融不利于骨折修复(图3q-r)，与之一致的是，我们发现低水平(而非高水平)aCsf1和Bmp2的组合将‘24-mo’愈合股骨的机械强度补救到年轻骨骼的机械强度(图4e)。值得注意的是，在经低水平aCsf1和Bmp2组合治疗的‘24-mo’小鼠中，骨折骨痂的SSC具有年轻集落形成和成骨能力，这表明恢复活力的干细胞的特征与愈合结果的改善相关(图4f-g)。在分子方面，与‘24-mo-PBS’组相比，‘24-mo-aCsf1低+Bmp2’补救小鼠第10天骨折骨痂的10X scRNAseq表明，非造血细胞类型中骨软骨形成基因的表达水平更高(图4h和图13a-c)。在成分方面，‘24-mo-aCsf1低+Bmp2’补救骨折骨痂具有更高的骨形成细胞分数，包括表型SSC(簇2和4)，而‘24-mo-PBS’对照组的免疫细胞具有更高的丰度且几乎完全源自骨髓(图13d-f)，这证实了治疗的作用。在富含造血细胞的簇(6和9)内，与预期一样，愈合骨骼组织中破骨细胞、巨噬细胞和中性粒细胞占主导地位(图4i-j和图13g)。与‘24-mo-PBS’对照组的晚期破骨细胞标志物(Ctsk、Cd68、Acp5)相比，‘24-mo-aCsf1低+Bmp2’补救治疗降低了总体骨髓细胞患病率，提高了前破骨细胞基因(Csf1r、Trem2、Rankl/Tnfrsf11a)的表达水平，这证实aCsf1的存在可增强对破骨细胞成熟的抑制作用(图4k-m)。总而言之，上述数据显示，通过局部暂时施用Bmp2刺激SSC激活，结合使用低水平aCsf1限制骨吸收，可以将老化骨骼的骨再生恢复到年轻水平(图50)。

该研究从真实干细胞角度解决了骨骼衰老的复杂性。骨与造血***密切相关，这种相互作用对于保持骨、血液和免疫***健康至关重要。在本发明中，我们研究了衰老引起的骨骼与造血干细胞谱系之间相互作用的变化。首先，我们发现老年小鼠仍然具有由与青年小鼠相同的表面标志物识别的表型SSC。其次，我们证明了骨衰老根源于SSC层面的细胞内在变化，而这种变化最终使骨骼和造血谱系输出偏斜，降低骨完整性并限制愈合能力。最后，通过靶向SSC自主和非自主活动，可以增强局部SSC谱系活性，同时精细调控促破骨细胞活性，从而恢复受到衰老影响的再生能力。

迄今为止，干细胞衰老研究的最佳示例是HSC***。我们对老化SSC进行的详细研究提供了干细胞区室之间一些值得关注的比较。尽管已知HSC随着年龄的增长而扩增，但我们证明SSC的频率随着年龄的增长而下降。SSC池耗尽可能导致骨骼退化，而骨骼再生能力自然会受到抑制。但是，scRNAseq数据显示，SSC群体随着年龄的增长而丧失转录组多样性，这表明功能不同的SSC亚群的克隆选择也可能导致骨骼表型老化。

HSC设置了年龄依赖性“克隆骨骼发生”模型的先例，其中谱系偏斜亚群的克隆扩增已知会影响造血功能。针对老化造血干细胞的多项研究表明，由细胞内在机制导致这些功能限制。但值得关注的是，我们的研究结果表明，老化SSC通过自身偏向Thy1+促骨髓基质并上调和分泌促骨髓细胞因子，促进骨髓偏斜谱系群体的选择性扩增，而这一特征似乎会传递给其所有后代。最终，这些向骨髓支持性信号传导的转变导致造血***发生改变，提高破骨细胞活性，使炎性环境加剧到全身水平。因此，老化骨骼表型很可能是SSC源性抗成骨和促破骨骨髓微环境的结果。

近期研究表明，SSC和HSC衰老可能由慢性炎症、血管成分变化或神经支配变化等多种其他细胞外在因素驱动。相比之下，我们发现，即使改变生态位条件，包括将肾移植到青年小鼠体内、与青年小鼠进行异种共生以及通过年轻HSC重建老化血液***，老化SSC在骨软骨形成活性方面也始终表现不佳。这些实验表明细胞内在机制表现出年龄相关SSC特性。本发明虽未涉及，但表观遗传预激或漂移也很可能驱动内在SSC衰老，不容忽视。此外，尽管有充分证据表明老化骨骼中的脂肪浸润增加，但由于老化SSC不会产生脂肪细胞，很可能存在塑造骨髓微环境的其他未经确定的纯化干细胞群。

值得注意的是，我们发现内在老化SSC谱系变化还包括炎性促破骨因子的上调和分泌。破骨细胞的成熟和存活依赖于Rankl和Csf1。经证明，骨髓基质细胞Rankl表达增加是骨髓成脂水平升高的标志，反之可以促进破骨细胞形成。相对而言，Rankl-KO小鼠出现骨硬化症，这与我们在老年单倍不足Csf1小鼠中的发现一致。先前研究证明老化基质细胞源性Csf1可在体外诱导骨质流失；但我们的研究首次表明该现象很可能通过体内既定干细胞谱系发生。值得探讨的是，在去卵巢小鼠中，通过中和Csf1，可以预防由Csf1基质细胞产量增加诱导的骨质流失。我们发现单独利用Csf1拮抗作用无法补救老年骨折愈合，因此未能在骨折情况下重复这些结果。

我们还发现全身因子无法使老化SSC恢复活力。先前异种共生研究发现非糖尿病小鼠血液不能补救糖尿病小鼠受损的骨折愈合能力，与之一致的是，暴露于年轻循环无法恢复老化SSC功能。这一发现与一项先前研究相反，先前研究指出，异时异种共生会对骨参数产生积极影响。但其结果仅由一个损伤后时间点和组织学分析得出。因此，随着此研究成果计划用于其他组织，循环因子的生理水平能否持久恢复骨骼活力仍然不确定。似乎更合理的做法是施用作用于SSC生态位的局部因子来增强骨软骨形成并调控谱系命运。相应地，我们发现通过组合使用重组Bmp2和低剂量Csf1拮抗剂，可以使老化SSC功能、骨痂组织的分子特征和骨折愈合恢复到青年小鼠的水平。通过仔细检验这些骨折骨痂组织中的分子变化，我们证实补救治疗对除SSC以外的其他细胞类型，例如成骨细胞和免疫细胞，均产生积极影响。

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材料和方法

动物：根据斯坦福大学指南，在斯坦福大学研究动物设施处供养小鼠。让动物自由采食食物和水，居住在温度和光线均受控的微型保温住所中。除非另有说明，否则使用来自Jackson实验室(JAX：000406)的出生后第3天(新生，0-mo)和2月龄(青年，2-mo)雄性B6小鼠(C57BL/Ka-Thy1.1-CD45.1)，以及来自NIA的24月龄(老年，24-mo)雄性B6小鼠，进行所有实验。进行Rainbow免疫荧光实验时，使用我们实验室饲养的青年和老年雄性Actin-CreERT2；R26VT2/GK3小鼠。在骨折前7天和3天以及骨折后3天向Rainbow小鼠给予溶于玉米油中的200mg/kg他莫昔芬(Sigma-Aldrich)的腹腔注射剂。对于异种共生实验，使用来自Jackson实验室(JAX：003291)的青年和老年雄性GFP小鼠(C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J)。用于雄性NSG小鼠移植肾的细胞(NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ；JAX：005557)也源自青年和老年GFP小鼠。通过将B6小鼠(JAX：000406)与从Jackson实验室(JAX：000231)获得的op/+小鼠(B6；C3Fe a/a-Csf1op/J)初始交配，然后将op/+B6小鼠与op/+小鼠异种交配，得到Csf1-KO^+/-小鼠。如上所述使用雌性和雄性Csf1-KO^+/-小鼠进行实验。

双皮质股骨骨折：使用雾化异氟烷麻醉动物，切开前给予镇痛措施。进行肌肉牵张和髌骨侧向脱位后，露出股骨。将25号规则坡口针(BD BioSciences)***股骨髁之间，实现相对髓内固定，使用微型剪刀在骨干中段诱导横向骨折。然后，重新定位髌骨，使用6-0尼龙缝合线(Ethicon)重新接合肌肉并闭合皮肤。通过射线照相验证骨折对齐情况，进行进一步分析时排除发生骨折移位或髓内针迁移的动物。

水凝胶的制作和放置：将包含降冰片烯(MW 10kDa)或巯基乙酸酯(MW 10kDa)端基的八臂聚乙二醇(PEG)单体以20％w/v的浓度溶于PBS中。然后，向每种溶液中加入光引发剂苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸酯，使浓度达到0.05％w/v。以1:1的体积比混合这两种聚合物溶液，获得水凝胶前体溶液。以预期浓度向前体溶液中加入重组小鼠生长因子BMP2(FisherScientific，货号：355-BM)和抗Csf1(FisherScientific，货号：MAB4161SP)。分别将溶液在体积为4μL的模具中采用UV(365nm，4mW/cm²)照射5分钟，获得浓度为附图说明中标注值50％的含因子水凝胶。将两种水凝胶放置在骨折部位，使其分别留在原处，直到收获组织。将一种水凝胶放置在骨折的前内侧，将另一种水凝胶放置在骨折的后内侧。含PBS水凝胶作为对照组。

X射线照相：收获股骨并清除软组织。成像前移除髓内钉。使用Lago-X扫描仪(Spectral Instruments Imaging)在收获后2小时内对股骨进行射线照相。使用ImageJ1.48v分析射线照相图像，以确定骨痂指数。骨痂指数是骨干中段骨痂最大直径与相邻未受伤骨干最大直径之比。

机械强度测试：使用由R.H.Dauskardt实验室(加利福尼亚州斯坦福)维护的层离装置进行机械强度测试。测试前，收获未受伤和骨折后第21天的股骨并清除软组织。移除髓内固定装置。将股骨样本储存在冰上的PBS中，直到在收获后6小时内进行测试。以2牛顿(N)的力预加载所有样本，随后以每秒2微米的压缩速率进行三点弯曲测试。记录断裂前承受的最大载荷(N)。

显微计算机断层扫描：收获股骨并清除软组织。成像前移除髓内钉。在收获后2小时内，使用Bruker Skyscan 1276(Bruker Preclinical Imaging)，以85kV的电源电压、200μA的电源电流、AI 1mm的滤波器设置和12微米的像素尺寸(2016×1344)，对股骨进行扫描。使用CT分析仪和CTvox软件(Bruker)分析重建样本。通过分析200个切片中的部分，即生长板末端远侧的50个切片，评估未受伤股骨的小梁骨参数。通过在骨折间隙的两个方向上各选择150个切片，共300个切片，分析骨折骨痂。然后使用CTAn手动选择骨折骨痂的确切范围进行分析。分析前使用CTAn手动识别和选择矿化移植肾。

动态组织形态分析：为了用钙黄绿素标记非脱钙骨标本，向小鼠腹膜内注射2.5mg/ml钙黄绿素(Sigma-Aldrich，货号：C-0875)的2％碳酸氢钠溶液。将小鼠每隔7天标记一次，第二次注射后3天处死。安乐死后，收获标记的肱骨，4℃下在10％缓冲***中固定48小时。将标本先用乙醇脱水至100％，再嵌入甲基丙烯酸甲酯(Dorn and HartMicroedge,Inc.)中。在磨粒机/抛光机上修剪塑料块，在配备碳化钨一次性刀片的电动RM2165切片机上进行切片。从受注射小鼠的骨中收集七微米切片。选择位于动物之间同一平面上的一组连续切片进行钙黄绿素标记分析，从而对动态参数进行定量。使用ImageJ(美国国立卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，http://imagej.nih.gov/ij/)进行所有计算。每根骨表面的矿化表面(MS/BS)表示具有矿化活性的骨表面的百分比。其通过公式dL.Pm/BS计算得出，其中dL.Pm是双标记周长，BS是每个图像的总骨表面。矿物质沉积率(MAR)是两个标记中点之间距离除以中点间隔时间所得的结果。骨形成率(BFR)是单位时间内形成的矿化骨的体积，计算为MAR和MS/BS的乘积。

组织学：将解剖后的无软组织标本在2％ PFA中在4℃下固定过夜。将样本在400mM乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS(pH 7.2)溶液中在4℃下脱钙2周，每周更换两次EDTA。然后将标本在30％蔗糖中在4℃下脱水过夜。将标本嵌入最适切割温度化合物(OCT)中并切成5mm切片。将典型切片用新鲜制备的苏木精和伊红、MovatPentachrome或TRAP染色。将Rainbow小鼠骨切片水合并安装到位，以进行共焦成像。

骨骼祖细胞流式细胞术：如前所述分离骨骼干细胞谱系群体。简而言之，收获股骨，清除软组织，使用研钵和研杵压碎。然后，将组织在M199(ThermoFisher；货号：11150067)中用2.2mg/ml胶原酶II缓冲液(Sigma-Aldrich；货号：C6885)以37℃消化60分钟。将解离后的细胞通过100微米尼龙过滤器过滤，用染色介质(10％胎牛血清[FBS]的PBS溶液)洗涤，在4℃下以200g沉淀。将细胞沉淀物重悬于染色介质中，通过5分钟ACK裂解去除造血谱系细胞。将细胞在染色介质中再次洗涤并在4℃下以200g沉淀。然后，使用针对CD45(货号：15-0451)、Ter119(货号：15-5921)、CD51(货号：12-0512)、Tie2(14-5987)、Thy1.1(货号：47-0900)、Thy1.2(货号：47-0902)、6C3(货号：17-5891)、CD49f(货号：11-0495)、CD105(货号：13-1051)和链霉亲和素-PE-Cy7缀合物(货号：25-4317-82)的荧光染料缀合抗体(ThermoFisher)制备细胞，以进行流式细胞术。在Lokey干细胞研究院(加利福尼亚州斯坦福)共享FACS设施中的FACS Aria II仪器(BD Biosciences)上使用70微米喷嘴进行流式细胞术。采用荧光减一对照组确定骨骼干细胞谱系门控策略。通过碘化丙啶染色，测定细胞活力。对所有细胞群进行纯度分选。

增殖和细胞凋亡检测：根据制造商的指南进行EdU增殖检测。简而言之，采用固定-透化试剂盒(BD Biosciences；货号：554714)分别固定和透化FACS纯化mSSC和BCSP，并通过ClickIT Edu反应(ThermoFisher；货号：C10337)进行加工。然后，通过流式细胞术重新分析细胞的增殖潜能。进行Annexin V细胞凋亡检测时，按照制造商的说明(ThermoFisher；货号：V13241)在新鲜分离的mSSC和BCSP上加工细胞。

细胞培养：用0.1％明胶预涂各孔，在包含10％ FBS和1％青霉素-链霉素的MEM-α(ThermoFisher；货号：15140-122)中以低水平O₂条件(2％大气氧气、7.5％二氧化碳)培养细胞。进行体外集落形成检测，将500个FACS纯化mSSC接种到6孔组织培养孔板中并保持上述条件14天。然后，将集落用结晶紫(Sigma-Aldrich；货号：C0775)染色，在明视野显微镜下定量。选用包含20个以上细胞的集落。使用照片扫描孔板的ImageJ软件测定集落尺寸。进行体外成骨分化时，在上述条件下24孔组织培养板各孔中培养12,000个FACS纯化mSSC或BCSP。每孔细胞融汇水平达到80％时，将细胞用PBS洗涤，进行胰蛋白酶化并移至成骨分化培养基(在包含10％ FBS、100μg/ml抗坏血酸和10mMβ-甘油磷酸盐的DMEM溶液中培养14天)、成软骨培养基(将包含约1.5×10⁷个细胞/ml的5μl细胞悬液液滴所形成的微团培养物用移液器移至48孔板的中心，在培养箱中培养2小时，然后加入DMEMhigh(包含10％ FBS、100nM***、1μM L-抗坏血酸-2-磷酸盐和10ng/ml转化生长因子β1)温热成软骨培养基并保持该条件21天)或成脂培养基(加入50μM吲哚美辛、1μM***、0.5μM异丁基甲基黄嘌呤、1nM 3,3',5-三碘-L-甲状腺原氨酸(T3)，培养48小时，然后在不含生长因子且仅在第10天后加入T3和胰岛素的生长培养基中进行进一步分化)。分化结束时，将细胞用PBS洗涤，用4％ PFA固定，用茜素红S(Roth；货号：A5533-25G)溶液(成骨)、阿尔新蓝(Alcian Blue8GX；货号：A3157)溶液(成软骨)或油红O(Sigma-Aldrich；货号：O0625)(成脂)溶液染色。将孔用水洗涤并在明视野显微镜下成像。用甲醇/乙酸混合物处理15分钟以提高染色效果，并使用Ultraspec 2100紫外/可见分光光度计(Biochrom，Harvard Bioscience)测量450nm处的吸光度，从而定量各孔中茜素红的浓度。通过采用分光光度法测量595nm处的吸光度，定量各孔中阿尔新蓝的浓度。由于所研究的细胞类型缺乏正染色，未定量油红O的浓度。进行体外细胞因子分泌测定时，在上述条件下24孔组织培养板各孔中培养25,000个FACS纯化SSC或BCSP。接种细胞后48小时，用PBS洗涤孔板3次，将培养基条件改变为包含1％青霉素-链霉素的无血清MEM-α。24小时后，收集条件培养基，将其在4℃(200g)下离心。将抽出物速冻并立即送往人类免疫监测中心(加利福尼亚州斯坦福)进行Luminex分析。进行破骨细胞分化测定时，从8周龄和24月龄小鼠身上切下四肢。使用研钵和研杵将骨压碎。将细胞通过70μM细胞过滤器过滤，然后铺在Histopaque-1077(Sigma-Aldrich；货号：10771)上，对红细胞进行梯度分离。抽出细胞中间相，用PBS洗涤并离心，然后使用血细胞计数器进行细胞计数。将细胞以每孔200,000个细胞的密度接种到24孔板中，其中包含无酚红MEMα、1％GlutaMAX补充剂(Gibco；货号：35050061)、10％胎牛血清(FBS)、1％青霉素-链霉素10,000U/ml 10^-7μM***素E2(PGE2)(Sigma-Aldrich；货号：P5640)、10ng/ml Csf1重组人蛋白(Peprotech；货号：315-02)，培养3天。到第三天，每天更换培养基，再加入10ng/ml重组小鼠RANKL(Peprotech；货号：315-11)。破骨细胞培养持续7-10天，直到较大的多核破骨细胞出现。根据抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色方案(Sigma-Aldrich)，从培养基中抽出培养物，使用包含25ml柠檬酸盐溶液、65ml丙酮和8ml 37％甲醛的固定溶液固定培养板中的细胞，停止培养。使用TRAP试剂盒(Sigma-Aldrich；货号：387A)对板进行破骨细胞染色。以10×放大倍数采集图像，使用ImageJ(NIH，马里兰州贝塞斯达)评估破骨细胞数量、细胞尺寸和细胞核计数。

肾小囊移植：如前所述进行肾小囊移植(Chan等人，《细胞》2015)。简而言之，使用雾化异氟烷麻醉小鼠并给予镇痛措施。对每只小鼠在背侧切出5mm切口，手动使肾脏露出。然后，使用针坡口在肾小囊切出2mm切口，将重悬于2μl基质胶中的3,000个FACS纯化mSSC或BCSP移植到肾小囊下方。手动重新接合肾脏，使用缝合线和缝合钉闭合切口。28天后收获移植物，进行显微计算机断层扫描和组织学分析。

异种共生：在实验干预前4周，将小鼠配对为以下嵌合对：等时青年(2×2月龄)、异时(1×2月龄和1×24月龄)和等时老年(2×24月龄)。使用雾化异氟烷麻醉小鼠并给予镇痛措施。在一个异种共生生物的右侧和第二个异种共生生物的左侧，从远侧前腿到远侧后腿切出切口。使用5-0尼龙缝合线(Ethicon)将前腿和后腿以及背侧-背侧和腹侧-腹侧皮肤褶皱缝合。2周后，采用流式细胞术通过外周血样本验证血液嵌合状态。外周血嵌合比率为1:1时，确定循环***完全融合。

如上所述在异种共生生物成对胁腹的相对两侧诱导骨折。使用断裂骨和对侧未受伤骨进行组织学、流式细胞术和microCT分析。

从异种共生生物中移植造血干细胞：如上所述制备等时和异时异种共生生物对。处死4周异种共生生物对，收获每只小鼠的骨骼，清除软组织，使用研钵和研杵机械压碎。收获骨髓，将其用染色缓冲液洗涤并通过70微米过滤器过滤。然后，将骨髓在4℃下以200g离心5分钟。将细胞沉淀物重悬于1mL染色缓冲液中，通过ACK裂解去除红细胞。将长期HSC(LT-HSC；Lin^-ckit⁺Sca1⁺CD150⁺CD34-)根据其特定表面标志物谱通过FACS分离：[谱系阴性(CD3(货号：15-0031)、CD4(货号：15-0041)、CD8(货号：15-0081)、B220(货号：15-0452)、Gr-1(货号：15-9668)、Mac1(货号：15-0112)、Ter119(货号：15-5921)]，c-kit(货号：17-1171)、Sca1(Biolegend；货号：108120)、Slam/CD150(货号：12-1502)呈阳性，CD34呈阴性(货号：50-0341)。进行HSC移植时，将100个双重分选GFP⁺LT-HSC与作为辅助骨髓的300,000个未分选宿主骨髓细胞组合使用，从眼眶后注射到致死性照射(800rad)的青年小鼠体内。进行重建分析时，在HSC移植后8周分析小鼠，以监测供体标记外周血对淋巴和骨髓谱系的影响。使用加热灯加热尾部，通过锐利切口将约4-6滴血液收集到包含10mM EDTA/PBS的试管中。加入等体积的2％ Dextran/PBS以产生密度梯度，37℃下孵育30分钟，使红细胞沉淀。收集上清液，在ACK裂解缓冲液中裂解剩余红细胞。然后将细胞用针对Ter119(货号：15-5921)、B220(货号：47-0452)、CD3(货号：17-0031)和Mac1(货号：25-0112)的抗体(ThermoFisher)染色。在Lokey干细胞研究院(加利福尼亚州斯坦福)共享FACS设施中的FACS Aria II仪器(BDBiosciences)上使用70微米喷嘴进行流式细胞术。

将造血干细胞移植到青年和老年小鼠体内：对2月龄或24月龄受体进行HSC移植实验时，将100个E15胎肝HSC或24月龄骨髓HSC与作为辅助骨髓的300,000个未分选宿主骨髓细胞一同从眼眶后注射到致死性照射(800rad)的B6小鼠体内。注射八周后，通过microCT测量骨矿物质密度。此外，在该时间点对这些小鼠诱导双皮质骨折，并在损伤后第10天和第21天测定再生参数。

对2月龄或24月龄受体进行HSC移植实验时，将来自2月龄GFP小鼠骨髓的1,000个HSC与作为辅助骨髓的500,000个已去除Sca1且未标记的骨髓细胞一同从眼眶后注射到致死性照射(950rad)的B6小鼠体内。注射后6周和12周进行外周血分析。在12周时间点处死小鼠，如Rossi等人⁴⁴所述分析骨髓中供体源性(GFP+)造血谱系树细胞群。

SSC和HSC共培养：进行共培养实验时，如上所述从2月龄或24月龄小鼠中新鲜分离SSC，将其按每孔3,000个细胞接种到96孔板中。将细胞保持在生长培养基中三到五天，直到其融汇。去除SSC生长培养基，替换为Wilkinson等人⁵⁷所述包含重组成纤维细胞生长因子的HSC支持性培养基。简而言之，该培养基包含1X Ham’s F-12Nutrient Mix液体培养基(Gibco，货号：11765-054)、1X青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco，货号：10378-016)、1X胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺(ITSX；Gibco，货号：51500-056)、1％聚乙烯醇(PVA；87-90％水解；Sigma，货号：P8136)、10mM HEPES(Gibco，货号：15630-080)、10ng/mL重组无动物成分鼠干细胞因子(SCF；Peprotech，货号：AF-250-03)、5ng/mL重组无动物成分鼠血小板生成素(TPO；Peprotech，货号：AF-315-14)、25ng/mL重组无动物成分鼠碱性FGF(bFGF；Peprotech，货号：AF-450-33)。此时，将1,000个来自GFP报告基因小鼠的HSC新鲜分选到各孔中。三天后补充一半培养基，在第6天用0.2％胶原酶提取细胞，对其进行FACS分析，或者将其(与300,000个未标记的辅助骨髓细胞一同)从眼眶后移植到致死性照射(950rad)的2月龄受体小鼠体内。包含单独扩增6天的HSC的孔作为对照组。注射后6周和12周进行外周血分析。在12周时间点处死小鼠，如Rossi等人⁴⁴所述分析骨髓中供体源性(GFP+)造血谱系树细胞群。

微阵列：对FACS纯化小鼠骨骼干细胞以及造血谱系群体进行微阵列分析。在FACS纯化前合并来自3-5只不同小鼠的细胞悬液。将5,000-10,000个靶细胞群的细胞直接分选到包含1mLTrizol的试管中。根据制造商的指南，使用RNeasy Micro Kit(Qiagen；货号：74004)分离RNA。将RNA使用Arcturus^TM RiboAmp^TM PLUS扩增试剂盒(ThermoFisher；货号：KIT0521)扩增两次。将扩增后的cRNA用链霉亲和素标记、片段化并与Affymetrix 430-2.0阵列(Affymetrix)混合。使用Gene Chip Scanner 3000(Affymetrix)运行GCOS1.1.1软件以扫描阵列。将原始微阵列数据提交至Gene Expression Commons(http://gexc.riken.jp)，在该网站上根据Common Reference，即国家生物技术信息基因表达综合中心公开提供的微阵列数据的大型集合(n＝11,939)，进行数据归一化计算。CommonReference的荟萃分析还提供了阵列上每个探针组的动态范围。仅选用动态范围>6的基因探针组，对于可采用多个探针组的基因，使用动态范围最宽的探针组。通过GeneExpression Commons生成显示基因表达百分比的热图。

批量RNA测序：从青年(2mo)、中年(12mo)和老年(24mo)B6小鼠(每个年龄段n＝3)的10天骨折骨痂中新鲜纯化10,000个SSC。如前所述进行批量mRNA加工和测序。简而言之，使用Qiagen miRNeasy试剂盒(货号：1071023)分离RNA，使用Clontech Smarter Ultra LowInput RNA试剂盒(TakaraBio，货号：634848)制备cDNA，并使用Clontech Low InputLibrary Prep试剂盒(Takara Bio，货号：634947)生成文库。合并带条形码的样本，然后在NextSeq 500(Illumina)的四个泳道上测序，获得2×76碱基对双末端读数(每个样本的映射读数的平均数量：约4,500万)。

如前所述分析批量mRNA测序数据。简而言之，将来自每个泳道的原始FASTQ读数合并，然后通过Salmon v0.12.0，使用--seqBias、--gcBias、--posBias、--useVBOpt、--rangeFactorizationBins 4和--validateMappings标志及其他默认双末端映射参数，与GENCODE vM20小鼠参考转录本(GRCm38.p6)比对。使用R包、tximport v1.10.1和归一化log2将Salmon结果合并到单个基因的每百万转录本(TPM)矩阵中。可从GEO获取原始数据和处理后的数据(入藏号：GSE166441)(审阅者令牌：slmbusuclrstrur)。

Smart-Seq2单细胞RNA测序：使用来自3-5只出生后第3天(新生)、2月龄或24月龄B6小鼠的合并新鲜加工长骨，如上所述通过FACS分离单细胞。在包含4μl裂解缓冲液的96孔板的各孔中捕获单细胞，该裂解缓冲液包含1U/μL RNase抑制剂(Clontech，货号：2313B)、0.1％riton(Thermo Fisher Scientific，货号：85111)、2.5mM dNTP(Invitrogen，货号：10297-018)、2.5μM低聚物dT30VN(IDT，定制：5′–AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′)以及1:600,000ERCC(外源RNA对照物论坛)ExFold RNASpike-In Mix 2(ERCC；Invitrogen，货号：4456739)的无核酸酶水(Thermo Fisher Scientific，货号：10977023)溶液。将细胞离心沉降，将板保持在-80℃下，直到cDNA合成。使用SMARTScribe逆转录酶(Clontech，货号：639538)和包含模板转换寡核苷酸的锁核酸(TSO；Exiqon，定制：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3′)，通过oligo-dT引发逆转录，从单细胞RNA中提取cDNA。使用KAPAHiFi HotStart ReadyMix(Kapa Biosystems，货号：KK2602)及ISPCR引物(IDT，定制：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)进行PCR扩增。然后使用0.6倍体积的Agencourt AMPure XP微珠(Beckman Coulter，货号：A63882)纯化扩增后的cDNA。在基于毛细管电泳的高灵敏度AATI 96毛细管片段分析仪(Advanced Analytical，Agilent HS NGSFragment Kit[1-6000bp])上，对每个96孔板中包含cDNA的12-24个随机孔进行浓度和尺寸分布定量。对包含单细胞cDNA的孔的浓度求平均值，以确定用于将每个孔归一化至预期浓度范围(0.05-0.16ng/μL)的稀释因子。然后将四个96孔板的内容物并入384孔板中，无需挑选/移除不含任何单细胞cDNA的孔。随后，使用384孔板通过半自动管道制备文库(NexteraXT试剂盒；Illumina，货号：FC-131-1096)。根据Nextera XT方案(Illumina)的建议，使用两轮(0.35倍和0.75倍)Agencourt AMPure XP微珠(Beckman Coulter)，对各孔的条形码文库进行合并、清理和尺寸选择。使用高灵敏度AATI 96毛细管片段分析仪评估片段分布和浓度。在NovaSeq6000(Illumina)上对合并文库进行测序，获得2×101bp双末端读数。

单细胞数据处理和分析：使用bcl2fastq2 2.18(Illumina)多路分解单个RNA测序数据。使用偏斜进一步处理原始读数，进行3'质量微调、3'适配器微调和不良读数去除。然后使用STAR 2.442将微调后的读数映射到小鼠基因组vM20(唯一映射读数的平均值>70％)，使用RSEM 1.2.21⁶³计算每百万计数(CPM)。使用Scanpy包(版本1.8.0.)⁶⁴挖掘数据，生成图谱。为了选取高质量的单细胞，排除基因数少于250个和计数少于2,500个的细胞。同时去除所有细胞在少于3个细胞中可检测到的基因。此外，排除任何线粒体基因含量超过7.5％、核糖体基因含量超过5％以及ERCC分数高于30％的细胞。执行上述严格质量过滤步骤后，使用65个‘0-mo’SSC、170个‘2-mo’SSC和67个‘24-mo’SSC进行下游分析。对原始CPM值进行平均值和对数归一化。使用Scanpy集成ComBat批量校正来自各个96孔加工板的细胞，然后进行数据缩放。使用UMAP(v.0.4.6.)和leidenalg(v.0.8.2.)完成单细胞数据聚类。使用主成分(PC)肘部图选择每次聚类分析所用PC的数量。将基因排序，并通过Wilcoxon秩和检验(Mann-Whitney-U)评估组间差异表达，以鉴定簇特异性基因。使用‘score_genes_cell_cycle’功能以及Nestorowa等人提供的更新基因列表，评估细胞周期状态。使用RNAvelocity³⁵进行谱系轨迹推断。使用GO Biological Processes的Enrichr⁶⁶网络服务器版本，对‘24-mo’组和‘0-mo’组/‘2-mo’组之间差异表达的基因进行基因本体富集测试。仅考虑显著丰富的GO术语(adj.p<0.1)，显示综合统计评分。可从GEO获取数据(入藏号：GSE161946)(审阅者令牌：apqlussmhrodjkx)。

10X基因组scRNAseq：受伤后第10天从24-mo小鼠中收集骨折骨痂组织。如上所述加工、消化并制备来自PBS对照和aCsf^低/BMP2治疗小鼠的三个骨折骨痂，以进行FACS。然后合并各个治疗组的单细胞溶液(每组n＝3)，将2×10⁵个PI-Ter119-细胞分选到包含FACS缓冲液的收集管中。根据制造商的说明，使用10X Chromium Next GEM Single Cell 3′GEM试剂盒(10X Genomics Inc，v3.1)加工细胞，每组靶向10,000个细胞。将带条形码的样本多路分解，与小鼠基因组(vM20)比对，并使用Cellranger工具包进行UMI折叠，同时采用标准设置以及Illumina NextSeq500平台上经过测序的--force-cells＝10,000(版本4.0.0，10XGenomics Inc.)得出：在PBS对照组中，每个细胞的读数平均值为80,589个，每个细胞的基因数中间值为1,633个；在aCsf^低/BMP2治疗组中，每个细胞有100,053个读数，每个细胞的基因中间值为2,062个。我们使用Scanpy包(版本1.7.1.)⁶⁴挖掘数据。首先，进行质量过滤，仅保留基因计数>250且<3000以及线粒体和核糖体基因含量低于10％和20％的细胞，排除多重谱线和劣质细胞，共留下17,230个细胞。同时从下游分析范围中去除所有细胞在少于3个细胞中表达的基因。采用ComBat实现方式对数据进行对数归一化和批量校正(适用于治疗组)，并进行缩放以便分析。根据PCA肘部图选择参数，进行降维和Leiden聚类及子聚类。根据以上有关SmartSeq2的说明进行所有进一步分析。可从GEO获取数据(入藏号：GSE172149)(审阅者令牌：obipiyoqltstfel)。

统计分析：除非附图说明中另有说明，否则通过双尾非配对学生t检验测定两组之间的统计显著性。通过Shapiro-Wilk检验评估正态性。如果未满足正态性，进行Mann-Whitney检验。如果数据具有不等方差(F检验)，通过Welch’s校正调整t检验。为了比较两组以上的数据，如附图说明所述进行ANOVA分析以及适当的事后检验。如果p<0.05，则认为P值显著。使用GraphPad Prism 9(GraphPad)进行统计分析。除非附图说明中另有说明，否则所有数据点均代表生物重复样本。附图说明包含各项实验的确切样本量。所有统计方法均未预定样本量。除非附图说明中另有说明，否则所有数据均表示为平均值+平均值标准误差(SEM)。

前述内容仅说明本发明的原理。应理解，本领域技术人员能够设计出未经本发明明确描述或示出但体现了本发明原理且属于本发明精神和范围内的各种布置。此外，本发明列举的所有示例和条件性语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及发明人为本领域进一步发展贡献的概念，应认为本发明不限于这些具体列举的示例和条件。此外，本发明中所有列举本发明原理、方面和实施例及其特定示例的陈述旨在涵盖其结构和功能等同物。此外，此类等同物旨在包括目前已知的等同物以及将来开发的等同物，即开发的任何要素，无论结构如何，具有相同功能即可。因此，本发明的范围不限于本发明所示和所述的示例性实施例。而所附权利要求体现本发明的范围和精神。

Claims (33)

1.一种用于促进老年哺乳动物骨再生的方法，所述方法包括：

使骨骼干细胞与因子组合接触，所述因子组合可再激活老化SSC，同时减少有利于炎性环境的造血细胞串扰。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述因子组合是共配制组合物，包含有效剂量的BMP2激活剂和CSF1抑制剂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述BMP2激活剂和CSF1抑制剂被植入到药物递送器械中。

4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述药物递送器械仅采用BMP2激活剂和CSF1抑制剂作为活性剂。

5.根据权利要求2-4中任一项所述的方法，其中，所述BMP2激活剂是BMP2蛋白。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述BMP2蛋白是人BMP2蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述人BMP2蛋白的单位剂量为约50μg-约10mg。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述人BMP2蛋白的单位剂量为约250μg-约5mg。

9.根据权利要求2-8中任一项所述的方法，其中，所述CSF1抑制剂是CSF1或CSF1R特异性抗体。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体的剂量为约20μg-约5mg。

11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述抗体的剂量为约50μg-约500μg。

12.根据权利要求2-11中任一项所述的方法，其中，所述植入物是可生物降解的植入物。

13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述可生物降解的植入物是嵌段聚合物植入物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中，所述可生物降解的植入物包含聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述可生物降解的植入物包含胶原、透明质酸、纤维素、壳聚糖、蚕丝、明胶、白蛋白、弹性蛋白或乳蛋白。

16.根据权利要求11-15中任一项所述的方法，其中，所述可生物降解的植入物是水凝胶。

17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述药物递送器械在没有外源性细胞的情况下被植入到局部急性损伤部位。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，在局部急性损伤后立即提供所述植入物。

19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，在局部急性损伤后3天内提供所述生化刺激。

20.一种药物递送器械，包含有效剂量的BMP2激活剂和CSF1抑制剂，用于再激活老化骨骼干细胞。

21.根据权利要求20所述的器械，其中，所述药物递送器械仅采用BMP2激活剂和CSF1抑制剂作为活性剂。

22.根据权利要求20-21中任一项所述的器械，其中，所述BMP2激活剂是BMP2蛋白。

23.根据权利要求22所述的器械，其中，所述BMP2蛋白是人BMP2蛋白。

24.根据权利要求23所述的器械，其中，所述人BMP2蛋白的单位剂量为约50μg-约10mg。

25.根据权利要求23所述的器械，其中，所述人BMP2蛋白的单位剂量为约250μg-约5mg。

26.根据权利要求20-25中任一项所述的器械，其中，所述CSF1抑制剂是CSF1或CSF1R特异性抗体。

27.根据权利要求26所述的器械，其中，所述抗体的剂量为约20μg-约5mg。

28.根据权利要求26所述的器械，其中，所述抗体的剂量为约50μg-约500μg。

29.根据权利要求20-28中任一项所述的器械，其中，所述器械是可生物降解的植入物。

30.根据权利要求29所述的器械，其中，所述可生物降解的植入物是嵌段聚合物植入物。

31.根据权利要求30所述的器械，其中，所述可生物降解的植入物包含聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)或聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)。

32.根据权利要求30所述的器械，其中，所述可生物降解的植入物包含胶原、透明质酸、纤维素、壳聚糖、蚕丝、明胶、白蛋白、弹性蛋白或乳蛋白。

33.根据权利要求20-32中任一项所述的器械，其中，所述可生物降解的植入物是水凝胶。